Name: Produkcja wektorów lentiwirusowych do transdukcji komórek z ośrodkowego układu nerwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj produkcję wektorów lentiwirusowych do transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego. Protokół obejmuje transfekcję, ultrawirówkę i titrację, umożliwiając skuteczną dostawę genów do neuronów i astrocytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NIH Neuroscience Blueprint Core (P30 NS057105, BJS) przyznany Washington University, grant Program Project Grant NS032636 (BJS) oraz przez Hope Center for Neurological Disorders.

1. Pakowanie wektorów lentiwirusowych
Wektory lentiwirusowe są wytwarzane poprzez kotransfekcję lentiwirusowego wektora transferowego oraz innych plazmidów niezbędnych do pakowania do komórek 293T metodą transfekcji fosforanem wapnia. W niniejszym protokole wykorzystujemy 10 szalek hodowlanych o średnicy 100 mm. Skalę procesu można zwiększyć lub zmniejszyć w zależności od zastosowania. Linia komórkowa 293T jest utrzymywana w pożywce DMEM (Dulbecco's modified Eagles medium) z wysoką zawartością glukozy (4500 mg/L), uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 jednostek/ml penicyliny oraz 100 μg/ml streptomycyny, w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
<ol>
	<li>Wysiać komórki 293T do 10 100-mm szalek do hodowli tkankowych w pożywce hodowlanej w zagęszczeniu 30-40% (3 x 106 komórek/szalkę). Umieścić komórki w inkubatorze.</li>
	<li>Po 20-24 h hodowli sprawdzić gęstość komórek. W momencie transfekcji komórki powinny osiągnąć około 80% konfluencji.</li>
	<li>Przygotować probówkę 50-ml. Dodać 4,4 ml TE79/10 (1 mM TrisHCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,9) pomniejszone o całkowitą objętość poniższego plazmidowego DNA. Dodać 100 μg lentiwirusego plazmidu transferowego (Rycina 1), 58 μg pMDLg/pRRE, 31 μg pCMV-G, 25 μg pRSV-Rev oraz 600 μl 2M CaCl2. Delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Przygotować kolejną probówkę 50-ml. Dodać 5 ml 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl, 1,5 mM Na2HPO4, pH 7,12).</li>
	<li>Pobrać mieszaninę DNA-CaCl2 za pomocą pipety 10-ml i dodać do probówki zawierającej 2x HBS, dodając kroplami podczas mieszania probówki na vortexie.</li>
	<li>Pozostawić reakcję wytrącania w temperaturze pokojowej (RT) na 30 min.</li>
	<li>Wyjąć szalki z hodowlą z inkubatora. Dobrze wymieszać reakcję wytrącania na vortexie. Do każdej szalki 100-mm z komórkami dodać 1 ml zawiesiny. Zawiesinę należy dodawać powoli, kroplami, delikatnie kołysząc szalką z pożywką. Umieścić szalki z powrotem w inkubatorze na 5 h.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z hodowli. Do każdej szalki dodać 6 ml świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 6 mM maślanu sodu. Umieścić hodowle w inkubatorze. Po hodowli nocnej, jeśli w konstrukcie znajduje się reporter fluorescencyjny, sprawdzić ekspresję genu reporterowego pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zazwyczaj ponad 80% komórek wykazuje ekspresję genu reporterowego, jeśli jest on sterowany przez promotor powszechny (np. promotor CMV).</li>
	<li>Dwa dni (40-44 h) po transfekcji zebrać nadsącz z 10 szalek do 2 probówek 50-ml (około 30 ml do każdej probówki). Zamrozić nadsącz w zamrażarce -80 °C lub przejść do następnego kroku.</li>
</ol>
2. Zagęszczanie i oczyszczanie wektorów
<ol>
	<li>Odwiruj świeżo pobrany lub rozmrożony nadsącz przy 900 g (około 2000 rpm) przez 10 min, aby usunąć z nadsączu pozostałości komórkowe.</li>
	<li>Podłącz strzykawkę 60 ml do filtra strzykawkowego SFCA 0,2 μm. Przenieś nadsącz z probówki 50 ml do strzykawki. Przefiltruj nadsącz do probówki wirówkowej z polialomeru.</li>
	<li>Pobierz 5 ml 20% sacharozy (przygotowanej w PBS) za pomocą pipety 5 ml. Wprowadź pipetę na dno probówki wirówkowej zawierającej nadsącz. Powoli dodaj roztwór sacharozy pod nadsącz z wektorem. Powtórz te kroki dla nadsączu z kolejnej probówki.</li>
	<li>Odwiruj nadsącz przy 11000 rpm i 4 °C przez 4 h, używając rotora kątowego Beckman SW28.</li>
	<li>Usuń nadsącz. Dodaj 150 μl 4% laktozy (przygotowanej w PBS) do każdej probówki wirówkowej. Resuspenduj osady.</li>
	<li>Przenieś skoncentrowany wektor ze wszystkich probówek wirówkowych do probówki 1,5 ml. Pozostaw probówkę na lodzie na 15 min.</li>
	<li>Wymieszaj zawiesinę wektora poprzez pipetowanie. Odwiruj w mikrowirówce z maksymalną prędkością (około 16000 g) przez 1 min.</li>
	<li>Przenieś nadsącz do nowej probówki 1,5 ml. Podziel końcową próbkę na aliquoty po 20 μl i przechowuj je w zamrażarce w -80 °C.</li>
</ol>
3. Miareczkowanie wektorów
<ol>
	<li>Wysiać 5 x 104 komórek HT1080 na dołek w płytce 12-dołkowej w 1 ml pożywki DMEM uzupełnionej o 10% FBS.</li>
	<li>Po inkubacji przez noc policzyć komórki z jednego dołka i określić ich liczbę.</li>
