Name: Wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów przy użyciu zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów komarów przy użyciu zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ. Ta metoda zwiększa wydajność i spójność wyników w genomice.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana grantem National Institutes of Health 1R21AI094289 przyznanym Igorowi V. Sharakhovowi. Zautomatyzowany system barwienia preparatów Xmatrx oraz zautomatyzowany system skanowania ACCORD PLUS zostały zakupione dzięki programowi Equipment Trust Fund, Fralin Life Science Institute, Katedrze Entomologii oraz Katedrze Biochemii Virginia Tech.

1. Przygotowanie politenicznych chromosomów z komórek pielęgnacyjnych jajnika metodą wysokociśnieniową
<ol>
	<li>Przeprowadź sekcję samic Anopheles w połowie stanu gravidności 25 godzin po pobraniu krwi pod mikroskopem sekcyjnym i utrwal jajniki w świeżym zmodyfikowanym roztworze Carnoya z metanolem (100% metanol: kwas octowy lodowaty, 3:1). Na tym etapie jajniki znajdują się w III stadium rozwoju według Christophersa, w którym pęcherzyki mają kształt owalny, a przezroczysty obszar z komórkami pielęgnującymi wewnątrz pęcherzyków ma kształt okrągły13. Umieść jajniki z około pięciu samic w 500 μl zmodyfikowanego roztworu Carnoya w probówce Eppendorf 1,5 ml i przechowuj w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Przenieś jajniki do temperatury -20 °C w celu długoterminowego przechowywania.</li>
	<li>Przygotuj zmodyfikowany roztwór Carnoya z etanolem (100% etanol: kwas octowy lodowaty, 3:1) oraz 50% kwas propionowy bezpośrednio przed przygotowaniem preparatów. Umieść jedną parę jajników na bezpyłowym szkiełku w jednej kropli zmodyfikowanego roztworu Carnoya. Podziel jajniki na około 6 sekcji za pomocą igieł sekcyjnych i umieść je w kroplach 50% kwasu propionowego na czystych szkiełkach pod stereomikroskopem MZ6 Leica. Użyj oddzielnego szkiełka dla każdej sekcji.</li>
	<li>Oddziel pęcherzyki za pomocą igieł i usuń pozostałą tkankę papierem filtracyjnym lub ręcznikiem papierowym pod mikroskopem sekcyjnym. Dodaj nową kroplę 50% kwasu propionowego do pęcherzyków i pozostaw je na 3-5 minut w temperaturze pokojowej. Nałóż szkiełko nakrywkowe na kroplę 50% kwasu propionowego. Pozostaw preparat na około 1 minutę.</li>
	<li>Owiń szkiełko papierem filtracyjnym i folią. Używając narzędzia rotacyjnego Dremel 200 z przystawką Flex-Shaft i miękką plastikową końcówką ustawioną na 3000-5000 RPM, rozgnieć pęcherzyki, wykonując okrężne ruchy końcówką i lekko naciskając szkiełko nakrywkowe, aby równomiernie rozprowadzić jądra. Ten krok powinien trwać około 1 minuty. Sprawdź jakość rozprzestrzenienia pod mikroskopem fazowym Olympus CX41 z obiektywem 20x.</li>
	<li>Przygotuj tzw. kanapkę, kładąc dodatkowe szkiełko nakrywkowe obok szkiełka nakrywającego chromosomy, a następnie przykryj je drugim szkiełkiem przedmiotowym. Zmniejsza to ryzyko zmiażdżenia szkiełka w imadle. Owiń szkiełka folią plastikową (dołączaną do pojemników na szkiełka) i papierem filtracyjnym, aby utrzymać konstrukcję i chronić szkiełko przed porysowaniem przez imadło.</li>
	<li>Wywrzyj nacisk na szkiełka za pomocą imadła mechanicznego. Wystarczający nacisk wynosi 85-120 inch-lbs i jest osiągany przy użyciu klucza dynamometrycznego. Krok ten jest niezbędny do maksymalnego spłaszczenia chromosomów.</li>
	<li>Usuń drugie szkiełko przedmiotowe oraz dodatkowe szkiełko nakrywkowe. Podgrzej szkiełko z nakrywką chroniącą chromosomy do 55 °C w systemie do denaturacji/hybrydyzacji szkiełek przez 10-15 minut, aby dodatkowo spłaszczyć chromosomy. Zanurz szkiełko w ciekłym azocie na co najmniej 15 sekund, a gdy ustanie bulgotanie, szybko usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki. Natychmiast umieść szkiełka w zimnym 50% etanolu na 5 minut. Odwodnij szkiełka w 70%, 90% i 100% etanolu przez 5 minut w każdym roztworze. Osusz szkiełka na powietrzu.</li>
</ol>
2. FISH przy użyciu zautomatyzowanego systemu barwienia preparatów
Program został skonfigurowany w automatycznym systemie barwienia preparatów Xmatrx w celu przeprowadzenia następujących etapów, z wyjątkiem znakowania sondy. Szczegółowy protokół znakowania metodą translacji nacięć (nick-translation) opisano w dokumentacji dołączonej do polimerazy DNA firmy Fermentas.
<ol>
	<li>Przed przeprowadzeniem FISH należy przygotować sondy fluorescencyjne poprzez znakowanie genomowego DNA z BAC fluorochromem przy użyciu protokołu translacji nacięć (nick-translation). Wymieszać 1 μg DNA, po 0,05 mM nieznakowanych dATP, dCTP i dGTP oraz 0,015 mM dTTP, 1 μl Cy3- lub Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml BSA, 5 μl 10x buforu do translacji nacięć, 20 jednostek polimerazy DNA I, 0,0012 jednostek DNazy I i uzupełnić wodą wolną od nukleaz do objętości 25 μl. Stosunek polimerazy DNA I do DNazy I dobiera się empirycznie, aby uzyskać sondy o wielkości od 300 do 500 bp. Mieszaninę inkubować w temperaturze 15 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przełożyć preparaty i odczynniki do zautomatyzowanego systemu barwienia preparatów Xmatrx i uruchomić program w celu wykonania następujących kroków. Nanieść 800 μl 1x PBS na 20 min. Osuszyć preparaty strumieniem powietrza. Przeprowadzić fiksację formaliną, nanosząc 450 μl 4% formaliny w 1x PBS przez 1 min, a następnie przemyć 100% etanolem dwukrotnie przez 1 s i raz przez 2 min. Osuszyć preparaty strumieniem powietrza.</li>
	<li>Podgrzać preparaty w temperaturze 45 °C przez 2 min, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza podczas nakładania sond. Nanieść 20 μl sond DNA, dodać krople oleju mineralnego, aby zapobiec odparowaniu roztworu hybrydyzacyjnego, i nałożyć szkiełko zakrywkowe. Zdenaturować chromosomy i sondy DNA, podgrzewając preparaty w temperaturze 90 °C przez 10 min.</li>
	<li>W celu hybrydyzacji inkubować preparaty w temperaturze 42 °C przez 14 godzin z nałożonymi szkiełkami zakrywowymi. Roztwór hybrydyzacyjny składa się z 2x SSC, 100 mM fosforanu sodu, 1x roztworu Denhardta, 100 μg/ml azotku sodu i 10% siarczanu dekstranu w formamidzie.</li>
