Name: Półilościowe podejście do oceny tworzenia biofilmu za pomocą rozwoju pomarszczonych kolonii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Poznaj półilościową metodę oceny tworzenia biofilmu poprzez obserwację rozwoju pomarszczonych kolonii bakteryjnych w czasie. Technika umożliwia badanie różnic w formowaniu biofilmu między szczepami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NHI R01 GM59690 przyznany KLV.

1. Wstępna charakterystyka i uwagi
<ol>
 <li>Tworzenie biofilmu jest zazwyczaj zależne od gęstości komórek i szybkości wzrostu. Dlatego konieczne jest określenie szybkości wzrostu (wzrostu gęstości optycznej (OD) w czasie) oraz wydajności (końcowej liczby komórek) badanych szczepów poprzez przeprowadzenie prostych testów krzywej wzrostu i wysiewu komórek na płytki. Zaburzenia wzrostu lub brak korelacji między OD a liczbą komórek muszą być uwzględnione podczas interpretacji wyników eksperymentów z nanoszeniem kropel (spotting).</li>
 <li>Podczas oceny tworzenia zmarszczonych kolonii na tej samej płytce należy uwzględnić odpowiednie kontrole pozytywne i negatywne, ponieważ niewielkie różnice między płytkami mogą wpływać na rozwój biofilmu.</li>
 <li>Należy zidentyfikować optymalne warunki do nanoszenia kropel, czyli takie, które wykazują najbardziej wyraźne różnice między kontrolą a badanym mutantem lub mutantami. Przed nanoszeniem kropel szczepy należy hodować w kulturze płynnej w różnych warunkach, np. na różnych pożywkach lub w różnych temperaturach, oraz do różnych faz wzrostu (faza wykładnicza lub stacjonarna). Należy nanieść 10 μl kultury o różnych gęstościach komórkowych na odpowiednie pożywki i inkubować w pożądanej temperaturze do momentu pojawienia się morfologii kolonii.</li>
 <li>Analiza punktu końcowego polega na ocenie tworzenia zmarszczonych kolonii w określonym punkcie czasowym po naniesieniu kropel (np. po 48 godzinach). Taka ocena jest przydatna w przypadku szczepów wykazujących (lub których zakłada się, że wykazują) poważne defekty w tworzeniu biofilmu.</li>
 <li>Analiza przebiegu czasowego ocenia tworzenie zmarszczonych kolonii w określonych odstępach czasu (np. co godzinę) po naniesieniu kropel. Analiza ta umożliwia półilościową ocenę tworzenia biofilmu poprzez wyznaczenie momentu rozpoczęcia tworzenia zmarszczonych kolonii oraz rozwoju wzoru w czasie. Czas trwania eksperymentu i liczba punktów pomiarowych dla danego przebiegu czasowego powinny zostać określone w badaniach wstępnych.</li>
 <li>Aby łatwo kontrolować czas po naniesieniu kropel, należy ustawić stoper w trybie licznika wznoszącego.</li>
</ol>
2. Mikroskopowa ocena pomarszczonej morfologii kolonii V. fischeri
<ol>
 <li>Zaszczep komórki V. fischeri do 5 ml pożywki LB-Salt (LBS) 13 (1% [w/v] tryptony, 0,5% [w/v] ekstraktu drożdżowego, 2% [w/v] chlorku sodu, 50 mM Tris-HCl [pH 7,5]) zawierającej niezbędne antybiotyki i inkubuj z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 28 °C. Rano wykonaj pasaż komórek w rozcieńczeniu 1:100 do 5 ml świeżej pożywki LBS i inkubuj w tych samych warunkach, aż komórki osiągną pożądaną wartość OD600 (np. OD600=0,2 lub 0,5).</li>
 <li>Pipetuj 1 ml hodowli do probówki do mikrowirówki i wiruj w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Usuń nadsącz poprzez aspirację. Przemyj komórki, aby usunąć pozostałości pożywki i komponenty zewnątrzkomórkowe, resuspendując osad w 1 ml sterylnej 70% sztucznej wody morskiej (ASW) (35 mM MgSO4-7H2O, 7 mM CaCl2-2H2O, 210 mM NaCl, 7 mM KCl) i powtarzając wirowanie. Resuspenduj przemyty osad w 1 ml 70% ASW.</li>
 <li>Upewnij się, że każda próbka zawiera taką samą liczbę komórek, oszacowaną na podstawie OD przy 600 nm. Wprowadź niezbędne korekty, rozcieńczając bardziej stężone próbki dodatkową ilością 70% ASW. W eksperymentach wstępnych nanieś kropkowo hodowle o różnych początkowych wartościach OD, aby wyznaczyć optymalną wartość OD startową dla danego zestawu szczepów lub warunków. Najlepsze wyniki dla V. fischeri uzyskuje się, gdy kropki są generowane z hodowli o OD około 0,2.</li>
 <li>Nanieś kropkowo 10 μl przemytych komórek na płytki LBS zawierające niezbędne antybiotyki. Podczas nanoszenia hodowli na płytkę upewnij się, że pipeta jest stabilna (przytrzymaj ją palcem) tuż nad powierzchnią agaru. Nanosić pionowo, nie pod kątem, i wypuszczaj ciecz powoli, aby uzyskać jednorodne rozłożenie kropki. Zazwyczaj każdy szczep jest nanoszony raz na płytkę (do 6 kropek na płytkę), przy użyciu wielu płytek (2-3) na eksperyment.</li>
 <li>Aby upewnić się, że naniesiona hodowla pozostaje równomiernie rozłożona, pozwól kropce wyschnąć przed przeniesieniem płytki do inkubatora. Odwróć płytki i inkubuj je w temperaturze 28 °C.</li>
 <li>Monitoruj morfologię rosnącej kropki co godzinę, zaczynając od 12-15 godzin po inokulacji. Do obserwacji i dokumentacji morfologii kolonii oraz oceny początku i postępu tworzenia się pomarszczonych kolonii używamy stereomikroskopu (Zeiss stemi 2000-C) z przystawką kamerową (ProgRES C10PLUS) oraz programów komputerowych ProgRes CapturePro i ImageJ.</li>
 <li>W przypadku konfiguracji opisanej w kroku 2.5 kropki są oświetlane od dołu przez przezroczysty szklany stolik za pomocą zimnego źródła światła CL 1500 EC, natomiast obrazy są rejestrowane z góry. Taka konfiguracja jest optymalna do obrazowania rozwoju pomarszczonych kolonii, ponieważ kolonie (kropki) V. fischeri są półprzezroczyste.</li>
 <li>W przypadku braku specjalistycznego sprzętu wymienionego w kroku 2.5 monitoruj morfologię pomarszczonych kolonii za pomocą dowolnego stereomikroskopu, który pozwala na pełny podgląd kolonii i posiada regulowane źródło światła oraz, idealnie, dołączoną kamerę. W razie potrzeby można również wykorzystać aparat cyfrowy w przypadku braku dołączonej kamery, ale nie jest to rozwiązanie optymalne.</li>
 <li>Aby najlepiej zwizualizować rozwój pomarszczonych kolonii, konieczne jest dostosowanie zarówno natężenia oświetlenia, jak i kąta odbicia pod koloniami bakteryjnymi w taki sposób, aby można było rozpoznać trójwymiarową morfologię rozwijających się biofilmów. Wyznacz optymalne warunki oświetlenia, które zapewnią najsilniejszy kontrast między naniesioną kolonią a otaczającym tłem agaru, tak aby architektura (zmarszczki) kolonii była wyraźnie rozróżnialna.</li>
 <li>W niektórych przypadkach należy wziąć pod uwagę również kolor naniesionej kolonii, ponieważ podczas tworzenia biofilmu mogą wystąpić zmiany w kolorze kolonii. Dostosuj natężenie i kąt źródła światła, aby ujawnić te subtelne zmiany w barwie. Po uzyskaniu odpowiednich ustawień zachowaj je przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
 <li>Zanotuj, ile czasu upływa od momentu inokulacji do chwili, w której rozpoczyna się tworzenie pomarszczonej kolonii dla każdego szczepu lub warunku. Zdefiniuj początek tworzenia pomarszczonej kolonii jako punkt czasowy, w którym po raz pierwszy widoczne jest tworzenie się wzorów i struktur 3D (tzn. prążkowania formujące się na zewnętrznej krawędzi lub „zmarszczki” występujące w centrum). Komórki mutantów mogą wykazywać skrócony lub wydłużony czas do rozpoczęcia tworzenia pomarszczonej kolonii (np. Rys. 2).</li>
