Name: Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj metodę FISH do wizualizacji wirusowego RNA w komórkach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie lokalizacji RNA i transportu wewnątrzkomórkowego wirusa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują byłym i obecnym członkom laboratorium za wkład w opracowanie opisanej tutaj metodologii oraz Alanowi Cochrane'owi za udzielone porady. L.A. jest stypendystą programu Doctoral Fellowship Canadian Institutes of Health Research (CIHR), a AJM otrzymuje wsparcie w ramach Fraser, Monat and MacPherson Career Award. Niniejsza praca jest finansowana z grantu CIHR (grant nr MOP-56974).

1. Przygotowanie sondy
<ol>
	<li>Przetraw 1 μg wektora do transkrypcji in vitro, pKS(+)pol 236nt 9 enzymem Kpn1 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie poddaj zlinearyzowany produkt DNA elektroforezie na żelu agarozowym. Fragment powinien mieć około 2500 bp.</li>
	<li>Wytnij fragment z żelu i oczyść go za pomocą zestawu Roche Micro Elute Gel Extraction Kit (wszystkie użyte odczynniki wymieniono w Tabeli 1). Końcową elucję przeprowadź w 30 μl buforu do elucji. Na żelu agarozowym rozdziel 5 μl produktu, aby zweryfikować oczyszczanie.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę do reakcji transkrypcji in vitro (patrz przepis poniżej), korzystając z zestawu do znakowania RNA Roche DIG RNA labeling kit, i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
</ol>
In vitro reakcja transkrypcji:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Linearyzowane DNA</td>
			<td>23 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X mieszanina do znakowania RNA DIG (Roche)</td>
			<td>4 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do transkrypcji 1X</td>
			<td>8 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20U RNase OUT</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 U polimerazy RNA T7</td>
			<td>4 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td>40 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="4">
	<li>Dodać 228 U DNazy I i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 min.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję poprzez dodanie EDTA pH 8.0 do stężenia końcowego 20 mM.</li>
	<li>Oczyścić produkt reakcji, używając kolumnek Quick Spin Columns firmy Roche zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Oczyścić sondę poprzez wytrącanie, dodając 1/10 objętości 3M NaOAc pH 5.2 (traktowanego DEPC) oraz 2,5 objętości lodowatego 95% etanolu. Wymieszać i inkubować w temperaturze -80 °C od 30 min do całej nocy.</li>
	<li>Wirować sondę przez 15 min w temperaturze 4 °C przy 15 000 x g.</li>
	<li>Usunąć nadsącz i przemyć osad lodowatym 70% etanolem. Wirować ponownie przez 5 min w temperaturze 4 °C przy 15 000 x g.</li>
	<li>Usunąć nadsącz i osuszyć osad. Resuspendować osad w 50 μl wody (wolnej od DNaz/RNaz) zawierającej 10 U Invitrogen RNase OUT.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie sondy metodą spektrofotometryczną (pomiar RNA przy 260 nm) i rozcieńczyć do stężenia 5 ng/μl. Przechowywać w alikwotach w temperaturze -20 °C do krótkotrwałego użytku lub w -80 °C do długotrwałego przechowywania. Zaleca się przeprowadzenie porównań międzytestowych, dlatego należy zachować do tego celu osobny alikwot.</li>
</ol>
2. Fixacja komórek
<ol>
	<li>W pierwszej kolejności należy wysiać komórki adherentne na niepoddane obróbce, sterylne szkiełka podstawowe, tak aby końcowa konfluencja w momencie zbioru wynosiła około 70-80%. W przypadku komórek nieadherentnych należy je hodować w zwykły sposób, a przed zbiorem inkubować przez 1 godzinę ze szkiełkami podstawowymi poddanymi obróbce 0,01% w/v poli-L-lizyną (Sigma-Aldrich, Inc.). Dla typowej polistyrenowej płytki do hodowli tkanek z 12 dołkami (3,8 cm2) 150 000 komórek (np. HeLa) wysiewa się na 24 godziny przed transfekcją. Komórki nieadherentne można zainfekować lub przetransfekować w zwykły sposób, a następnie pozwolić im przywrzeć do szkiełkach podstawowych przed fiksacją 3.</li>
	<li>Należy usunąć medium i przemyć komórki 1X solą fizjologiczną buforowaną fosforanem przygotowaną w wodzie dwukrotnie destylowanej (DPBS) przez 1 min. Można również zastosować 1X PBS poddany obróbce dietylopirokarbonianem (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.), natomiast nie można używać niepoddanego obróbce PBS, ponieważ może on zawierać enzymy RNaza.</li>
	<li>Należy usunąć PBS i dodać 4% paraformaldehydu w ilości wystarczającej do całkowitego zakrycia komórek. Inkubować przez 15-20 min.</li>
	<li>Należy usunąć paraformaldehyd i przemyć komórki 1X DPBS przez 1 min.</li>
	<li>Należy usunąć DPBS i dodać 0,1 M glicyny (rozpuszczonej w 1X DPBS). Inkubować przez 10 min.</li>
	<li>Należy usunąć glicynę i przemyć komórki 1X DPBS przez 1 min.</li>
	<li>Należy usunąć DPBS i dodać 0,2% Triton-X (rozpuszczonego w 1X DPBS). Inkubować przez 5-10 min. W przypadku barwienia białek jąderek lub otoczki jądrowej, permeabilizację Tritonem X-100 należy prowadzić nie dłużej niż przez 5 min, w przeciwnym razie lokalizacja białek stanie się rozproszona.</li>
	<li>Należy usunąć Triton X-100 i przemyć raz w 1X DPBS przez 1 min.</li>
	<li>Do długoterminowego przechowywania należy zastąpić PBS 70% etanolem i przechowywać w temperaturze 4 °C do czterech miesięcy. Alternatywnie można przemyć komórki jeszcze raz 1X DPBS i przystąpić do procedury FISH.</li>
</ol>
3. Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH)
<ol>
	<li>Jeśli szkiełka nakrywkowe były przechowywane w etanolu, należy zastąpić etanol 1X DPBS i pozwolić komórkom na rehydratację przez 30 min. Rehydratację można przeprowadzić przez noc, jeśli szkiełka nakrywkowe są przechowywane w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć szkiełka nakrywkowe 1X DPBS przez 1 min.</li>
	<li>Przygotować szkiełka do inkubacji szkiełek nakrywkowych, dbając o ich dokładne oczyszczenie i odpowiednie oznakowanie.</li>
	<li>W przypadku szkiełka nakrywkowego o średnicy 18 mm, nanieść na szkiełko 50 μl roztworu DNazy (25 jednostek/szkiełko nakrywkowe, dostępny w handlu). Nałożyć szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że strona z komórkami jest skierowana w dół, i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć szkiełka nakrywkowe 1X DPBS przez 1 min.</li>
	<li>Nanieść na szkiełko 50 μl mieszaniny hybrydyzacyjnej (patrz przepis poniżej) na każde szkiełko nakrywkowe i inkubować szkiełko nakrywkowe stroną z komórkami do dołu przez 16-18 h w temperaturze 42 °C. Inkubację należy przeprowadzić w kuwecie zawierającej mieszaninę 50% formamidu i 2X SSPE (12,5 ml zdejonizowanego formamidu, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml wody).</li>
</ol>
Mieszanina do hybrydyzacji (na jedno szkiełko podstawowe, 50 μl):
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ilość roztworu zapasowego</td>
			<td>Materiał (w stężeniu końcowym)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 μl</td>
