Name: Mysi model śródświetlnego MCAO: ocena zawału mózgu za pomocą barwienia fioletem krezylowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj model śródświetlnego MCAO u myszy do badania udaru niedokrwiennego z oceną neurologiczną i barwieniem fioletem krezylowym. Ta metoda umożliwia badanie genetycznych czynników wpływających na przebieg udaru.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsze badanie było wspierane przez grant CIHR TEAM nr CTP 82946, grant CIHR nr MOP 102741, a także fundusz Canada chair nr 216684 oraz Strauss Foundation. E.R. otrzymała wsparcie w ramach stypendium z Canadian Heart &amp; Stroke Foundation.

Przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (MCAO)
 1. Procedura chirurgiczna (Rysunek 1)
 Przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (tMCAO) wykonuje się u samców myszy C57Bl/6 w wieku od 2 do 3 miesięcy (22-28g). Protokół ten został zatwierdzony przez komisję bioetyczną ds. opieki nad zwierzętami IRCM. Narzędzia chirurgiczne sterylizowano w autoklawie (121 °C przy 15 psi przez 60 min). Pomiędzy kolejnymi zwierzętami narzędzia sterylizowano za pomocą sterylizatora koralikowego (15 sek). Stół operacyjny i pozostały sprzęt dezynfekuje się 70% etanolem.
 Na dwie godziny przed operacją myszom podano buprenorfinę w celu uśmierzenia bólu (0,03 mg/kg b.w. i.p.).
 Rysunek 1A. 
 <ol>
 <li>Mysz wprowadza się w stan głębokiej narkozy za pomocą 5% izofluranu, a następnie utrzymuje znieczulenie przy stężeniu 2,5% izofluranu. Podczas operacji temperatura ciała myszy jest utrzymywana na stałym poziomie za pomocą mata grzewczego.</li>
 <li>Sierść i skórę dezynfekuje się 70% etanolem lub Betadine. Ponieważ golenie powoduje uwalnianie fragmentów włosa, powstawanie mikrościernięć oraz stan zapalny, które mogą wpływać na patofizjologię udaru, nie golimy futra myszy.</li>
 <li>Wykonuje się cięcie w linii pośrodkowej szyi i delikatnie rozsuwa tkanki miękkie.</li>
 <li>Pod mikroskopem stereoskopowym (Stemi 2000, Zeiss) przeprowadza się tępe rozcięcie w celu odsłonięcia tchawicy i odsuniecia mięśni, aby zlokalizować tętnicę szyjną wspólną.</li>
 <li>Lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA) ostrożnie oddziela się od otaczających tkanek, a następnie czasowo zamyka za pomocą tymczasowej szwy (1), używając jedwabnej nici 5-0 pociętej na odcinki 20 mm. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić nerwu błędnego.</li>
 <li>Wyodrębnia się miejsce rozgałęzienia lewej tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) i tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA). Szew stały (2) zakłada się wokół ECA tak dystalnie, jak to możliwe, a kolejny szew tymczasowy, lekko zaciśnięty (3), zakłada się na ECA dystalnie od rozwidlenia.</li>
 <li>Zaciska się lewą ICA (4) za pomocą pęsety z odwrotnym działaniem, aby zapobiec krwawieniu. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić nerwu błędnego.</li>
 <li>W ECA wykonuje się mały otwór (5) pomiędzy szwem stałym (2) a tymczasowym (3).</li>
 </ol>
 Rycina 1B. 
 <ol start="9">
 <li>Wprowadź 12 mm długą jednonitkową sznurówkę 6-0 z powłoką silikonową (powłoka silikonowa o długości ok. 9-10 mm) (Doccol Corporation) do tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) (6), całkowicie przetnij ECA dystalnie względem stałej szwy i wprowadź okluder do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA). Sznurówkę należy ciasno zawiązać wokół monofilamentu, aby zapobiec krwawieniu, a następnie wyjąć pęsetę z odwróconym działaniem.</li>
 <li>Okluder wprowadza się w celu zamknięcia ujścia tętnicy środkowej mózgu (MCA) w kręgu Willisa. Wprowadzanie należy przerwać na ok. 9-10 mm za rozwidleniem ECA i tętnicy szyjnej wspólnej (CCA). Okluder zostaje zablokowany i nie może się już przesuwać. Należy zachować ostrożność, aby nie przebić tętnicy skrzydłowopodniebiennej. Sznurówkę (3) na ECA należy ciasno zawiązać, aby utrwalić monofilament w pozycji.</li>