 <li>Dokumentuj początek i rozwój tworzenia pomarszczonej kolonii poprzez rejestrowanie odpowiednich obrazów cyfrowych. Ważne jest stosowanie tego samego powiększenia podczas zbierania obrazów w trakcie całego eksperymentu. Przełącz widok z okularu mikroskopu na ekran komputera za pomocą dźwigni znajdującej się z tyłu kamery. Podczas przełączania między widokiem przez okular a ekranem komputera odpowiednio dostosuj widok i ostrość.</li>
 <li>Przed obrazowaniem naniesionych hodowli zazwyczaj zdejmuje się pokrywkę płytki Petri, aby uzyskać najczystszy obraz. Jest to jednak krok opcjonalny, ponieważ hodowle można obrazować przez pokrywkę, korzystając z konfiguracji opisanej w krokach 2.5 i 2.6.</li>
 <li>W każdym punkcie czasowym po rozpoczęciu tworzenia pomarszczonej kolonii zanotuj wzór rozwoju pomarszczonej kolonii. Architektura może rozwijać się od środka na zewnątrz lub od zewnątrz do środka. Ocena ta pozwala odróżnić biofilmy tworzone przez różne szczepy lub w różnych warunkach.</li>
 <li>Mierz średnicę rozwijającej się kolonii w każdym punkcie czasowym. Można to zrobić ręcznie lub cyfrowo za pomocą powiązanego programu komputerowego. W przypadku pomiaru cyfrowego użyj programu ProgRes CapturePro i najpierw skalibruj pasek skali do konkretnego powiększenia zastosowanego w eksperymencie. Dołącz pasek skali do każdego zarejestrowanego obrazu.</li>
 <li>Aby obliczyć średnicę kolonii za pomocą programu ImageJ, otwórz każdy plik obrazu. Zestandaryzuj pasek skali w następujący sposób: Wybierz opcję „Straight line” z paska narzędzi. Nałóż linię prostą o tej samej długości i szerokości na dołączony pasek skali. Wybierz „Set Scale” z karty oznaczonej jako „Analyze”. W polu „known distance” wpisz odpowiednią długość (wyznaczoną z oryginalnego paska skali; np. 2 mm) i wybierz „OK”.</li>
 <li>Użyj opcji „Straight line”, aby wstawić linię poziomą przez kropkę. W karcie Analyze wybierz „Measure”. W nowym oknie wyników (Results) pojawi się obliczona długość. Wykonaj drugi pomiar, wstawiając linię prostopadłą przez kropkę. Ponownie oblicz średnicę. Zapisz średnią z dwóch pomiarów. Przedstaw średnią średnicę dla każdej kropki w każdym punkcie czasowym na wykresie, korzystając z programu takiego jak Excel.</li>
 <li>Eksperyment kończy się w określonym punkcie czasowym lub gdy nie następuje już dalszy rozwój biofilmu. Po zakończeniu połącz obrazy w jedną lub kilka rycin, aby zwizualizować rozwój wzoru w czasie, korzystając z programu takiego jak Powerpoint.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
W niniejszych eksperymentach wykorzystaliśmy V. fischeri jako organizm modelowy do badania tworzenia biofilmu poprzez ocenę rozwoju pomarszczonych kolonii na stałej powierzchni agarowej. Szczepy V. fischeri wytwarzające biofilm tworzą kolonie o rozbudowanej architekturze 3D w ciągu 40 h (Ryc. 1) 8,9,14. Analiza w czasie pokazuje, że formowanie pomarszczonych kolonii przez szczep kontrolny rozpoczyna się już około 12 h po inokulacji (w zależności od konkretnych warunków) (Ryc. 2) 9. W przeciwieństwie do tego, tworzenie biofilmu przez reprezentatywny mutant jest opóźnione o około 4 h i nie rozpoczyna się aż do około 16 h po inokulacji 9. Powtórzenia tych eksperymentów sugerowały, że czas ten był stosunkowo spójny, co czyni tę ocenę półilościową 9. Druga półilościowa miara tworzenia biofilmu wykorzystuje zmianę średnicy rozwijającej się kolonii w czasie. Jak pokazano na Ryc. 3A, reprezentatywny szczep zdolny do tworzenia biofilmu formuje kolonie, których złożoność i średnica zwiększają się w porównaniu do reprezentatywnego szczepu, który nie tworzy biofilmu. Dokładne pomiary średnic kolonii utworzonych przez te dwa szczepy w czasie wykazały, że rozmiar kolonii zdolnych do tworzenia biofilmu zwiększał się w szybszym tempie niż w przypadku kolonii niezdolnych do tworzenia biofilmu, a w końcowym punkcie czasowym różnica między nimi była niemal dwukrotna (Ryc 3B). Zatem, choć w literaturze często przedstawiane są obrazy reprezentatywnej morfologii kolonii w późnym punkcie czasowym lub "punkcie końcowym", można zebrać dodatkowe dane półilościowe, które pozwolą na lepsze zrozumienie defektu biofilmu.
<img alt="Obraz mikroskopowy porównania kolonii na szalce Petriego do analizy wzrostu kultur komórkowych i badania wzorców." src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Analiza punktu końcowego. Rycina ta przedstawia przykład analizy punktu końcowego z wykorzystaniem reprezentatywnych szczepów V. fischeri nietworzących biofilmu (lewa strona) i tworzących biofilm (prawa strona). Obrazy te zostały wykonane 40 h po naniesieniu kropli. Obrazy zostały wygenerowane z wykorzystaniem szczepów typu dzikiego V. fischeri zawierających kontrolny wektor (nietworzące biofilmu) lub plazmid nadekspresyjny rscS (tworzące biofilm) i stanowiły część zestawu danych zebranych dla Morris et al., 2011.
<img alt="Mikroskopia poklatkowa wzrostu grzyba; schemat przedstawia ekspansję kolonii w czasie od 12 do 40 godzin." src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Analiza przebiegu czasowego. Górny panel zawiera reprezentatywne obrazy tworzenia biofilmu przez szczep kontrolny V. fischeri zdolny do tworzenia biofilmu w wybranym przebiegu czasowym. Rozpoczęcie tworzenia biofilmu jest widoczne w 12 h. Dolny panel zawiera reprezentatywne obrazy szczepu mutanta V. fischeri, który wykazuje opóźnienie (4 h) w rozpoczęciu tworzenia pomarszczonych kolonii w czasie, przy czym tworzenie biofilmu rozpoczyna się w 16 h po inokulacji. Należy zauważyć, że w 40 godzinie szczepy wyglądają podobnie pod względem intensywności i wzorca tworzenia biofilmu, podczas gdy subtelne różnice między tymi szczepami są obserwowane jedynie we wcześniejszych punktach czasowych. Obrazy te zostały wygenerowane z komórek V. fischeri typu dzikiego z nadekspresją rscS oraz mutantów sypE i stanowiły część zestawu danych zebranych dla Morris et al., 2011.
<img alt="Wzrost grzybów w czasie, obrazy kolonii (14-72h), wykres powierzchni w funkcji czasu, analiza mikrobiologiczna." src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Średnica kolonii jako półilościowa analiza tworzenia biofilmu. (A) Przebieg czasowy tworzenia biofilmu przez reprezentatywne szczepy V. fischeri tworzące biofilm (panel górny) i nietworzące biofilmu (panel dolny). Zauważalny jest większy przyrost średnicy w czasie w przypadku szczepu tworzącego biofilm w porównaniu do szczepu nietworzącego biofilmu. Obrazy te uzyskano z dzikiego typu V. fischeri zawierającego plazmid nadekspresujący rscS (tworzący biofilm) lub kontrolny wektor (nietworzący biofilmu) i stanowiły one część zestawu danych zebranych dla Morris et al., 2011. (B) Przedstawienie graficzne przyrostu średnicy kolonii w czasie dla dwóch szczepów z panelu A. Dane te wygenerowano przy użyciu oprogramowania ImageJ i Excel zgodnie z opisem w protokole.