	<li>W celu przeprowadzenia przemywań stringencyjnych podgrzać preparaty w temperaturze 42 °C przez 2 min, zdjąć szkiełka zakrywowe i przemyć preparaty w 2x SSC przez 1 s (4 razy). Osuszyć preparaty strumieniem powietrza. Nanieść 800 μl 0,4x SSC w temperaturze 42 °C przez 10 min (2 razy). Przemyć preparaty w 2x SSC w temperaturze 25 °C przez 10 min.</li>
	<li>Przeprowadzić barwienie chromosomów, nanosząc 50 μl 1 μM YOYO-1 w 1x PBS. Dodać krople oleju mineralnego, aby zapobiec odparowaniu roztworu barwiącego, nałożyć szkiełka zakrywowe i inkubować w temperaturze 25 °C przez 10 min. Zdjąć szkiełka zakrywowe i przemyć preparaty w 2x SSC przez 1 s (4 razy). Osuszyć preparaty strumieniem powietrza. Nanieść 15 μl odczynnika antyblaknącego ProLong Gold. Nałożyć szkiełka zakrywowe.</li>
</ol>
3. Odczyt preparatów za pomocą automatycznego systemu obrazowania fluorescencyjnego
W tej sekcji szczegółowo opisano użytkowanie oprogramowania Duet, które jest standardowym elementem zautomatyzowanego systemu skanowania ACCORD PLUS. Instrukcje rozpoczynają się po włączeniu urządzeń w następującej kolejności: zasilacza Olympus U-RFL-T dla żarówki halogenowej, komputera Dell precision T3500 oraz mikroskopu Olympus BX61 z podłączoną kamerą Olympus U-CMAD3.
<ol>
	<li>Aby skonfigurować wstępne skanowanie 10x (10x Pre-Scan), otwórz oprogramowanie Duet w zautomatyzowanym systemie skanowania ACCORD PLUS. Kliknij przycisk „Online”. Wprowadź nowy Case ID i przypisz Slide ID. Kliknij kropkę oznaczoną jako „BF” (opcja jasnego pola). Ustaw wybór skanowania na „10x Prescan”. Wybierz „2500x circle”, „10000x circle” lub „rectangle”. Kliknij „Set&amp;run”, aby uruchomić 10x Pre-Scan.</li>
	<li>Kliknij przycisk „OK”, aby rozpocząć 10x Pre-Scan. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby odpowiednio dostosować skanowanie. Kliknij „Finish”, aby rozpocząć skanowanie. Przejdź do karty „Main”, aby powrócić do ekranu głównego. Kliknij przycisk „Offline”. Znajdź przypisany Case ID oraz Slide ID i kliknij „Offline Scan”. W czarnym polu w lewym górnym obszarze kliknij strzałkę i wybierz „10x Prescan”. Używając strzałek (&lt; || Δ &gt;, czyli przycisków „wstecz”, „pauza”, „odtwarzaj”, „dalej”), przejrzyj zeskanowane obrazy.</li>
	<li>Po znalezieniu interesującego obrazu dwukrotnie kliknij na ekranie w środku docelowego obszaru i naciśnij „Snap”. Pozwoli to wyznaczyć obraz do późniejszego przechwycenia. Po wybraniu wszystkich celów kliknij „Classify”. Wybierz „10x Prescan”. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obraz, aby przejść do klasyfikacji obrazów. Wybierz „Polytene”.</li>
	<li>Skonfiguruj wstępne skanowanie 40x w oprogramowaniu Duet. Kliknij „Main”, aby powrócić do menu głównego. Ponownie wybierz „Online”. Wybierz preparat. Zmień „BF” na „FL”. Zmień nazwę zadania na „Revisit-X40-RG”. Zmień sekcję znajdującą się bezpośrednio pod ostatnim ustawieniem na „Revisit-ALL”. Kliknij „Set&amp;Run”. Naciśnij „OK”. Ponownie postępuj zgodnie z instrukcjami, aby skonfigurować automatyzację. Kliknij przycisk „Start matching views”, aby dopasować obrazy 10x i 40x. Kliknij „Finish”, aby rozpocząć skanowanie. Po zakończeniu kliknij „Classify” i przejrzyj obrazy.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia graficznie schemat przygotowania chromosomów pod wysokim ciśnieniem. Krok ten obejmuje proces zgniatania i spłaszczania chromosomów przy użyciu narzędzia Dremel oraz imadła mechanicznego, a także wizualizację chromosomów za pomocą mikroskopu fazowo-kontrastowego. Rysunek 2 ilustruje hybrydyzację fluorescencyjnie znakowanej sondy z docelowym DNA na preparatach chromosomów na szkiełkach przy użyciu automatycznego systemu barwienia szkiełek, wykorzystanie automatycznego mikroskopu skanującego do wizualizacji i mapowania sond po eksperymencie FISH oraz rozmieszczanie i orientowanie rusztowań genomicznych na chromosomach.
Preparaty chromosomów politenicznych komórek pielęgnowych jajnika samic An. gambiae wykonano przy użyciu techniki wysokociśnieniowej. Metoda ta nie uszkadza ani nie zmienia większości struktury chromosomów (Rycina 3). Pozwala ona na spłaszczenie zgiętych chromosomów, a tym samym ujawnia ukryte, cienkie prążki, które nie są widoczne w standardowych preparatach (Rycina 4).
Sondy wykorzystane w tym protokole to genomowe klony DNA BAC pochodzące z biblioteki ND-TAM BAC wygenerowanej z DNA szczepu PEST An. gambiae. DNA genomowe do tej biblioteki zostało wyekstrahowane z nowo wyklutych larw pierwszego stadium obu płci. Rysunek 5 przedstawia wyniki FISH z użyciem klonów BAC hybrydyzowanych z chromosomami politenicznymi An. gambiae. Procedura ta została przeprowadzona przy użyciu zautomatyzowanego systemu barwienia preparatów Xmatrx. Korzystając z cytogenetycznej fotomapy dla An. gambiae10, dwa klony BAC, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) oraz BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), zostały zlokalizowane odpowiednio w podregionach 16C i 16D ramienia 2R. Jednakże wyszukiwanie BLAST w zestawieniu AgamP3 szczepu PEST An. gambiae 14 zidentyfikowało sekwencje homologiczne do 102B24 i 142O19 odpowiednio w podregionach 16B i 17A ramienia 2R (Tabela 1). W związku z tym odpowiedniość między współrzędnymi genomowymi a podregionami cytogenetycznymi może zostać teraz skorygowana zgodnie z naszymi danymi mapowania. Wyszukiwanie BLAST w zestawieniach genomów formy M i formy S An. gambiae wykazało, że dwa klony BAC znajdują się w różnych kontigach, ale w tych samych scaffoldach w obrębie każdej formy (Tabela 1). Zidentyfikowane kontigi można teraz powiązać z konkretnymi lokalizacjami chromosomowymi. Ponadto zidentyfikowane scaffoldy mogą zostać teraz prawidłowo zorientowane w obrębie podregionów cytologicznych 16CD. Co ciekawe, odległości między sekwencjami 102B24 a 142O19 w scaffoldach wynoszą odpowiednio 1 892 981 bp, 1 658 391 bp i 1 688 426 bp w zestawieniach genomów szczepu PEST, formy M i formy S. Ponieważ szczep PEST jest hybrydą form M i S, różnica ta wynika prawdopodobnie z błędnego zestawienia genomu PEST.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BAC 
			(numer akcesyjny)</td>
			<td>szczep PEST 
			AgamP3 
			 