			<td>Formamid, 50% (dejonizowany; dowolne źródło)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 μl (z 10 mg/ml)</td>
			<td>tRNA, 1 mg/ml (Sigma-Aldrich, Inc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 μl (z 20X)</td>
			<td>SSPE, 2X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 μl (z 50X)</td>
			<td>Denharts, 5X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,125 μl (z 5 jednostek)</td>
			<td>RNase OUT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 μl (25 ng z 5 ng/μl)</td>
			<td>Sonda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 μl</td>
			<td>H2O DEPC, do uzyskania objętości końcowej 50 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="7">
	<li>Inkubować szkiełka podstawowe stroną z komórkami do dołu w 50 μl 50% formamidu (rozcieńczonego w 1X DPBS) przez 15 min w temperaturze 42 °C.</li>
	<li>Przemyć szkiełka podstawowe dwukrotnie w 2X SSPE, inkubując je stroną z komórkami do dołu w 50 μl 2X SSPE (20X SSPE rozcieńczonego w 1X DPBS) po 5 min każdy raz w temperaturze 42 °C.</li>
	<li>Przemyć szkiełka podstawowe w 1X DPBS przez 1 min.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Zablokuj szkiełka podstawowe, umieszczając je stroną z komórkami do dołu w 50 μl 1X Roche blocking solution (10X Roche blocking solution rozcieńczony w 1X DPBS) na 30 min.</li>
	<li>Inkubuj szkiełka podstawowe stroną z komórkami do dołu w 50 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych przez 1 godzinę w 37 °C. Przeciwciała anty-DIG należy rozcieńczyć zgodnie z instrukcją producenta w 1X blocking solution. Jeśli do barwienia białek używane są inne przeciwciała, można je dodać w odpowiednim stężeniu, pod warunkiem że wszystkie użyte przeciwciała pochodzą od różnych gatunków gospodarzy.</li>
	<li>Przemyj szkiełka podstawowe przez 10 min w 1X DPBS.</li>
	<li>Inkubuj szkiełka podstawowe stroną z komórkami do dołu w 50 μl roztworu przeciwciał wtórnych przez 1 godzinę w 37 °C. Do uzyskania różnych kolorów można zastosować przeciwciała sprzężone z Alexa Fluor (Invitrogen), używane w rozcieńczeniu 1:500 w 1X blocking solution, 1X DPBS.</li>
	<li>Przemyj szkiełka podstawowe dwukrotnie po 10 min każde w 1X DPBS.</li>
	<li>Osusz szkiełka podstawowe stroną z komórkami do góry na papierze Whatman. Należy pamiętać o zakryciu szkiełek, aby uniknąć ekspozycji na światło i blaknięcia.</li>
	<li>Po odparowaniu całego płynu zamontuj szkiełka podstawowe na nowych preparatach, używając 8 μl ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.). Delikatnie dociśnij szkiełko, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Nałóż lakier do paznokci na krawędzie szkiełka, aby je utrwalić.</li>
	<li>Wizualizacja RNA i białek za pomocą technik mikroskopowych jest również kluczowa dla sukcesu tej metody. Ustawienia użytego mikroskopu mogą ułatwiać lub utrudniać wizualizację, dlatego kluczowe jest, aby parametry mikroskopu były ustawione prawidłowo i spójnie dla każdej próbki w danym eksperymencie. Szczegółowe ustawienia mikroskopu, optykę oraz kombinacje przeciwciał można znaleźć w literaturze1,10.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład barwienia RNA wirusa przedstawiono na Rysunku 2. RNA wirusa HIV-1 widoczne jest w całej cytoplazmie, głównie w formie rozproszonej, choć niewielkie punkty w cytoplazmie nie są rzadkością. Specyficzność można zaobserwować, porównując komórki pozytywne z otaczającymi je komórkami, które nie wykazują fluorescencji. Jak wspomniano we wstępie, HIV-1 pozbawiony białka regulacyjnego Rev produkuje RNA, które zostaje zatrzymane w jądrze: można to zwizualizować jako jasny sygnał w jądrze oraz brak sygnału fluorescencji RNA w cytoplazmie. Nadekspresja białek komórkowych może również zmienić dystrybucję RNA wirusa HIV-1. Na Rysunku 2 nadekspresja białek zaangażowanych w transport pęcherzyków endosomalnych (np. białka lizosomalnego oddziałującego z Rab7 (RILP)11 lub RILP z usuniętym końcem N (RILPN)11) oraz białek zakłócających funkcję motoru dyneiny [np. p50/dynamityny1,12] zakłóca normalną lokalizację stanu stacjonarnego genomowego RNA wirusa, co zostało określone w analizach FISH. Ekspresja RILP prowadzi do relokalizacji genomowego RNA wirusa do centrum organizacyjnego mikrotubul (MTOC) 13; RILPN rozprasza późne endosomy w cytoplazmie z powodu niezdolności do wiązania się z p150Glued kompleksu motoru dyneiny 14, a p50/dynamityna blokuje dużą podjednostkę motoru dyneiny i uwalnia późne endosomy, a także genomowe RNA wirusa i białka strukturalne HIV-1, do obwodu komórki1 (Rysunek 2). Manipulacja lokalizacją stanu stacjonarnego genomowego RNA wirusa, który jest kluczowym czynnikiem zakaźności cząsteczek wirusa, mogłaby mieć kluczowe znaczenie dla przyszłego opracowania metod terapeutycznych. W naszych badaniach RNA wirusa pojawia się w komórce już 3 godziny po transfekcji i infekcji10 i staje się łatwo obserwowalne za pomocą tej techniki FISH do 12 godziny.
<img alt="Schemat przygotowania komórek; przedstawia proces barwienia przeciwciałami z opisem kroków, etapów przemywania i kontroli temperatury." src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat blokowy protokołu dla korelacyjnych analiz FISH/IF. Komórki są hodowane na szkiełkach nakrywkach, a następnie utrwalane paraformaldehydem. Przed wykorzystaniem komórek do analiz FISH/IF lub ich przechowywaniem w 70% etanolu przeprowadza się inkubację z glicyną i Triton-X. Komórki odwodnione do przechowywania są rehydratowane w 1X DPBS (PBS traktowany DEPC) przed przejściem do etapu FISH/IF. Komórki traktuje się DNase I i pozostawia na noc w celu hybrydyzacji z sondą. Po zakończeniu hybrydyzacji komórki są przemywane formamidem, a następnie SSPE oraz końcowo płukane w 1X DPBS. Na komórki nakłada się roztwór blokujący, a następnie inkubuje je z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Po przemyciu nakłada się przeciwciała wtórne. Procedurę barwienia kończą dwa ostatnie przemycia w 1X DPBS, po czym szkiełka nakrywkowe są suszone i montowane na slajdach do obrazowania.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna wykazująca lokalizację vRNA, markery białkowe (G3BP, LAMP1), badanie kolokalizacji." src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki z zastosowaniem koanaliz FISH/IF. A) HIV-1 został przetransfekowany do komórek HeLa, w niektórych przypadkach z konstruktami powodującymi nadekspresję białek komórkowych (RILP, p50/Dynamitin oraz RILPΔN (mutant z delecją aminokońca)). Wykonano koanalizy FISH/IF: RNA zidentyfikowano kolorem zielonym, natomiast białka G3BP lub LAMP1 (kolor czerwony) w celu rozróżnienia. B) HIV-1 jest ekspresowany w komórkach HeLa i zbierany w różnych punktach czasowych. Ekspresja viralnego RNA jest śledzona w kolorze zielonym, natomiast białko komórkowe, hnRNP A1, jest barwione na czerwono. Paski skali oznaczają 10 μm. Obrazy zmodyfikowano na podstawie referencji 1 (wybrane rysunki z panelu A; RILP, p50/Dynamitin oraz RILP deltaN) i 17 (panel B).

