Schemat ilościowej analizy sprawności fizycznej

Celem niniejszej procedury jest równoległe, precyzyjne i wysokoprzepustowe wyznaczanie ilościowych wskaźników sprawności hodowli mikrobiologicznych w skali całego genomu. Osiąga się to poprzez uprawę biblioteki kolonii mikrobiologicznych w płytkach 96-dołkowych i prowadzenie hodowli do fazy nasycenia. Następnie nasycone kultury są rozcieńczane w wodzie, a potem naniesione metodą kropelkowania na stałe płytki agarowe.

Następnie płytki agarowe z przesiewem są fotografowane okresowo, aż do momentu nasycenia wzrostu kolonii drobnoustrojów. Na koniec fotografie przebiegu czasowego wzrostu każdej kultury przekształca się w ilościowe miary gęstości komórek, a obserwowane krzywe wzrostu zestawiane są z modelami wzrostu i ilościowymi miarami dostosowania drobnoustrojów. W rezultacie można uzyskać dane dowodzące interakcji genetycznych poprzez wykazanie, że szczepy drobnoustrojów wykazują różny stopień dostosowania w zależności od kombinacji różnych mutacji lub warunków hodowli.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metody wysokiej gęstości pinowania (np. SGA) czy eksperymenty z konkurencją kodów kreskowych, jest większa dokładność pomiarów dostosowania. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie opracowywania leków przeciwnowotworowych, na przykład dotyczące tego, które geny i procesy są istotne w odpowiedzi na uszkodzenia DNA oraz w kontroli cyklu komórkowego, a także w rozumieniu i przenoszeniu wyników takich badań na podstawowych mikroorganizmach w formie potencjalnych celów terapeutycznych w ludzkich komórkach nowotworowych. Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat funkcji telomerów oraz visi.

Metodę tę można zastosować również w innych obszarach biologii drożdży lub w każdym obszarze, w którym fenotypy sprawności (fitness phenotypes) mogą dostarczyć wiedzy na temat biologii drodrobnoustrojów. Mamy nadzieję, że QFA znajdzie zastosowanie w przypadku wielu innych organizmów drobnoustrojowych, dla których istnieją biblioteki macierzowe. Na przykład, povi e coli, orilla surplus. Rozpoczynając od nasyconych kultur nocnych, namnożono 96 niezależnych szczepów drożdży w objętościach 200 µL bogatej pożywki płynnej.

W płytce hodowlanej z 96 dołkami należy wysterylizować ręczny replikator z 96 pinami o średnicy 1/8 cala, najpierw zanurzając go w 100% etanolu, a następnie opalając płomieniem i pozostawiając do ostygnięcia. Do dołków płytki 96-dołkowej należy nalać po 200 µL sterylnej wody; nasycone kultury drożdży należy wymieszać w wirówce i rozcieńczyć, zanurzając wysterylizowane narzędzie z pinami trzykrotnie w poszczególnych szczepach. Następnie należy zanurzyć je raz w płytce zawierającej wodę, ponownie wysterylizować narzędzie i pozwolić mu ostygnąć przed trzykrotnym zanurzeniem w rozcieńczonych kulturach. Na koniec należy przenieść próbki z pinów na szalę z pożywką agarową.

Po inkubacji płytek z agarem, użyj obrazownika s and p robotics SP do wykonania ręcznego obrazowania płytek w celu zautomatyzowanego hodowania. Rozpocznij od prostokątnej macierzy niezależnych szczepów drożdży hodowanych na stałym agarze. W tym przykładzie szczepy wyjściowe są wynikiem krzyżowania temperaturozależnej mutacji zapytania z kolekcją delecji drożdży.

