Name: Przepływ pracy ilościowej analizy sprawności fizycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy sprawności fizycznej QFA wykorzystującą obrazowanie i modelowanie wzrostu mikroorganizmów. Technika umożliwia precyzyjną ocenę interakcji genetycznych na skalę genomową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Z wdzięcznością dziękujemy wszystkim członkom naszego laboratorium oraz Centre for Integrated System Biology of Ageing and Nutrition (CISBAN) za wsparcie i pomocne dyskusje. Badanie to było finansowane przez Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) oraz Wellcome Trust (075294, 093088).

<ol><li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362(2011).</li>
<li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li>
<li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonyzer%3A+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li>
<li>Colonyzer - Image analysis software [Internet]. , Newcastle University. Newcastle, UK. Available from:
 <a target="_blank" href="http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/">http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/</a> (2012).</li>
<li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. , University of Vienna. Vienna, Austria. Available from:
 <a target="_blank" href="http://qfa.r-forge.r-project.org/">http://qfa.r-forge.r-project.org/</a> (2012).</li>
<li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li>
<li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70%CE%94mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li>
<li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li>
<li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864(2011).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+ecology%3A+The+social+side+of+wild+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

QFA jest w wielu aspektach bezpośrednim rozwinięciem trzech uznanych mikrobiologicznych technik laboratoryjnych: testów punktowych z serii rozcieńczeń kultur 9, wyznaczania krzywej wzrostu w napowietrzanych kulturach ciekłych 9 oraz metody replikowania 13. Trzy te metody zostały podsumowane i porównane z QFA oraz innymi technikami wysokoprzepustowymi w Tabeli 2. Podczas gdy testy punktowe z serii rozcieńczeń definiują fitness szczepu jako jego zdolność do tworzenia kolonii w serii kultur hodowanych z różnych rozcieńczeń inokulum, QFA mierzy fitness szczepu poprzez powtarzalne obserwacje pojedynczej kultury w celu skonstruowania krzywej wzrostu. Ilościowe określanie fitness na podstawie pojedynczych kultur pozwala na jednoczesne badanie znacznie większej liczby szczepów w identycznych warunkach. Replikowanie macierzy kultur umożliwia wielokrotne testowanie kolekcji szczepów, co jest szczególnie przydatne przy badaniu różnic w fitness kultur w różnych środowiskach lub przy różnych tłach genetycznych. Przedstawiony tutaj protokół QFA wykorzystuje kosztowny sprzęt robotyczny do replikowania, inokulowania, inkubowania i obrazowania szalek z agarem, co jest odpowiednie do obserwacji wzrostu tysięcy niezależnych kultur (robotyczne QFA, Tabela 2). Ponieważ jednak QFA opiera się na uznanych, tradycyjnych technikach laboratoryjnych, można je przeprowadzić znacznie taniej, zastępując pomoc robota krokami manualnymi (manualne QFA, Tabela 2). Manualne QFA obejmuje replikowanie i inokulowanie kultur na szalkach z agarem przy użyciu manualnego narzędzia z pinem oraz ręczne przenoszenie szalek do inkubatora i z inkubatora w celu wykonania zdjęć. Ten sam schemat analizy obliczeniowej może zostać zastosowany do generowania krzywych wzrostu dla obu projektów eksperymentalnych.
Szacunki sprawności (fitness) uzyskane metodą QFA wydają się być stosunkowo precyzyjne. Na Rysunku 4 wyróżniono średnie wartości sprawności dla czterech przykładowych klastrów delecji genów powiązanych funkcjonalnie. Bliskie sąsiedztwo członków każdej klasy genów powiązanych funkcjonalnie w dwóch niezależnych tłach genetycznych (ura3Δ oraz cdc13-1) wskazuje na powtarzalność szacunków sprawności QFA. Na przykład tylko 3 delecje genów (z możliwych 4300) oddzielają trzy człony konserwatywnego kompleksu MRX.