 <li>Zamknij skórę za pomocą systemu zamykania ran autoclip.</li>
 <li>Wstrzyknij 1 ml roztworu soli fizjologicznej podskórnie i umieść myszy pod lampą grzewczą na podczerwień przez cały okres po okluzji (60 min).</li>
 </ol>
 2. Przywrócenie przepływu krwi w tętnicy środkowej mózgu
 Przed ponownym znieczuleniem można sprawdzić wynik neurologiczny (neuroscore), aby ocenić powodzenie operacji.
 <ol>
 <li>Zanurz myszy w narkozie zgodnie z wcześniejszym opisem i usuń autoklipsy.</li>
 <li>Lekko rozluźnij szew (3) na tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), aby umożliwić wyjęcie monofilamentu i reperfuzję krwi.</li>
 <li>Na stałe zawiąż tymczasowy szew na ECA, aby zapobiec utracie krwi. Monofilament należy zachować do ponownego użycia.</li>
 <li>Usuń tymczasowy szew (1) na tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), aby umożliwić ponowny przepływ krwi.</li>
 <li>Zamknij ranę. Myszy powinny otrzymać podskórnie kolejny 1 ml roztworu soli fizjologicznej.</li>
 <li>Umieść myszy pod lampą grzewczą na podczerwień na 1 hr. Po upewnieniu się, że zwierzę odzyskało sprawność ruchową, mysz zostaje przeniesiona do klatki i pozostawiona na podkładce grzewczej i ręcznikach przez 72 hr. Należy pamiętać, aby na podkładce grzewczej umieścić tylko połowę klatki, co pozwoli myszom na wybór środowiska. Ponieważ zazwyczaj obserwuje się utratę masy ciała po operacji, w szalce Petriego należy umieścić rozgnieciony pokarm, aby zachęcić zwierzęta do jedzenia. 
 Dwanaście godzin po zabiegu myszy otrzymały kolejną dawkę buprenorfiny (0.03 mg/kg b.w. i.p).</li>
</ol>
 3. Operacja pozorowana
 W przypadku operacji pozorowanych wszystkie procedury są identyczne, z wyjątkiem tego, że okluder nie jest wprowadzany.
 4. Neuroscore
 Deficyty neurologiczne pozwalają na ocenę powodzenia tMCAO bezpośrednio po reperfuzji, a w późniejszym czasie na oszacowanie stopnia nasilenia uszkodzenia. Deficyty neurologiczne są punktowane zgodnie z wcześniejszym opisem 5, a ocenę przeprowadza się w 1, 24, 48 i 72 h po reperfuzji. Stosowana jest rozszerzona skala sześciopunktowa:
 <ul>
 <li>0: prawidłowy.</li>
 <li>1: łagodne zachowanie krążenia z niespójną lub bez niespójnej rotacją podczas podniesienia za ogon, &lt;50% prób rotacji na stronę przeciwległą.</li>
 <li>2: łagodne, spójne krążenie, &gt;50% prób rotacji na stronę przeciwległą.</li>
 <li>3: spójne, silne i natychmiastowe krążenie, mysz utrzymuje pozycję rotacyjną przez ponad 1-2 sec, z nosem niemal dotykającym ogona.</li>
 <li>4: silna rotacja przechodząca w ruch obrotowy (barreling), utrata zdolności chodzenia lub odruchu prostowania.</li>
 <li>5: stan śpiączki lub stan agonalny.</li>
 </ul>
 5. Barwienie fioletem krezylowym (Rysunek 2)
 Po perfuzji roztworem PBS mózgi są szybko mrożone w izopentanie i przechowywane w temperaturze -80 °C. W zależności od planowanych badań immunohistochemicznych, mózgi myszy mogą być również perfundowane 4% paraformaldehydem (PFA). Wykonuje się przekroje koronalne mózgu (17 μm) przy użyciu kriostatu. Jeden przekrój z każdych 30 jest zbierany na tym samym szkiełku, aby uzyskać reprezentatywny obraz uszkodzenia mózgu. W celu kwantyfikacji objętości, 2 szkiełka barwi się fioletem krezylu, a do oceny zmiany wykorzystuje się system analizy obrazu (Scion Corporation, Frederick, MD). Objętość uszkodzenia obliczano w jednostkach arbitralnych (pikselach) i wyrażano jako procent przeciwległego, nieuszkodzonego obszaru dla każdego przekroju. Pozostałe szkiełka przechowuje się w temperaturze -80 °C do badań immunohistochemicznych. Alternatywnie, utrwalony w PFA mózg można kroić w grubości 30-50 μm przy użyciu wibratomu, a objętość zawału mierzyć zgodnie z zaleceniami Han et al. (2009)6.