			Współrzędne</td>
			<td>forma M 
			kontigi 
			 
			Współrzędne</td>
			<td>forma M 
			rusztowania 
			 
			Współrzędne</td>
			<td>forma S 
			kontigi 
			 
			Współrzędne</td>
			<td>formularz S 
			rusztowania 
			 
			Współrzędne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>102B24 
			(BH372694)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8844_26 (16B) 
			 
			43,681,342- 
			43,681,874</td>
			<td>ABKP020247 
			53.1 
			 
			32,513- 
			33,045</td>
			<td>EQ090167.1 
			 
			1,858,377- 
			1,858,909</td>
			<td>ABKQ010123 
			32.1 
			 
			4,299- 
			4,832</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			215,891- 
			216,424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>102B24 
			(BH372701)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8844_28 (16B) 
			 
			43,788,213- 
			43,788,969</td>
			<td>ABKP020247 
			51.1 
			 
			24,816- 
			25,575</td>
			<td>EQ090167.1, 
			 
			1,772,683- 
			1,773,442</td>
			<td>ABKQ010123 
			35.1 
			 
			27,782- 
			28,540</td>
			<td>EQ099711.1, 
			 
			305,514- 
			306,272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>142O19 
			(BH368698)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			 
			8805_5 (17A) 
			45,428,580- 
			45,429,264</td>
			<td>ABKP020247 
			01.1 
			 
			2,499- 
			3,185</td>
			<td>EQ090167.1 
			 
			315,806- 
			316,492</td>
			<td>ABKQ010123 
			76.1 
			 
			49,242- 
			49,942</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			1,791,625- 
			1,792,325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>142O19 
			(BH368703)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8805_8 (17A) 
			 
			45,560,099- 
			45,574,323</td>
			<td>ABKP020220 
			17.1 
			 
			30,971- 
			32,469</td>
			<td>EQ090167.1 
			200,518- 
			202,016</td>
			<td>ABKQ010123 
			79.1 
			 