Wysokoprzepustowe alternatywy dla QFA do badania charakterystyki wzrostu szczepów mikrobiologicznych obejmują SGA 5,6, przesiewy konkurencyjne w bibliotekach z kodami kreskowymi 11,12 oraz przesiewy rejestrujące kinetykę gęstości optycznej w płytkowych czytnikach spektrofotometrycznych 10, które zostały podsumowane w Tabeli 2 i opisane szerzej w innym opracowaniu 8. Płytki QFA i SGA, na których kultury rosną na stałych powierzchniach agarowych (metody oparte na agarze, Tabela 2), mogą być szybko i łatwo obsługiwane przez robota. Kultury na stałej powierzchni agarowej są dobrze napowietrzone przez cały czas wzrostu, a komórki mogą rosnąć w kulturach stacjonarnych, co pozwala mikroorganizmom wykazującym socjalność na wzrost w obrębie społeczności 14. Pozostawione w nienaruszonym stanie, społeczności mikrobiologiczne wpływają na swoje mikrootoczenie, wydzielając toksyny, takie jak etanol, i potencjalnie sygnalizując między komórkami. Jednak ciągłe mieszanie kultur w cieczy, niezbędne do zapewnienia odpowiedniego napowietrzenia, sztucznie zaburza społeczności mikrobiologiczne i ich mikrootoczenie, co może wpływać na ich tryby wzrostu. Zanieczyszczenia krzyżowe stanowią mniejszy problem w metodach na stałym agarze, ponieważ istnieje mniejsza możliwość rozpryskiwania cieczy przenoszącej komórki między kulturami. Jeśli w badaniach na stałym agarze dojdzie do kontaminacji obcymi mikrobami przenoszonymi przez powietrze, można ją często wykryć poprzez inspekcję wizualną płytek agarowych i uwzględnić lub usunąć.
Przepustowość QFA jest znacznie wyższa niż w przypadku równoległych metod w cieczy na dwa sposoby. Po pierwsze, na płytkach QFA (i SGA) zaszczepione kultury są rozmieszczone gęściej, co pozwala na uzyskanie większej liczby niezależnych kultur na jednej płytce. W QFA zazwyczaj znajduje się 308 kultur, nie licząc kultur brzegowych niezwiązanych z eksperymentem (Rycina 1), w porównaniu do równoległych kultur w cieczy, gdzie na płytce znajduje się 96 lub 100 kultur. Po drugie, eksperymenty QFA można skalować do znacznie większej liczby płytek. Podczas gdy liczba płytek analizowanych w pojedynczym eksperymencie QFA jest ograniczona jedynie dostępną przestrzenią w inkubatorze lub pomieszczeniu termostatycznym, minimalną dopuszczalną oraz maksymalną osiągalną częstotliwością przechwytywania obrazów, liczba płytek w eksperymencie wzrostu w cieczy jest silnie ograniczona wydajnością czytnika płytek (zazwyczaj jedna lub dwie płytki) lub stosownika dołączonego do czytnika płytek (zazwyczaj 25-50 płytek). Niedawno przeprowadziliśmy w pełni zautomatyzowany eksperyment QFA na 123 płytkach, z których każda zawierała 308 kultur eksperymentalnych, co dało łącznie 37 884 symultanicznych kultur. Szacujemy, że maksymalna osiągalna liczba niezależnych kultur rosnących w cieczy wynosi 96 (kultur/płytka) x 50 (płytek/stosownik) = 4800, co jest około dziesięciokrotnie mniejszą wartością niż przepustowość QFA. Alternatywą dla przesiewu kultur w cieczy jest wykorzystanie wielu zautomatyzowanych urządzeń do wzrostu równolegle (Tabela 1 z przeglądu Blomberga 8), z których każde posiada pojemność jednej lub dwóch płytek. Kontrola temperatury w każdym urządzeniu jest niezależna, zatem warunki nie są identyczne, ale zakładając, że takie są, ten przepływ pracy wymagałby co najmniej 190 takich urządzeń, aby zrównać się z przepustowością QFA (zakładając 200 kultur w cieczy na urządzenie).
Podsumowując, QFA jest wysokiej jakości procesem analitycznym, który można z powodzeniem zastosować do gromadzenia ilościowych fenotypów wzrostu zarówno w niewielkich eksperymentach ukierunkowanych, jak i w badaniach wysokoprzepustowych. Jest on wystarczająco elastyczny, aby efektywnie funkcjonować przy różnych wymaganiach dotyczących wyposażenia robotycznego. Komponent obliczeniowy procesu QFA opiera się na ogólnodostępnym kodzie o otwartym źródle.