<ol><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).</li>
<li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+as+complex+differentiated+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 187(2002).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20(2005).</li>
<li>Branda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).</li>
<li>Beyhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+rugosity+and+biofilm+formation+in+Vibrio+cholerae%3A+comparison+of+VpsT+and+VpsR+regulons+and+epistasis+analysis+of+vpsT%2C+vpsR%2C+and+hapR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR.</a> J. Bacteriol. 189, 388(2007).</li>
<li>Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+of+biofilm+development+of+opaque+and+translucent+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus.</a> Mol. Microbiol. 55, 1160(2005).</li>
<li>Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SadC+reciprocally+influences+biofilm+formation+and+swarming+motility+via+modulation+of+exopolysaccharide+production+and+flagellar+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function.</a> J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).</li>
<li>Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+symbiosis+regulator+rscS+controls+the+syp+gene+locus%2C+biofilm+formation+and+symbiotic+aggregation+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).</li>
<li>Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+a+novel+response+regulator+is+necessary+for+biofilm+formation+and+host+colonization+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 82, 114(2011).</li>
<li>Nyholm, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Vibrio+fischeri+and+nonsymbiotic+bacteria+in+the+dynamics+of+mucus+secretion+during+symbiont+colonization+of+the+Euprymna+scolopes+light+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113(2002).</li>
<li>Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+conserved+cluster+of+genes+promotes+symbiotic+colonization+and+%C3%8F%C6%9254-dependent+biofilm+formation+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and Ïƒ54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 57, 1485(2005).</li>
<li>Mandel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215(2009).</li>
<li>Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+transposon-induced+motility+mutations+on+colonization+of+the+host+light+organ+by+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 176, 6986(1994).</li>
<li>Geszvain, K., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hybrid+sensor+kinase+RscS+integrates+positive+and+negative+signals+to+modulate+biofilm+formation+in+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 190, 4437(2008).</li>
<li>Krasteva, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+VpsT+regulates+matrix+production+and+motility+by+directly+sensing+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP.</a> Science. 327, 866(2010).</li>
<li>Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+rdar+morphotype%2C+a+multicellular+behaviour+in+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae.</a> Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234(2005).</li>
<li>Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rippling+is+a+predatory+behavior+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus.</a> J. Bacteriol. 188, 5888(2006).</li>
<li>Lee, K., Veeranagouda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicrocells+form+by+reductive+division+in+macroscopic+Pseudomonas+aerial+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures.</a> Environ. Microbiol. 11, 1117(2009).</li>
</ol>