<ol><li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%2C+I%3A+a+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. rain <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((infarction+is+not+reduced+in+SOD-1+transgenic+mice+after+a+permanent+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia.</a> Neuroreport. 5, 293-296 (1993).</li>
<li>Yang, G., Chan, P. H., Chen, J., Carlson, E., Chen, S. F., Weinstein, P., Epstein, C. J., Kamii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+copper-zinc+superoxide+dismutase+transgenic+mice+are+highly+resistant+to+reperfusion+injury+after+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Human copper-zinc superoxide dismutase transgenic mice are highly resistant to reperfusion injury after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 25, 165-170 (1994).</li>
<li>Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+stroke+model+guidelines+for+preclinical+stroke+trials+%281st+edition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Stroke+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition.</a> J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).</li>
<li>Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlortetracycline+and+demeclocycline+inhibit+calpains+and+protect+mouse+neurons+against+glutamate+toxicity+and+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia.</a> J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).</li>
<li>Han, R. Q., Ouyang, Y. B., Xu, L., Agrawal, R., Patterson, A. J., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postischemic+brain+injury+is+attenuated+in+mice+lacking+the+beta2-adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth.+Analg%22%5BJournal%5D)">Postischemic brain injury is attenuated in mice lacking the beta2-adrenergic receptor.</a> Anesth. Analg. 108, 280-287 (2009).</li>
<li>Rousselet, E., Marcinkiewicz, J., Kriz, J., Zhou, A., Hatten, M. E., Prat, A., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCSK9+reduces+the+protein+levels+of+the+LDL+receptor+in+mouse+brain+during+development+and+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke.</a> J. Lipid Res. 52, 1383-1391 (2011).</li>
<li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%3A+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1986).</li>
<li>Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+pterygopalatine+arterial+blood+flow+decreases+infarct+volume+variability+in+a+mouse+model+of+intraluminal+suture+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 18-24 (2008).</li>
<li>Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+suture+size+and+carotid+clip+application+upon+blood+flow+and+infarct+volume+after+permanent+and+temporary+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Brain Res. 970, 131-192 (2003).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia%3A+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).</li>
</ol>

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez firmę Zeiss, Inc.

Opracowano różne modele udaru, aby naśladować skutki udaru u pacjentów. Wybór modelu udaru zależy od stawianego pytania biologicznego. Intraluminalny model MCAO naśladuje jeden z najczęstszych typów udaru niedokrwiennego u pacjentów, jest mniej inwazyjny i bardziej powtarzalny niż model Tamury 4,7. Jest to niezwykle interesujący model do analiz neuroprotekcji, neuroregeneracji i śmierci komórkowej. Sukces modelu intraluminalnego zależy od wielu czynników, takich jak płeć, wiek i masa ciała zwierzęcia, temperatura, znieczulenie oraz czas trwania zabiegu, które muszą być kontrolowane. Właściwości fizyczne okludera (średnica końcówki, długość, kształt i elastyczność) mają krytyczne znaczenie dla powtarzalności MCAO 4. W niniejszej pracy stosujemy monofilament 6-0 o długości 12 mm, pokryty silikonem na odcinku 9-10 mm, firmy Doccol Corporation. Wielką zaletą tego monofilamentu jest redukcja krwawień podpajęczynówkowych, a ponieważ jego długość obejmuje całą długość ICA, zapobiega to pozostałemu przepływowi krwi pochodzącemu z przednich i tylnych tętnic łączących koła Willisa oraz PPA, co zmniejsza zmienność objętości zawału (zmienność na poziomie 15% w naszych badaniach) 8. Podwiązanie CCA również zmniejsza zmienność objętości zawału 9.
	Zakres uszkodzenia mózgu po tMCAO można oceniać na różne sposoby. Deficyty neurologiczne można mierzyć w sposób wspomniany wcześniej, jednak trudno jest uzyskać za pomocą tej metody wydajny pomiar. Zakres zawału określa się zazwyczaj poprzez barwienie TTC. W ostatnim czasie stosowane są również techniki rezonansu magnetycznego, które stanowią szczególnie interesującą technologię w przypadku terapii neuroprotekcyjnych. Aby zrozumieć leżące u podłoża udaru mechanizmy komórkowe, takie jak neuroreparacja, śmierć komórek czy proliferacja komórek, krytyczne i bardzo informacyjne jest badanie różnych markerów metodą immunohistochemii. Zatem nasz protokół przygotowywania przekrojów mózgu ma tę wielką zaletę, że umożliwia przeprowadzenie tych analiz i minimalizuje liczbę wykorzystanych myszy. Ponadto Tureyen et al. 10 wykazali, że istnieje dobra korelacja między barwieniem fioletem krezylowym a barwieniem TTC.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td><a href="http://www.zeiss.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz o wysokiej intensywności Fiber-Light</td><td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System anestezjologiczny do izofluranu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>CDMV</td><td>108737</td><td></td></tr><tr><td>Koc grzewczy</td><td>Gaymar Medsearch</td><td>TP22G</td><td></td></tr><tr><td>Podczerwieniona lampa grzewcza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęseta ultraprecyzyjna, model 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78320-5TI</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Vannasa, ostrze 3 mm, proste</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72932-01</td><td></td></tr><tr><td>Model LA-1 i MPF-1, wszystkie ostrza gładkie</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77926-5S</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta o działaniu odwróconym, model KOPINC 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72850-F</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do sekcji 5 1/2", proste</td><td>Cedarlane</td><td>72960</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw startowy Autoclip</td><td>Harvard apparatus</td><td>34-0557</td><td></td></tr><tr><td>System zamykania ran BD Autoclip, dł. 9 mm, 100/opak.</td><td>Fisher</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>Szew 5-0</td><td>Harvard apparatus</td><td>517763</td><td></td></tr><tr><td>Materiał szewny PDS II monofilament fioletowy, 5-0, RB-1; Z303H</td><td>CDMV</td><td>6167</td><td></td></tr><tr><td>Szew monofilamentowy powlekany silikonem 6-0, dł. 12 mm</td><td>Doccol Corporation</td><td>60SPRePK5</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>Fisher</td><td>14-823-2F</td><td></td></tr><tr><td>Igły 26G1/2</td><td>Fisher</td><td>BD-305111</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C57BL/6&lt;/em&gt; myszy</td><td>IRCM</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