			27,760- 
			28,508</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			1,903,569- 
			1,904,317</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Wyniki BLAST sekwencji końców BAC w odniesieniu do asemblacji genomu An. gambiae.
<img alt="Disekcja jajnika komara; mikroskop stereoskopowy; preparatyka chromosomów; mikroskopia fazowo-kontrastowa." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie preparatyki chromosomów metodą wysokiego ciśnienia. Przedstawiono jajniki komara na odpowiednim etapie rozwoju.
<img alt="Znakowanie sond do mapowania chromosomów z wykorzystaniem automatycznej hybrydyzacji preparatów i mikroskopu skanującego." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat przedstawiający automatyczną technikę FISH, skanowanie preparatów oraz mapowanie chromosomowe rusztowań genomowych.
<img alt="Struktura chromosomów politenicznych, obraz mikroskopowy, analiza wzoru prążkowania DNA, badania genetyczne." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Preparat chromosomu politenicznego 3 An. gambiae uzyskany za pomocą techniki wysokociśnieniowej. 3L i 3R oznaczają odpowiednio lewe i prawe ramię w obrębie telomerów. PH i IH wskazują odpowiednio na heterochromatynę pericentryczną i interkalarnej.
<img alt="Obraz mikroskopowy porównujący wzory prążkowania chromosomów 3R/3L pod różnym ciśnieniem." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Porównanie chromosomów politenicznych An. gambiae przygotowanych przy użyciu tradycyjnej (góra) i wysokociśnieniowej (dół) techniki. Obrazy obejmują podziały 29A-30E ramienia 3R (A) oraz 43D-46D ramienia 3L (B).
<img alt="Diagram mapowania chromosomów, markerów fluorescencyjnych i loci genetycznych w chromosomach politenicznych Drosophila." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. FISH klonów BAC na chromosomach politenicznych An. gambiae. A) Hybrydyzacja 102B24 (sygnał czerwony) z ramieniem 2R. B) Dwukolorowy FISH 102B24 (sygnał czerwony) i 142O19 (sygnał niebieski) odpowiednio do podziałów 16C i 16D rozciągniętego ramienia 2R. Strzałki wskazują sygnały hybrydyzacji klonów BAC znakowanych Cy3 (czerwony) i Cy5 (niebieski). C – region centromeryczny. a/+ oznacza heterozygotę dla inwersji 2La. Chromosomy przeciwbarwiono fluorophorem YOYO-1.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+10K%3A+a+proposal+to+obtain+whole-genome+sequence+for+10%2C000+vertebrate+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hered%22%5BJournal%5D)">Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species.</a> J. Hered. 100, 659-674 (2009).</li>
<li>Robinson, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+Buzz+About+Insect+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Creating a Buzz About Insect Genomes.</a> Science. 331, 1386-1386 (2011).</li>
<li>Project description at Broad Institute [Internet]. , The Eli and Edythe L. Broad Institute of Harvard and MIT. Cambridge, MA. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/">http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/</a> (2012).</li>
<li>Besansky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Analysis+Of+Vectorial+Capacity+In+Major+Anopheles+Vectors+Of+Malaria+Parasites%5BTitle%5D)+AND+%22White+Paper%22%5BJournal%5D)">Genome Analysis Of Vectorial Capacity In Major Anopheles Vectors Of Malaria Parasites.</a> White Paper. , 1-15 (2008).</li>
<li>Alkan, C., Sajjadian, S., Eichler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+next-generation+genome+sequence+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Limitations of next-generation genome sequence assembly.</a> Nature. 8, 61-65 (2011).</li>
<li>Sharakhova, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+Anopheles+gambiae+PEST+genome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly.</a> Genome Biol. 8, R5(2007).</li>
<li>Lewin, H. A., Larkin, D. M., Pontius, J., O'Brien, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Every+genome+sequence+needs+a+good+map%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Every genome sequence needs a good map.</a> Genome Res. 19, 1925-1928 (2009).</li>
<li>Bhutkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+rearrangement+inferred+from+comparisons+of+12+Drosophila+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosomal rearrangement inferred from comparisons of 12 Drosophila genomes.</a> Genetics. 179, 1657-1680 (2008).</li>
<li>Novikov, D., Kireev, I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+treatment+of+polytene+chromosomes+improves+structural+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution.</a> Nature. 4, 483-485 (2007).</li>
<li>George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+cytogenetic+map+for+the+African+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution cytogenetic map for the African malaria vector Anopheles gambiae.</a> Insect Mol. Biol. 19, 675-682 (2010).</li>
<li>FISH Complete Automation [Internet]. , Abbott Laboratories. Abbott Park, IL. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html">http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html</a> (2012).</li>
<li>The ACCORD system [Internet]. , BioView Ltd. Billerica, MA. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332">http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332</a> (2012).</li>
<li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClements%2C+AN+%22The+Biology+of+Mosquitoes%3A+Development%2C+Nutrition+and+Reproduction%22">The Biology of Mosquitoes: Development, Nutrition and Reproduction</a>. , Chapman & Hall. (1992).</li>
<li>BLAST @ VectorBase.org [Internet]. , VectorBase.org. Notre Dame, IN. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/">http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/</a> (2012).</li>
<li>Sharakhova, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs--a+new+source+of+chromosomes+for+genome+mapping+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e10(2011).</li>
<li>Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+for+Pre-implantation+Genetic+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (48), e2570(2011).</li>
<li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Drosophila+Polytene+Chromosome+Squashes+for+Antibody+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling.</a> J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).</li>
