Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja lokalizacji wirusowego RNA w C dwa w komórkach. Aby to osiągnąć, najpierw hoduj komórki, które zostaną transfekowane lub zainfekowane, na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Drugim krokiem jest utrwalenie komórek za pomocą 4% aldehydu paraform po udanej transfekcji lub infekcji.

Następnie inkubuj komórki za pomocą mieszaniny hybrydyzacyjnej, która znakuje RNA. Odbywa się to poprzez umieszczenie komórki szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na mieszaninie hybrydyzacyjnej na szkiełku. Ostatnim krokiem w tej procedurze jest użycie przeciwciał do barwienia komórek w celu uzyskania znacznika RNA.

Ostatecznie lokalizacja znakowanego RNA w komórce jest wizualizowana przez fluorescencję w hybrydyzacji C dwa lub rybach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak obrazowanie RNA i żywe komórki za pomocą znaczników, jest to, że można wykryć natywne RNA w przeciwieństwie do zmodyfikowanego RNA. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą techniką, będą miały trudności, ponieważ wymaga ona od pacjentów opieki i obsługi szkiełek nakrywkowych, standaryzacji metody, a także precyzyjnego czasu.

Podczas inkubacji Konkretna procedura hodowli komórek do utrwalenia będzie zależeć od rodzaju komórek. W przypadku komórek przylegających początkowo ważne jest, aby wysiać je na nieobrobione sterylne szkiełka nakrywkowe. Tak więc ostateczna płynność po zbiorze wynosi około 70 do 80%, Nieprzylegające komórki powinny być hodowane w standardowy sposób, dopóki nie będą gotowe do zebrania.

Następnie inkubuj je za pomocą szkiełek nakrywkowych, które zostały potraktowane poli-L-lizyną na typowej 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z polistyrenu 150 000 komórek na basenik na 24 godziny przed infekcją lub transfekcją. Inkubuj komórki na wargach okrywowych przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby rozpocząć procedurę utrwalania komórek. Wyrzuć pożywkę przez ostrożne zasysanie i delikatnie dodaj jedną przygotowaną przez XPBS i podwójnie destylowaną wodę.

Lub DPBS myje komórki przez jedną minutę. Można również użyć Dathyl pyro CARBATE lub DEPC treated jeden XPBS. Nie należy stosować nieleczonego PBS, ponieważ może on zawierać enzymy R w nazie.

Wyrzuć DPBS i delikatnie dodaj tyle. 4% para formaldehydu, aby całkowicie pokryć komórki, inkubować przez 15 do 20 minut, po czym wyrzuć paraldehyd i myj komórki DPBS przez jedną minutę. Odrzucić DPBS i dodać 0,1 molowej glicyny inkubować przez 10 minut.

Następnie wyrzuć glicynę i myj komórki DPBS przez jedną minutę. Po odrzuceniu DPBS dodać 0,2% Triton X 100, inkubować przez pięć do 10 minut. W przypadku barwienia białek otoczki jąderkowej lub jądrowej należy przepuścić tryton X 100 nie dłużej niż pięć minut, w przeciwnym razie lokalizacja białka stanie się rozproszona.

Tryton X 100 należy odrzucić i umyć dwa razy w DPBS przez jedną minutę za każdym razem przed rozpoczęciem procedury dla ryb. Przygotuj boki, na których będziesz inkubować szkiełka okładkowe, zwracając uwagę, aby je dobrze oczyścić i oznaczyć. W przypadku 18-milimetrowego szkiełka nakrywkowego dodaj do szkiełka 50 mikrolitrów roztworu DNA.

Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest właściwe obchodzenie się z szkiełkami nakrywkowymi. Ważne jest, aby upewnić się, że inkubujesz prawą stronę szkiełka nakrywkowego i obchodzić się z nimi delikatnie. Aby uniknąć pęknięcia, Dodaj szkiełko nakrywkowe do szkiełka, pamiętając, aby umieścić je komórką do dołu i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej Po 15 minutach umieść szkiełka nakrywkowe stroną do góry w naczyniu hodowlanym z jednym X-D-P-B-S.

Umyj szkiełka nakrywkowe przez jedną minutę. Ta mieszanka zawiera następujące elementy. 50% dejonizowana forma amidu jeden miligram na mililitr, TRNA dwa X-S-S-P-E pięć X dnar RNA na zewnątrz sondy i DEPC woda do końcowej objętości 50 mikrolitrów.

Sonda jest sondą RNA znakowaną geniną, zaprojektowaną tak, aby była komplementarna w stosunku do wirusowego genomowego RNA. Miejsce. Każde szkiełko nakrywkowe stroną do dołu na mieszaninie hybrydyzacyjnej na szkiełku. Inkubację należy przeprowadzić na tacy zawierającej 50% FIDE dwa X-S-S-P-E.

Mieszać, inkubować przez 16 do 18 godzin w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Następnie inkubować szkiełko nakrywkowe stroną do dołu w 50 mikrolitrach 50% fide przez 50 minut w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie w dwóch X-S-S-P-E, inkubując je stroną do dołu w 50 mikrolitrach dwóch X-S-S-P-E przez pięć minut każdy w temperaturze 42 stopni Celsjusza.