model mysi wewnątrzluminalnego mcao: ocena zawału mózgu za pomocą barwienia fioletem krezylu

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Udar jest trzecią przyczyną śmiertelności i główną przyczyną niepełnosprawności na świecie. Udar niedokrwienny odpowiada za około 80% wszystkich udarów. Jednakże trombolityczny aktywator plazminogenu tkankowego (tPA) jest jedyną istniejącą metodą leczenia ostrego udaru niedokrwiennego. Skłoniło to badaczy do opracowania kilku modeli udaru niedokrwiennego u różnych gatunków. Opracowano dwa główne typy modeli gryzoni: modele globalnego niedokrwienia mózgu lub ogniskowego niedokrwienia mózgu. Aby naśladować udar niedokrwienny u pacjentów, u których około 80% udarów zakrzepowych lub zatorowych występuje w obszarze tętnicy środkowej mózgu (MCA), model wewnątrzświatowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest bardzo istotny w badaniach nad udarem. Model ten został opracowany po raz pierwszy u szczurów przez Koizumi et al. w 1986 roku 1. Ze względu na łatwość manipulacji genetycznych u myszy, modele te opracowano również u tego gatunku 2-3.
	W niniejszym opracowaniu przedstawiamy procedurę przejściowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCA) u myszy C57/Bl6. Wcześniejsze badania wykazały, że właściwości fizyczne okludera, takie jak średnica końcówki, długość, kształt i elastyczność, mają kluczowe znaczenie dla powtarzalności objętości zawału 4. W niniejszej metodzie zastosowano komercyjne monofilamenty powlekane silikonem (Doccol Corporation). Kolejną istotną zaletą jest fakt, że monofilament ten zmniejsza ryzyko wywołania krwawień podpajęczynówkowych. Przy użyciu stereomikroskopu Zeiss Stemi 2000 monofilament powlekany silikonem wprowadzono do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) via nacięcie w tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), aż do momentu zamknięcia podstawy MCA przez monofilament. Przepływ krwi przywrócono po 1 godzinie poprzez usunięcie monofilamentu, aby naśladować przywrócenie przepływu krwi po lizie skrzepu tromboembolicznego u ludzi. Zakres zawału mózgu można ocenić najpierw za pomocą skali neurologicznej oraz poprzez pomiar objętości zawału. Myszy z niedokrwieniem analizowano pod kątem wyniku neurologicznemu w różnych odstępach czasu po reperfuzji. W celu oceny objętości zawału zazwyczaj stosuje się barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazoliom (TTC). W niniejszym przypadku zastosowano barwienie fioletem krezylowym, ponieważ umożliwia ono badanie wielu krytycznych markerów metodą immunohistochemiczną. W niniejszym filmie opisujemy procedurę MCAO, ocenę neurologiczną oraz wyznaczanie objętości zawału za pomocą barwienia fioletem krezylowym.