<li>Vatolina, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Identical+Functional+Organization+of+Nonpolytene+and+Polytene+Chromosomes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Kluczowym etapem procedury wysokociśnieniowej jest prawidłowe rozgniecenie komórek pielęgnujących jajnika wyizolowanych w stadium III według Christophersa rozwoju jajnika13. Nieprawidłowe rozgniecenie może prowadzić do niewystarczającego rozprzestrzenienia chromosomów, co może powodować problemy podczas próby określenia lokalizacji sond po FISH. Jeśli chromosomy zostaną nadmiernie rozgniecione, mogą ulec pęknięciu lub wydłużeniu do stopnia, w którym wzory prążkowania zostaną utracone. Przygotowanie wielu szkiełek powinno prowadzić do uzyskania powtarzalności podczas rozgniatania preparatów za pomocą narzędzia Dremel, co zwiększy ogólną wydajność przygotowania szkiełek. Technika wysokociśnieniowa została opracowana pierwotnie dla świeżo wyizolowanych gruczołów ślinowych D. melanogaster9. Jednak jajniki komarów są rutynowo konserwowane w zmodyfikowanym roztworze utrwalającym Carnoy'a (3 części metanolu : 1 część lodowatego kwasu octowego objętościowo) przed użyciem ich do preparacji chromosomowych. Dlatego zmodyfikowaliśmy istniejący protokół wysokociśnieniowy, aby dostosować go do utrwalonych politenicznych chromosomów komórek pielęgnujących jajnika komara malarycznego An. gambiae. Ponieważ wysokie ciśnienie jest przykładane za pomocą precyzyjnego imadła posiadającego wysoce równoległą powierzchnię roboczą na całej długości szkiełka, przygotowanie rozgniecenia chromosomów zajmuje znacznie mniej czasu niż przy zastosowaniu tradycyjnej techniki opukiwania gumką ołówka.
Inne ważne kroki obejmują wystarczające namoczenie mieszków w 50% kwasie propionowym oraz podgrzanie szkiełka. Oba te etapy są niezbędne, aby pomóc w spłaszczeniu chromosomów. Jeśli zostaną pominięte, chromosomy mogą wydawać się błyszczące po odwodnieniu, co potencjalnie prowadzi do nadmiernego tła, które może zostać pomylone z sygnałem w FISH. Technika zgniatania pod wysokim ciśnieniem sprawdza się również przy użyciu tych samych roztworów podczas przygotowywania preparatów chromosomów mitotycznych. Dodatkowe rozprzestrzenianie i spłaszczanie pomaga w lepszym uwolnieniu chromosomów z jąder komórkowych. Przyłożenie równomiernego nacisku powinno odpowiednio je spłaszczyć, co umożliwi pomiary i potencjalnie lepszą rozdzielczość prążków widocznych po barwieniu. Szczegóły dotyczące izolacji chromosomów mitotycznych z komarów podano w innym opracowaniu15. Chociaż zwykłe preparaty zgniatane są wystarczające dla wielu celów, w tym dla FISH 16 i immunostainingu17, metoda wysokociśnieniowa nie tylko zmniejsza potencjalną zmienność między poszczególnymi szkiełkami, ale także zwiększa ogólną jakość chromosomów, co pozwala na uzyskanie większej szczegółowości podczas mapowania chromosomów. Procedurę tę można również wykorzystać do przygotowania szkiełek z błoną chromosomów politenicznych do mikrodissekcji laserowej.
Ograniczenia metody wysokociśnieniowej obejmują pękanie szkiełek oraz nadmierne rozciągnięcie chromosomów. Możliwe jest pęknięcie szkiełka spowodowane zbyt dużym naciskiem ścisku, jednak stosowanie ciśnień określonych w artykule ogranicza to ryzyko. W przypadku nadmiernego rozciągnięcia chromosomów, zbyt długie stosowanie narzędzia Dremel na szkiełku może doprowadzić do ich nadmiernego rozciągnięcia i utraty rozdzielczości. Można temu zaradzić, stosując narzędzie przez krótki czas, sprawdzając efekt pod mikroskopem i wydłużając czas pracy narzędziem Dremel, jeśli chromosomy nie są wystarczająco rozprzestrzenione.
Tradycyjny protokół FISH obejmuje szereg etapów płukania i inkubacji, które zazwyczaj trwają od 5 do 20 min i wymagają niemal pełnej uwagi badacza przez cały czas trwania eksperymentu. Co więcej, liczba preparatów, które można opracować ręcznie, jest zazwyczaj ograniczona do kilku slajdów w ramach jednego eksperymentu. W przeciwieństwie do tego, zautomatyzowany system barwienia preparatów wykonuje wszystkie kroki (w tym płukanie, inkubację, aplikację sondy, denaturację, hybrydyzację, nakładanie i usuwanie szkiełek zakrywek) automatycznie. Pozwala to badaczowi odzyskać do 6-8 godzin pracy podczas eksperymentu FISH. Ponadto zautomatyzowany system FISH może znacznie zwiększyć przepustowość. Na przykład system Xmatrx jest w stanie przetwarzać jednocześnie do 40 testów na slajdach z pojedynczym preparatem i do 80 testów na slajdach z podwójnym preparatem. Do ograniczeń tego systemu należy fakt, że nie jest on wydajny przy niewielkiej liczbie eksperymentów FISH, ponieważ wymaga przygotowania dużych objętości roztworów. Dodatkowo protokół FISH zaprogramowany w systemie może wymagać modyfikacji i dostosowań dla nowych zastosowań.
System skanowania preparatów jest zautomatyzowaną wersją mikroskopu fluorescencyjnego. Zautomatyzowany ruch stolika oraz prosty panel sterowania mikroskopem oszczędzają czas badacza i sprawiają, że obsługa urządzenia jest niezwykle prosta. Na przykład oprogramowanie w systemie skanowania ACCORD PLUS umożliwia łatwe rejestrowanie wielu kanałów fluorescencji oraz sprawne zarządzanie akwizycją obrazów. Przykładem jest funkcja rejestrowania stosu obrazów w osi z (z-stack) zamiast pojedynczego zdjęcia; oprogramowanie wykonuje konfigurowalny stos obrazów, aby zapewnić, że przynajmniej jedna z nich pozostanie w ostrości. Choć system ten jest przeznaczony przede wszystkim do akwizycji wielu obrazów (duża liczba komórek na jednym preparacie), wciąż znacznie ułatwia on lokalizowanie chromosomów na szkiełku w porównaniu z ręcznym przeszukiwaniem preparatu.
Zarówno zautomatyzowany system barwienia preparatów, jak i system skanujący są rutynowo wykorzystywane przez kliniki cytogenetyczne do diagnostyki FISH w kierunku nieprawidłowości chromosomowych w komórkach ludzkich. W niniejszym badaniu opracowaliśmy protokół, który wykorzystuje te zautomatyzowane systemy w zastosowaniach badawczych. Zautomatyzowany protokół wysokoprzepustowego mapowania fizycznego może ułatwić szybkie opracowanie fizycznych map chromosomów dla dowolnego gatunku. Choć w niniejszym raporcie do mapowania fizycznego wykorzystaliśmy chromosomy politeniczne, systemy te mogą być również stosowane do chromosomów mitotycznych. Dostosowanie protokołu do chromosomów mitotycznych byłoby przydatne, ponieważ większość organizmów nie wytwarza czytelnych chromosomów politenicznych. Jednakże chromosomy politeniczne, gdy są dostępne, mogą dostarczyć cennych informacji na temat odpowiedniości funkcjonalnych domen genomu do struktury chromosomu z najwyższą rozdzielczością. Zasady organizacji chromosomów politenicznych, takie jak wzory prążków i międzyprążków, zostały niedawno przyrównane do organizacji zwykłych chromosomów niepolitenicznych (interfazowych)18. W związku z tym szczegółowe mapowanie fizyczne przeprowadzone na preparatach chromosomów wysokociśnieniowych ma potencjał do powiązania sekwencji DNA z konkretnymi strukturami chromosomowymi, takimi jak prążki, międzyprążki, pufy, centromery, telomery i heterochromatyna, co pozwala na tworzenie asemblacji genomu w oparciu o chromosomy.