	<li>Przygotować 5-krotne rozcieńczenia szeregowe (1:5, 1:25, 1:125 oraz 1:625) stężonego wektora w pożywce hodowlanej. Dodać 1 μl każdego z rozcieńczeń wektora do oddzielnych dołków. Próbki można wykonać w duplikacie w celu zwiększenia dokładności.</li>
	<li>Dodać 1 μl Polybrene (bromek heksadymetryny) o stężeniu 4 mg/ml do każdego dołka zawierającego wektor oraz do dołka bez wektora. Wymieszać, delikatnie wstrząsając płytką. Inkubować w inkubatorze przez 48 h.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z dołków z hodowlą komórkową. Przemyć każdy dołek PBS. Dodać do komórek 250 μl 1x roztworu trypsyny-EDTA. Po odklejeniu się komórek (3-5 min), dodać 1 ml pożywki hodowlanej. Resuspender komórki poprzez pipetowanie. Przenieść zawiesinę komórkową do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przy 900 g przez 6 min. W przypadku wektorów z fluorescencyjnym genem reporterowym (np. GFP), przejść do kroku 3.7 w celu analizy FACS. W przypadku wektorów bez genu reporterowego, przejść do kroku 3.8 w celu analizy qPCR w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>W przypadku wektorów zawierających fluorescencyjny gen reporterowy, usunąć nadsącz i resuspender osad w 300 μl 3,7% formaldehydu w PBS. Określić procent komórek pozytywnych pod kątem genu reporterowego za pomocą analizy FACS. Miano zostanie przedstawione jako jednostki transdukcji na mililitr stężonego wektora (TU/ml).</li>
</ol>
<img alt="Wzór na obliczanie miana w badaniach wirusologicznych; liczba komórek, komórki reporterowe, współczynnik rozcieńczenia, wektor." src="/files/ftp_upload/4031/4031eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">
Na przykład, jeśli 1 x 105 komórek zostało transdukowanych 1/25 μl (0,04 μl) wektora i 30% komórek wykazuje pozytywny wynik dla reportera, miano będzie wynosić:
<img alt="Równanie ilustrujące obliczanie stężenia komórek; zawiera konwersję jednostek z µl na ml." src="/files/ftp_upload/4031/4031eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2">
Do obliczenia miana należy użyć wyłącznie tych rozcieńczeń, w których zachodzi liniowa zależność między procentem komórek pozytywnych a ilością dodanego wektora. Końcowe miano powinno być średnią mian uzyskanych z transdukcji co najmniej 2 różnych ilości wektora.
<ol start="8">
	<li>W przypadku wektorów bez fluorescencyjnego genu reporterowego, należy wyizolować DNA genomowe z komórek HT1080 przy użyciu zestawu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) zgodnie z protokołem producenta. Sekwencję wektora w DNA genomowym należy namnożyć za pomocą systemu ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) z użyciem starterów (w regionie HIV-1 PBS/psi 17) 5'-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3' oraz 5'-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3' i sondy TaqMan 5'-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3'. Jako kontrolę wewnętrzną namnożono również gen albuminy, który występuje w genomie w jednej kopii (2 kopie/komórkę), stosując startery 5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3' oraz 5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3' i sondę 5'-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3'. Liczbę kopii wektora i albuminy należy określić metodą PCR na płytce 96-dołkowej zgodnie z instrukcją producenta, stosując następujący program: 50 °C przez 2 min, 95 °C przez 10 min oraz 35 cykli: 95 °C przez 15 sec i 60 °C przez 2 min. W celu stworzenia krzywej wzorcowej do ilościowego oznaczenia nieznanych próbek należy również namnożyć dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne plazmidów o znanym stężeniu (wyrażonym jako liczba kopii) zawierających sekwencje matrycowe. Miano zostanie przedstawione jako jednostki integracyjne na mililitr zagęszczonego wektora (IU/ml).</li>
</ol>
<img alt="Wzór na miano wirusa służący do obliczania stężenia wektora wirusowego przy użyciu liczby kopii komórek i albuminy." src="/files/ftp_upload/4031/4031eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3">
4. Transdukcja kultur neokortykalnych
Kultury neokory zawierające zarówno neurony, jak i glej są przygotowywane z kory mysiej przy użyciu dwuetapowej procedury wysiewu, zgodnie z wcześniejszym opisem 18. Neokory pobrane z myszy płodowych w 14-16 dniu gestation są wysiewane na wcześniej utworzoną warstwę glii w pożywce MEM uzupełnionej o 10% FBS, 20 mM glukozy i 2 mM glutaminy w 24-dołkowej płytce hodowlanej.
<ol>
	<li>Po 5 dniach in vitro do hodowli neokorykalnej dodać 10 μM cytarabiny (Ara-C) w celu zahamowania podziałów komórek nieneuronalnych. Kontynuować hodowlę komórek przez 2 dni.</li>
	<li>Podgrzewać pożywkę hodowlaną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5-10 min. Zastąpić pożywkę zawierającą Ara-C świeżą pożywką hodowlaną (500 μl/dołek).</li>
	<li>Do hodowli dodać wektor z wybraną MOI (multiplicity of infection; stosunek liczby cząsteczek wektora do liczby komórek docelowych). Kontynuować hodowlę przez 24 h. W pierwotnych hodowlach korowych stosujemy MOI od 1-10 (zwykle 5).</li>
