Półilościowe podejście do oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem rozwoju pomarszczonych kolonii

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja i pomiar zmian w tworzeniu biofilmu poprzez ocenę rozwoju pomarszczonych kolonii w czasie. Cel ten osiąga się najpierw poprzez hodowlę wybranych szczepów bakteryjnych w kulturze płynnej. Drugim krokiem jest naniesienie kultur kropelkowo na agar odżywczy.

Następnie plamki są monitorowane w czasie, aby zidentyfikować moment, w którym zaczynają rozwijać struktury trójwymiarowe, co wskazuje na początek formowania się pomarszczonych kolonii. Rozwój morfologii kolonii jest monitorowany do momentu, w którym nie zaobserwowano dalszych zmian. Ostatecznie mikroskopia plamek służy do półilościowego wykazania różnic w rozwoju biofilmu w czasie dla konkretnych szczepów lub w określonych warunkach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia ona półilościową analizę tworzenia się biofilmu bakteryjnego na podstawie rozwoju zmarszczonej morfologii kolonii. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji o tworzeniu biofilmu w przypadku Vireo fishery, można ją również zastosować do charakterystyki fenotypów biofilmu w innych systemach bakteryjnych, takich jak basc, slus, pseudomonas osa i vial cholera. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po raz pierwszy, gdy zidentyfikowaliśmy mutanty bakteryjne wykazujące opóźnienie w rozwoju zmarszczonej morfologii kolonii.

Tworzenie biofilmu jest zazwyczaj zależne od gęstości komórek i tempa wzrostu. W związku z tym, przed oceną pomarszczonej morfologii kolonii, należy wyznaczyć tempo wzrostu i wydajność badanych szczepów w celu określenia szybkości wzrostu. Należy mierzyć przyrost gęstości optycznej lub OD każdego szczepu w czasie i wykreślić krzywą wzrostu, aby określić wydajność lub końcową liczbę komórek.

Można zastosować test wysiewu komórek. Badane szczepy bakteryjne hoduje się w kulturze płynnej, a następnie rozcieńczenia kultur wysiewa się na płytki agarowe. Po inkubacji oblicza się liczbę żywych komórek i przedstawia ją graficznie, jak pokazano tutaj.

Ważne jest również zidentyfikowanie optymalnych warunków nanoszenia plamek, które ujawnią najbardziej wyraźne różnice między próbką kontrolną a badanym mutantem. Aby to osiągnąć przed naniesieniem szczepów hodowlanych z kultur płynnych w różnych warunkach, takich jak różne pożywki lub temperatury, oraz w różnych fazach wzrostu, na przykład w fazie wykładniczej lub stacjonarnej, należy nanieść 10 µL kultury o różnych gęstościach komórkowych na odpowiednie pożywki i inkubować w pożądanej temperaturze do momentu pojawienia się morfologii kolonii. W ten sposób można określić optymalną początkową wartość OD dla danego zestawu szczepów lub warunków, aby rozpocząć tę procedurę.

Przenieś komórki v Fisher eye z płytek z agarem do pięciu mililitrów soli LB lub pożywki LBS zawierającej niezbędne antybiotyki; inkubuj z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C przez noc. Następnego dnia rano wykonaj subkulturę komórek w rozcieńczeniu 1:100 w pięciu mililitrach świeżej pożywki LBS; inkubuj w tych samych warunkach, aż komórki osiągną pożądane OD przy 600 nm. W przypadku Vibrio fii najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy plamki są generowane z kultur o OD wynoszącym około 0,2. Następnie pipetuj jeden mililitr każdej kultury do probówki do mikrocentryfugi i wirować z maksymalną prędkością.

Przez jedną minutę usuń nadosad odsysając go, a następnie zawiesić osad w jednym mililitrze sterylnej, 70% sztucznej wody morskiej lub w SW centrifuge. Komórki, ponownie, ten etap płukania usunie resztki pożywki oraz komponenty zewnątrzkomórkowe. Po odwirowaniu usuń nadosad i zawieś wypłukany osad w jednym mililitrze 70% A SW, aby upewnić się, że każda próbka zawiera liczbę komórek oszacowaną na podstawie OD przy 600 nanometrach.

Wprowadź wszelkie niezbędne korekty, rozcieńczając bardziej stężone próbki dodatkowym 70%A SW, nanieś 10 µL każdej kultury na płytki LBS zawierające niezbędne antybiotyki. Należy prowadzić pipetę palcem tuż nad powierzchnią agaru i nanosić próbki pionowo, a nie pod kątem. Wypuść ciecz powoli, aby uzyskać równomierny rozkład plamki; na tej samej płytce umieść odpowiednie kontrole pozytywne i negatywne.

Podczas oceny tworzenia pomarszczonych kolonii na płytkach pomocniczych, wariancja AFL może wpływać na rozwój biofilmu. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest zidentyfikowanie momentu rozpoczęcia tworzenia się pomarszczonych kolonii. Czasami staje się to widoczne dopiero po zaistnieniu rozwoju.

Aby uchwycić początek rozwoju kolonii pomarszczonych, pobieramy próbki w odstępach godzinnych w określonym przedziale czasowym. Pozwala nam to również na przeprowadzenie porównań po rozpoczęciu rozwoju. Aby zapewnić równomierne rozmieszczenie naniesionej kultury, należy poczekać do wyschnięcia plamki przed przeniesieniem płytki do inkubatora, a następnie odwrócić płytki i inkubować je w temperaturze 28 °C.

Jednym ze sposobów oceny morfologii kultur naniesionych metodą kropelkowania jest test końcowy, który polega na ocenie tworzenia pomarszczonych kolonii w określonym punkcie czasowym po naniesieniu. Jest to reprezentatywny wynik testu końcowego, w którym oceniano tworzenie pomarszczonych kolonii. Po 40 godzinach od naniesienia, po lewej stronie przedstawiono szczep Vibrio FII nietworzący biofilmu, a po prawej szczep tworzący biofilm.