<table><tbody><tr><td>szkiełka nakrywkowe do mikroskopu 22x22 mm</td><td>Fisher</td><td>12-544-10</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe do mikroskopu 18x18 mm</td><td>Fisher</td><td>12-553-402</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propionowy </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>narzędzie rotacyjne Dremel 200 z przystawką Flex-Shaft</td><td>Rand</td><td></td><td>3&quot; Wielozadaniowa mini szlifierka stołowa (z ogranicznikiem prędkości)</td></tr><tr><td>Specjalnie zaprojektowane 200 &amp;mu;plastikowe końcówki (z koralikowymi krawędziami) do narzędzia Dremel</td><td>Pipetman</td><td>F171300</td><td>Odciąć i podgrzać końcówki końcówek pipetujących</td></tr><tr><td>Szybki imadło z powłoką cynową</td><td>Avenger Gold Toolmaker</td><td>MTC-200-1</td><td>Precyzyjnie szlifowany kątownik i klocki pomiarowe z dokładnością do 0,00025</td></tr><tr><td>Klucz dynamometryczny</td><td>Rzemieślnik</td><td>44593</td><td></td></tr><tr><td>System do denaturacji i hybrydyzacji szkiełek ThermoBrite</td><td>Abbott Molecular</td><td>30-144110</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka z komorką 25 mm</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT108-SL</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe 25 mm</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT122-90X</td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowany system barwienia preparatów Xmatrx</td><td>Abbott Molecular</td><td>08L46-001</td><td></td></tr><tr><td>stereomikroskop Leica MZ6</td><td>Leica</td><td>VA-OM-E194-354</td><td>Można użyć innego stereomikroskopu</td></tr><tr><td>mikroskop fazowy Olympus CX41</td><td>Olympus</td><td>CX41RF-5</td><td>Można użyć innego mikroskopu fazowego</td></tr><tr><td>Zautomatyzowany system skanowania ACCORD PLUS</td><td>BioView (USA)</td><td>BV-5000-ACCP</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>10% NBF (neutralnie buforowana formalina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>99% formamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu sodowy</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>bufor 20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9765</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>50-krotny roztwór Denhardta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>Azotek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>roztwór 1 mM jodku YOYO-1 (491/509) w DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>odczyn antyblaknący ProLong Gold </td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Fermentas</td><td>R0141, R0151, R0161, R0171</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022, PA55022</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA I</td><td>Fermentas</td><td>EP0041</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I </td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów z wykorzystaniem zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Przewiduje się, że w ciągu najbliższych 5 lat zostaną zrealizowane projekty mające na celu uzyskanie sekwencji całych genomów dla 10 000 gatunków kręgowców1 oraz 5 000 gatunków owadów i spokrewnionych stawonogów2. Przykładowo, sekwencjonowanie genomów 15 gatunków komarów przenoszących malarię jest obecnie przeprowadzane z wykorzystaniem platformy Illumina3,4. Ta grupa gatunków z rodzaju Anopheles obejmuje zarówno wektory, jak i gatunki niewektorowe malarii. Gdy złożenia genomów staną się dostępne, badacze zyskają wyjątkową możliwość przeprowadzenia analiz porównawczych w celu wnioskowania o zmianach ewolucyjnych istotnych dla zdolności wektorskich. Okazało się jednak trudne wykorzystanie odczytów z sekwencjonowania nowej generacji do generowania wysokiej jakości złożeń genomów de novo5. Co więcej, istniejące złożenia genomu dla Anopheles gambiae, mimo że zostały uzyskane metodą Sangera, posiadają luki lub są pofragmentowane4,6.
Sukces analiz porównawczych genomów będzie ograniczony, jeśli badacze będą operować na licznych kontigach sekwencyjnych, a nie na zestawieniach genomów opartych na chromosomach. Pofragmentowane, niezmapowane sekwencje stwarzają problemy w analizach genomicznych, ponieważ: (i) niezidentyfikowane luki powodują błędną lub niepełną adnotację sekwencji genomicznych; (ii) niezmapowane sekwencje prowadzą do pomylenia genów paralogicznych z genami z różnych haplotypów; oraz (iii) brak przypisania do chromosomów i orientacji kontigów sekwencyjnych uniemożliwia rekonstrukcję filogenezy rearanżacji oraz badanie ewolucji chromosomów. Opracowanie wysokorozdzielczych map fizycznych dla gatunków z nowo zsekwencjonowanymi genomami jest aktualną i kosztowo efektywną inwestycją, która ułatwi adnotację genomu, analizy ewolucyjne oraz resekwencjonowanie pojedynczych genomów z populacji naturalnych7,8.
W niniejszej pracy przedstawiamy innowacyjne podejścia do przygotowania chromosomów, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) oraz obrazowania, które ułatwiają szybkie opracowywanie map fizycznych. Na przykładzie An. gambiae wykazujemy, że opracowanie fizycznych map chromosomowych może potencjalnie usprawnić składanie genomów, a tym samym podnieść jakość analiz genomicznych. Po pierwsze, stosujemy metodę wysokociśnieniową do przygotowania preparatów chromosomów politenicznych. Metoda ta, opracowana pierwotnie dla Drosophila9, pozwala na wizualizację większej liczby szczegółów na chromosomach niż standardowa technika rozgniatania10. Po drugie, do wysokoprzepustowego fizycznego mapowania genomu wykorzystuje się w pełni zautomatyzowany system front-end do FISH. Zautomatyzowany system barwienia szkiełek umożliwia jednoczesne przeprowadzanie wielu analiz i drastycznie skraca czas pracy manualnej11. Po trzecie, automatyczny system obrazowania fluorescencyjnego, obejmujący zmotoryzowany stolik do szkiełek, automatycznie skanuje i fotografuje znakowane chromosomy po FISH12. System ten jest szczególnie użyteczny przy identyfikacji i wizualizacji wielu preparatów chromosomowych na tym samym szkiełku. Dodatkowo proces skanowania pozwala na uzyskanie bardziej jednolitych wyników FISH. Podsumowując, zautomatyzowany protokół wysokoprzepustowego mapowania fizycznego jest bardziej wydajny niż standardowy protokół manualny.

