Model mysi wewnątrzluminalnego MCAO: ocena zawału mózgu za pomocą barwienia fioletem krezylu

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie modelu udaru niedokrwiennego u myszy. W pierwszej kolejności tymczasowo podwiązuje się wspólną tętnicę szyjną, natomiast zewnętrzną tętnicę szyjną podwiązuje się trwale tak dystalnie, jak to możliwe. Powyżej rozwidlenia tętnicy szyjnej zewnętrznej umieszcza się kolejny, lekko dociągnięty szew tymczasowy.

Drugim krokiem jest zaklemowanie tętnicy szyjnej wewnętrznej za pomocą pęsety o działaniu odwróconym, aby zapobiec krwawieniu. Następnie należy przeciąć ECA pomiędzy wiązaniem stałym a tymczasowym. W kolejnym etapie do ECA wprowadza się monofilament w powłoce silikonowej.

Następnie tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) odwraca się, aby wprowadzić monofilament do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), aż obejmie on podstawę tętnicy mózgu środkowej. Po godzinie przywraca się przepływ krwi poprzez usunięcie monofilamentu, aby zasymulować przywrócenie przepływu krwi po lizie zakrzepu zatorowego u ludzi. Ostatecznie deficyt neurologiczny, odzwierciedlający powodzenie procedury T-M-C-A-O oraz rozległość zawału, może zostać oceniony bezpośrednio po reperfuzji oraz w różnych odstępach czasu po reperfuzji.

Oprogramowanie Cyan image z NIH jest wykorzystywane do obliczenia objętości zawału na reprezentatywnych przekrojach mózgu barwionych fioletem krystalicznym. Jedną z głównych zalet przejściowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu z wykorzystaniem techniki filamentu wewnątrznaczyniowego jest fakt, że naśladuje ono udar niedokrwienny u pacjentów poprzez przywrócenie przepływu krwi, a opracowanie tej procedury u myszy daje możliwość wykorzystania narzędzi genetyki markerowej do zidentyfikowania roli białka docelowego. W modelu udaru przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu wykonuje się u samców myszy C 57 black six w wieku od dwóch do trzech miesięcy, o masie ciała od 22 do 28 g.

Protokół ten został zatwierdzony przez Komitet Bioetyczny IRCM w celu zwiększenia powtarzalności objętości zawału. Stosujemy wielorazowe monofilamenty o długości 12 mm i średnicy 60 µm z powłoką silikonową firmy Doco Corporation. Dwie godziny przed operacją.

Wykonaj myszy iniekcję buprenorfiny dootrzewnowo w dawce 0,03 milligrams per kilogram. Aby rozpocząć procedurę, znieczul myszy 5% isoflurenem i utrzymuj znieczulenie przy stężeniu 2,5% isofluranu; użyj mata grzewczego, aby utrzymać stałą temperaturę ciała myszy podczas operacji, a skórę w okolicy szyi zdezynfekuj 70% etanolem lub Betadyną. Następnie wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej szyi i rozsuń tkanki miękkie pod mikroskopem stereoskopowym.

Wykonaj tępe rozcięcie szyi myszy, aby odsłonić tchawicę. Następnie odsun mięśnie, aby zlokalizować tętnicę szyjną wspólną. Ostrożnie wypreparuj lewą tętnicę szyjną wspólną z otaczających ją tkanek.

Umieść tymczasową szwę z jedwabiu 5-0, pociętą na 20 milimetrowe segmenty, wokół tętnicy. Należy uważać, aby nie uszkodzić nerwu błędnego. Następnie oddziel rozwidlenie lewej tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) i tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), a następnie umieść trwałą szwę wokół ECA tak dystalnie, jak to możliwe.

Następnie nałóż kolejny tymczasowy szew na ECA powyżej rozwidlenia. Po czym zaciskaj lewą ICA, używając pęsety o działaniu odwrotnym, aby uniknąć krwawienia. Ponownie, zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić nerwu błędnego.

Wytnij mały otwór w ECA przed rozwidleniem na ECA i ICA oraz pomiędzy wcześniej założonymi szwami permanentnymi i tymczasowymi. Następnie wprowadź do ECA 12-milimetrowy szew monofilamentowy z powłoką silikonową o rozmiarze 6-0, całkowicie przetnij ECA i wprowadź monofilament do ICA. Zwiąż szew ściśle, aby zapobiec krwawieniu, a następnie wyjmij pęsetę z funkcją odwracalną.

Następnie wprowadź monofilament do kręgu Willisa, aż zablokuje on podstawę tętnicy środkowej mózgu (MCA). Należy go wprowadzić na głębokość około 9 do 10 mm poza rozwidlenie tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) i tętnicy szyjnej wspólnej (CCA). Zazwyczaj monofilament zostanie zatrzymany i nie będzie mógł przesunąć się dalej.

Należy uważać, aby nie uszkodzić tętnicy podniebiennej wstępującej. Mocno zawiązać szew na ECA, aby ustabilizować włókno w odpowiedniej pozycji. Następnie zamknąć skórę za pomocą systemu zamykania ran auto clip.

