Wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów przy użyciu zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ
June 28th, 2012
Zespoły genomu oparte na technologiach sekwencjonowania DNA są zazwyczaj bardzo rozdrobnione. Opracowanie fizycznych map chromosomów może potencjalnie poprawić składanie genomu. W tym miejscu demonstrujemy innowacyjne podejścia do przygotowania chromosomów, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i obrazowania, które znacznie zwiększają przepustowość opracowywania map fizycznych.
Ogólnym celem tej procedury jest mapowanie sond DNA do chromosomów politanu komara przy użyciu preparatu chromosomowego pod wysokim ciśnieniem, a następnie zautomatyzowana fluorescencyjna hybrydyzacja w C 2 i automatyczne obrazowanie. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie rozkładów chromosomów politanu metodą wysokociśnieniową. Kolejnym krokiem procedury jest przygotowanie sond fluorescencyjnych poprzez znakowanie genomowego DNA wstecznego fluorochromem za pomocą protokołu translacji Nicka.
Trzecim krokiem jest przeprowadzenie fluorescencyjnej hybrydyzacji w C 2 przy użyciu zautomatyzowanych systemów barwienia szkiełkowego. Ostatnim krokiem jest zeskanowanie i sfotografowanie znakowanych chromosomów za pomocą automatycznego systemu obrazowania fluorescencyjnego. Ostatecznie obrazy mogą pokazać lokalizację znakowanej fluorescencyjnie sondy DNA na polichromosomie.
Główną zaletą tej techniki lub istniejących metod, takich jak standardowy protokół ręcznej hybrydyzacji in situ, jest to, że protokół mapowania fizycznego o najwyższej przepustowości daje bardziej spójne wyniki i znacznie skraca czas pracy ręcznej. Protokół ten rozpoczyna się od przeprowadzenia sekcji samic w połowie grawitacji i oliwy po około 25 godzinach od karmienia krwią, aby zebrać ich jajniki, gdy są w trzecim stadium Christophera. Na tym etapie przezroczysty obszar z komórkami pielęgniarskimi w pęcherzykach powinien mieć okrągły kształt, zebrać jajniki od pięciu samic i umieścić je w 500 mikrolitrach świeżo przygotowanego zmodyfikowanego roztworu hałasu samochodowego.
Następnie można je przechowywać w temperaturze pokojowej do 24 godzin lub dłużej w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie, tuż przed wykonaniem preparatów do wypreparowania jajników, przygotuj roztwór hałasu samochodowego i 50% kwas propionowy. Umieść każdą parę jajników w kropli świeżego roztworu hałasu samochodowego na bezpyłowym szkiełku pod mikroskopem preparacyjnym.
Rozłup jajniki za pomocą igły preparującej. Przenieś wszystkie części jajnika na sześć czystych szkiełek z 50% kwasem propionowym. Oddziel mieszki włosowe od siebie za pomocą igieł preparacyjnych.
Następnie wytrzyj pozostałe chusteczki ręcznikiem papierowym. Dodaj kolejną kroplę 50% kwasu proponowego i odczekaj od trzech do pięciu minut. Legenda, pęcherzyki znajdują się w 50% kwasie proponowym przez trzy do pięciu minut, co znacznie poprawia rozprzestrzenianie się chromosomów.
Następnie nałóż szkiełko nakrywkowe i odczekaj kolejną minutę, aby rozprowadzić jądra. Owiń szkiełko bibułą filtracyjną i plastikiem. Ustaw prędkość obrotową Dremel między trzema a 5 000 obr./min i przez około minutę delikatnie obracaj obracającą się końcówką dremel na szkiełku nakrywkowym.
Potwierdź jakość rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopu fazowego i w razie potrzeby przyłóż dremel dłużej, aby spłaszczyć chromosomy. Umieść drugie szkiełko nakrywkowe obok pierwszego, a następnie ułóż je warstwowo pod innym mikroskopem. Przesuń następnie, owiń szkiełka plastikowym arkuszem i bibułą filtracyjną, umieść szkiełka do owijania w imadle, aby ścisnąć szkiełka do funtów od 85 do 120 cali.
Po spłaszczeniu chromosomów na wszystkich sześciu szkiełkach, rozwiń szkiełka i usuń dodatkowe szkiełka, aby jeszcze bardziej spłaszczyć chromosomy. Inkubować szkiełka w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut w systemie hybrydyzacji denaturacji szkiełka. Następnie zanurz szkiełko w ciekłym azocie na co najmniej 15 sekund lub do momentu, gdy bulgotanie ustanie.
Następnie szybko zdejmij szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki i natychmiast umieść szkiełko w zimnym, 50% etanolu na pięć minut. Powtórz ten proces dla każdego slajdu sekwencyjnie. Odwodnić szkiełka w kąpieli 70%, 90% i 100% etanolowej.
Zanurz je w każdej kąpieli na pięć minut. Wreszcie, po wyschnięciu szkiełek na powietrzu, są gotowe do barwienia ryb. Zautomatyzowane urządzenie wykonuje większość kroków w procedurze, z wyjątkiem etykietowania sondy.