	<li>Wymienić pożywkę hodowlaną na świeżą. Kontynuować hodowlę. Jeśli w konstrukcie wektora znajduje się gen reporterowy, sprawdzić komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym 2 dni po transdukcji. Ekspresja genu reporterowego będzie widoczna w neuronach od 2 do 7 dni po transdukcji, w zależności od projektu wektora i zastosowanej dawki.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Miana wektorów lentiwirusowych otrzymanych zgodnie z tym protokołem mieszczą się w zakresie 108-1010 IU/ml, które nadają się do transdukcji różnych typów komórek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) zarówno in vitro i in vivo. Tabela 1 i rycina 2 przedstawiono reprezentacyjny wynik z wykorzystaniem wektorów otrzymanych zgodnie z tym protokołem. Przeprowadzono transdukcję hodowle neocortex myszy z wektorami lentiwirusowymi wykazującymi ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą promotora synapsyny (SYN) lub promotora gliałego białka kwaśnego (GFAP). Siedem dni po transdukcji przeprowadzono barwienie immunocytochemiczne w celu znakowania neuronów i astrocytów odpowiednio przeciwciałami anty-NeuN i anty-GFAP. Jak pokazano w tabela 1 i Ryc. 2A, po transdukcji wektorem zawierającym promotor synapsyny, ponad 90% neuronów (NeuN+ komórki) wykazują ekspresję GFP i nie są astrocytami (GFAP+ komórki) wykazują ekspresję tego genu reporterowego. W przypadku zastosowania promotora GFAP w konstrukcie wektora (Rys. 2B), około 80% astrocytów (GFAP+ komórki) wykazują ekspresję GFP; wszystkie GFP+ Komórkami tymi są astrocyty, co potwierdzono poprzez kolokalizację z GFAP oraz brak ekspresji GFP w komórkach znakowanych NeuN. Wyniki te wykazują, że wektory lentiwirusowe są bardzo wydajne w dostarczaniu transgenów do komórek OUN, a specyficzna dla danego typu komórek ekspresja genów jest możliwa do osiągnięcia przy zastosowaniu odpowiednich promotorów.
<img alt="Schemat prowirusa HIV-1 i wektora lentiwirusowego przedstawiający elementy genetyczne i komponenty transferowe." src="/files/ftp_upload/4031/4031fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie lentiwirusowych wektorów opartych na HIV oraz plazmidów opakowujących. Na górze przedstawiono prowirusa HIV-1. Elementy do produkcji wektora są rozdzielone na cztery różne plazmidy. Lentiwirusowy plazmid transferowy zawiera hybrydowy 5' LTR, w którym region U3 został zastąpiony promotorem cytomegalowirusa (CMV), sygnał opakowywania (ψ), sekwencję RRE, centralny trakt polipurynowy (cPPT), gen zainteresowania (np. fluorescencyjny reporter) wraz z wybranym promotorem oraz 3' LTR, w którym sekwencje regulacyjne cis zostały całkowicie usunięte z regionu U3. pMDLg/pRRE zawiera geny gag i pol oraz sekwencję RRE z HIV-1 pod kontrolą promotora CMV. pRSV-Rev zawiera sekwencję kodującą Rev sterowaną przez promotor RSV. pCMV-G zawiera gen białka VSV-G pod kontrolą promotora CMV. PA oznacza sygnał poliadenylacji z ludzkiego genu β-globiny.
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna, ekspresja GFP w neuronach i gleju, konstrukty LV, nałożenie obrazów dwukolorowych." src="/files/ftp_upload/4031/4031fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ekspresja genów reporterowych w mieszanej kulturze neokory myszy transdukowanej wektorami lentiwirusowymi zawierającymi promotory specyficzne dla typu komórek. Kultury transdukowano wektorami LV-SYN-GFP (A) lub LV-GFAP-GFP (B) przy MOI równym 5. Siedem dni po transdukcji komórki poddano immunobarwieniu przeciwciałem anty-NeuN lub anty-GFAP. Górne panele przedstawiają fluorescencję GFP, środkowe panele przedstawiają immunobarwienie, a dolne panele są obrazami nałożonymi (GFP: zielony; NeuN lub GFAP: czerwony).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wektor</td>
			<td>Komórki GFP+ w neuronach</td>
			<td>GFP+ w astrocytach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-SYN-GFP</td>
			<td>92.2±7.3</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LV-GFAP-GFP</td>
			<td>0</td>
			<td>78.3±11.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Porównanie ekspresji GFP w kulturach nowokory tych mysich po transdukcji wektorami lentiwiralnymi zawierającymi różne promotorya. 
aKultury nowokory tych mysich (5 x 105/dołek w płytce 24-dołkowej) poddano transdukcji LV-SYN-GFP lub LV-GFAP-GFP przy MOI wynoszącym 5. Siedem dni po transdukcji kultury utrwalono i poddano barwieniu immunologicznemu na NeuN lub GFAP. Liczbę komórek wykazujących ekspresję GFP oraz NeuN/GFAP policzono na obrazach z 10 pól dla każdego warunku eksperymentalnego. Wartości przedstawiają procent neuronów (komórek NeuN+) lub astrocytów (komórek GFAP+), które wykazywały również ekspresję genu reporterowego GFP. Przedstawione wartości to średnie ± SD z trzech niezależnych eksperymentów.