Produkcja i wolny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Zeiss, Inc.

W niniejszej pracy opisujemy półilościową metodę oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem V. fischeri jako organizmu modelowego. W szczególności wykorzystujemy stereomikroskop z dołączoną kamerą do monitorowania tworzenia i rozwoju biofilmu w postaci formowania się pomarszczonych kolonii w czasie na stałej powierzchni agarowej. W niniejszym protokole przedstawiamy dwa konkretne rodzaje metod, których powszechnie używamy do oceny formowania się pomarszczonych kolonii. Pierwszą z nich jest test końcowy (end-point assay), który pozwala na obserwację ostatecznej, ogólnej architektury 3D, wzorowania i średnicy naniesionej kultury w wybranym „końcowym” punkcie czasowym. Podejście to jest najbardziej użyteczne przy ocenie szczepów mutantów lub warunków prowadzących do drastycznych defektów w tworzeniu biofilmu. Jednak metoda ta nie pozwala na rozróżnienie bardziej subtelnych różnic występujących w punktach czasowych poprzedzających wybrany punkt końcowy. Aby dokładniej monitorować formowanie się pomarszczonych kolonii, stosujemy analizę przebiegu czasowego (time course assay), która pozwala zidentyfikować moment rozpoczęcia tworzenia pomarszczonej kolonii i obserwować jej rozwój w czasie. Dzięki temu podejściu można zidentyfikować subtelniejsze różnice w czasie formowania się pomarszczonych kolonii, ich architekturze 3D oraz wzorowaniu. Wykorzystaliśmy tę analizę przebiegu czasowego do opracowania dwóch półilościowych testów tworzenia biofilmu. Po pierwsze, czas, w którym szczep zaczyna rozwijać architekturę 3D, można porównać z czasem dla szczepów kontrolnych. Stwierdziliśmy, że opóźnienie w tworzeniu biofilmu u konkretnego mutanta w tych samych warunkach jest dość spójne 9. Na przykład w danych przedstawionych na Rys. 2 mutant konsekwentnie wykazywał około 4 h opóźnienia w inicjowaniu tworzenia biofilmu. Drugą półilościową miarą tworzenia biofilmu jest zmiana średnicy pomarszczonej kolonii (plamki). Zaobserwowaliśmy, że średnica pomarszczonych kolonii stopniowo różni się od średnicy kolonii nietworzących biofilmu, osiągając około 2-krotną różnicę w końcowym punkcie czasowym (Rys. 3) (Morris i Visick, dane niepublikowane). Do tej pory nie zaobserwowaliśmy jednego fenotypu bez drugiego (tzn. tworzenia biofilmu bez zwiększenia średnicy kolonii) (dane niepublikowane), choć nadal możliwe jest, że niektóre mutanty będą zachowywać się inaczej. Rzeczywiście, w przypadku V. cholerae zgłaszano, że niektóre pomarszczone kolonie prowadzą do znacznego zwiększenia średnicy kolonii, podczas gdy inne nie 15. Mimo to, ocena zmiany średnicy w czasie mogłaby pomóc w charakterystyce potencjalnych mutantów biofilmu i/lub dostarczyć dodatkowej miary ilościowej dla mutantów z opóźnieniem w rozwoju. Z dwóch miar tworzenia biofilmu (czas i średnica), wyznaczenie momentu rozpoczęcia formowania się pomarszczonej kolonii jest bardziej czułe, ale także bardziej subiektywne niż wyznaczenie średnicy plamki. Niemniej jednak obie miary zapewniają półilościową ocenę fenotypu, który jest niezwykle użyteczny dla badaczy biofilmu, ale nie poddaje się łatwej kwantyfikacji.
Podczas przeprowadzania testów z nakropieniem kultur ważne jest uwzględnienie warunków środowiskowych, w których hodowane są nakropione szczepy. Tworzenie pomarszczonych kolonii jest często zależne od różnych czynników środowiskowych, w tym dostępności składników odżywczych, temperatury i wilgotności. Aby zmniejszyć zmienność między eksperymentami, pomocne jest maksymalne ustandaryzowanie tych warunków (np. standaryzacja objętości pożywki na płytkach agarowych i hodowanie nakropionych szczepów w kontrolowanej temperaturze). W celu dalszego ograniczenia zmienności między eksperymentami z nakropieniem, ważne jest uwzględnienie odpowiednich szczepów kontrolnych w każdym zestawie badań. Wreszcie, przy interpretacji danych z tych testów, konieczne jest powtórzenie każdego eksperymentu wielokrotnie (3+), zwłaszcza przy ocenie subtelnych różnic w tworzeniu pomarszczonych kolonii (np. opóźnienia w tworzeniu biofilmu lub różnic w jego wzorze). Niektóre ograniczenia tego protokołu to: 1) trudność w określeniu, czy komórki mają defekt wzrostu: wzrost komórek w kulturze płynnej może nie odzwierciedlać dokładnie tempa wzrostu na pożywkach stałych, a dokładne określenie wzrostu komórek tworzących biofilm, które mogą się ze sobą sklejać, może być niemożliwe; 2) analiza szczepów z defektami wzrostu będzie problematyczna; 3) może nie być możliwe rozróżnienie różnic w średnicy między szczepami o subtelnych fenotypach biofilmu; 4) w przypadku szczepów, które nie rosną w formie koncentrycznego pierścienia, może nie być możliwe dokładne zmierzenie zmian średnicy; 5) choć podczas tworzenia biofilmu można obserwować wzorowanie, nie ma sposobu na ilościowe określenie wzoru powstałego biofilmu; oraz 6) w tej konfiguracji eksperymentalnej nie ma możliwości zmierzenia wymiaru Z biofilmu. Pomimo tych ograniczeń, protokół ten dostarcza jednak sposobu na uzyskanie danych liczbowych pomagających w ocenie tworzenia pomarszczonych kolonii.
W niniejszym protokole wykorzystujemy specjalistyczny system obrazowania (tj. mikroskop stereoskopowy Zeiss oraz oprogramowanie do obrazowania ProgRes CapturePro) w celu obserwacji i oceny tworzenia się pomarszczonych kolonii. Opisany tutaj system obrazowania jest bardzo wydajny: możliwość wykrycia początku tworzenia się pomarszczonych kolonii, a tym samym oceny rozwoju w podejściu czasowym, jest znacznie zwiększona dzięki zastosowaniu mikroskopu stereoskopowego. Jeśli jednak technologia ta jest niedostępna, protokół można dostosować do użytku z innym sprzętem, w tym z prostym aparatem cyfrowym z zoomem. Chociaż niniejszy protokół koncentruje się na ocenie rozwoju pomarszczonych kolonii, można go również zmodyfikować w celu oceny tworzenia się pelikuli, formy biofilmu, która rozwija się, gdy komórki rosną statycznie w hodowli płynnej. Protokół ten może być również przydatny w ocenie innych wskaźników tworzenia biofilmu, w tym włączania specyficznych barwników do naniesionych kolonii podczas rozwoju biofilmu. Należą do nich, między innymi, barwniki takie jak czerwień kongijska i kalkofluor, które mogą wiązać się z celulozą, częstym składnikiem bakteryjnych biofilmów 16. Ponadto protokół ten, choć opracowany do użytku z V. fischeri, nie ogranicza się do tego organizmu, lecz może zostać uogólniony na badanie tworzenia biofilmu u wielu różnych organizmów, takich jak Bacillus subtilis 4, Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6 oraz Pseudomonas aeruginosa 7, z których wszystkie wykazują tworzenie pomarszczonych kolonii. Wreszcie, można go również dostosować do badania innych morfologii kolonii posiadających wzorzec rozwojowy, takich jak potencjalnie wzorowanie zachodzące podczas wzrostu Myxococcus xanthus 17 oraz rozwój struktur powietrznych u Pseudomonas aeruginosa 18. Niniejszy protokół znajduje zatem ogólne zastosowanie w badaniach mikrobiologicznych oraz badaniach nad biofilmem.