Ocena neuroscore potwierdza powodzenie tMCAO po udarze i określa efektywność tMCAO po reperfuzji. W naszych badaniach wszystkie myszy poddane procedurze wewnątrzluminalnej wykazywały co najmniej łagodne, stałe zwijanie się (neuroscore 2), a deficyty neurologiczne były zazwyczaj stabilne do 72 hr. Większość myszy wykazuje łagodne, stałe zwijanie się (neuroscore 2). Myszy niewykazujące zwijania się są wykluczane z badania. Jednakże ocena neuroscore nie pozwala nam odróżnić myszy z uszkodzonym hipokampem od myszy z nienaruszonym hipokampem.
	W dniu operacji nie zaobserwowano śmiertelności, co sugeruje brak krwawień podpajęczynówkowych. W przypadku stwierdzenia krwotoku podpajęczynówkowego u myszy, zwierzę to jest systematycznie wykluczane z analizy. Zastosowanie monofilamentu powlekanego silikonem firmy Doccol Corporation, który jest gładszy od monofilamentów przygotowywanych samodzielnie, zwiększa skuteczność tMCAO i ogranicza występowanie krwawień podpajęczynówkowych. Śmiertelność między 24 hr a 72 hr w tym modelu wynosi 14%, co jest zgodne z ogólnymi doniesieniami dla 60 min okluzji. Obserwowana śmiertelność wynika prawdopodobnie z dużej objętości zawału u tego szczepu myszy. Odnotowano również wysoką powtarzalność zmian (odchylenie standardowe wynosi 15%), co jest bardzo istotne przy badaniu cząsteczek neuroprotekcyjnych, których działanie mogłoby zostać zamaskowane przez zmienność modelu.
	Aby ocenić zakres uszkodzenia mózgu po tMCAO, zdecydowaliśmy się zastosować barwienie fioletem krezylowym (Ryc. 2>) zamiast TTC, aby dysponować większą ilością materiału do badania odpowiednich markerów6. Zakres zmiany chorobowej jest stosunkowo spójny. Zauważyliśmy jednak, że u niektórych myszy doszło do uszkodzenia hipokampa (około 30% myszy). Warto odnotować, że barwienie fioletem krezylowym można przeprowadzić do 1 tygodnia po zabiegu. W literaturze procentowy obszar zawału mózgu różni się w zależności od badania. Zależy on od wyboru szczepu myszy, zastosowanej anestezji, grubości przekrojów mózgu, użytego monofilamentu lub zastosowanej metody barwienia 6, 7.
	<img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1.jpg" alt="Schemat tętnic mózgowych; drogi ACA, MCA, PCA, ECA; przedstawia rozkład przepływu krwi." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat zamykania tętnicy środkowej mózgu przy użyciu monofilamentu wewnątrznaczyniowego pokrytego silikonem. A. Uproszczony schemat mózgu myszy i tętnic mózgowych przedstawiający kolejne szwy i klips przygotowujący wprowadzenie monofilamentu pokrytego silikonem. B. Przedstawiono położenie monofilamentu w obrębie kręgu Willisa. Monofilament jest wprowadzany do ICA poprzez ECA w celu zamknięcia podstawy MCA. ACA, tętnica przednia mózgu; BA, tętnica podstawna; CCA, wspólna tętnica szyjna; C. Willis, krąg Willisa; ECA, zewnętrzna tętnica szyjna; ICA, wewnętrzna tętnica szyjna; MCA, tętnica środkowa mózgu; PCA, tylna tętnica łącząca; PPA, tętnica skrzydłowopodniebna.
	<img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig2.jpg" alt="Przekroje histologiczne mózgu, eksperyment nad udarem u myszy; analiza porównawcza zawału mózgu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywne przekroje czołowe mózgu myszy barwione fioletem krezylowym 72 h po reperfuzji. Obszar zawału (głównie prążkowie, kora i przyległe obszary mózgu) widoczny jest w kolorze białym (niezbarwionym fioletem krezylowym). Objętość uszkodzenia (część biała, prawa półkula) została wyznaczona i wyrażona jako procent przeciwległego obszaru niezmienionego (lewa półkula).

W niniejszej pracy przedstawiono model intraluminalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu u myszy. Zakres zawału mózgu oceniano za pomocą skali neurologicznej oraz barwienia fioletem krezylowym, który stanowi alternatywę dla barwienia TTC, oferując znaczącą zaletę w postaci możliwości równoległego badania wielu interesujących markerów.

Model mysi wewnątrzluminalnego MCAO: ocena zawału mózgu za pomocą barwienia fioletem krezylu