Wstrzyknij podskórnie jeden mililitr roztworu soli fizjologicznej i umieść myszy pod lampą grzewczą na podczerwień podczas okresu po okluzji, który trwa 60 minut. Z narkozuj myszy w taki sam sposób jak poprzednio i usuń automatyczne klipsy, lekko rozwierając szew na ECA, aby umożliwić wycofanie monofilamentu i reperfuzję krwi. Następnie na stałe zawiąż tymczasowy szew na ECA, aby zapobiec utracie krwi.

Godzinę po udarze wyciągnij monofilament i zachowaj go do ponownego użycia. Następnie usuń tymczasowy szew na CCA, aby umożliwić ponowny przepływ krwi. Zamknij ranę oraz tkankę podskórną.

Wstrzyknij myszom kolejny 1 mL roztworu soli fizjologicznej. Po upewnieniu się, że zwierzę odzyskało sprawność ruchową, umieść je z powrotem w klatce, ustawiając połowę klatki na podkładce grzewczej, aby umożliwić myszom wybór środowiska. 12 godzin po operacji, we wszystkich grupach operacji pozorowanych myszy otrzymują kolejną dawkę buprenorfiny.

Wszystkie procedury są identyczne, z wyjątkiem tego, że po operacji nie wprowadza się monofilamentu. Deficyt neurologiczny jest oceniany w celu potwierdzenia powodzenia procedury T-M-C-A-O i określenia jej skuteczności; deficyty neurologiczne myszy ocenia się w 1, 24, 48 i 72 godzinach po perfuzji w sześciostopniowej skali w następujący sposób: zero oznacza stan prawidłowy, jeden oznacza łagodny skręt z niespójnym lub bez niespójnego zwijania się podczas podnoszenia za ogon. Więcej niż 50% prób zwinięcia się w stronę przeciwległą.

Wynik dwa oznacza umiarkowane i spójne zwijanie w ponad 50% prób zwijania się w stronę przeciwległą. Wynik trzy oznacza spójne, silne i natychmiastowe zwijanie. Mysz utrzymuje pozycję zwiniętą przez więcej niż jedną do dwóch sekund.

Z nosem niemal dotykającym ogona. Stopień czwarty oznacza silne zwijanie. Postępując w stronę wygięcia w łuk (barreling), utrata odruchu chodzenia lub pisania; stopień piąty oznacza stan śpiączki lub całkowite zwinięcie w kłębek.

Po perfuzji roztworem PBS, szybko zamroź mózgi w izopentanie i przechowuj je w temperaturze -80 °C. Należy pamiętać, że w zależności od planowanych badań immunohistochemicznych, mózgi myszy można również perfundować 4% paraformaldehydem. Następnie, przy użyciu kriotoma, wykonaj koronalne przekroje mózgu o grubości 17 µm, wykorzystując 30 szkiełek.

Umieść jeden przekrój z każdych 30 na tym samym szkiełku. Następnie zabarw pierwsze i piętnaste szkiełko fioletem krystalicznym. Aby uzyskać dokładniejszą ocenę objętości uszkodzenia, użyj systemu analizy obrazu, takiego jak Scion image z NIH, aby ocenić obszar zmiany, czyli obszar zawału, który w lewej i prawej półkuli mózgu przejawia się kolorem białym.

Powtórz to ograniczenie D na wszystkich skrawkach mózgu. Oblicz objętość zawału w jednostkach umownych i wyraź ją jako procent przeciwległego obszaru nieuszkodzonego dla każdego przekroju. Pozostałe preparaty przechowuj w temperaturze -80 °C do badań immunohistochemicznych.

Ocena punktacji neurologicznej potwierdza powodzenie T-M-C-A-O u myszy poddanych procedurze wewnątrznaczyniowej. Jak widać tutaj, obserwuje się spójne, silne i umiarkowane zwijanie się, a mysz utrzymuje zwiniętą pozycję przez ponad jedną do dwóch sekund, przy czym nos niemal dotyka ogona. W naszym eksperymencie wszystkie myszy wykazywały co najmniej łagodne, spójne zwijanie się, co odpowiada punktacji neurologicznej równej dwa w całym okresie testowym.

Barwienie fioletem Kressela wykonano w celu oceny zakresu zawału mózgu. Po zastosowaniu modelu T-M-C-A-O przedstawiono reprezentatywne przekroje czołowe mózgu myszy zabarwione fioletem Kressela 72 godziny po reperfuzji. Obszar zawału, obejmujący głównie prążkowie, korę oraz przyległe obszary mózgu, które zostały oznakowane, widoczny jest w kolorze białym, ponieważ nie uległ zabarwieniu fioletem.

Kolorem fioletowym zaznaczono objętość uszkodzenia, która stanowi białą część prawej półkuli wyrażoną jako procent powierzchni nieuszkodzonej półkuli przeciwległej w lewej hemisferze. Objętość zawału u samców myszy C 57 black six po udarze niedokrwiennym reprezentuje około 70% nieuszkodzonej półkuli. Procedura ta zapewnia wysoką powtarzalność tworzenia uszkodzeń.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak wywołać przemijający udar niedokrwienny u myszy. Ponadto, podejście z wykorzystaniem quiz viol do pomiaru objętości zawału mózgu daje ogromną zaletę w postaci dostępu do dużej ilości materiału do badania odpowiednich markerów za pomocą immunochemii. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.