<ol><li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li>
<li>Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).</li>
<li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).</li>
<li>Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-promoter+lentiviral+vectors+for+constitutive+and+regulated+gene+expression+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).</li>
<li>Hioki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transduction+of+neurons+by+lentivirus+with+enhanced+neuron-specific+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters.</a> Gene Ther. 14, 872-882 (2007).</li>
<li>Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+promoter+usage+for+lentiviral+vector-mediated+transduction+of+cultured+central+nervous+system+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells.</a> J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).</li>
<li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfer%2C+integration%2C+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li>
<li>Blomer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+sustained+gene+transfer+in+adult+neurons+with+a+lentivirus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector.</a> J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).</li>
<li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+in+vivo+gene+transfer+into+adult+mammalian+neural+stem+cells+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).</li>
<li>Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transgene+expression+in+rat+brain+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors.</a> J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).</li>
<li>Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-activator+gene+of+human+T-lymphotropic+virus+type+III+%28HTLV-III%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III).</a> Science. 229, 69-73 (1985).</li>
<li>Sirven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+immunodeficiency+virus+type-1+central+DNA+flap+is+a+crucial+determinant+for+lentiviral+vector+nuclear+import+and+gene+transduction+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 96, 4103-4110 (2000).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).</li>
<li>Farson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new-generation+stable+inducible+packaging+cell+line+for+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).</li>
<li>Broussau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+packaging+cells+for+large-scale+production+of+lentiviral+vectors+in+serum-free+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture.</a> Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499(2009).</li>
<li>Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titering+lentiviral+vectors%3A+comparison+of+DNA%2C+RNA+and+marker+expression+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods.</a> Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).</li>
<li>Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioning+heat+stress+reduces+excitotoxic+and+apoptotic+components+of+oxygen-glucose+deprivation-induced+neuronal+death+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro.</a> J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).</li>
<li>Mazarakis, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+glycoprotein+pseudotyping+of+lentiviral+vectors+enables+retrograde+axonal+transport+and+access+to+the+nervous+system+after+peripheral+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery.</a> Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).</li>
<li>Kato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-specific+gene+transfer+through+retrograde+transport+of+lentiviral+vector+pseudotyped+with+a+novel+type+of+fusion+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).</li>
<li>Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+protocol+for+lentiviral+vector+mass+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New protocol for lentiviral vector mass production.</a> Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).</li>
<li>Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+production+and+concentration+of+HIV-1-based+lentiviral+vectors+using+HYPERFlask+vessels+and+anion+exchange+membrane+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography.</a> BMC Biotechnol. 9, 10(2009).</li>
<li>Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+butyrate+stimulation+of+HIV-1+gene+expression%3A+a+novel+mechanism+of+induction+independent+of+NF-kappa+B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr+Hum+Retrovirol%22%5BJournal%5D)">Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B.</a> J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).</li>
<li>Gasmi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+efficient+production+and+transduction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors.</a> J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).</li>
<li>Palsson, B., Andreadis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physico-chemical+factors+that+govern+retrovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer.</a> Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).</li>
<li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li>
<li>Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-Protein+Signaling-10+Negatively+Regulates+NF-%7Bkappa%7DB+in+Microglia+and+Neuroprotects+Dopaminergic+Neurons+in+Hemiparkinsonian+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats.</a> J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).</li>