<ol><li>Lehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+transport+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomic+RNA+and+viral+production+are+dependent+on+dynein+motor+function+and+late+endosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning.</a> J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).</li>
<li>Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+mRNA+interactions+with+RNA+granules+during+translation+initiation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition.</a> PLoS One. 6, e19727(2011).</li>
<li>Abrahamyan, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Staufen1+ribonucleoproteins+prevent+formation+of+stress+granules+but+favour+encapsidation+of+HIV-1+genomic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA.</a> J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).</li>
<li>Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+visualization+of+the+interactions+between+HIV-1+Gag+and+the+cellular+RNA-binding+protein+Staufen1%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1.</a> Retrovirology. 7, 41-41 (2010).</li>
<li>Vercruysse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cooperative+Rev+protein-protein+interactions+on+Rev+responsive+RNA+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer.</a> RNA Biol. 8, 316-324 (2011).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mRNA+export%3A+insights+from+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear mRNA export: insights from virology.</a> Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).</li>
<li>Cmarko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev+inhibition+strongly+affects+intracellular+distribution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs.</a> J Virol. 76, 10473-10484 (2002).</li>
<li>Ajamian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+roles+for+UPF1+in+HIV-1+RNA+metabolism+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation.</a> RNA. 14, 914-927 (2008).</li>
<li>Beriault, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+late+role+for+the+association+of+hnRNP+A2+with+the+HIV-1+hnRNP+A2+response+elements+in+genomic+RNA%2C+Gag%2C+and+Vpr+localization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization.</a> J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).</li>
<li>Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+remodels+the+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 remodels the nuclear pore complex.</a> J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).</li>
<li>Jordens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rab7+effector+protein+RILP+controls+lysosomal+transport+by+inducing+the+recruitment+of+dynein-dynactin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors.</a> Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).</li>
<li>Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+imaging+reveals+a+peroxisomal+reticulum+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).</li>
<li>Levesque, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+HIV-1+RNA+is+mediated+by+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A2+expression+and+impacts+on+viral+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly.</a> Traffic. 7, 1177-1193 (2006).</li>
<li>Rocha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+sensor+ORP1L+contacts+the+ER+protein+VAP+to+control+Rab7-RILP-p150+Glued+and+late+endosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning.</a> J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).</li>
<li>Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Rev+function+by+a+dominant-negative+mutant+of+Sam68+through+sequestration+of+unspliced+RNA+at+perinuclear+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles.</a> J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).</li>
<li>Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hRIP%2C+a+cellular+cofactor+for+Rev+function%2C+promotes+release+of+HIV+RNAs+from+the+perinuclear+region%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region.</a> Genes Dev. 18, 23-34 (2004).</li>
<li>Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+induces+the+cytoplasmic+retention+of+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A1+by+disrupting+nuclear+import%3A+implications+for+HIV-1+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression.</a> J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).</li>
<li>Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+rev+trans-activator+acts+through+a+structured+target+sequence+to+activate+nuclear+export+of+unspliced+viral+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA.</a> Nature. 338, 254-257 (1989).</li>
<li>Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+destinies%3A+degradation%2C+targeting%2C+assembly%2C+and+endocytosis+of+HIV+Gag%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag.</a> AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).</li>
<li>Molle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+trafficking+of+HIV-1+gag+and+genomic+RNAs+regulates+viral+egress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress.</a> J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).</li>
<li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li>
<li>Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+coimaging+of+the+genomic+RNAs+and+Gag+proteins+of+two+lentiviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses.</a> J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).</li>
<li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li>
<li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007(2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Koanalizy FISH/IF stanowią niezawodną metodę wizualizacji viralnego RNA w komórkach, która została obecnie udoskonalona 9,15,16. Na przestrzeni kilku lat opracowaliśmy ulepszoną metodę barwienia RNA. Technikę tę można zastosować w szerokim zakresie typów komórek, pod warunkiem, że sonda jest specyficzna dla docelowego RNA17. Dzięki znakowaniu sondy DIG jesteśmy w stanie wizualizować RNA za pomocą prostego barwienia. Gdy barwienie RNA łączy się z barwieniem innych białek, koanalizy FISH/IF stają się potężnym narzędziem do obserwacji struktur komórkowych oraz lokalizacji białek i RNA.
Specyficzność detekcji RNA jest bardzo wysoka. Zostało to zilustrowane na Rysunku 2. W niektórych z pierwotnych prac skupiających się na lokalizacji wirusowego RNA genomowego, metoda FISH wykazała, że brak białka Rev powoduje uwięzienie wirusowego RNA w jądrze18. Od tego czasu, stosując opisaną tutaj technikę, uzyskano wiele nowych informacji na temat lokalizacji wirusowego RNA genomowego. Poprzez nadekspresję białek komórkowych można wymusić lokalizację specyficznych populacji – a nie wszystkich – wirusowego RNA w różnych regionach komórki. Nadekspresja RILP, która przypomina fenotyp uzyskany po wyciszeniu hnRNP A2 za pomocą siRNA w komórkach wykazujących ekspresję HIV-113, powoduje widoczną akumulację RNA w MTOC. Wirusowe RNA genomowe może zostać przesunięte na peryferie komórki poprzez unieruchomienie białka motorowego końca minus, dyneiny: nadekspresja p50/Dynamityny lub wyciszenie ciężkiego łańcucha dyneiny1 skutkuje uwalnianiem wirusowego RNA genomowego z domen wewnątrzkomórkowych na peryferie komórkowe (Rysunek 2). Mutant RILP, RILPΔN, który nie wiąże już motoru dyneiny, powoduje rozproszenie endosomów (oznaczonych LAMP1) w cytoplazmie, ponieważ nie są one już aktywnie lokalizowane w domenach przyjądrowych. Wyniki te wskazują na koncepcję plastycznej populacji genomowego RNA HIV-1, a w szczególności na istnienie różnych pul genomowego RNA HIV-1, które pełnią niekiedy zidentyfikowane role w cyklu replikacyjnym wirusa. Te same zależności zidentyfikowano już w przypadku białka Gag, kodowanego przez ten mRNA19.
Zastosowanie współanaliz FISH/IF jest ograniczone przez kwestie związane z wyborem i dostępnością przeciwciał. Optymalizacja najlepszej kombinacji przeciwciał pierwotnych i wtórnych oraz ich stężeń wymaga czasu (patrz Tabela 1 i 2). Przeciwciała pochodzące z hybridom lub produkowane przez głównych dostawców mogą mieć stężenia różniące się w zakresie od 1:2 do 1:2000; aby uzyskać najlepsze wyniki, należy ściśle przestrzegać wytycznych producenta. Należy również wziąć pod uwagę gatunek gospodarza, w którym przeciwciało zostało wytworzone. W przypadku przeciwciał pierwotnych i wtórnych należy unikać łączenia przeciwciał owczych i kozich, ponieważ taka kombinacja prowadzi do wysokiego tła ze względu na reaktywność krzyżową między gatunkami (dane niepokazane). W przypadku wtórnych przeciwciał Alexa-Fluor, dla niemal każdego przeciwciała z zestawu można zastosować stężenie 1:500. Inną wadą współanaliz FISH/IF opisanych w niniejszym raporcie jest to, że rejestrują one RNA w jego lokalizacji w stanie stacjonarnym, po utrwaleniu i permeabilizacji komórek przy użyciu paraformaldehydu i detergentu (Rysunek 1). 
Obrazowanie RNA w żywych komórkach zostało jednak osiągnięte za pomocą różnych metod 20-22, głównie z wykorzystaniem wariantów wirusowych genomów RNA znakowanych białkami fluorescencyjnymi, takimi jak GFP. Niemniej jednak wciąż pojawiają się dodatkowe sposoby identyfikacji lokalizacji RNA w żywych komórkach. Te nowe metody obejmują znakowanie RNA za pomocą Spinach 23, SNAP 24 lub MTRIP 2. Techniki te obarczone są również pewnymi wadami, takimi jak konieczność permeabilizacji komórek przed dodaniem substratów lub wymóg zaprojektowania fragmentu znakującego mRNA w celu jego wykrycia za pomocą mikroskopii. W rzeczywistości główna zaleta analiz FISH opisanych w niniejszym raporcie polega na tym, że natywne RNA pozostaje niezmienione, co prowadzi do uzyskania najbardziej istotnych fizjologicznie wyników.