Udar mózgu jest trzecią przyczyną śmiertelności i główną przyczyną niepełnosprawności na świecie. Udar niedokrwienny odpowiada za około 80% wszystkich przypadków udarów. ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie modelu udaru niedokrwiennego u myszy. W pierwszej kolejności tymczasowo podwiązuje się wspólną tętnicę szyjną, natomiast zewnętrzną tętnicę szyjną podwiązuje się trwale tak dystalnie, jak to możliwe. Powyżej rozwidlenia tętnicy szyjnej zewnętrznej umieszcza się kolejny, lekko dociągnięty szew tymczasowy.Drugim krokiem jest zaklemowanie tętnicy szyjnej wewnętrznej za pomocą pęsety o działaniu odwróconym, aby zapobiec krwawieniu. Następnie należy przeciąć ECA pomiędzy wiązaniem stałym a tymczasowym. W kolejnym etapie do ECA wprowadza się monofilament w powłoce silikonowej.Następnie tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) odwraca się, aby wprowadzić monofilament do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), aż obejmie on podstawę tętnicy mózgu środkowej. Po godzinie przywraca się przepływ krwi poprzez usunięcie monofilamentu, aby zasymulować przywrócenie przepływu krwi po lizie zakrzepu zatorowego u ludzi. Ostatecznie deficyt neurologiczny, odzwierciedlający powodzenie procedury T-M-C-A-O oraz rozległość zawału, może zostać oceniony bezpośrednio po reperfuzji oraz w różnych odstępach czasu po reperfuzji.Oprogramowanie Cyan image z NIH jest wykorzystywane do obliczenia objętości zawału na reprezentatywnych przekrojach mózgu barwionych fioletem krystalicznym. Jedną z głównych zalet przejściowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu z wykorzystaniem techniki filamentu wewnątrznaczyniowego jest fakt, że naśladuje ono udar niedokrwienny u pacjentów poprzez przywrócenie przepływu krwi, a opracowanie tej procedury u myszy daje możliwość wykorzystania narzędzi genetyki markerowej do zidentyfikowania roli białka docelowego. W modelu udaru przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu wykonuje się u samców myszy C 57 black six w wieku od dwóch do trzech miesięcy, o masie ciała od 22 do 28 g.Protokół ten został zatwierdzony przez Komitet Bioetyczny IRCM w celu zwiększenia powtarzalności objętości zawału. Stosujemy wielorazowe monofilamenty o długości 12 mm i średnicy 60 µm z powłoką silikonową firmy Doco Corporation. Dwie godziny przed operacją.Wykonaj myszy iniekcję buprenorfiny dootrzewnowo w dawce 0,03 milligrams per kilogram. Aby rozpocząć procedurę, znieczul myszy 5% isoflurenem i utrzymuj znieczulenie przy stężeniu 2,5% isofluranu; użyj mata grzewczego, aby utrzymać stałą temperaturę ciała myszy podczas operacji, a skórę w okolicy szyi zdezynfekuj 70% etanolem lub Betadyną. Następnie wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej szyi i rozsuń tkanki miękkie pod mikroskopem stereoskopowym.Wykonaj tępe rozcięcie szyi myszy, aby odsłonić tchawicę. Następnie odsun mięśnie, aby zlokalizować tętnicę szyjną wspólną. Ostrożnie wypreparuj lewą tętnicę szyjną wspólną z otaczających ją tkanek.Umieść tymczasową szwę z jedwabiu 5-0, pociętą na 20 milimetrowe segmenty, wokół tętnicy. Należy uważać, aby nie uszkodzić nerwu błędnego. Następnie oddziel rozwidlenie lewej tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) i tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), a następnie umieść trwałą szwę wokół ECA tak dystalnie, jak to możliwe.Następnie nałóż kolejny tymczasowy szew na ECA powyżej rozwidlenia. Po czym zaciskaj lewą ICA, używając pęsety o działaniu odwrotnym, aby uniknąć krwawienia. Ponownie, zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić nerwu błędnego.Wytnij mały otwór w ECA przed rozwidleniem na ECA i ICA oraz pomiędzy wcześniej założonymi szwami permanentnymi i tymczasowymi. Następnie wprowadź do ECA 12-milimetrowy szew monofilamentowy z powłoką silikonową o rozmiarze 6-0, całkowicie przetnij ECA i wprowadź monofilament do ICA. Zwiąż szew ściśle, aby zapobiec krwawieniu, a następnie wyjmij pęsetę z funkcją odwracalną.Następnie wprowadź monofilament do kręgu Willisa, aż zablokuje on podstawę tętnicy środkowej mózgu (MCA). Należy go wprowadzić na głębokość około 9 do 10 mm poza rozwidlenie tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) i tętnicy szyjnej wspólnej (CCA). Zazwyczaj monofilament zostanie zatrzymany i nie będzie mógł przesunąć się dalej.Należy uważać, aby nie uszkodzić tętnicy podniebiennej wstępującej. Mocno zawiązać szew na ECA, aby ustabilizować włókno w odpowiedniej pozycji. Następnie zamknąć skórę za pomocą systemu