1 536 kultur reprezentujących cztery powtórzenia 384 niezależnych szczepów drożdży jest hodowli na płytkach SGA przy użyciu robota wyposażonego w sterylne narzędzie z 96 pinami o średnicy 1 mm; przeniesiono 384 z 1 536 szczepów do 4 płytek hodowlanych z 96 dołkami zawierających 200 µL pożywki selektywnej; hodowlę prowadzono w temperaturze 20 °C aż do osiągnięcia stanu nasycenia. Aby nanieść nasycone kultury drożdży, należy najpierw przenieść je do robota do obsługi cieczy i resuspender na wytrząsarze magnetycznym; kultury rozcieńczono do stężenia około 1:70, przenosząc je za pomocą sterylnego robotycznego narzędzia z 96 pinami do 200 µL sterylnej wody.

Po wyczyszczeniu i wysterylizowaniu narzędzia typu pin, nanieś rozcieńczone kultury na płytki agarowe. W formacie 384 dołków przenieś płytki do inkubatora z kontrolą temperatury i wilgotności, wyposażonego w automatyczny karuzelę oraz właz dostępowy. Do obrazowania kultur użyj zrobotyzowanego systemu obrazowania, który wielokrotnie wyjmuje płytki z inkubatora, zdejmuje pokrywki, przenosi je do jednorodnie oświetlonej przestrzeni pod kamerą 35 mm i wykonuje obraz o rozdzielczości 5 184 na 3 456.

System Pixel resolution zakłada pokrywkę, a następnie umieszcza płytki z powrotem w karuzeli inkubatora, aby śledzić lokalizację kultur na płytkach oraz zastosowane wobec nich zabiegi. Płytki są automatycznie kodowane kreskowo zgodnie z nazwą inkubatora, temperaturą, unikalnym sekwencyjnym numerem partii oraz pozycją w inkubatorze. Nazwy obrazów stanowią połączenie nazwy płytki i znacznika czasu i są generowane automatycznie podczas przechwytywania obrazu.

Płytki są często etykietowane również ręcznie, aby zapewnić zachowanie tej samej kolejności podczas przenoszenia ich pomiędzy karuzelami robota. Pliki z metadanymi to pliki tekstowe rozdzielane znakami tabulacji, generowane ręcznie. Plik z opisem eksperymentu FT two.

Tabela jeden jest unikalna dla każdego eksperymentu, ale opis biblioteki FT trzy, tabela jeden, może być wielokrotnie wykorzystywany. Po skonstruowaniu eksperyment jest opisany w pliku opisu eksperymentalnego FT dwa tabela jeden, który zawiera kolumny na kod kreskowy lub automatycznie wygenerowaną nazwę płytki, znacznik czasu rozpoczęcia eksperymentu, zawartość traktowania płytki, treść stałej pożywki agarowej, nazwę ekranu, numer płytki biblioteki w przypadku bibliotek wielopłytkowych oraz numer kwadrantu powtórzeń dla skalowania z formatu 1 536-dołkowego do formatu 384-dołkowego. Biblioteka szczepów e jest opisana w pliku opisu biblioteki FT trzy, tabela jeden, określającym genotyp hodowany w każdym miejscu kultury.

Każda płytka w bibliotece zawiera cztery kolumny: nazwę biblioteki, ORF, numer płytki, wiersz i kolumnę płytki oraz opcjonalną kolumnę uwag. Można dostarczyć opcjonalny plik ze standardowymi nazwami genów FT cztery, tabela jeden, opisujący standardową nazwę genu przypisaną do każdego systematycznego numeru ORF, co pozwala na identyfikację przesiewanych szczepów. Plik ten zawiera dwie kolumny: ORF oraz nazwę genu służącą do analizy danych.

Obliczeniowy proces analizy QFA wymaga dostępu do odpowiednio wydajnej wielordzeniowej stacji roboczej, na której zainstalowano odpowiednie oprogramowanie. Narzędzie do analizy obrazów kolonii colonizer oraz pakiet QFAR, oba udokumentowane online, są dostępne bezpłatnie i działają na wielu systemach operacyjnych. Uruchom program colonizer, wykorzystując jako dane wejściowe każdy z przejętych obrazów płytek, co wygeneruje jeden plik wyjściowy colonizer (np. tabela 1) dla każdego obrazu. Pliki wyjściowe z programu colonizer zawierają szacunki gęstości kultury, obszar, kształt oraz kolor kultur.