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop Zeiss stemi 2000-C</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>45505300000000000</td><td>(nabyty poprzez Lukas Microscope)</td></tr><tr><td>ProgRes C10&lt;sup&gt;PLUS&lt;/sup&gt;</td><td>JENOPTIK Optical Systems GmbH</td><td>017953-602-26</td><td>Adapter kamery (nabyty poprzez Lukas Microscope)</td></tr><tr><td>Zimne źródło światła CL 1500 EC</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>4355400000000000</td><td>(nabyty poprzez Lukas Microscope)</td></tr><tr><td>ProgRes CapturePro</td><td>JENOPTIK Optical Systems GmbH</td><td>Bezpłatne oprogramowanie do zarejestrowanej kamery</td><td>Program komputerowy do przechwytywania obrazu</td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institutes of Health</td><td>Bezpłatne oprogramowanie ze strony:&lt;a href=&quot;http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html&quot; target=&quot;_blank"> http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html&lt;/a&gt;</td><td>Program komputerowy do pomiarów średnicy</td></tr></tbody></table>

półilościowe podejście do oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem rozwoju pomarszczonych kolonii

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilmy, czyli przytwierdzone do powierzchni społeczności komórek zamknięte w macierzy zewnątrzkomórkowej, stanowią powszechny sposób bytowania wielu bakterii. W obrębie biofilmu komórki bakteryjne często wykazują zmienioną fizjologię, w tym zwiększoną oporność na antybiotyki i inne stresy środowiskowe 1. Ponadto biofilmy mogą odgrywać istotną rolę w interakcjach między gospodarzem a mikroorganizmami. Biofilmy powstają, gdy bakterie przechodzą ze stanu pojedynczych komórek planktonicznych do formowania złożonych, wielokomórkowych społeczności 2. W warunkach laboratoryjnych biofilmy bada się poprzez ocenę rozwoju specyficznych fenotypów biofilmowych. Typowym fenotypem biofilmowym jest tworzenie pomarszczonych lub rugoznych kolonii bakteryjnych na stałych pożywkach agarowych 3. Tworzenie pomarszczonych kolonii stanowi szczególnie prosty i użyteczny sposób identyfikacji i charakteryzacji szczepów bakteryjnych wykazujących zmienione fenotypy biofilmowe oraz badania warunków środowiskowych wpływających na tworzenie biofilmu. Tworzenie pomarszczonych kolonii służy jako wskaźnik formowania biofilmu u wielu rodzajów bakterii, w tym zarówno bakterii Gram-dodatnich, takich jak Bacillus subtilis 4, jak i bakterii Gram-ujemnych, takich jak Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7 oraz Vibrio fischeri 8.
Morska bakteria V. fischeri stała się modelem tworzenia biofilmu ze względu na krytyczną rolę biofilmów podczas kolonizacji gospodarza: biofilmy produkowane przez V. fischeri wspomagają kolonizację mątwy hawajskiej Euprymna scolopes 8-10. Co istotne, fenotypy biofilmu obserwowane in vitro korelują ze zdolnością komórek V. fischeri do efektywnej kolonizacji zwierząt gospodarzy: szczepy z upośledzonym tworzeniem biofilmu in vitro wykazują defekt kolonizacji 9,11, natomiast szczepy wykazujące zwiększone fenotypy biofilmu charakteryzują się wzmocnioną kolonizacją 8,12. V. fischeri stanowi zatem prosty system modelowy do oceny mechanizmów, za pomocą których bakterie regulują tworzenie biofilmu oraz tego, jak biofilmy wpływają na kolonizację gospodarza.
W niniejszym raporcie opisujemy półilościową metodę oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem V. fischeri jako systemu modelowego. Metoda ta polega na precyzyjnym naniesieniu kropel kultur bakteryjnych o określonych stężeniach i objętościach na stałe podłoża agarowe; naniesiona w ten sposób kultura jest analogiczna do pojedynczej kolonii bakteryjnej. Technika „naniesionych kropel” może być wykorzystana do porównania ogólnych fenotypów biofilmu w pojedynczych, określonych punktach czasowych (analizy końcowe) lub do identyfikacji i charakterystyki subtelnych fenotypów biofilmu poprzez analizy przebiegu czasowego rozwoju biofilmu oraz pomiary średnicy kolonii, na którą wpływa proces tworzenia biofilmu. Tym samym technika ta umożliwia półilościową analizę tworzenia biofilmu, pozwalając na ocenę czasu i wzorca rozwoju pomarszczonych kolonii oraz względnej wielkości rozwijającej się struktury, co stanowi charakterystykę wykraczającą poza prostą morfologię ogólną.

Przedstawiamy prostą, półilościową metodę badania tworzenia się biofilmu in vitro. Metoda ta wykorzystuje stereomikroskop Zeiss stemi 2000-C (z dołączoną kamerą) do monitorowania czasu oraz wzorca tworzenia się biofilmu, ocenianego na podstawie rozwoju pomarszczonych kolonii.

Półilościowe podejście do oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem rozwoju pomarszczonych kolonii