<table><tbody><tr><td>szkiełka nakrywki 18 mm</td><td>VWR international</td><td>48380 046</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18814</td><td>Rozcieńczyć do stężenia 4% (masy/objętości) w 1X DPBS</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>OmniPur, EMD Millipore</td><td>9400</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA z żelu Micro Elute</td><td>Grupa Roche</td><td>D6294-02</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka do znakowania RNA DIG</td><td>Grupa Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Transkrypcja za pomocą polimerazy RNA T7</td><td>Invitrogen</td><td>18033-019</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do szybkiego wirowania</td><td>Grupa Roche</td><td>11814427001</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Invitrogen</td><td>18047-019</td><td></td></tr><tr><td>1X DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>EMD Millipore</td><td>FX0420-8</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401-021</td><td></td></tr><tr><td>RNase OUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw wzmacniający sygnał przeciwciał fluorescencyjnych do detekcji DIG nr 4 (roztwór blokujący)</td><td>Grupa Roche</td><td>1768506</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała wtórne Alexa Fluor</td><td>Invitrogen</td><td>Patrz Tabela 2</td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 24100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroslajdy</td><td>VWR international</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>Immunomontaż</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Identyfikacja konkretnych odczynników i sprzętu </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;obramowanie tabeli=&quot;1&quot;&gt;
 &lt;ciało tabeli&gt;
 &lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;
 &lt;td&gt;&lt;silny&gt;Gatunek przeciwciała anty-DIG (rozcieńczenie; firma, numer katalogowy)&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt;
 &lt;td&gt;&lt;silny&gt;Kolory&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt;
 &lt;td&gt;&lt;silny&gt;użyto Alexa Fluor (1:500)&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt;
 &lt;/tr&gt;
 &lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;
 &lt;td rowspan=&quot;3&quot;&gt;myszy (1:500; Sigma, B7405)&lt;/td&gt;
 &lt;td&gt;zielony&lt;/td&gt;
 &lt;td&gt;Alexa Fluor 488 przeciwciało osioł przeciwko mysi (Invitrogen, A21202)&lt;/td&gt;
 &lt;/tr&gt;
 &lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;
 &lt;td&gt;czerwony&lt;/td&gt;
 &lt;td&gt;Alexa Fluor 594 przeciwciało osie donkey anty-mysie (Invitrogen, A21203)&lt;/td&gt;
 &lt;/tr&gt;
 &lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;
 &lt;td&gt;niebieski&lt;/td&gt;
 &lt;td&gt;przeciwciało przeciwko mysim przeciwciałom z osocza osła Alexa Fluor 647 (Invitrogen, A31571)&lt;/td&gt;
 &lt;/tr&gt;
 &lt;Proszę podać tekst źródłowy w języku angielskim, który należy przetłumaczyć.&gt;
 &lt;td rowspan=&quot;3&quot;&gt;owca (1:200; Roche, 11376623)&lt;/td&gt;
 &lt;td&gt;zielony&lt;/td&gt;
 &lt;td&gt;przeciwciało osiołkowe przeciwko owczym Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A11015)&lt;/td&gt;
 &lt;/tr&gt;
 &lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;
 &lt;td&gt;czerwony&lt;/td&gt;
 &lt;td&gt;Alexa Fluor 594 przeciwko owczym (donkey anti-sheep) (Invitrogen, A11016)&lt;/td&gt;
 &lt;/tr&gt;
 &lt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&gt;
 &lt;td&gt;niebieski&lt;/td&gt;
 &lt;td&gt;Alexa Fluor 647 przeciwowczy przeciwciało osiołkowe (Invitrogen, A21448)&lt;/td&gt;
 &lt;/tr&gt;
&lt;/tbody&gt;
&lt;/table&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Kombinacje przeciwciał wtórnych i przeciwciał anty-DIG wraz z numerami katalogowymi i stężeniami</td></tr></tbody></table>