Dla każdej z 384 lokalizacji na płytce obrazu nazwa pliku wyjściowego jest automatycznie kopiowana z nazwy pliku obrazu źródłowego. Pakiet QFAR zawiera funkcje służące do analizy przebiegów czasowych dla każdej hodowli w celu dopasowania uogólnionych logistycznych modeli populacyjnych do obserwacji oraz do ich przedstawienia na wykresach. Przykłady znajdują się na rysunkach dwa i trzy.

Dopasowane wartości parametrów są zapisywane w plikach parametrów logistycznych QFA. Pakiet QFAR zawiera również funkcje do kontroli jakości. Kolonie brzegowe są odrzucane ze względu na większą dostępność składników odżywczych na krawędziach płytki oraz trudności w analizie obrazu.

Z analizy wyklucza się hodowle znajdujące się w pobliżu ścian płytek, hodowle, które nie przeszły testu SGA, oraz genotypy wykazujące sprzężenie z markerami genetycznymi specyficznymi dla przesiewu. Na podstawie parametrów logistycznego modelu populacyjnego dla każdej hodowli wyznacza się kilka ilościowych miar przystosowania. Obejmują one maksymalne szybkości podwajania populacji oraz liczbę podziałów od momentu inokulacji do nasycenia dla każdego zestawu hodowli powtórzonych oraz dla każdej definicji przystosowania.

Obliczono kilka statystyk podsumowujących szacunki dostosowania: średnie i medianowe dostosowanie, odchylenie standardowe dostosowania oraz liczbę zaobserwowanych powtórzeń. Statystyki podsumowujące są wyprowadzane do plików podsumowania dostosowania QFA FT eight, tabela 1 w celu dalszej analizy. Przykładem są obliczenia wyników interakcji genetycznych FT nine tabela 1.

Rysunek ten przedstawia typową krzywą wzrostu w skali logarytmicznej dla 384 QFA. Kultury rosnące w temperaturze 20 °C na stałym agarze, ilościowo określone za pomocą kolonizera, wykazują wzrost gęstości komórkowej wykrywalny po około dwóch dniach. Opóźnienie to jest prawdopodobnie wynikiem połączonego efektu fazy adaptacyjnej kultury po inokulacji na podłoże stałe oraz dolnej granicy wykrywalności gęstości komórkowej.

Tutaj przedstawiono 308 podobnych krzywych wzrostu zarejestrowanych z jednej płytki. Należy zauważyć, że szczepy, w których uzyskano linię płaską, były w bardzo złym stanie lub martwe. Rycina ta obrazuje porównanie dwóch genomowych przesiewów QFA w celu wnioskowania o sile interakcji genetycznych.

Pakiet QFAR zawiera również funkcje służące do generowania wspomnianego wcześniej wykresu krzywej wzrostu oraz do tworzenia rankingowych list badanych genotypów i szacunków siły interakcji genetycznej. Wraz z wartością Q dla istotności zaobserwowanego GIS, po opanowaniu metody, kompletny eksperyment QF.A z czterema powtórzeniami w skali całego genomu można przeprowadzić w ciągu trzech tygodni. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby zachować dobrą organizację w śledzeniu i nazywaniu wszystkich płytek oraz obrazów.

Wszystkie płytki muszą zostać zaszczepione i naniesione w odpowiedniej orientacji oraz kolejności. Analiza danych opiera się na poprawności pomocniczych plików tekstowych stworzonych przez badacza. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak oceniać przymocowanie (fitness) tysięcy niezależnych kultur drobnoustrojów.

Przystosowanie szacuje się poprzez wielokrotne fotografowanie kultur w plamkach, rosnących na stałych płytkach agarowych, konwersję uzyskanych obrazów na szacunki gęstości komórek oraz generowanie krzywych wzrostu. Modelowanie matematyczne krzywych wzrostu pozwala na ilościowe oszacowanie przystosowania, co może być następnie wykorzystane do wywnioskowania zależności funkcjonalnych między produktami genów w skali całego genomu.