<table><tbody><tr><td>Plater do replikacji</td><td>Sigma</td><td>R-2508</td><td>ręczny wyciągacz pinów 96-dołkowy z końcówką 1/8 &quot; piny ustalające</td></tr><tr><td>Mix Mate</td><td>Eppendorf</td><td>5353 000.014</td><td></td></tr><tr><td>Biomek FX</td><td>Beckman</td><td>A31842</td><td></td></tr><tr><td>Teleshake</td><td>Thermo Scientific</td><td>50095890</td><td>Zainstalowano na Biomek FX</td></tr><tr><td>BM3-SC</td><td>S&amp;amp;P Robotics Inc</td><td>BM3-SC</td><td>karuzela obrotowa z 192 półkami</td></tr><tr><td>spImager</td><td>S&amp;amp;P Robotics Inc</td><td>spImager</td><td>Manualne obrazowanie o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>spImager z systemem Cytomat</td><td>S&amp;amp;P Robotics Inc</td><td>Niestandardowy</td><td>Zautomatyzowane obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z kontrolą temperatury</td></tr><tr><td>Cytomat 6001 z wymiennikiem ciepła</td><td>Thermo Scientific</td><td>51022222</td><td>Przyłączony do spImager</td></tr><tr><td>Ecoline RE207</td><td>Lauda</td><td>RE207</td><td>Przymocowany do Cytomatu</td></tr><tr><td>spImager z karuzelą</td><td>S&amp;amp;P Robotics Inc</td><td>Niestandardowy</td><td>Zautomatyzowane obrazowanie o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Uchwyt narzędzia do pinów robota dla FP12pins</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>AFIX96FP12</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>96 pinu FP12</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>FP12</td><td>długość 50,4 mm, długość wystającego pinu 17 mm</td></tr><tr><td>Stacja dokująca dla narzędzia do pinowania</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>VP425</td><td>Podstawa stacji dokującej została zdjęta, aby umożliwić wysuszenie pinów za pomocą wentylatora</td></tr><tr><td>Szczoteczka do czyszczenia pinów</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>VP425</td><td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td></tr><tr><td>Plater do replikacji</td><td>Sigma</td><td>R-2508</td><td>Ręczne narzędzie do pinów</td></tr><tr><td>Nunc OmniTray z pokrywką</td><td>Nunc</td><td>734-0490</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>sterylne płytki polistyrenowe z 96 dołkami</td><td>Greiner BioOne</td><td>655161</td><td>Brak danych</td></tr><tr><td>sterylne pokrywki polistyrenowe do płytek 96-dołkowych</td><td>Greiner BioOne</td><td>656171</td><td>Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie materiałów, które mają zostać przetłumaczone na język polski zgodnie z wytycznymi.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę dostarczyć treść źródłową do tłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 3. &lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