<li>Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoters+and+serotypes%3A+targeting+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+transfer+in+the+rat+central+nervous+system+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo.</a> Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym protokole przedstawiliśmy produkcję wektorów lentiwirusowych oraz zastosowanie tych wektorów w kulturach nowokory). Wykazaliśmy efektywną i specyficzną dla typu komórek transdukcję za pomocą wektorów otrzymanych tymi metodami. Przy zastosowaniu promotora synapsyny ekspresja GFP jest ściśle specyficzna dla neuronów. Przy zastosowaniu promotora GFAP ekspresja GFP występuje wyłącznie w astrocytach. Jeśli nie jest wymagana ekspresja specyficzna dla typu komórek, można zastosować promotor powszechny. Stwierdziliś...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyclone</td><td>SV3001403</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Bromek heksadymetryny (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Komórki 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HT1080</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td></td></tr><tr><td>Szalka do hodowli tkankowej Falcon 100 x 20 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do wirowania z polialom&amp;#8211;eru 1 x 3 &amp;frac12; cala</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,2 µm</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja wektorów lentiwirusem do transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efektywne dostarczanie genów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest istotne w badaniu funkcji genów, modelowaniu chorób neurologicznych i opracowywaniu podejść terapeutycznych. Wektory lentiwirusowe są atrakcyjnymi narzędziami w transdukcji neuronów i innych typów komórek OUN, ponieważ transdukują zarówno komórki dzielące się, jak i niedzielące się, zapewniają trwałą ekspresję transgenów oraz charakteryzują się stosunkowo dużą pojemnością pakowania i niską toksycznością 1-3. Wektory lentiwirusowe zostały z powodzeniem zastosowane w transdukcji wielu typów komórek nerwowych in vitro 4-6 oraz u zwierząt 7-10.
Podjęto ogromne wysiłki w celu opracowania wektorów lentiwiralnych o poprawionym bezpieczeństwie biologicznym i wydajności dostarczania genów. Obecne wektory lentiwiralne trzeciej generacji, wadliwe replikacyjnie i samoinaktywujące się (SIN), przedstawiono na Rysunku 1. Elementy niezbędne do pakowania wektora są rozdzielone na cztery plazmidy. W transferowym plazmidzie lentiwiralnym region U3 w 5' długim powtórzeniu końcowym (LTR) został zastąpiony silnym promotorem z innego wirusa. Modyfikacja ta umożliwia transkrypcję sekwencji wektora niezależnie od białka HIV-1 Tat, które jest normalnie wymagane do ekspresji genów HIV 11. Sygnał pakowania (Ψ) jest niezbędny do enkapsydacji, a element responsywny dla Rev (RRE) jest wymagany do produkcji wektorów o wysokim mianie. Centralny trakt polipurynowy (cPPT) jest ważny dla importu jądrowego DNA wektora, co jest cechą niezbędną do transdukcji komórek niedzielących się 12. W 3' LTR sekwencje cis-regulacyjne zostały całkowicie usunięte z regionu U3. Delecja ta jest kopiowana do 5' LTR po odwrotnej transkrypcji, co prowadzi do inaktywacji transkrypcyjnej obu LTR. Plazmid pMDLg/pRRE zawiera geny HIV-1 gag/pol, które kodują białka strukturalne i odwrotną transkryptazę. pRSV-Rev koduje białko Rev, które wiąże się z RRE w celu wydajnego eksportu RNA z jądra. pCMV-G koduje glikoproteinę wirusa zapalenia jamy ustnej (VSV-G), która zastępuje białko Env HIV-1. VSV-G rozszerza tropizm wektorów i umożliwia ich zagęszczanie poprzez ultrawirowanie 13. Wszystkie geny kodujące białka akcesoryjne, w tym Vif, Vpr, Vpu i Nef, zostały wykluczone z systemu pakowania. Produkcja i manipulowanie wektorami lentiwiralnymi powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi badań z wykorzystaniem rekombinowanego DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). Przed użyciem wektorów lentiwiralnych może być wymagana zgoda odpowiedniej Instytucjonalnej Komisji Bezpieczeństwa Biologicznego i Chemicznego. Wektory lentiwiralne są powszechnie produkowane poprzez kotransfekcję komórek 293T transferowym plazmidem lentiwiralnym oraz plazmidami pomocniczymi kodującymi białka niezbędne do pakowania wektora. Wiele transferowych plazmidów lentiwiralnych i plazmidów pomocniczych można pozyskać z Addgene, non-profitowego repozytorium plazmidów (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Opracowano niektóre stabilne linie komórkowe do pakowania, ale systemy te zapewniają mniejszą elastyczność, a ich wydajność pakowania zazwyczaj spada z czasem 14, 15. Komercyjnie dostępne zestawy do transfekcji mogą zapewniać wysoką wydajność transfekcji 16, ale mogą być bardzo kosztowne przy wielkoskalowych preparacjach wektorów. Metody wytrącania fosforanem wapnia zapewniają wysoką wydajność transfekcji komórek 293T, stanowiąc tym samym niezawodne i kosztowo efektywne podejście do produkcji wektorów lentiwiralnych.
W niniejszym protokole wytwarzamy wektory lentiwirusowe poprzez kotransfekcję komórek 293T czterema plazmidami w oparciu o zasadę wytrącania fosforanu wapnia, a następnie oczyszczamy i zagęszczamy je za pomocą ultrawirowania przez 20% poduszkę sacharozy. Miana wektorów są określane za pomocą analizy FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) lub za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym. Produkcja i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych w tym protokole mogą zostać ukończone w ciągu 9 dni. Przedstawiamy przykład transdukcji tych wektorów do kultur nowokory neokortykalnej myszy zawierających zarówno neurony, jak i astrocyty. Wykazujemy, że wektory lentiwirusowe zapewniają wysoką wydajność transdukcji oraz specyficzną dla typu komórek ekspresję genów w pierwotnych kulturach komórek z OUN.