Tak więc przed załadowaniem urządzenia należy przygotować sondę fluorescencyjną, znakując DNA fluorochromem za pomocą komercyjnego protokołu translacji NIC z przygotowaną sondą, załadować szkiełka i odczynniki do automatycznych szkiełek. System barwienia i zaprogramuj system tak, aby wykonywał następujące kroki. Najpierw dostarcz 800 mikrolitrów jednego XPBS przez 20 minut.
Po drugie, wysusz szkiełka suszarką. Po trzecie, przymocuj szkiełka za pomocą 450 mikrolitrów 4% formaliny w jednym XPBS przez jedną minutę. Następnie myj szkiełka 100% etanolem przez jedną sekundę, dwa razy i przez dwie minuty.
Po kąpieli etanolowej ponownie wysusz szkiełka suszarką. Teraz podgrzej szkiełka w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby uniknąć bulgotania. Następnie nałóż 20 mikrolitrów sondy DNA, a następnie kroplę oleju mineralnego i szkiełko nakrywkowe, chromosomy w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Następnie ustaw szkiełka do hybrydyzacji w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 14 godzin. Po ustawieniu hybrydyzacji rygorystyczność myje się przez dwie minuty w temperaturze 42 stopni Celsjusza, a następnie cztery kolejne jednosekundowe aplikacje dwóch XSSC i suszenie. Następnie dwukrotnie nałóż 800 mikrolitrów 0,4 XSSC w 42 stopniach Celsjusza przez 10 minut, a następnie jeszcze jedno pranie i dwa XSSC w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Teraz nałóż plamę na 50 mikrolitrów jo-jo, a następnie olej mineralny i szkiełka nakrywkowe. Inkubuj szkiełka w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie usuń szkiełka nakrywkowe.
Umyj szkiełka w dwóch XSSC cztery razy przez jedną sekundę na pranie i wysusz szkiełka. Na koniec nałóż 15 mikrolitrów przedłużonego złotego odczynnika zapobiegającego blaknięciu na każde szkiełko i przymocuj nowe szkiełka nakrywkowe. Włącz automatyczny system skanowania Accord plus, zaczynając od zasilacza Olympus U-R-F-L-T do żarówki halogenowej.
Potem komputer, a na końcu mikroskop z przystawką do kamery. Teraz najpierw otwórz pakiet oprogramowania duet, skonfiguruj 10-krotne skanowanie wstępne. Kliknij przycisk online, wprowadź nowy identyfikator sprawy i przypisz identyfikator slajdu.
Kliknij kropkę oznaczoną bf. Jest to opcja jasnego pola. Wybierz opcję skanowania, aby 10-krotnie skanować wstępnie.
Wybierz 2 500 x okrąg, 10 000 x okrąg lub prostokąt. Kliknij przycisk ustaw i uruchom. A potem, w porządku, postępuj zgodnie z instrukcjami, aby prawidłowo dostosować skanowanie, a następnie kliknij Zakończ.
Aby rozpocząć skanowanie, naciśnij główną kartę, aby wrócić do ekranu głównego. Teraz kliknij przycisk offline, znajdź identyfikator sprawy i identyfikator slajdu, który został przypisany. I kliknij offline.
Zeskanuj w czarnym polu w lewym górnym rogu. Kliknij strzałkę i wybierz 10 x skanowanie wstępne. Użyj strzałek, aby przejść przez zeskanowane obrazy po znalezieniu interesującego obrazu.
Kliknij dwukrotnie ekran w środku docelowego regionu i naciśnij przyciąganie. Spowoduje to wycelowanie obrazu w celu przechwycenia go później po wybraniu wszystkich celów. Kliknij prawym przyciskiem myszy każdy obraz, kliknij klasyfikuj, wybierz 10 razy skanowanie wstępne i wybierz politan.
Wróć do menu głównego i skonfiguruj 40-krotne skanowanie wstępne. Ponownie wybierz opcję online i wybierz slajd. Zmień BF na ffl i zmień nazwę zadania, aby ponownie odwiedzić dash X 40 dash rg.
Zmień sekcję tuż pod ostatnim ustawieniem, aby ponownie odwiedzić kreskę wszystko. Następnie uruchom program i postępuj zgodnie z instrukcjami. Aby skonfigurować automatyzację, kliknij przycisk Rozpocznij dopasowywanie widoków, aby dopasować obrazy 10 x i 40 x.
Kliknij przycisk Zakończ, aby rozpocząć skanowanie. Po zakończeniu kliknij klasyfikuj i spójrz na obrazy. Preparaty chromosomów politanowych komórek pielęgniarskich jajnika z anomalii żeńskiej Gambii wykonano techniką wysokociśnieniową.
Metoda ta nie uszkadza ani nie zmienia większości struktury chromosomów. Spłaszcza wygięte chromosomy, a tym samym odsłania ukryte drobne prążki, których nie widać w regularnych preparatach. Chromosom badano za pomocą klonów DNA uzyskanych z biblioteki anomalii S Gambia i Tam.