schemat ilościowej analizy sprawności fizycznej

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Ilościowa Analiza Przystosowania (Quantitative Fitness Analysis, QFA) to eksperymentalny i obliczeniowy schemat postępowania służący do porównywania przystosowania kultur drobnoustrojów hodowanych równolegle1,2,3,4. QFA może być stosowane do ukierunkowanych obserwacji pojedynczych kultur, jednak jest najbardziej użyteczne w przypadku genomowych badań oddziaływań genetycznych lub przesiewów lekowych obejmujących do tysięcy niezależnych kultur. Główną metodą eksperymentalną jest szczepienie niezależnych, rozcieńczonych płynnych kultur drobnoustrojów na stałe płytki agarowe, które są inkubowane i regularnie fotografowane. Analiza zdjęć z każdego punktu czasowego pozwala na uzyskanie ilościowych szacunków gęstości komórek, które służą do konstrukcji krzywych wzrostu, umożliwiając wyprowadzenie ilościowych miar przystosowania. Przystosowanie kultur można porównać w celu określenia i uszeregowania siły oddziaływań genetycznych lub wrażliwości na leki. QFA pozwala na ilościowe określenie wpływu na przystosowanie kultur wszelkich czynników dodanych do agaru podłoża (np. małych cząsteczek, antybiotyków lub składników odżywczych) lub zastosowanych zewnętrznie na płytki (np. promieniowanie UV, temperatura).
Procedura QFA pozwala na uzyskanie szacunków szybkości wzrostu analogicznych do tych otrzymywanych za pomocą pomiarów spektrofotometrycznych równoległych kultur w cieczy w czytnikach płytek 96- lub 200-dołkowych. Co istotne, QFA charakteryzuje się znacznie wyższą przepustowością w porównaniu z takimi metodami. Kultury w QFA rosną na stałej powierzchni agarowej i są zatem dobrze napowietrzane podczas wzrostu bez konieczności mieszania lub wstrząsania.
Przepustowość QFA nie jest tak wysoka, jak w przypadku niektórych metod przesiewowych Synthetic Genetic Array (SGA)5,6. Jednakże, ponieważ kultury QFA są silnie rozcieńczane przed inokulacją na agar, QFA pozwala na rejestrację pełniejszych krzywych wzrostu, obejmujących fazy wykładniczą i nasycenia3. Na przykład obserwacje krzywych wzrostu pozwalają na bezpośrednie i precyzyjne szacowanie czasu podwojenia kultury, co było omawiane wcześniej1.
W niniejszej pracy przedstawiamy specyficzny protokół QFA zastosowany do tysięcy kultur S. cerevisiae, które są automatycznie obsługiwane przez roboty podczas szczepienia, inkubacji i obrazowania. Każdy z tych zautomatyzowanych etapów może zostać zastąpiony równoważną procedurą ręczną, co wiąże się z obniżeniem przepustowości; przedstawiamy również ręczny protokół o niższej przepustowości. Te same narzędzia programistyczne QFA mogą być stosowane do obrazów zarejestrowanych w obu wariantach procesu.
Posiadamy szerokie doświadczenie w stosowaniu metody QFA do hodowli drożdży pączkujących S. cerevisiae, jednak spodziewamy się, że QFA okaże się równie użyteczna przy badaniu hodowli drożdży rozdzielających S. pombe oraz hodowli bakteryjnych.

Ilościowa Analiza Przystosowania (QFA) to komplementarna seria metod eksperymentalnych i obliczeniowych służąca do szacowania przystosowania kultur mikrobiologicznych. QFA pozwala ocenić wpływ mutacji genetycznych, leków lub innych zastosowanych zabiegów na wzrost drobnoustrojów. Możliwe jest zaprojektowanie eksperymentów o skali od ukierunkowanej analizy pojedynczych kultur po tysiące kultur prowadzonych równolegle.

Schemat ilościowej analizy sprawności fizycznej

Ilościowa analiza przystosowania (Quantitative Fitness Analysis, QFA) to eksperymentalny i obliczeniowy schemat postępowania służący do porównywania przystosowania kultur drobnoustrojów hodowanych równolegle1,2,3,4. ...