wykrywanie wirusowego rna za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (fish)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Wirusy infekujące komórki wywołują specyficzne zmiany w normalnych funkcjach komórkowych, które służą przekierowaniu energii i zasobów na replikację wirusa. Wiele aspektów funkcji komórki gospodarza jest przejmowanych przez wirusy, zazwyczaj poprzez ekspresję produktów genów wirusowych, które rekrutują białka i mechanizmy komórkowe gospodarza. Co więcej, wirusy tworzą specyficzne organella błonowe lub przyłączają się do mobilnych pęcherzyków i białek motorowych, aby dotrzeć do określonych obszarów komórki (podczas infekcji de novo wirusy wykorzystują białka motorowe do dotarcia do jądra; później, podczas składania wirusa, przejmują mechanizmy komórkowe pomagające w montażu cząsteczek wirusa). Mniej poznane jest to, w jaki sposób wirusy, w szczególności te z genomem RNA, koordynują wewnątrzkomórkowy transport komponentów białkowych i RNA oraz w jaki sposób osiągają składanie cząsteczek zakaźnych w specyficznych miejscach w komórce. Badania nad lokalizacją RNA rozpoczęły się w wcześniejszych pracach. Rozwijające się embriony niższych eukariotów oraz komórki neuronalne dostarczyły istotnych informacji biologicznych, a także podkreśliły znaczenie lokalizacji RNA w programowaniu kaskad ekspresji genów. Badania na innych organizmach i systemach komórkowych dostarczyły podobnych, ważnych informacji. Wirusy są pasożytami obligatoryjnymi i do replikacji muszą wykorzystywać swoje komórki gospodarza. Dlatego krytyczne jest zrozumienie, w jaki sposób wirusy RNA kierują swoje genomy RNA z jądra, przez pory jądrowe, przez cytoplazmę, aż do jednego z końcowych przeznaczeń – do cząsteczek wirusa potomnego 1.
Metoda FISH stanowi przydatne narzędzie do identyfikacji zmian w lokalizacji stanu stacjonarnego RNA wirusowego. W połączeniu z analizą immunofluorescencji (IF) 22, współanalizy FISH/IF dostarczają informacji o kolokalizacji białek z RNA wirusowym3. Analiza ta stanowi zatem dobry punkt wyjścia do testowania oddziaływań RNA-białko za pomocą innych testów biochemicznych lub biofizycznych 4,5, ponieważ sama kolokalizacja nie jest wystarczającym dowodem, aby mieć pewność co do wystąpienia oddziaływania. Badając lokalizację RNA wirusowego za pomocą takiej metody, uzyskano wiele informacji na temat zdarzeń transportu RNA zarówno wirusowego, jak i komórkowego 6. Na przykład HIV-1 produkuje RNA w jądrze zainfekowanych komórek, ale RNA jest translacyjnie przetwarzane tylko w cytoplazmie. W przypadku braku jednego kluczowego białka wirusowego (Rev) 7, metoda FISH RNA wirusowego wykazała, że blokada replikacji wirusa wynika z retencji genomowego RNA HIV-1 w jądrze 8.
W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wizualnej analizy wirusowego RNA genomowego in situ. Metoda ta wykorzystuje znakowaną sondę RNA. Sonda ta jest zaprojektowana tak, aby była komplementarna do wirusowego RNA genomowego. Podczas syntezy sondy RNA antysensownej in vitro, w reakcji transkrypcji in vitro uwzględnia się rybonukleotyd zmodyfikowany digoksigeniną (DIG). Po hybrydyzacji sondy z docelowym mRNA w komórkach, kolejne etapy znakowania przeciwciałami (Rysunek 1) pozwolą na ujawnienie lokalizacji mRNA, a także białek zainteresowania podczas przeprowadzania FISH/IF.