W niniejszym protokole opisujemy produkcję, oczyszczanie i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych. Przedstawiamy przykład dostarczania genów za pomocą wektora lentiwirusowego do pierwotnych hodowli neuronów i astrocytów. Nasze metody mogą mieć zastosowanie również do innych typów komórek in vitro oraz in vivo.

Produkcja wektorów lentiwirusem do transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego

Efektywne dostarczanie genów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest istotne w badaniu funkcji genów, modelowaniu chorób neurologicznych i opracowywaniu ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie wektorów lentiwirusowych do dostarczania transgenów do komórek ośrodkowego układu nerwowego. Osiąga się to poprzez najpierw kotransfekcję lentiwirusowych plazmidów transferowych oraz plazmidów pomocniczych do komórek 293T z wykorzystaniem zasady wytrącania fosforanem wapnia. Drugim krokiem procedury jest oczyszczanie i zagęszczanie nadsączu wektora poprzez ultrawirowanie na 20% poduszce sacharozowej.Trzecim krokiem jest oznaczenie miana wektora za pomocą analizy FACS lub ilościowej PCR w czasie rzeczywistym. Ostatnim etapem procedury jest transdukcja wektora do komórek docelowych. Ostatecznie wydajność transdukcji oraz specyficzność względem typu komórek można wykazać poprzez immunobarwienie komórek docelowych wykazujących ekspresję transgenu.Główną zaletą naszej techniki w porównaniu z niektórymi innymi istniejącymi metodami, takimi jak stosowanie zestawów komercyjnych, jest to, że stanowi ona niedrogie, skuteczne i niezawodne podejście do produkcji wektorów lentiwirusowych. W związku z tym metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat dostarczania transgenów do komórek ośrodkowego układu nerwowego (CNS). Może ona zostać