zamykania ran auto clip.Wstrzyknij podskórnie jeden mililitr roztworu soli fizjologicznej i umieść myszy pod lampą grzewczą na podczerwień podczas okresu po okluzji, który trwa 60 minut. Z narkozuj myszy w taki sam sposób jak poprzednio i usuń automatyczne klipsy, lekko rozwierając szew na ECA, aby umożliwić wycofanie monofilamentu i reperfuzję krwi. Następnie na stałe zawiąż tymczasowy szew na ECA, aby zapobiec utracie krwi.Godzinę po udarze wyciągnij monofilament i zachowaj go do ponownego użycia. Następnie usuń tymczasowy szew na CCA, aby umożliwić ponowny przepływ krwi. Zamknij ranę oraz tkankę podskórną.Wstrzyknij myszom kolejny 1 mL roztworu soli fizjologicznej. Po upewnieniu się, że zwierzę odzyskało sprawność ruchową, umieść je z powrotem w klatce, ustawiając połowę klatki na podkładce grzewczej, aby umożliwić myszom wybór środowiska. 12 godzin po operacji, we wszystkich grupach operacji pozorowanych myszy otrzymują kolejną dawkę buprenorfiny.Wszystkie procedury są identyczne, z wyjątkiem tego, że po operacji nie wprowadza się monofilamentu. Deficyt neurologiczny jest oceniany w celu potwierdzenia powodzenia procedury T-M-C-A-O i określenia jej skuteczności; deficyty neurologiczne myszy ocenia się w 1, 24, 48 i 72 godzinach po perfuzji w sześciostopniowej skali w następujący sposób: zero oznacza stan prawidłowy, jeden oznacza łagodny skręt z niespójnym lub bez niespójnego zwijania się podczas podnoszenia za ogon. Więcej niż 50% prób zwinięcia się w stronę przeciwległą.Wynik dwa oznacza umiarkowane i spójne zwijanie w ponad 50% prób zwijania się w stronę przeciwległą. Wynik trzy oznacza spójne, silne i natychmiastowe zwijanie. Mysz utrzymuje pozycję zwiniętą przez więcej niż jedną do dwóch sekund.Z nosem niemal dotykającym ogona. Stopień czwarty oznacza silne zwijanie. Postępując w stronę wygięcia w łuk (barreling), utrata odruchu chodzenia lub pisania; stopień piąty oznacza stan śpiączki lub całkowite zwinięcie w kłębek.Po perfuzji roztworem PBS, szybko zamroź mózgi w izopentanie i przechowuj je w temperaturze -80 °C. Należy pamiętać, że w zależności od planowanych badań immunohistochemicznych, mózgi myszy można również perfundować 4% paraformaldehydem. Następnie, przy użyciu kriotoma, wykonaj koronalne przekroje mózgu o grubości 17 µm, wykorzystując 30 szkiełek.Umieść jeden przekrój z każdych 30 na tym samym szkiełku. Następnie zabarw pierwsze i piętnaste szkiełko fioletem krystalicznym. Aby uzyskać dokładniejszą ocenę objętości uszkodzenia, użyj systemu analizy obrazu, takiego jak Scion image z NIH, aby ocenić obszar zmiany, czyli obszar zawału, który w lewej i prawej półkuli mózgu przejawia się kolorem białym.Powtórz to ograniczenie D na wszystkich skrawkach mózgu. Oblicz objętość zawału w jednostkach umownych i wyraź ją jako procent przeciwległego obszaru nieuszkodzonego dla każdego przekroju. Pozostałe preparaty przechowuj w temperaturze -80 °C do badań immunohistochemicznych.Ocena punktacji neurologicznej potwierdza powodzenie T-M-C-A-O u myszy poddanych procedurze wewnątrznaczyniowej. Jak widać tutaj, obserwuje się spójne, silne i umiarkowane zwijanie się, a mysz utrzymuje zwiniętą pozycję przez ponad jedną do dwóch sekund, przy czym nos niemal dotyka ogona. W naszym eksperymencie wszystkie myszy wykazywały co najmniej łagodne, spójne zwijanie się, co odpowiada punktacji neurologicznej równej dwa w całym okresie testowym.Barwienie fioletem Kressela wykonano w celu oceny zakresu zawału mózgu. Po zastosowaniu modelu T-M-C-A-O przedstawiono reprezentatywne przekroje czołowe mózgu myszy zabarwione fioletem Kressela 72 godziny po reperfuzji. Obszar zawału, obejmujący głównie prążkowie, korę oraz przyległe obszary mózgu, które zostały oznakowane, widoczny jest w kolorze białym, ponieważ nie uległ zabarwieniu fioletem.Kolorem fioletowym zaznaczono objętość uszkodzenia, która stanowi białą część prawej półkuli wyrażoną jako procent powierzchni nieuszkodzonej półkuli przeciwległej w lewej hemisferze. Objętość zawału u samców myszy C 57 black six po udarze niedokrwiennym reprezentuje około 70% nieuszkodzonej półkuli. Procedura ta zapewnia wysoką powtarzalność tworzenia uszkodzeń.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak wywołać przemijający udar niedokrwienny u myszy. Ponadto, podejście z wykorzystaniem quiz viol do pomiaru objętości zawału mózgu daje ogromną zaletę w postaci dostępu do dużej ilości materiału do badania odpowiednich markerów za pomocą immunochemii. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