Celem niniejszej procedury jest równoległe, precyzyjne i wysokoprzepustowe wyznaczanie ilościowych wskaźników sprawności hodowli mikrobiologicznych w skali całego genomu. Osiąga się to poprzez uprawę biblioteki kolonii mikrobiologicznych w płytkach 96-dołkowych i prowadzenie hodowli do fazy nasycenia. Następnie nasycone kultury są rozcieńczane w wodzie, a potem naniesione metodą kropelkowania na stałe płytki agarowe.Następnie płytki agarowe z przesiewem są fotografowane okresowo, aż do momentu nasycenia wzrostu kolonii drobnoustrojów. Na koniec fotografie przebiegu czasowego wzrostu każdej kultury przekształca się w ilościowe miary gęstości komórek, a obserwowane krzywe wzrostu zestawiane są z modelami wzrostu i ilościowymi miarami dostosowania drobnoustrojów. W rezultacie można uzyskać dane dowodzące interakcji genetycznych poprzez wykazanie, że szczepy drobnoustrojów wykazują różny stopień dostosowania w zależności od kombinacji różnych mutacji lub warunków hodowli.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metody wysokiej gęstości pinowania (np. SGA) czy eksperymenty z konkurencją kodów kreskowych, jest większa dokładność pomiarów dostosowania. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie opracowywania leków przeciwnowotworowych, na przykład dotyczące tego, które geny i procesy są istotne w odpowiedzi na uszkodzenia DNA oraz w kontroli cyklu komórkowego, a także w rozumieniu i przenoszeniu wyników takich badań na podstawowych mikroorganizmach w formie potencjalnych celów terapeutycznych w ludzkich komórkach nowotworowych. Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat funkcji telomerów oraz visi.Metodę tę można zastosować również w innych obszarach biologii drożdży lub w każdym obszarze, w którym fenotypy sprawności (fitness phenotypes) mogą dostarczyć wiedzy na temat biologii drodrobnoustrojów. Mamy nadzieję, że QFA znajdzie zastosowanie w przypadku wielu innych organizmów drobnoustrojowych, dla których istnieją biblioteki macierzowe. Na przykład, povi e coli, orilla surplus. Rozpoczynając od nasyconych kultur nocnych, namnożono 96 niezależnych szczepów drożdży w objętościach 200 µL bogatej pożywki płynnej.W płytce hodowlanej z 96 dołkami należy wysterylizować ręczny replikator z 96 pinami o średnicy 1/8 cala, najpierw zanurzając go w 100% etanolu, a następnie opalając płomieniem i pozostawiając do ostygnięcia. Do dołków płytki 96-dołkowej należy nalać po 200 µL sterylnej wody; nasycone kultury drożdży należy wymieszać w wirówce i rozcieńczyć, zanurzając wysterylizowane narzędzie z pinami trzykrotnie w poszczególnych szczepach. Następnie należy zanurzyć je raz w płytce zawierającej wodę, ponownie wysterylizować narzędzie i pozwolić mu ostygnąć przed trzykrotnym zanurzeniem w rozcieńczonych kulturach. Na koniec należy przenieść próbki z pinów na szalę z pożywką agarową.Po inkubacji płytek z agarem, użyj obrazownika s and p robotics SP do wykonania ręcznego obrazowania płytek w celu zautomatyzowanego hodowania. Rozpocznij od prostokątnej macierzy niezależnych szczepów drożdży hodowanych na stałym agarze. W tym przykładzie szczepy wyjściowe są wynikiem krzyżowania temperaturozależnej mutacji zapytania z kolekcją delecji drożdży.1 536 kultur reprezentujących cztery powtórzenia 384 niezależnych szczepów drożdży jest hodowli na płytkach SGA przy użyciu robota wyposażonego w sterylne narzędzie z 96 pinami o średnicy 1 mm; przeniesiono 384 z 1 536 szczepów do 4 płytek hodowlanych z 96 dołkami zawierających 200 µL pożywki