Przepływ pracy ilościowej analizy sprawności fizycznej

Celem tej procedury jest uchwycenie ilościowych kultur drobnoustrojów równolegle w skali całego genomu w sposób precyzyjny i wysokoprzepustowy. Osiąga się to dzięki pierwszemu Turingowi i bibliotece macierzy kolonii drobnoustrojów na 96-dołkowych płytkach i wyhodowaniu kultury do nasycenia. Następnie nasycone kultury rozcieńcza się w wodzie, a następnie nakrawa się na stałe płytki agarowe.

Następnie okresowo fotografuje się stałe płytki garfa i aż do momentu nasycenia wzrostu kolonii drobnoustrojów. Na koniec fotografie przebiegu czasowego wzrostu każdej kultury są przekształcane w ilościowe miary gęstości komórek, a obserwowane krzywe wzrostu z modelami wzrostu i ilościowymi miarami dopasowania mikrobiologicznego są podsumowywane. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują dowody na interakcje genetyczne poprzez wykazanie, że szczepy drobnoustrojów mają różne przystosowania, zarówno w połączeniu z różnymi mutacjami, jak i uprawiane w różnych warunkach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metody przypinania o dużej gęstości, takie jak SGA lub eksperymenty z konkurencją kodów kreskowych, jest to, że pomiary sprawności są dokładniejsze. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie opracowywania leków przeciwnowotworowych, takie jak to, które geny i procesy są ważne w odpowiedzi na uszkodzenia DNA i kontroli cyklu komórkowego, zrozumienie i przełożenie takich badań i podstawowych mikroorganizmów w postaci potencjalnych celów leków w ludzkich komórkach nowotworowych. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w funkcję telomerów i visi.

Można go również zastosować w innych obszarach biologii drożdży, a nawet w każdym obszarze, w którym fenotypy fitness mogą zapewnić wgląd w biologię drobnoustrojów. Mamy nadzieję, że QFA można zastosować do wielu innych organizmów mikrobiologicznych, dla których istnieją biblioteki tablicowe. Na przykład povi e coli, nadwyżka orilla Zaczynając od nasyconych kultur nocnych, odtwarzano do 96 niezależnych szczepów drożdży w 200 mikrolitrach objętości bogatego płynnego podłoża.

W 96-dołkowym naczyniu hodowlanym wysterylizuj ręczną replikę plater o średnicy 96 szpilek i średnicy jednej ósmej cala, najpierw zanurzając ją w 100% etanolu, a następnie paląc i pozostawiając do ostygnięcia, 200 mikrolitrów sterylnej wody w studzienkach wiru 96-dołkowego nasycił kultury drożdży i rozcieńczyć, zanurzając wysterylizowane narzędzie do szpilek w szczepach trzy razy. Następnie, po włożeniu do płytki zawierającej wodę, wysterylizuj szpilkę i pozwól jej ostygnąć przed trzykrotnym zanurzeniem w rozcieńczonych kulturach. Następnie przenieś czop na solidną płytkę agarową.

Po inkubacji płytek agarowych użyj imagera s and p robotics SP, aby ręcznie je zobrazować w celu zautomatyzowanej hodowli. Zacznij od prostokątnego układu niezależnych szczepów drożdży wyhodowanych na stałym agarze . W tym przykładzie szczepy wyjściowe są wynikiem skrzyżowania mutacji zapytania wrażliwej na temperaturę z kolekcją delecji drożdży.

1 536 kultur reprezentujących cztery repliki 384 niezależnych szczepów drożdży jest hodowanych na płytkach SGA przy użyciu robota z 96 szpilkami o średnicy jednego milimetra, sterylnymi narzędziami do przenoszenia 384 z 1 536 szczepów do 4 96. Cóż, na płytkach hodowlanych zawierających 200 mikrolitrów selektywnej pożywki hoduje się kultury w temperaturze 20 stopni Celsjusza do nasycenia. Aby dostrzec nasycone kultury drożdży, zacznij od przeniesienia ich do robota do obsługi cieczy, a Resus, zawieszając je na wytrząsarce magnetycznej, rozcieńcz kultury do około 1 do 70 za pomocą sterylnego 96-pinowego narzędzia do szpilek robotycznych, aby wbić je do 200 mikrolitrów sterylnej wody.