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Wirusy infekujące komórki wywołują specyficzne zmiany w ich normalnych funkcjach, które służą przekierowaniu energii i zasobów na replikację wirusową. Wiele...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja lokalizacji viralnego RNA w komórkach. Aby to osiągnąć, w pierwszej kolejności należy hodować komórki przeznaczone do transfekcji lub infekcji na szkiełkach podstawkowych. Drugim krokiem jest utrwalenie komórek w 4% paraformaldehydzie po pomyślnej transfekcji lub infekcji.Następnie inkubuj komórki z mieszaniną hybrydyzacyjną, która znakuje RNA. Odbywa się to poprzez umieszczenie szkiełka nakrywki stroną z komórkami do dołu na nałożonej na przedmiot szkiełko mieszaninie hybrydyzacyjnej. Ostatnim krokiem w tej procedurze jest zastosowanie przeciwciał w celu zabarwienia komórek pod kątem znacznika RNA.Ostatecznie lokalizacja znakowanego RNA wewnątrz komórki jest wizualizowana za pomocą fluorescencji w hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH). Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak obrazowanie RNA w żywych komórkach przy użyciu znaczników, jest możliwość wykrywania natywnego RNA zamiast RNA zmodyfikowanego. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mogą napotkać trudności, ponieważ wymaga ona staranności w obchodzeniu się z szkiełkami nakrywkami, standaryzacji metody oraz precyzyjnego przestrzegania ram czasowych.Podczas inkubacji specyficzna procedura hodowli komórek do fiksacji będzie zależeć od rodzaju komórek. W przypadku komórek adherentnych ważne jest, aby początkowo wysiać je na niepoddane specjalnej obróbce, sterylne szkiełka podstawowe, tak aby końcowa konfluencja w momencie zbioru wynosiła około 70 do 80%. Komórki nieadherentne należy hodować w sposób standardowy aż do momentu ich zbioru.Następnie inkubuj je na szkiełkach podstawowych potraktowanych poli-L-lizyną; dla typowej polistyrenowej płytki hodowlanej z 12 dołkami użyj 150 000 komórek na dołek, 24 godziny przed infekcją lub transfekcją. Inkubuj komórki na szkiełkach przez jedną godzinę w temperaturze 37°C, aby rozpocząć procedurę utrwalania komórek. Usuń medium poprzez ostrożną aspirację i delikatnie dodaj 1x PBS przygotowany w wodzie dwukrotnie destylowanej.Następnie przemyj komórki roztworem DPBS przez jedną minutę. Można również zastosować DPBS traktowany DEPC. Nie należy używać nietraktowanego PBS, ponieważ może on zawierać enzymy RNazy.Odlać DPBS i delikatnie dodać odpowiednią ilość 4%paraformaldehydu, aby całkowicie przykryć komórki; inkubować przez 15 do 20 minut. Następnie odlać paraformaldehyd i przemyć komórki DPBS przez jedną minutę. Odlać DPBS i dodać 0,1 M glicyny; inkubować przez 10 minut.Następnie należy usunąć glicynę i przemyć komórki DPBS przez jedną minutę. Po usunięciu DPBS należy dodać 0,2% Triton X 100 i inkubować przez od pięciu do 10 minut. W przypadku barwienia białek jąderek lub otoczki jądrowej należy przeprowadzać permeabilizację Tritonem X 100 nie dłużej niż przez pięć minut, aby uniknąć rozproszenia lokalizacji białek.Odprzypuścić triton X 100 i dwukrotnie przemyć w DPBS przez jedną minutę przy każdym myciu przed rozpoczęciem procedury dla ryb. Przygotować szkiełka, na których będą inkubowane szkiełka nakrywki, dbając o ich dokładne oczyszczenie i odpowiednie oznakowanie. W przypadku szkiełka nakrywki o rozmiarze 18 mm, nanieść 50 µL roztworu DNA na szkiełko.Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest prawidłowe obchodzenie się z szkiełkami nakrywkami. Ważne jest, aby upewnić się, że inkubowana jest odpowiednia strona szkiełka nakrywkowe i aby operować nimi delikatnie. Aby uniknąć pęknięć, nałóż szkiełko nakrywkowe na preparat, upewniając się, że strona z komórkami jest skierowana w dół, i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po 15 minutach umieść szkiełka nakrywkowe stroną z komórkami do góry w naczyniu hodowlanym z 1X DPBS.Myj szkiełka podstawowe przez jedną minutę. Mieszanina ta zawiera następujące składniki: 50% formamidu zjonizowanego, 1 mg/mL TRNA, 2 X-S-S-P-E, 5 X dnar RNAs out probe oraz wodę z DEPC do uzyskania końcowej objętości 50 µL.Sonda jest znakowaną digoksgeniną sondą RNA, zaprojektowaną tak, aby była komplementarna do wirusowego RNA genomowego. Umieść każdą szkiełko nakrywkę stroną z komórkami do dołu na mieszaninie hybrydyzacyjnej na preparacie. Inkubację należy przeprowadzić w kuwecie zawierającej 50% formamid w 2X-SSPE.Mieszać i inkubować przez 16 do 18 godzin w temperaturze 42 °C. Następnie inkubować szkiełko podstawowe stroną z komórkami skierowaną w dół w 50 µL 50% fide przez 50 minut w temperaturze 42 °C. Przemyć szkiełka podstawowe dwukrotnie w 2X-SSPE, inkubując je stroną w dół w 50 µL 2X-SSPE przez pięć minut każdorazowo w temperaturze 42 °C.Na koniec