production-lentiviral-vectors-for-transducing-cells-from-central

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Produkcja wektorów lentivirusowych do transdukcji komórek z otoczenia układu nerwowego centralnego

W celu wytworzenia lentiwirusów wektory DNA są transfekowane do ludzkich komórek 293. Po zbiorze i skoncentrowaniu naddatku miano wirusa jest określane na podstawie ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego.

Produkcja lentiwirusa

Lentiwirusowe wektory ekspresyjne są najskuteczniejszymi nośnikami do stabilnej ekspresji różnych cząsteczek efektorowych lub konstruktów reporterowych w dzielących się i niedzielących się komórkach ssaków oraz w całych organizmach. Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący pakowania lentiwirusowych konstruktów ekspresyjnych w pseudowirusowe cząstki oraz transdukcji komórek docelowych przy użyciu tych cząstek.

Pakowanie konstruktów ekspresyjnych lentiwektorów opartych na HIV lub FIV oraz transdukcja pseudotypowanych cząsteczek wirusowych VSV-G

Tutaj używamy transdukcji retrowirusowej i transfekcji konkategomerycznej, aby stworzyć linię komórkową, która może wyrażać składniki wektora lentiwirusowego (LV) przy braku tetracykliny. Ten LV koduje GFP i jest pseudotypowany glikoproteiną SVGmu, która jest specyficzna dla receptora na komórkach dendrytycznych.

Linia komórkowa regulowana tetracykliną wytwarza wektory lentiwirusowe o wysokim mianie, które są specyficznie ukierunkowane na komórki dendrytyczne

Tutaj prezentujemy protokoły, które oferują elastyczną i strategiczną podstawę do wirusowego manipulowania komórkami prekursorowymi oligodendrocytów w celu nadekspresji interesujących białek w celu specyficznego zbadania ich roli w oligodendrocytach za pomocą modelu mielinizacji ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem przez regulowany transkrypcyjnie system Śpiącej Królewny. Opisano przygotowanie do integracji wadliwych wektorów lentiwirusowych, transdukcję in vitro komórek ludzkich oraz test molekularny na transdukowanych komórkach.

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Pokazujemy krok po kroku protokół badania funkcji genów w makrofagach rezydujących w tkance otrzewnej in vivo, przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

Poznaj produkcję wektorów lentiwirusowych do transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego. Protokół obejmuje transfekcję, ultrawirówkę i titrację, umożliwiając skuteczną dostawę genów do neuronów i astrocytów.

Produkcja wektorów lentiwirusem do transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego

Przeglądaj więcej filmów