Po oczyszczeniu i wysterylizowaniu szpilki rozcieńczone kultury nanieść na płytki agarowe. W 384 formacie studzienki przenieś płytki do nawilżanego inkubatora o kontrolowanej temperaturze z automatyczną karuzelą i włazem dostępowym. Do obrazowania kultur używa się zrobotyzowanego automatycznego imagera, który wielokrotnie wyjmuje płytki z inkubatora, zdejmuje pokrywki, przenosi je do równomiernie oświetlonej przestrzeni pod kamerą o średnicy 35 milimetrów, rejestruje obraz w odległości 5 184 na 3 456.

Pixel resolution zakłada pokrywę, a następnie zwraca je do karuzeli inkubatora, aby śledzić lokalizacje kultur na płytkach i zastosowane na nich zabiegi. Płytki są automatycznie oznaczane kodami kreskowymi zgodnie z nazwą inkubatora, temperaturą, unikalnym kolejnym numerem partii i pozycją w inkubatorze. Nazwy obrazów są konkatenacją nazwy płyty i znacznika czasu i są generowane automatycznie po przechwyceniu obrazu.

Płyty są często również etykietowane ręcznie, aby zapewnić, że pozostaną w tej samej kolejności podczas przenoszenia między karuzelami robotów. Pliki metadanych są plikami tekstowymi rozdzielanymi tabulatorami, które są generowane ręcznie. Eksperymentalny plik opisu FT dwa.

Tabela pierwsza jest unikatowa dla każdego eksperymentu, ale opis biblioteki FT trzeci, tabela pierwsza może być szeroko wykorzystywana. Po skonstruowaniu eksperyment jest opisany w pliku opisu eksperymentu FT dwie tabela, jedna zawierająca kolumny dla kodu kreskowego lub automatycznie wygenerowanej nazwy płytki, eksperyment rozpoczynający się znacznik czasu, zawartość płytki z stałym agarem, nazwę ekranu, numer tabliczki biblioteki dla bibliotek z wieloma płytkami oraz powtórzony numer kwadrantu dla skalowania w dół od 1 536, format dołka do 384. Dobrze sformatowany plik biblioteki szczepów e jest opisany za pomocą pliku opisu biblioteki FT trzy, tabela pierwsza określająca genotyp uprawiany w każdej lokalizacji hodowli.

Na każdej tablicy biblioteki znajdują się kolumny czwarte, nazwa biblioteki, ORF, tablica rejestracyjna, kolumna z tablicą wierszy i opcjonalna kolumna notatek. Opcjonalny plik standardowej nazwy genu może być dostarczony FT cztery, tabela pierwsza opisująca standardową nazwę genu związaną z każdym systematycznym numerem ORFY, identyfikując szczepy poddawane badaniom przesiewowym. Ten plik zawiera dwie kolumny, ORF i nazwę genu do analizy danych.

Obliczeniowy przepływ pracy QFA wymaga dostępu do dość wydajnej wielordzeniowej stacji roboczej, na której jest zainstalowana. Narzędzie do analizy obrazu kolonizatora i pakiet QFAR, które są udokumentowane online, są swobodnie dostępne i działają na wielu systemach operacyjnych. Uruchom kolonizator z każdym z przechwyconych obrazów płyt jako danymi wejściowymi, generując jeden plik wyjściowy kolonizatora FT pięć, tabelę po jednym dla każdego przechwyconego obrazu plików wyjściowych kolonizatora, określ szacunki gęstości kultur, kulturę, obszar, kształt i kolor.