Biblioteka została wygenerowana z samców i samic pierwszej larwy gwiaździstej anomalii szczepu szkodnika S Gambia. Po tej procedurze można przeprowadzić zautomatyzowane mapowanie fizyczne o wysokiej przepustowości w celu ułatwienia szybkiego rozwoju zespołów genomu opartych na chromosomach.
Przegląd
To badanie przedstawia protokół wysokiego przepływu do mapowania sond DNA na chromosomach politan komarów. Wykorzystując preparację chromosomów pod wysokim ciśnieniem i zautomatyzowane techniki obrazowania, metoda poprawia efektywność i spójność opracowywania map fizycznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Genomika
- Mapowanie chromosomów
- Fluorymetryczna hybrydyzacja in situ
Tło
- Zestawy genomów z sekwencjonowania DNA są często fragmentaryczne.
- Fizyczne mapy chromosomów mogą poprawić jakość zestawów genomów.
- Innowacyjne techniki mogą zwiększyć przepływność w mapowaniu fizycznym.
- Zautomatyzowane systemy mogą zmniejszyć czas pracy na procedury laboratoryjne.
Cel badania
- Opracować protokół wysokiego przepływu do mapowania chromosomów.
- Wykazać skuteczność zautomatyzowanego obrazowania w opracowywaniu map fizycznych.
- Poprawić spójność wyników w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Stosowane metody
- Preparacja chromosomów pod wysokim ciśnieniem z jajników komarów.
- Oznaczanie sond fluorymetrycznych za pomocą protokołu Nick translation.
- Zautomatyzowana fluorymetryczna hybrydyzacja in situ.
- Zautomatyzowane obrazowanie do lokalizacji chromosomów.
Główne wyniki
- Protokół produkuje spójne i wysokiej jakości rozmieszczenia chromosomów.
- Systemy zautomatyzowane znacznie zmniejszają czas potrzebny na mapowanie fizyczne.
- Obrazy skutecznie pokazują lokalizacje fluorymetrycznie oznaczonych sond DNA.
- Metoda zwiększa przepływność w porównaniu z protokołami manualnymi.
Wnioski
- Ten protokół wysokiego przepływu jest znaczącym postępem w mapowaniu chromosomów.
- Automatyzacja poprawia efektywność i spójność w mapowaniu fizycznym.
- Demonstrowane techniki mogą być zastosowane do innych badań genomowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput physical chromosome mapping addresses a critical bottleneck in genome assembly quality, directly impacting downstream genomic analyses and evolutionary studies. By enabling rapid, consistent localization of DNA probes, this approach supports de-risking of target validation and improves predictive confidence in comparative genomics workflows. The integration of automation reduces hands-on time and enhances reproducibility, positioning the method as a scalable capability for large-scale sequencing projects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genomic architecture and clarification of gene localization relative to phenotypic traits.
- Operational Value: Reduces ambiguity in gene annotation by assigning contigs to specific chromosomal locations.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by improving confidence in gene function inference through accurate physical mapping.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-resolution chromosome spreads suitable for reproducible FISH-based assays.
- Operational Value: Automated staining and imaging systems increase throughput and reduce variability in probe localization detection.
- Assay Readiness: Generates quantifiable spatial outputs that enable comparison across genetic variants or experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates evolutionary analysis and phylogenetic reconstruction by assigning orientation and location to sequencing contigs.
- Preclinical Model Relevance: Supports vector competence studies by enabling comparative genomics in disease-transmitting versus non-transmitting species.
- Risk-Adjusted Advancement: Improves genome annotation quality, reducing false positives in target identification pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early genome sequencing through annotation and comparative analysis, particularly when physical map resolution is needed to resolve assembly gaps or misassemblies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding gene order, synteny, and chromosomal evolution in disease-relevant models.
- Screening: Enables standardized, automated FISH workflows for high-throughput probe validation and localization screening.
- Analytics: Generates spatial and intensity-based readouts that allow quantitative comparison of probe binding across chromosomes or samples.
- Translational Research: Connects physical mapping to evolutionary inference and biomarker discovery in comparative genomics studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for physical mapping applicable across multiple species and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene annotation and reduces mechanistic ambiguity in genomic data interpretation.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through automation of staining, hybridization, and imaging steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target selection by enhancing genome assembly reliability and reducing biological false leads.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genomic targets through improved assembly quality and evolutionary insight.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromosome preparation, FISH protocols, and automated imaging systems.
- Dependent on access to high-pressure preparation tools, automated slide stainers, and motorized fluorescence microscopes.
- Necessitates cross-team standardization for probe labeling, hybridization conditions, and image analysis pipelines.
- Adaptation across model systems may require optimization of chromosome spreading and denaturation steps.
- Practical limitations include dependency on high-quality polytene chromosomes and suitability primarily for dipteran genomes with polytene stages.