Analiza punktu końcowego jest przydatna w przypadku szczepów, które wykazują lub w których przypuszcza się występowanie poważnych defektów w tworzeniu biofilmu. Inną metodą oceny morfologii kolonii jest analiza przebiegu czasowego, w której tworzenie pomarszczonych kolonii ocenia się w określonym czasie po naniesieniu kropli, co pozwala na łatwe monitorowanie czasu od momentu posiewu. Uruchom stoper.

W tej demonstracji morfologia rosnącej plamki będzie monitorowana co godzinę, zaczynając od 12 do 15 godzin po naniesieniu próbki, przy użyciu stereomikroskopu z dołączoną kamerą, a także funkcji akwizycji i analizy obrazu. Programy komputerowe są wykorzystywane do obserwacji i dokumentowania morfologii kolonii oraz do oceny początku i postępu tworzenia się pomarszczonych kolonii. Przed obrazowaniem kultur naniesionych na podłoże, pokrywkę szalki Petriego zazwyczaj się zdejmuje, aby uzyskać najwyraźniejszy obraz.

W tej konfiguracji plamki są oświetlane od spodu przez przezroczysty szklany stolik za pomocą zimnego źródła światła, podczas gdy obrazy są rejestrowane z góry. Układ ten jest optymalny do obrazowania rozwoju pomarszczonych kolonii, ponieważ kolonie Vibrio fischeri są półprzezroczyste. Aby najlepiej zwizualizować rozwój pomarszczonych kolonii, należy dostosować zarówno natężenie oświetlenia, jak i kąt odbicia pod koloniami bakteryjnymi w taki sposób, aby można było rozpoznać trójwymiarową morfologię rozwijających się biofilmów.

Należy ustalić optymalne warunki oświetlenia, które zapewnią najsilniejszy kontrast między kolonią z plamkami a otaczającym tłem agaru. Ważne jest zachowanie tego samego powiększenia podczas pozyskiwania obrazów w trakcie całego eksperymentu; za pomocą dźwigni znajdującej się z tyłu kamery należy przełączyć widok z okularu mikroskopu na ekran komputera, dostosować obraz, odpowiednio ustawić ostrość, a następnie zapisać zdjęcie. Należy wykonać odpowiednie zdjęcia dokumentujące początek i rozwój formowania się pomarszczonych kolonii. Eksperyment kończy się w momencie, gdy nie następuje dalszy rozwój biofilmu.

Po zakończeniu przeprowadzonych eksperymentów obrazy są scalane w ryciny, aby zwizualizować rozwój wzorca w czasie dla każdego szczepu lub warunku. Należy odnotować, ile czasu upływa od momentu inokulacji do czasu rozpoczęcia formowania się pomarszczonych kolonii; moment rozpoczęcia formowania się pomarszczonych kolonii definiuje się jako punkt czasowy, w którym po raz pierwszy staje się widoczne tworzenie wzorców i struktur 3D. W tym przykładzie rozpoczęcie formowania biofilmu jest widoczne po 12 godzinach dla kompetentnego pod względem tworzenia biofilmu szczepu kontrolnego Vibrio FII, przedstawionego na górnym panelu.

Na dolnym panelu przedstawiono reprezentatywne obrazy szczepu mutant Vibrio FII, który wykazuje czterogodzinne opóźnienie w rozpoczęciu tworzenia pomarszczonych kolonii w czasie, przy czym formowanie biofilmu rozpoczyna się 16 godzin po inokulacji. Należy zauważyć, że choć w wcześniejszych punktach czasowych, przy 40 godzinach, obserwowane są subtelne różnice między tymi szczepami, szczepy wyglądają podobnie pod względem intensywności i wzorca tworzenia biofilmu w każdym punkcie czasowym następującym po rozpoczęciu formowania pomarszczonych kolonii. Należy zwrócić uwagę na wzorzec rozwoju pomarszczonych kolonii.

Architektura może rozwijać się od zewnątrz do wewnątrz, jak pokazano na panelu A, lub od wewnątrz na zewnątrz, jak przedstawiono na panelu B. Ocena ta zapewnia mechanizm odróżniania biofilmów tworzonych przez różne szczepy lub w różnych warunkach. Druga półilościowa miara tworzenia biofilmu wykorzystuje zmieniającą się średnicę kolonii rozwijającej się w czasie. Jak pokazano w górnym panelu, reprezentacyjny szczep zdolny do tworzenia biofilmów formuje kolonie, których złożoność i średnica zwiększają się.

W przeciwieństwie do niego, inny szczep przedstawiony na dolnym panelu nie tworzy biofilmów. Na koniec, figura ta prezentuje graficzną reprezentację wzrostu średnicy kolonii w czasie. W przypadku obu szczepów, szczep zdolny do tworzenia biofilmu jest reprezentowany przez białe okręgi.

Strain nietworzący biofilmu przedstawiono za pomocą czarnych kwadratów. Analiza ta wykazała, że rozmiar kolonii zdolnych do tworzenia biofilmu zwiększa się w szybszym tempie niż rozmiar kolonii niezdolnych do tworzenia biofilmu, a w końcowym punkcie czasowym różnica między nimi była niemal dwukrotna. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o uważnym naniesieniu każdego szczepu oraz o udokumentowaniu początkowego powstawania pomarszczonych kolonii dla każdego szczepu.

Po zastosowaniu tego protokołu można przeprowadzić inne metody, takie jak test iCal lub barwienie całego kryształu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące procesów zaangażowanych w tworzenie biofilmu.