Dla każdego z 384 miejsc na płycie obrazu nazwa pliku wyjściowego jest automatycznie kopiowana z nazwy pliku obrazu źródłowego. Pakiet QFAR zawiera funkcje seldens do kursów czasowych dla każdej kultury, aby dopasować uogólnione modele populacji logistycznej do obserwacji i wykresu. Oba te rysunki znajdują się na rysunkach drugim i trzecim jako przykłady.

Dopasowane wartości parametrów są zapisywane w plikach parametrów logistycznych QFA. Pakiet QFAR zawiera również funkcje do kontroli jakości. Kolonie brzegowe są odrzucane ze względu na większą dostępność składników odżywczych na krawędziach płytki i trudności z analizą obrazu.

W pobliżu ścian płytek i kultur, które nie powiodły się SGA i genotypy wykazujące powiązanie z genami markerowymi specyficznymi dla ekranu, są usuwane z analizy. Na podstawie parametrów modelu populacji logistycznej dla każdej kultury wyprowadza się kilka ilościowych miar dopasowania. Obejmują one maksymalne wskaźniki podwajania populacji i liczbę podziałów od inokulacji do nasycenia dla każdego zestawu powtórzonych kultur i dla każdej definicji przystosowania.

Oblicza się kilka zbiorczych statystyk oszacowań sprawności: średnią i średnią przydatność, odchylenie standardowe dopasowania oraz liczbę zaobserwowanych powtórzeń. Statystyki podsumowujące są wyprowadzane do plików podsumowujących sprawność fizyczną QFA FT osiem, tabela pierwsza w celu dalszej analizy. Na przykład obliczenia interakcji genetycznych dają wyniki FT dziewięć w tabeli pierwszej.

Rysunek ten przedstawia jedną typową krzywą wzrostu w skali logarytmicznej OUTTA 384 QFA. Kultury rosnące w temperaturze 20 stopni Celsjusza na stałym agarze określonym ilościowo przez kolonizatora, ze wzrostem gęstości komórek wykrywalnym po raz pierwszy po około dwóch dniach. Opóźnienie to jest prawdopodobnie połączonym efektem opóźnionej fazy hodowli po inokulacji na pożywce stałej i dolnej granicy wykrywalności gęstości komórek.

W tym przypadku 308 podobnych krzywych wzrostu zostało uchwyconych z jednej płytki. Należy zauważyć, że szczepy, które wytwarzały płaską linię, były bardzo chore lub martwe. Rysunek ten przedstawia porównanie dwóch badań przesiewowych QFA obejmujących cały genom w celu wywnioskowania siły interakcji genetycznych.

Pakiet QFAR zawiera również funkcje do tworzenia poprzedniej krzywej wzrostu oraz do generowania list rankingowych badanych genotypów i oszacowań siły interakcji genetycznej. Wraz z wartością Q dla znaczenia obserwowanego GIS Once opanował kompletny, obejmujący cały genom, cztery replikowane QF. Eksperyment można przeprowadzić w ciągu trzech tygodni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o organizacji śledzenia i nazywania wszystkich tablic i obrazów.

Wszystkie płytki muszą być zaszczepione i umieszczone we właściwej orientacji i uporządkowane dalej. Analiza danych opiera się na poprawności pomocniczych plików tekstowych zbudowanych przez naukowca doświadczalnego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oszacować przydatność tysięcy niezależnych kultur drobnoustrojów.

Sprawności szacuje się poprzez wielokrotne fotografowanie nakrapianych kultur, rosnących na solidnych płytkach agarowych, przekształcanie przechwyconych obrazów na szacunki gęstości komórek i generowanie krzywych wzrostu. Modelowanie matematyczne krzywych wzrostu dostarcza ilościowych szacunków dopasowania, które można następnie wykorzystać do wywnioskowania funkcjonalnych relacji między produktami genów w skali całego genomu.