Biofilmy, czyli przytwierdzone do powierzchni społeczności komórek otoczone macierzą zewnątrzkomórkową, stanowią powszechny sposób bytowania wielu bakterii. W obrębie...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja i pomiar zmian w tworzeniu biofilmu poprzez ocenę rozwoju pomarszczonych kolonii w czasie. Cel ten osiąga się najpierw poprzez hodowlę wybranych szczepów bakteryjnych w kulturze płynnej. Drugim krokiem jest naniesienie kultur kropelkowo na agar odżywczy.Następnie plamki są monitorowane w czasie, aby zidentyfikować moment, w którym zaczynają rozwijać struktury trójwymiarowe, co wskazuje na początek formowania się pomarszczonych kolonii. Rozwój morfologii kolonii jest monitorowany do momentu, w którym nie zaobserwowano dalszych zmian. Ostatecznie mikroskopia plamek służy do półilościowego wykazania różnic w rozwoju biofilmu w czasie dla konkretnych szczepów lub w określonych warunkach.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia ona półilościową analizę tworzenia się biofilmu bakteryjnego na podstawie rozwoju zmarszczonej morfologii kolonii. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji o tworzeniu biofilmu w przypadku Vireo fishery, można ją również zastosować do charakterystyki fenotypów biofilmu w innych systemach bakteryjnych, takich jak basc, slus, pseudomonas osa i vial cholera. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po raz pierwszy, gdy zidentyfikowaliśmy mutanty bakteryjne wykazujące opóźnienie w rozwoju zmarszczonej morfologii kolonii.Tworzenie biofilmu jest zazwyczaj zależne od gęstości komórek i tempa wzrostu. W związku z tym, przed oceną pomarszczonej morfologii kolonii, należy wyznaczyć tempo wzrostu i wydajność badanych szczepów w celu określenia szybkości wzrostu. Należy mierzyć przyrost gęstości optycznej lub OD każdego szczepu w czasie i wykreślić krzywą wzrostu, aby określić wydajność lub końcową liczbę komórek.Można zastosować test wysiewu komórek. Badane szczepy bakteryjne hoduje się w kulturze płynnej, a następnie rozcieńczenia kultur wysiewa się na płytki agarowe. Po inkubacji oblicza się liczbę żywych komórek i przedstawia ją graficznie, jak pokazano tutaj.Ważne jest również zidentyfikowanie optymalnych warunków nanoszenia plamek, które ujawnią najbardziej wyraźne różnice między próbką kontrolną a badanym mutantem. Aby to osiągnąć przed naniesieniem szczepów hodowlanych z kultur płynnych w różnych warunkach, takich jak różne pożywki lub temperatury, oraz w różnych fazach wzrostu, na przykład w fazie wykładniczej lub stacjonarnej, należy nanieść 10 µL kultury o różnych gęstościach komórkowych na odpowiednie pożywki i inkubować w pożądanej temperaturze do momentu pojawienia się morfologii kolonii. W ten sposób można określić optymalną początkową wartość OD dla danego zestawu szczepów lub warunków, aby rozpocząć tę procedurę.Przenieś komórki v Fisher eye z płytek z agarem do pięciu mililitrów soli LB lub pożywki LBS zawierającej niezbędne antybiotyki; inkubuj z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C przez noc. Następnego dnia rano wykonaj subkulturę komórek w rozcieńczeniu 1:100 w pięciu mililitrach świeżej pożywki LBS; inkubuj w tych samych warunkach, aż komórki osiągną pożądane OD przy 600 nm. W przypadku Vibrio fii najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy plamki są generowane z kultur o OD wynoszącym około 0,2. Następnie pipetuj jeden mililitr każdej kultury do probówki do mikrocentryfugi i wirować z maksymalną prędkością.Przez jedną minutę usuń nadosad odsysając go, a następnie zawiesić osad w jednym mililitrze sterylnej, 70% sztucznej wody morskiej lub w SW centrifuge. Komórki, ponownie, ten etap płukania usunie resztki pożywki oraz komponenty zewnątrzkomórkowe. Po odwirowaniu usuń nadosad i zawieś wypłukany osad w jednym mililitrze 70% A SW, aby upewnić się, że każda próbka zawiera liczbę komórek oszacowaną na podstawie OD przy 600 nanometrach.Wprowadź wszelkie niezbędne korekty, rozcieńczając bardziej stężone próbki dodatkowym 70%A SW, nanieś 10 µL każdej kultury na płytki LBS zawierające niezbędne antybiotyki. Należy prowadzić pipetę palcem tuż nad powierzchnią agaru i nanosić próbki pionowo, a nie pod kątem. Wypuść ciecz powoli, aby uzyskać równomierny rozkład plamki; na tej samej płytce umieść odpowiednie kontrole pozytywne i negatywne.Podczas oceny tworzenia pomarszczonych kolonii na płytkach pomocniczych, wariancja AFL może wpływać na rozwój biofilmu. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest zidentyfikowanie momentu rozpoczęcia tworzenia się pomarszczonych kolonii. Czasami staje się to widoczne dopiero po zaistnieniu rozwoju.Aby uchwycić początek rozwoju kolonii pomarszczonych, pobieramy próbki w odstępach godzinnych w określonym przedziale czasowym. Pozwala nam to również na przeprowadzenie porównań po rozpoczęciu rozwoju. Aby zapewnić równomierne rozmieszczenie naniesionej kultury, należy poczekać do wyschnięcia plamki przed przeniesieniem płytki do inkubatora, a następnie odwrócić płytki i inkubować je w temperaturze 28 °C.Jednym ze sposobów oceny morfologii kultur naniesionych metodą kropelkowania jest test końcowy, który polega na ocenie tworzenia pomarszczonych kolonii w określonym punkcie czasowym po naniesieniu. Jest to reprezentatywny wynik testu końcowego, w którym oceniano tworzenie pomarszczonych kolonii. Po 40 godzinach od naniesienia, po lewej stronie przedstawiono szczep Vibrio FII nietworzący biofilmu, a po prawej szczep tworzący biofilm.Analiza punktu końcowego jest przydatna w przypadku szczepów, które wykazują lub w których przypuszcza się występowanie poważnych defektów w tworzeniu biofilmu. Inną metodą oceny morfologii kolonii jest analiza przebiegu czasowego, w której tworzenie pomarszczonych kolonii ocenia się w określonym czasie po naniesieniu kropli, co pozwala na łatwe monitorowanie czasu od momentu posiewu. Uruchom stoper.W tej demonstracji morfologia rosnącej plamki będzie monitorowana co godzinę, zaczynając od 12 do 15 godzin po naniesieniu próbki, przy użyciu stereomikroskopu z dołączoną kamerą, a także funkcji akwizycji i analizy obrazu. Programy komputerowe są wykorzystywane do obserwacji i dokumentowania morfologii kolonii oraz do oceny początku i postępu tworzenia się pomarszczonych kolonii. Przed obrazowaniem kultur naniesionych na podłoże, pokrywkę szalki Petriego zazwyczaj się zdejmuje, aby uzyskać najwyraźniejszy obraz.W tej konfiguracji plamki są oświetlane od spodu przez przezroczysty szklany stolik za pomocą zimnego źródła światła, podczas gdy obrazy są rejestrowane z góry. Układ ten jest optymalny do obrazowania rozwoju pomarszczonych kolonii, ponieważ kolonie Vibrio fischeri są półprzezroczyste. Aby najlepiej zwizualizować rozwój pomarszczonych kolonii, należy dostosować zarówno natężenie oświetlenia, jak i kąt odbicia pod koloniami bakteryjnymi w taki sposób, aby można było rozpoznać trójwymiarową morfologię rozwijających się biofilmów.Należy ustalić optymalne warunki oświetlenia, które zapewnią najsilniejszy kontrast między kolonią z plamkami a otaczającym tłem agaru. Ważne jest zachowanie tego samego powiększenia podczas pozyskiwania obrazów w trakcie całego eksperymentu; za pomocą dźwigni znajdującej się z tyłu kamery należy przełączyć widok z okularu mikroskopu na ekran komputera, dostosować obraz, odpowiednio ustawić ostrość, a następnie zapisać zdjęcie. Należy wykonać odpowiednie zdjęcia dokumentujące początek i rozwój formowania się pomarszczonych kolonii. Eksperyment kończy się w momencie, gdy nie następuje dalszy rozwój biofilmu.Po zakończeniu przeprowadzonych eksperymentów obrazy są scalane w ryciny, aby zwizualizować rozwój wzorca w czasie dla każdego szczepu lub warunku. Należy odnotować, ile czasu upływa od momentu inokulacji do czasu rozpoczęcia formowania się pomarszczonych kolonii; moment rozpoczęcia formowania się pomarszczonych kolonii definiuje się jako punkt czasowy, w którym po raz pierwszy staje się widoczne tworzenie wzorców i struktur 3D. W tym przykładzie rozpoczęcie formowania biofilmu jest widoczne po 12 godzinach dla kompetentnego pod względem tworzenia biofilmu szczepu kontrolnego Vibrio FII, przedstawionego na górnym panelu.Na dolnym panelu przedstawiono reprezentatywne obrazy szczepu mutant Vibrio FII, który wykazuje czterogodzinne opóźnienie w rozpoczęciu tworzenia pomarszczonych kolonii w czasie, przy czym formowanie biofilmu rozpoczyna się 16 godzin po inokulacji. Należy zauważyć, że choć w wcześniejszych punktach czasowych, przy 40 godzinach, obserwowane są subtelne różnice między tymi szczepami, szczepy wyglądają podobnie pod względem intensywności i wzorca tworzenia biofilmu w każdym punkcie czasowym następującym po rozpoczęciu formowania pomarszczonych kolonii. Należy zwrócić uwagę na wzorzec rozwoju pomarszczonych kolonii.Architektura może rozwijać się od zewnątrz do wewnątrz, jak pokazano na panelu A, lub od wewnątrz na zewnątrz, jak przedstawiono na panelu B. Ocena ta zapewnia mechanizm odróżniania biofilmów tworzonych przez różne szczepy lub w różnych warunkach. Druga półilościowa miara tworzenia biofilmu wykorzystuje zmieniającą się średnicę kolonii rozwijającej się w czasie. Jak pokazano w górnym panelu, reprezentacyjny szczep zdolny do tworzenia biofilmów formuje kolonie, których złożoność i średnica zwiększają się.W przeciwieństwie do niego, inny szczep przedstawiony na dolnym panelu nie tworzy biofilmów. Na koniec, figura ta prezentuje graficzną reprezentację wzrostu średnicy kolonii w czasie. W przypadku obu szczepów, szczep zdolny do tworzenia biofilmu jest reprezentowany przez białe okręgi.Strain nietworzący biofilmu przedstawiono za pomocą czarnych kwadratów. Analiza ta wykazała, że rozmiar kolonii zdolnych do tworzenia biofilmu zwiększa się w szybszym tempie niż rozmiar kolonii niezdolnych do tworzenia biofilmu, a w końcowym punkcie czasowym różnica między nimi była niemal dwukrotna. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o uważnym naniesieniu każdego szczepu oraz o udokumentowaniu początkowego powstawania pomarszczonych kolonii dla każdego szczepu.Po zastosowaniu tego protokołu można przeprowadzić inne metody, takie jak test iCal lub barwienie całego kryształu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące procesów zaangażowanych w tworzenie biofilmu.