selektywnej; hodowlę prowadzono w temperaturze 20 °C aż do osiągnięcia stanu nasycenia. Aby nanieść nasycone kultury drożdży, należy najpierw przenieść je do robota do obsługi cieczy i resuspender na wytrząsarze magnetycznym; kultury rozcieńczono do stężenia około 1:70, przenosząc je za pomocą sterylnego robotycznego narzędzia z 96 pinami do 200 µL sterylnej wody.Po wyczyszczeniu i wysterylizowaniu narzędzia typu pin, nanieś rozcieńczone kultury na płytki agarowe. W formacie 384 dołków przenieś płytki do inkubatora z kontrolą temperatury i wilgotności, wyposażonego w automatyczny karuzelę oraz właz dostępowy. Do obrazowania kultur użyj zrobotyzowanego systemu obrazowania, który wielokrotnie wyjmuje płytki z inkubatora, zdejmuje pokrywki, przenosi je do jednorodnie oświetlonej przestrzeni pod kamerą 35 mm i wykonuje obraz o rozdzielczości 5 184 na 3 456.System Pixel resolution zakłada pokrywkę, a następnie umieszcza płytki z powrotem w karuzeli inkubatora, aby śledzić lokalizację kultur na płytkach oraz zastosowane wobec nich zabiegi. Płytki są automatycznie kodowane kreskowo zgodnie z nazwą inkubatora, temperaturą, unikalnym sekwencyjnym numerem partii oraz pozycją w inkubatorze. Nazwy obrazów stanowią połączenie nazwy płytki i znacznika czasu i są generowane automatycznie podczas przechwytywania obrazu.Płytki są często etykietowane również ręcznie, aby zapewnić zachowanie tej samej kolejności podczas przenoszenia ich pomiędzy karuzelami robota. Pliki z metadanymi to pliki tekstowe rozdzielane znakami tabulacji, generowane ręcznie. Plik z opisem eksperymentu FT two.Tabela jeden jest unikalna dla każdego eksperymentu, ale opis biblioteki FT trzy, tabela jeden, może być wielokrotnie wykorzystywany. Po skonstruowaniu eksperyment jest opisany w pliku opisu eksperymentalnego FT dwa tabela jeden, który zawiera kolumny na kod kreskowy lub automatycznie wygenerowaną nazwę płytki, znacznik czasu rozpoczęcia eksperymentu, zawartość traktowania płytki, treść stałej pożywki agarowej, nazwę ekranu, numer płytki biblioteki w przypadku bibliotek wielopłytkowych oraz numer kwadrantu powtórzeń dla skalowania z formatu 1 536-dołkowego do formatu 384-dołkowego. Biblioteka szczepów e jest opisana w pliku opisu biblioteki FT trzy, tabela jeden, określającym genotyp hodowany w każdym miejscu kultury.Każda płytka w bibliotece zawiera cztery kolumny: nazwę biblioteki, ORF, numer płytki, wiersz i kolumnę płytki oraz opcjonalną kolumnę uwag. Można dostarczyć opcjonalny plik ze standardowymi nazwami genów FT cztery, tabela jeden, opisujący standardową nazwę genu przypisaną do każdego systematycznego numeru ORF, co pozwala na identyfikację przesiewanych szczepów. Plik ten zawiera dwie kolumny: ORF oraz nazwę genu służącą do analizy danych.Obliczeniowy proces analizy QFA wymaga dostępu do odpowiednio wydajnej wielordzeniowej stacji roboczej, na której zainstalowano odpowiednie oprogramowanie. Narzędzie do analizy obrazów kolonii colonizer oraz pakiet QFAR, oba udokumentowane online, są dostępne bezpłatnie i działają na wielu systemach operacyjnych. Uruchom program colonizer, wykorzystując jako dane wejściowe każdy z przejętych obrazów płytek, co wygeneruje jeden plik wyjściowy colonizer (np. tabela 1) dla każdego obrazu. Pliki wyjściowe z programu colonizer zawierają szacunki gęstości kultury, obszar, kształt oraz kolor kultur.Dla każdej z 384 lokalizacji na płytce obrazu nazwa pliku wyjściowego jest automatycznie kopiowana z nazwy pliku obrazu źródłowego. Pakiet QFAR zawiera