przemyj szkiełka nakrywki w 1X DPBS przez jedną minutę. Aby rozpocząć tę procedurę, zablokuj szkiełka nakrywki, umieszczając je stroną z komórkami do dołu w 50 µL 1X roztworu blokującego Roche przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu blokowania umieść każde szkiełko nakrywki stroną z komórkami do dołu w 50 µL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych zawierającego wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe dla danego eksperymentu w odpowiednich stężeniach. Inkubuj przez jedną godzinę w 37 °C.Umieść szkiełko nakrywkowe stroną z komórkami do góry w naczyniu hodowlanym zawierającym DPPS i płucz nakrywki przez 10 minut. Następnie nanieś pipetą 50 µL roztworu przeciwciał wtórnych na przedmiot szkiełko dla każdej nakrywki. W celu uzyskania różnych kolorów można zastosować przeciwciała konjugowane z Alexa Fluor, których używa się w rozcieńczeniu 1:500 w 1x roztworze blokującym i 1x DPBS. Umieść każdą nakrywkę stroną z komórkami do dołu w roztworze przeciwciał wtórnych i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.Myj szkiełka nakrywki dwukrotnie przez 10 minut każde z tych myć. W DPBS osusz szkiełka nakrywki stroną do komórek na papierze filtracyjnym. Upewnij się, że szkiełka nakrywki są przykryte, aby uniknąć ekspozycji na światło i blaknięcia.Po odparowaniu całego płynu, przymocuj szkiełka nakrywki do nowych szkiełek przedmiotowych. Używając ośmiu mikrolitrów medium do montażu immunochemicznego, delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie nałóż lakier do paznokci na krawędzie szkiełka nakrywki, aby zabezpieczyć je na miejscu. Wizualizacja RNA i białek za pomocą technik mikroskopowych jest również kluczowa dla powodzenia tej procedury.Ustawienia używanego mikroskopu mogą ułatwiać lub utrudniać wizualizację. Dlatego kluczowe jest, aby parametry mikroskopu były ustawione prawidłowo i pozostawały spójne dla wszystkich próbek w danym eksperymencie. Reprezentatywny wynik wizualizacji viralnego RNA w tkankach ryb oraz lokalizacji białek metodą immunofluorescencji został przedstawiony na tej rycinie.Na tym pierwszym panelu, gdzie komórki HeLa zostały przetransfekowane wirusem HIV-1, wirusowe RNA dla HIV-1 znakowane na zielono jest widoczne w całej cytoplazmie, przejawiając w większości rozproszoną lokalizację, choć niewielkie punkty cytoplazmatyczne nie są rzadkością; specyficzność można ocenić, porównując komórki pozytywne z otaczającymi je komórkami, które nie wykazują fluorescencji, co zilustrowano na czarno-białym wstawionym obrazie przedstawiającym wyłącznie barwienie RNA wirusa. Barwienie na czerwono odzwierciedla immunofluorescencję białka wiążącego domenę G3BP (Ross GAPSH3 domain binding protein), które przede wszystkim znakuje cytoplazmę w przypadku komórek HeLa przetransfekowanych HIV-1 pozbawionym regulacyjnego białka Rev. Wytworzone RNA wirusa zostaje zatrzymane w jądrze komórkowym.Można to zwizualizować jako jasny zielony sygnał w jądrze oraz brak fluorescencyjnego sygnału RNA w cytoplazmie. Rozkład wirusowego RNA HIV 1 może być również zmieniony przez nadekspresję niektórych białek komórkowych. Na przykład nadekspresja białka lizosomalnego oddziałującego z RAB 7, czyli białka RLPH zaangażowanego w transport pęcherzyków endosomalnych, prowadzi do relokalizacji śledzonego na zielono genomowego RNA wirusa do centrum organizacji mikrotubul.Tutaj endosomy są znakowane przez LAMP1 i barwione na czerwono. W przeciwieństwie do tego, nadekspresja białka delta N z usuniętym końcem aminowym, który nie jest w stanie wiązać się z P150 glidyny kompleksu motoru dyneiny, powoduje rozproszenie późnych endosomów w cytoplazmie. Nadekspresja P50 dyneiny blokuje dużą podjednostkę motoru dyneiny i uwalnia późne endosomy, a także wirusowe RNA genomowe i białka strukturalne HIV V1, do obwodu komórki. Gdy HIV-1 jest eksprimowany w komórkach HeLa, a następnie komórki są zbierane i analizowane w różnych punktach czasowych, wirusowe RNA pojawia się w komórce już trzy godziny po transfekcji i infekcji, a do 12 godziny staje się łatwo obserwowalne za pomocą techniki FISH.W tym przypadku ekspresja wirusowego RNA jest śledzona w kolorze zielonym, natomiast komórkowe białko H-N-R-N-P-A 1 jest barwione na czerwono. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w 20 minut w pierwszym dniu i w cztery i pół godziny w drugim dniu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z szkiełkami nakrywkowymi, aby uniknąć ich stłuczenia, oraz o unikaniu ekspozycji na światło po zastosowaniu przeciwciała wtórnego. Pamiętaj, że podczas pracy z HIV-1 oraz innymi patogenami o wyższym stopniu ryzyka, materiał jest niezwykle niebezpieczny przed utrwaleniem, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak odpowiednie przeszkolenie i zapewnienie właściwej izolacji.

detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrycie RNA wirusowej przez hybrydyzację in situ z fluorescencją (FISH)

W tym filmie, komórki zainfekowane wirionami MCPyV zostały poddane reakcji łańcuchowej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia specyficznych genomów MCPyV. Co więcej, technikę DNA-HCR połączono z FISH w celu wizualizacji DNA MCPyV w zakażonych ludzkich komórkach skóry.

HCR-DNA FISH: Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania wirusowego DNA w zakażonych komórkach

Źródło: Vallery, T. K. &amp; Steitz, J. A. Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells. J. Vis. Exp. (2019)Niniejszy film demonstruje metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu wizualizacji wirusowego RNA w komórkach zainfekowanych wirusem. Przedstawia on etapy związane z hybrydyzacją sond, amplifikacją sygnału oraz obrazowaniem konfokalnym.

Oznaczanie rozmieszczenia wirusowego RNA w komórkach gospodarza za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji reakcji łańcuchowej (HCR)-fluorescencji in situ (FISH) do wizualizacji przestrzennego rozkładu subgenomowego RNA SARS-CoV-2. Połączenie HCR z technikami immunofluorescencji może dostarczyć informacji na temat interakcji gospodarz-wirus na poziomie pojedynczej komórki.

Wykorzystanie fluorescencji immuno-RNA Hybrydyzacja in Situ do wizualizacji SARS-CoV-2

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Tutaj opisujemy prostą metodę, która łączy fluorescencję RNA hybrydyzację in situ (RNA-FISH) z immunofluorescencją w celu wizualizacji RNA koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Protokół ten może zwiększyć zrozumienie charakterystyki molekularnej interakcji RNA-gospodarz SARS-CoV-2 na poziomie pojedynczej komórki.

Wizualizacja SARS-CoV-2 za pomocą hybrydyzacji immuno RNA-fluorescencji in situ

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Niniejszy artykuł wideo przedstawia krok po kroku sposób przetwarzania próbki nasienia w celu uzyskania wysokiej jakości hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ na ludzkich plemnikach. Otrzymane preparaty mogą być wykorzystywane do przesiewowego badania aneuploidii w ramach diagnostyki klinicznej.<br...

Protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w ludzkich plemnikach

Poznaj metodę FISH do wizualizacji wirusowego RNA w komórkach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie lokalizacji RNA i transportu wewnątrzkomórkowego wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Przeglądaj więcej filmów