mouse-model-intraluminal-mcao-cerebral-infarct-evaluation-cresyl

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model myszy intraluminalnego MCAO: Ocena zawału mózgu przez barwienie kresylowioletowe

W materiale wideo demonstrujemy metodę wywołania zatoru w środkowej tętnicy mózgowej u dorosłych myszy z wykorzystaniem wewnątrzluminalnego monofilamentu. Pokazujemy również, jak oceniać zakres zawału mózgu za pomocą barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC).

Myszy model udaru niedokrwiennego wywołanego zamknięciem tętnicy środkowej mózgu

Model intraluminalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest najczęściej stosowanym modelem wśród eksperymentalnych modeli udaru niedokrwiennego. W niniejszym materiale szczegółowo zaprezentujemy cały model z wykorzystaniem laserowej flowmetrii dopplerowskiej oraz przedstawimy reprezentatywne wyniki.

Model wewnątrznaczyniowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) w udarze niedokrwiennym u myszy z prowadzeniem za pomocą laserowej dopplerometrii przepływu

Wykazano, że monitorowanie perfuzji mózgowej poprawia dokładność modeli udaru niedokrwiennego. Trudności techniczne często ograniczają wykorzystanie tego niezbędnego narzędzia do badań naczyń mózgowych. W tym filmie pokazano zoptymalizowany system do uzyskania jedno- lub wielomiejscowego monitorowania hemodynamicznego podczas śródświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczurów.

Zoptymalizowany system do monitorowania perfuzji mózgowej w modelu udaru szczura wewnątrzświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Fotozakrzepica to szybka, minimalnie inwazyjna technika wywoływania małego i dobrze zdefiniowanego zawału w obszarach zainteresowania w wysoce powtarzalny sposób. Jest szczególnie przydatny do badania odpowiedzi komórkowych i molekularnych leżących u podstaw plastyczności mózgu u myszy transgenicznych.

Fotozakrzepowe niedokrwienie: minimalnie inwazyjny i powtarzalny fotochemiczny model zmiany korowej do badań nad udarem u myszy

Różne mysie modele zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) są szeroko stosowane w eksperymentalnych badaniach mózgu. W tym miejscu demonstrujemy model przezczaszkowego stałego dystalnego MCAO, który powoduje konsekwentny zawał kory mózgowej o wielkości odpowiadającej uszkodzeniom spowodowanym przez większość udarów niedokrwiennych u ludzi.

Modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu

Charakterystyka komórek szpikowych mózgu po udarze może być przeprowadzona za pomocą metody frakcjonowania optycznego lub za pomocą analizy cytometrycznej zawiesin leukocytów mózgu. Obie są użytecznymi technikami do przeprowadzenia dokładnego fenotypowego rozróżnienia głównych podzbiorów komórek szpikowych znajdujących się w niedokrwionym mózgu.

Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu

W tym badaniu modyfikujemy istniejącą metodę eksperymentalną, aby uzyskać bardziej powtarzalne wyniki, ustanawiając mysi model zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO). Doustne podawanie ekstraktu metanolowego (GRex) Glycyrrhizae Radix et Rhizome (GR) po indukcji udaru znacznie zmniejszyło całkowitą objętość zawału w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną.

Ocena neuroprotekcyjnego działania ekstraktu z Glycyrrhizae radix et rhizoma przy użyciu przejściowego mysiego modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

Różne modele niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAo) są używane w eksperymentalnych badaniach nad udarem. W tym miejscu opisano eksperymentalny model udaru przejściowego MCAo przez tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA), który ma na celu naśladowanie udaru u człowieka, w którym skrzeplina naczyniowo-mózgowa jest usuwana w wyniku spontanicznej lizy skrzepu lub terapii.

Modelowanie udaru u myszy: przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu przez tętnicę szyjną zewnętrzną

Ten protokół demonstruje unikalny model udaru myszy ze średniej wielkości zawałem i doskonałym wskaźnikiem przeżycia. Model ten pozwala przedklinicznym badaczom zajmującym się udarem mózgu wydłużyć czas trwania niedokrwienia, wykorzystać starzejące się myszy i ocenić długoterminowe wyniki funkcjonalne.

Zmodyfikowany przezczaszkowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu do badania wyników udaru u starszych myszy

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia modelu dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (dMCAO) poprzez przezczaszkową elektrokoagulację u myszy C57BL/6J i oceny późniejszego zachowania neurologicznego i cech histopatologicznych.

Indukcja ostrego udaru niedokrwiennego u myszy przy użyciu techniki niedrożności dystalnej tętnicy środkowej

Poznaj model śródświetlnego MCAO u myszy do badania udaru niedokrwiennego z oceną neurologiczną i barwieniem fioletem krezylowym. Ta metoda umożliwia badanie genetycznych czynników wpływających na przebieg udaru.

Model mysi wewnątrzluminalnego MCAO: ocena zawału mózgu za pomocą barwienia fioletem krezylu

Przeglądaj więcej filmów