Na koniec umyj szkiełka nakrywkowe w jednym X-D-P-P-S przez jedną minutę. Aby rozpocząć tę procedurę, zablokuj szkiełka nakrywkowe, umieszczając stronę z komórką do dołu w 50 mikrolitrach jednego roztworu blokującego X Roche na 30 minut w temperaturze pokojowej po zakończeniu blokowania, umieść każdą szkiełko nakrywkowe stroną do dołu w 50 mikrolitrach roztworu przeciwciała pierwszorzędowego, który zawiera wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe do eksperymentu w odpowiednich stężeniach. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza po godzinie.

Umieść szkiełko nakrywkowe komórką do góry w naczyniu hodowlanym zawierającym DPPS i myj szkiełka nakrywkowe przez 10 minut. Następnie odpipetować 50 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał na szkiełko podstawowe dla każdego szkiełka nakrywkowego. Przeciwciała sprzężone z podłogą Alexa mogą być używane do generowania szeregu kolorów i są używane w rozcieńczeniu od jednego do 500 w jednym roztworze blokującym x i jednym X-D-P-B-S Umieść każdą komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu w roztworze przeciwciała drugorzędowego i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni.

Szkiełka nakrywkowe należy umyć dwukrotnie po 10 minut każde. W DPBS suszyć okładkę wsuwa się komórką do góry na kawałek bibuły. Pamiętaj, aby zakryć szkiełka nakrywkowe, aby uniknąć ekspozycji na światło i wybielanie.

Gdy cały płyn odparuje, zamontuj pokrywę na świeżych szkiełkach. Używając ośmiu mikrolitrów mocowania immunologicznego, delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza, nałóż lakier do paznokci na krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby zabezpieczyć je na miejscu. Wizualizacja RNA i białek za pomocą technik mikroskopowych ma również kluczowe znaczenie dla powodzenia tej procedury.

Ustawienia używanego mikroskopu mogą pomagać lub utrudniać wizualizację. Dlatego tak ważne jest, aby ustawienia mikroskopu były ustawione prawidłowo i były spójne dla każdej próbki w danym eksperymencie. Reprezentatywny wynik wizualizacji wirusowego RNA przez ryby i lokalizację białek za pomocą immunofluorescencji ilustruje ten rysunek.

W tym pierwszym panelu, w którym komórki hela są transfekowane wirusem HIV, wirusowy RNA dla HIV jeden przewodzony na zielono jest widoczny w całej cytoplazmie wyświetlany dyfuzyjnie w większości, chociaż małe cytoplazmatyczne punte nie są rzadkością, specyficzność można zobaczyć, porównując komórki dodatnie z otaczającymi komórkami, które nie wykazują fluorescencji, jak pokazano na czarno-białym obrazie wstawki, który reprezentuje tylko barwienie wirusowego RNA. Czerwone zabarwienie odzwierciedla immunofluorescencję białka wiążącego trzy domeny Ross GA PSH lub G trzy bp, które przede wszystkim oznacza cytoplazmę, gdy komórki helo są transfekowane wirusem HIV, który nie ma regulatorowego białka rev. Wytworzone wirusowe RNA jest zatrzymywane w jądrze.

Można to zwizualizować jako jasnozielony sygnał w jądrze i brak sygnału fluorescencyjnego RNA w cytoplazmie. Dystrybucja RNA wirusa HIV one może być również zmieniona przez nadekspresję niektórych białek komórkowych. Na przykład nadekspresja białka lizosomalnego RAB seven lub rzeczywistego białka A biorącego udział w transporcie pęcherzyków endosomalnych prowadzi do relokalizacji wirusowego genomowego RNA śledzonego na zielono do centrum organizacji mikrojajowodów.

Tutaj endosomy są oznaczane przez lampę pierwszą i barwione na czerwono. W przeciwieństwie do tego, nadekspresja amendalnie usuniętej delta N, która nie jest w stanie związać się z P one 50 sklejonym kompleksem motorycznym dine, rozprasza późne endosomy w cytoplazmie nad ekspresją dyny P 50 blokuje dużą podjednostkę motoryczną dine i uwalnia późne endosomy, ale także wirusowe genomowe RNA i białka strukturalne HIV V one na obrzeżach komórki. Kiedy wirus HIV ulega ekspresji w komórkach helo, a następnie komórki są zbierane i analizowane w różnych punktach czasowych, wirusowe RNA pojawia się w komórce już po trzech godzinach od transfekcji i infekcji i staje się łatwo zauważalne za pomocą tej techniki ryb w ciągu 12 godzin.

Tutaj ekspresja wirusowego RNA jest śledzona na zielono, podczas gdy białko komórkowe H-N-R-N-P-A jest barwione na czerwono Po opanowaniu tej techniki można wykonać w 20 minut pierwszego dnia i cztery i pół godziny w drugim dniu, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z szkiełkami nakrywkowymi, aby uniknąć ich złamania i uniknąć światła po nałożeniu przeciwciała drugorzędowego. Nie zapominaj, że podczas pracy z HIV V i innymi patogenami wyższego poziomu, jest to niezwykle niebezpieczne przed utrwaleniem i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podjąć środki ostrożności, takie jak odpowiednie szkolenie i powstrzymywanie.