a-semi-quantitative-approach-to-assess-biofilm-formation-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Półilościowy podejście do oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem rozwoju pomarszczonej kolonii

Analiza opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby. Metoda ta wykorzystuje płytkę mikrotitracyjną jako podłoże do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego, a sam biofilm jest wizualizowany przy użyciu fioletu krystalicznego. Analiza ta pozwala na jakościowe lub ilościowe oznaczenie wczesnego etapu tworzenia biofilmu.

Analiza tworzenia biofilmu w płytkach mikrotitrowych

Niniejszy artykuł opisuje procedurę tworzenia i wizualizacji biofilmu bakteryjnego hodowanego w szkiełku przedmiotowym z komorą...

In vitro tworzenie biofilmu w szkiełku przedmiotowym z 8-komorowym układem

Źródło: Bucher, T. i in., Metodologie badań biofilmów B. subtilis jako modelu do charakteryzacji inhibitorów biofilmu małocząsteczkowego. J. Vis. Exp.(2016)Ten film pokazuje przygotowanie dojrzałych kolonii biofilmu bakteryjnego do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Obejmuje etapy utrwalania, odwodnienia, montażu oraz nakładania powłok metalowych, aby zachować i zobrazować morfologię biofilmu.

Przygotowanie kolonii biofilmu bakteryjnego do analizy morfologicznej

Film pokazuje test przylegania do fazy stałej do oceny tworzenia biofilmu. W płytce wielodołkowej bakterie w pożywce uzupełnionej solą żółciową przylegają do powierzchni stałych, tworząc biofilmy, co potwierdza kolorymetria poprzez barwienie fioletem krystalicznym i obróbkę etanolem.

Test przylegania do fazy stałej w celu oceny tworzenia się biofilmu

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

To badanie przedstawia rozwój powtarzalnych metodologii badania inhibitorów biofilmu i ich wpływu na wielokomórkowość Bacillus subtilis.

Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzującego małocząsteczkowe inhibitory biofilmu

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Opisujemy techniki utrwalania, zatapiania parafiny i cienkiego cięcia biofilmów kolonii mikroorganizmów. W przygotowanych próbkach za pomocą mikroskopii można uwidocznić podstrukturę biofilmu i wzorce ekspresji reporterowej.

Osadzanie parafiny i cienkie cięcie biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej

Ten protokół opisuje przygotowanie inokulum, kwantyfikację biofilmu na płytkach mikromiareczkowych za pomocą barwnika fioletu krystalicznego, liczenie żywotnych w biofilmach oraz wizualizację biofilmów Acinetobacter.

Kwantyfikacja, ocena żywotności i strategie wizualizacji biofilmów Acinetobacter

Protokół ten zapewnia modułowy workflow BSL-2, łączący testy biomasy kryształowo-fioletowej, kinetykę kontrastu fazowego poklatkowego, konfokalne mapowanie 3D/matrycowe macierzy, ultrastrukturę SEM oraz moduł in vivo dla infekcji chomików, aby kultywować, ilościować, charakteryzować i badać funkcjonalną rolę biofilmu Leptospira , umożliwiając standaryzowaną ocenę mutantów i interwencji antybiofilmowych w różnych laboratoriach.

Modułowy workflow do analizy ilościowej, strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów Leptospira

Poznaj półilościową metodę oceny tworzenia biofilmu poprzez obserwację rozwoju pomarszczonych kolonii bakteryjnych w czasie. Technika umożliwia badanie różnic w formowaniu biofilmu między szczepami.

Półilościowe podejście do oceny tworzenia biofilmu z wykorzystaniem rozwoju pomarszczonych kolonii

Przeglądaj więcej filmów