funkcje służące do analizy przebiegów czasowych dla każdej hodowli w celu dopasowania uogólnionych logistycznych modeli populacyjnych do obserwacji oraz do ich przedstawienia na wykresach. Przykłady znajdują się na rysunkach dwa i trzy.Dopasowane wartości parametrów są zapisywane w plikach parametrów logistycznych QFA. Pakiet QFAR zawiera również funkcje do kontroli jakości. Kolonie brzegowe są odrzucane ze względu na większą dostępność składników odżywczych na krawędziach płytki oraz trudności w analizie obrazu.Z analizy wyklucza się hodowle znajdujące się w pobliżu ścian płytek, hodowle, które nie przeszły testu SGA, oraz genotypy wykazujące sprzężenie z markerami genetycznymi specyficznymi dla przesiewu. Na podstawie parametrów logistycznego modelu populacyjnego dla każdej hodowli wyznacza się kilka ilościowych miar przystosowania. Obejmują one maksymalne szybkości podwajania populacji oraz liczbę podziałów od momentu inokulacji do nasycenia dla każdego zestawu hodowli powtórzonych oraz dla każdej definicji przystosowania.Obliczono kilka statystyk podsumowujących szacunki dostosowania: średnie i medianowe dostosowanie, odchylenie standardowe dostosowania oraz liczbę zaobserwowanych powtórzeń. Statystyki podsumowujące są wyprowadzane do plików podsumowania dostosowania QFA FT eight, tabela 1 w celu dalszej analizy. Przykładem są obliczenia wyników interakcji genetycznych FT nine tabela 1.Rysunek ten przedstawia typową krzywą wzrostu w skali logarytmicznej dla 384 QFA. Kultury rosnące w temperaturze 20 °C na stałym agarze, ilościowo określone za pomocą kolonizera, wykazują wzrost gęstości komórkowej wykrywalny po około dwóch dniach. Opóźnienie to jest prawdopodobnie wynikiem połączonego efektu fazy adaptacyjnej kultury po inokulacji na podłoże stałe oraz dolnej granicy wykrywalności gęstości komórkowej.Tutaj przedstawiono 308 podobnych krzywych wzrostu zarejestrowanych z jednej płytki. Należy zauważyć, że szczepy, w których uzyskano linię płaską, były w bardzo złym stanie lub martwe. Rycina ta obrazuje porównanie dwóch genomowych przesiewów QFA w celu wnioskowania o sile interakcji genetycznych.Pakiet QFAR zawiera również funkcje służące do generowania wspomnianego wcześniej wykresu krzywej wzrostu oraz do tworzenia rankingowych list badanych genotypów i szacunków siły interakcji genetycznej. Wraz z wartością Q dla istotności zaobserwowanego GIS, po opanowaniu metody, kompletny eksperyment QF.A z czterema powtórzeniami w skali całego genomu można przeprowadzić w ciągu trzech tygodni. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby zachować dobrą organizację w śledzeniu i nazywaniu wszystkich płytek oraz obrazów.Wszystkie płytki muszą zostać zaszczepione i naniesione w odpowiedniej orientacji oraz kolejności. Analiza danych opiera się na poprawności pomocniczych plików tekstowych stworzonych przez badacza. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak oceniać przymocowanie (fitness) tysięcy niezależnych kultur drobnoustrojów.Przystosowanie szacuje się poprzez wielokrotne fotografowanie kultur w plamkach, rosnących na stałych płytkach agarowych, konwersję uzyskanych obrazów na szacunki gęstości komórek oraz generowanie krzywych wzrostu. Modelowanie matematyczne krzywych wzrostu pozwala na ilościowe oszacowanie przystosowania, co może być następnie wykorzystane do wywnioskowania zależności funkcjonalnych między produktami genów w skali całego genomu.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza pracochłonnościowa ilościowa