Zespoły genomowe oparte na technologiach masowego równoległego sekwencjonowania DNA są zazwyczaj silnie pofragmentowane. Opracowanie fizycznych map chromosomowych może potencjalnie usprawnić składanie genomów. W niniejszej pracy prezentujemy innowacyjne podejścia do przygotowania chromosomów, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz obrazowania, które znacząco zwiększają wydajność tworzenia map fizycznych.

Wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów z wykorzystaniem zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ

Projektów mających na celu uzyskanie sekwencji całogenomowych dla 10 000 gatunków kręgowców1 oraz dla 5 000 gatunków owadów i spokrewnionych stawonogów2 oczekuje się, że zostaną one przeprowadzone ...

Ogólnym celem tej procedury jest mapowanie sond DNA na politenicznych chromosomach komara z wykorzystaniem preparatyki chromosomów pod wysokim ciśnieniem, a następnie zautomatyzowanej hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ oraz zautomatyzowanego obrazowania. Cel ten osiąga się poprzez wstępne przygotowanie preparatów chromosomów politenicznych metodą wysokociśnieniową. Kolejnym krokiem procedury jest przygotowanie sond fluorescencyjnych poprzez znakowanie genomicznego DNA bakteryjnego fluorochromem z wykorzystaniem protokołu translacji nacięć (Nick translation).Trzecim krokiem jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej przy użyciu zautomatyzowanych systemów barwienia preparatów. Ostatnim etapem jest skanowanie i fotografowanie znakowanych chromosomów za pomocą automatycznego systemu obrazowania fluorescencyjnego. W rezultacie obrazy mogą ukazać lokalizację fluorescencyjnie znakowanej sondy DNA na polichromosomie.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowy ręczny protokół hybrydyzacji in situ, jest to, że protokół mapowania fizycznego o wysokiej przepustowości zapewnia bardziej spójne wyniki i drastycznie skraca czas pracy manualnej. Protokół ten rozpoczyna się od sekcji samic o połowie grawitacji i oly około 25 godzin po żerowaniu na krwi, aby zebrać ich jajniki w stadium trzecim według klasyfikacji Christophera. Na tym etapie przezroczysty obszar z komórkami pielęgnującymi wewnątrz pęcherzyków powinien mieć okrągły kształt; należy zebrać jajniki od pięciu samic i utrwalić je w 500 µL świeżo przygotowanego zmodyfikowanego roztworu Carnoya.Następnie można je przechowywać w temperaturze pokojowej do 24 godzin lub dłużej w temperaturze -20 °C. Przed przygotowaniem preparatów do sekcji jajników należy przygotować roztwór Carnoy'a oraz 50% kwas propionowy. Każdą parę jajników należy umieścić w kropli świeżego roztworu Carnoy'a na czystym szkiełku przedmiotowym pod mikroskopem sekcyjnym.Rozdziel jajniki za pomocą igły sekcyjnej. Przenieś wszystkie fragmenty jajnika na sześć czystych szkiełek z 50% kwasem propionowym. Oddziel od siebie pęcherzyki za pomocą igieł sekcyjnych.Następnie usuń pozostałe tkanki za pomocą ręcznika papierowego. Dodaj kolejną kroplę 50% kwasu propionowego i odczekaj od trzech do pięciu minut. Zgodnie z legendą, pozostawienie mieszków w 50% kwasie propionowym na trzy do pięciu minut znacząco poprawia rozprzestrzenienie chromosomów.Następnie nałóż szkiełko cover slip i odczekaj kolejną minutę, aby jądra komórkowe się rozprzestrzeniły. Owiń preparat papierem filtracyjnym i folią plastikową. Ustaw urządzenie Dremel na prędkość od 3 000 do 5 000 RPM i przez około jedną minutę lekko dociskaj obracającą się końcówkę Dremela do szkiełka cover slip, wykonując koliste ruchy.Potwierdzić jakość rozprzestrzenienia pod mikroskopem fazowym i w razie potrzeby dłużej stosować dremel, aby spłaszczyć chromosomy. Umieścić drugie szkiełko zakrywające obok pierwszego, a następnie złożyć szkiełka zakrywające za pomocą innego mikroskopu. Następnie owinąć preparaty arkuszem plastiku oraz papierem filtracyjnym, a następnie umieścić owinięte preparaty w imadle, aby ścisnąć je z siłą od 85 do 120 cali-funtów.Po spłaszczeniu chromosomów na wszystkich sześciu szkiełkach, rozwiń je i usuń dodatkowe szkiełka, aby dalej spłaszczyć chromosomy. Inkubuj szkiełka w temperaturze 55 °C przez 10 do 15 minut w systemie do denaturacji i hybrydyzacji szkiełek. Następnie zanurz szkiełko w ciekłym azocie na co najmniej 15 sekund lub do momentu ustąpienia pęcherzyków.Następnie szybko usuń szkiełko nakrywkę za pomocą żyletki i niezwłocznie umieść preparat w zimnym 50% etanolu na pięć minut. Powtórz ten proces dla każdego preparatu sekwencyjnie. Odwodnij preparaty w kąpielach z 70%, 90% oraz 100% etanolu.Zanurz je w każdej kąpieli na pięć minut. Na koniec, po wyschnięciu preparatów na powietrzu, są one gotowe do barwienia. Automatyczne urządzenie wykonuje większość etapów procedury, z wyjątkiem znakowania sondy.Przed załadowaniem urządzenia należy przygotować sondę fluorescencyjną poprzez znakowanie DNA wstecznego fluorochromem, korzystając z komercyjnego protokołu translacji NIC. Po przygotowaniu sondy należy umieścić slajdy i odczynniki w zautomatyzowanym systemie barwienia slajdów i zaprogramować system do wykonania następujących kroków. W pierwszej kolejności należy podać 800 µL 1x PBS przez 20 minut.Po drugie, wysusz preparaty strumieniem powietrza. Po trzecie, utrwal preparaty za pomocą 450 µL 4% formaliny w 1x PBS przez jedną minutę. Następnie przemyj preparaty 100% etanolem przez jedną sekundę (dwukrotnie) oraz przez dwie minuty.Po kąpieli w etanolu ponownie wysuszyć preparaty strumieniem powietrza. Następnie podgrzewać preparaty w temperaturze 45°C przez dwie minuty, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Potem nanieść 20 µL sondy DNA, a następnie dodać kroplę oleju mineralnego i nałożyć szkiełko nakrywkę; w dalszej kolejności denaturować chromosomy w temperaturze 90°C przez 10 minut.Następnie pozostawcie preparaty do hybrydyzacji w temperaturze 42 °C przez 14 godzin. Po hybrydyzacji przeprowadźcie płukanie o wysokiej rygorystyczności przez dwie minuty w temperaturze 42 °C, a następnie wykonajcie cztery kolejne jednosekundowe aplikacje 2X SSC i wysuszcie preparaty. Następnie dwukrotnie zastosujcie 800 µL 0,4X SSC w temperaturze 42 °C przez 10 minut, po czym wykonajcie jeszcze jedno płukanie oraz zastosujcie 2X SSC w temperaturze 25 °C przez 10 minut.Następnie nanieś barwnik: 50 µL YO-YO-1, a następnie olej mineralny i szkiełka nakrywkowe. Inkubuj preparaty w temperaturze 25 °C przez 10 minut. Następnie zdejmij szkiełka nakrywkowe.Przemyj preparaty czterokrotnie w roztworze two XSSC przez jedną sekundę podczas każdego płukania, a następnie osusz je strumieniem powietrza. Na koniec nanieś 15 µL odczynnika Prolonged Gold Anti-Fade na każdy preparat i nałóż nowe szkiełka nakrywkowe. Włącz zautomatyzowany system skanowania Accord plus, zaczynając od zasilacza Olympus U-R-F-L-T dla żarówki halogenowej.Następnie komputer, a na koniec mikroskop z dołączoną kamerą. Teraz w pierwszej kolejności uruchom pakiet oprogramowania duet, a następnie ustaw wstępne skanowanie 10 x. Kliknij przycisk online, wprowadź nowy identyfikator przypadku (case ID) i przypisz identyfikator preparatu (slide id).Kliknij punkt oznaczony jako bf. Jest to opcja jasnego pola. Wybierz opcję skanowania 10 x pre-scan.Wybierz opcję 2 500 x circle, 10 000 x circle lub rectangle. Kliknij set and run. Następnie postępuj zgodnie z komunikatami, aby odpowiednio dostosować skanowanie, a następnie kliknij finish.Aby rozpocząć skanowanie, naciśnij główną kartę, aby wrócić do ekranu głównego. Następnie kliknij przycisk offline, znajdź przypisane ID przypadku oraz ID slajdu, a potem kliknij offline.Zeskanuj obszar czarnej skrzynki w lewym górnym rogu. Kliknij strzałkę i wybierz opcję 10 x pre-scan. Po znalezieniu interesującego obrazu użyj strzałek, aby przejrzeć przeskanowane obrazy.Kliknij dwukrotnie na ekranie w środku docelowego obszaru i naciśnij przycisk snap. Pozwoli to wyznaczyć obraz do późniejszego zarejestrowania, po wybraniu wszystkich celów. Kliknij prawym przyciskiem myszy na każdym obrazie, wybierz classify, zaznacz 10 x pre-scan oraz wybierz polytan.Powróć do menu głównego i skonfiguruj skan wstępny 40x. Ponownie wybierz opcję online i wybierz preparat. Zmień BF na ffl oraz zmień nazwę zadania na revisit dash X 40 dash rg.Zmień sekcję znajdującą się bezpośrednio pod ostatnim ustawieniem na revisit dash all. Następnie uruchom program i postępuj zgodnie z instrukcjami. Aby skonfigurować automatyzację, kliknij przycisk start matching views, aby dopasować obrazy 10 x i 40 x.Kliknij „finish”, aby rozpocząć skanowanie. Po zakończeniu kliknij „classify” i przejrzyj obrazy. Preparaty politenicznych chromosomów komórek pielęgnujących jajnika od samic anomaly Gambia zostały wykonane przy użyciu techniki wysokociśnieniowej.Ta metoda nie uszkadza ani nie zmienia większości struktur chromosomowych. Prostuje ona zagięte chromosomy, co pozwala na ujawnienie ukrytych, cienkich prążków, których nie widać w standardowych preparatach. Chromosom poddano hybrydyzacji z klonami DNA z biblioteki bakteryjnej anomaly S Gambia nd Tam.Bibliotekę przygotowano z samców i samic larw w stadium pierwszej gwiazdy szkodnika z anomalii S Gambia. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać zautomatyzowane wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne w celu ułatwienia szybkiego opracowania asemblacji genomu opartych na chromosomach.