Przedstawiamy protokół do oceny funkcjonalnej kompleksowych bibliotek mutagenezy saturacji pojedynczym miejscem białek wykorzystujących sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Co ważne, podejście to wykorzystuje ortogonalne pary starterów do budowy i sekwencjonowania bibliotek multipleksowych. Przedstawiono reprezentatywne wyniki przy użyciu TEM-1 β-laktamazy dobranej w klinicznie istotnej dawce ampicyliny.

Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

Opisana jest skuteczna i prosta metodologia komputerowej analizy zachowania nicieni podczas pływania w cieczy. Metoda ta wymaga niewielkich lub żadnych inwestycji dla laboratoriów C. elegans. Używany sprzęt jest standardowy, a oprogramowanie komputerowe do analizy behawioralnej (CeleST) jest oprogramowaniem typu open source.

Zautomatyzowana analiza zachowania C. elegans podczas pływania przy użyciu oprogramowania CeleST

To oparte na molekularnym podejściu do określania sprawności bakterii umożliwia precyzyjne i dokładne wykrywanie mikroorganizmów za pomocą unikalnych kodów kreskowych genomowego DNA, które są określane ilościowo za pomocą cyfrowego PCR. W protokole opisano obliczanie indeksu konkurencyjnego dla szczepów Salmonella; Technologia ta jest jednak łatwa do zaadaptowania do protokołów wymagających bezwzględnej kwantyfikacji każdego genetycznie plastycznego organizmu.

Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli

Framework eVOLVER umożliwia wysokoprzepustową ciągłą hodowlę mikroorganizmów z wysoką rozdzielczością i dynamiczną kontrolą parametrów eksperymentalnych. Protokół ten pokazuje, jak zastosować system do przeprowadzenia złożonego eksperymentu fitness, prowadząc użytkowników przez programowanie automatycznej kontroli nad wieloma indywidualnymi kulturami, mierzenie, gromadzenie i interakcję z danymi eksperymentalnymi w czasie rzeczywistym.

Projektowanie zautomatyzowanych, wysokowydajnych, ciągłych eksperymentów wzrostu komórek przy użyciu eVOLVER

Ten protokół opisuje, jak utrzymać Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) poprzez wykonywanie codziennych transferów i okresowych zamrażania oraz jak przeprowadzać testy konkurencji w celu zmierzenia poprawy kondycji u wyewoluowanych bakterii. Procedury te mogą służyć jako szablon dla naukowców rozpoczynających własne eksperymenty z ewolucją drobnoustrojów.

Codzienne transfery, archiwizacja populacji i pomiar sprawności w długoterminowym eksperymencie ewolucji z Escherichia coli

Tutaj wprowadzamy protokół do przekształcania danych transkryptomicznych w widok mqTrans, umożliwiając identyfikację ciemnych biomarkerów. Chociaż biomarkery te nie są wyrażane różnicowo w konwencjonalnych analizach transkryptomicznych, wykazują różnicową ekspresję w ujęciu mqTrans. Podejście to służy jako technika uzupełniająca tradycyjne metody, odsłaniając wcześniej pomijane biomarkery.

Generowanie widoku regulacji transkrypcji cech transkryptomicznych na potrzeby zadania predykcyjnego i wykrywania ciemnych biomarkerów na małych zestawach danych

Prezentujemy elastyczny, rozszerzalny przepływ pracy oparty na laboratorium Jupyter do nienadzorowanej analizy złożonych zestawów danych multi-omicznych, który łączy różne etapy wstępnego przetwarzania, oszacowanie modelu analizy czynnikowej multi-omicznej i kilka dalszych analiz.

Zastosowanie nienadzorowanej analizy czynników multiomicznych w celu odkrycia wzorców zmienności i procesów molekularnych związanych z chorobami sercowo-naczyniowymi

Technologia wearable ma niski koszt i oferuje wygodne monitorowanie danych fizjologicznych. Jednak dokładność i niezawodność tych urządzeń wymaga starannej oceny, aby zapewnić ich skuteczność i bezpieczeństwo dla użytkowników. Ten raport opisuje proces walidacji komercyjnego smartwatcha w monitorowaniu danych fizjologicznych i aktywności fizycznej.

Ocena dokładności danych smartwatcha fitness do monitorowania aktywności sercowo-naczyniowej i fizycznej: badanie walidacyjne w cyfrowym zdrowiu

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Poznaj metodę ilościowej analizy sprawności fizycznej QFA wykorzystującą obrazowanie i modelowanie wzrostu mikroorganizmów. Technika umożliwia precyzyjną ocenę interakcji genetycznych na skalę genomową.

Schemat ilościowej analizy sprawności fizycznej

Przeglądaj więcej filmów