high-throughput-physical-mapping-chromosomes-using-automated-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przetłumacz z en na pl. Zachowaj wszystkie tagi HTML i formatowanie dokładnie. Wypisz tylko tłumaczenie.

Wysokowydajne mapowanie fizyczne chromosomów z wykorzystaniem zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Opisano nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która pozwala na jednoczesne badanie zmian numerycznych i strukturalnych chromosomów, w szczególności specyficznych translokacji chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem, dla wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w ramach jednej hybrydyzacji.

Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) pozwala na wykrywanie kwasów nukleinowych w ich naturalnym środowisku w komórkach. Opisujemy tutaj protokół połączonego, jednoczesnego wykrywania RNA i DNA za pomocą FISH, który może być wykorzystany do badania inaktywacji chromosomu X w embrionalnych komórkach macierzystych myszy.

Połączona fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA-RNA (FISH) w celu zbadania inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Metody mapowania interakcji białko-DNA in vivo stają się kluczowe dla każdego aspektu badań genomicznych, ale są pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. W artykule przedstawiono dostępny na rynku zrobotyzowany system obsługi cieczy, który automatyzuje immunoprecypitację chromatyny w celu mapowania in vivo interakcji białko-DNA z ograniczoną liczbą komórek.

Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa

Tutaj prezentujemy prostą metodę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (DNA ISH) w celu wizualizacji powtarzających się sekwencji heterochromatycznych na chromosomach montowanych na szkiełkach. Metoda wymaga minimalnej ilości odczynników i jest uniwersalna w użyciu z krótkimi lub długimi sondami, różnymi tkankami oraz detekcją za pomocą sygnałów fluorescencyjnych lub nieopartych na fluorescencji.

Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół identyfikacji zdarzeń rekombinacji homologicznej, które wystąpiły w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą Southern blotting i/lub PCR. Przykładem tej metody jest generowanie modeli myszy zastępujących genetyczną miozynę II bez mięśni przy użyciu tradycyjnej technologii celowania opartej na embrionalnych komórkach macierzystych opartej na rekombinacji homologicznej.

Identyfikacja zdarzeń rekombinacji homologicznej w embrionalnych komórkach macierzystych myszy przy użyciu Southern blotting i reakcji łańcuchowej polimerazy

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Raportujemy protokół DNA-FISH metafazowej dystrybucji, który wizualnie wykrywa liczbę kopii lokusu i jego lokalizację w genomie. To podejście umożliwia rozdzielczość pojedynczych komórek stanów amplifikacji, szczególnie w liniach komórek nowotworowych zawierających DNA pozachromosomowe i jednorodnie barwiące regiony.

Rozmazy metafazowe DNA-FISH w celu odróżnienia dodatkowego DNA chromosomowego od jednolicie barwiących się regionów w ludzkich liniach komórek nowotworowych

Poznaj wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów komarów przy użyciu zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ. Ta metoda zwiększa wydajność i spójność wyników w genomice.

Wysokoprzepustowe mapowanie fizyczne chromosomów z wykorzystaniem zautomatyzowanej hybrydyzacji in situ

Przeglądaj więcej filmów