Mysi model śródświetlnego MCAO: ocena zawału mózgu za pomocą barwienia fioletem krezylowym

Ogólnym celem tej procedury jest naśladowanie udaru niedokrwiennego u myszy. Po pierwsze, tętnica szyjna wspólna jest tymczasowo podwiązana, podczas gdy tętnica szyjna zewnętrzna jest trwale podwiązana tak dystalnie, jak to możliwe. Kolejny tymczasowy szew lekko ciasny umieszcza się na ECA powyżej rozwidlenia.

Drugim krokiem jest zaciśnięcie tętnicy szyjnej wewnętrznej za pomocą pęsety o odwrotnym działaniu, aby uniknąć krwawienia. Następnie przeciąć ECA między ligaturami stałymi i tymczasowymi. Następnie monofilament pokryty silikonem jest wprowadzany do ECA.

Następnie ECA jest odwracany, aby wprowadzić monofilament do ICA, aż obejmie podstawę tętnicy środkowej mózgu. Godzinę później przepływ krwi jest przywracany przez usunięcie monofilamentu, aby naśladować przywrócenie przepływu krwi po lizie pazura zakrzepowo-zatorowego u ludzi. Ostatecznie deficyt neurologiczny, który odzwierciedla sukces T-M-C-A-O i nasilenie zawału, można ocenić tuż po reperfuzji i w różnym czasie po reperfuzji.

Oprogramowanie do obrazowania cyjanu z NIH służy do obliczania objętości zawału na reprezentatywnych wycinkach mózgu wybarwionych fioletem wyrostka zębodołowego. Jedną z głównych zalet przejściowej niedrożności tętnicy środkowej mózgu przy użyciu techniki włókien śródświetlnych jest to, że naśladuje ona udar niedokrwienny u pacjenta z przywróceniem przepływu krwi, a rozwój tej procedury u myszy oferuje możliwość wykorzystania narzędzia genetyki etykietowej do identyfikacji roli białka docelowego. W udarze Przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu wykonuje się na dwu- lub trzymiesięcznym samcu C 57 czarnych sześciu myszy o wadze od 22 do 28 gramów.

Protokół ten został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki Bioetycznej IRCM w celu zwiększenia odtwarzalności objętości zawału. Używamy wielorazowej żyłki o długości 12 milimetrów, pokrytej sześcioma warstwami silikonu firmy Doco Corporation. Dwie godziny przed zabiegiem.

Wstrzyknąć myszowi dootrzewnowo buprenorfinę w dawce 0,03 miligrama na kilogram. Aby rozpocząć procedurę, znieczulij myszy 5% izofluorem i utrzymuj znieczulenie na poziomie 2,5% fluoru ISO, użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać stałą temperaturę ciała myszy podczas operacji, zdezynfekuj skórę paproci myszy za pomocą 70% etanolu lub betadyny. Następnie wykonaj nacięcie w linii środkowej szyi i rozsuń tkanki miękkie pod mikroskopem stereoskopowym.

Tępo rozetnij szyję myszy, aby odsłonić tchawicę. Następnie cofnij mięśnie, aby zlokalizować tętnicę szyjną. Ostrożnie wypreparuj lewą tętnicę szyjną wspólną z otaczającej tkanki.

Umieść tymczasowy jedwabny szew o grubości pięciu och, pocięty na 20-milimetrowe segmenty wokół tętnicy. Uważaj, aby nie uszkodzić nerwu błędnego. Następnie oddziel rozwidlenie lewej tętnicy szyjnej wewnętrznej wspólnej lub ICA i zewnętrznej tętnicy szyjnej wspólnej lub ECA, umieść stały szew wokół ECA tak dystalnie, jak to możliwe.

I kolejny tymczasowy szew na ECA powyżej rozwidlenia. Następnie przypnij lewy ICA za pomocą pęsety o odwrotnym działaniu, aby uniknąć krwawienia. Ponownie, bądź bardzo ostrożny, aby nie uszkodzić nerwu błędnego.

Wyciąć mały otwór w ECA przed rozwidleniem do ECA i ICA oraz między założonymi wcześniej szwami stałymi i tymczasowymi. Następnie wprowadź 12-milimetrowy szew monofilamentowy pokryty silikonem do ECA, całkowicie przetnij ECA i odwróć monofilament do ICA. Mocno zawiąż szew, aby zapobiec krwawieniu i wyjmij pęsetę o odwrotnym działaniu.

Następnie wprowadź żyłkę do koła Willisa, aż żyłka zasłania podstawę ogranicznika MCA. Jego wstawienie około dziewięciu do 10 milimetrów poza rozwidlenie ECA i CCA. Ogólnie rzecz biorąc, żyłka zostanie zablokowana i nie będzie mogła się już poruszać.

Należy uważać, aby nie przebić tętnicy podniebiennej. Mocno zawiąż szew na ECA, aby zamocować filament na miejscu. Teraz zamknij skórę za pomocą systemu automatycznego zamykania ran z klipsem.

Wstrzyknij podskórnie jeden mililitr roztworów soli fizjologicznej i umieść myszy pod lampą grzewczą na podczerwień w okresie po okluzji, który wynosi 60 minut. Znieczulij myszy jak poprzednio i usuń automatyczne klipsy, lekko otwórz szew na ECA, aby umożliwić wycofanie się żyłki i ponowne ukrwienie krwi. Następnie na stałe przywiąż tymczasowy szew na ECA, aby zapobiec utracie krwi.

Godzinę po pociągnięciu wyjmij żyłkę i zachowaj ją do ponownego użycia. Następnie usuń tymczasowy szew na CCA, aby umożliwić ponowne krążenie krwi. Zamknij ranę i podskórnie.

Wstrzyknij myszom kolejny mililitr roztworu soli fizjologicznej. Po upewnieniu się, że zwierzę odzyska mobilność, włóż je z powrotem do klatki i umieść połowę klatki na poduszce grzewczej, aby myszy mogły wybrać środowisko. 12 godzin po operacji myszy otrzymują kolejną dawkę buprenorfiny do wszystkich operacji pozorowanych.

Wszystkie procedury są identyczne, z wyjątkiem tego, że monofilament nie jest wprowadzany po zabiegu. Deficyt neurologiczny jest oceniany w celu potwierdzenia sukcesu T-M-C-A-O i określenia jego wydajności, oceny deficytów neurologicznych myszy w 1, 24, 48 i 72 godzinach po perfuzji w sześciopunktowej skali w następujący sposób, zero równa się normalnemu, jeden równa się łagodnemu, obracając się z niespójnym zwijaniem lub bez niego, gdy jest podniesiony przez ogon. Ponad 50%próbuje zwinąć się w bok po przeciwnej stronie.

Dwa to łagodne, konsekwentne zwijanie się ponad 50%próby zwijania się na stronę przeciwległą. Trzy równają się konsekwentnemu, mocnemu i natychmiastowemu podkręcaniu. Mysz utrzymuje pozycję zwiniętą przez ponad jedną do dwóch sekund.

Z nosem sięgającym prawie ogona. Cztery równają się ciężkiemu curlingowi. Przejście do beczkowania, utraty odruchu chodzenia lub pisania równa się śpiączce lub wzgórkowi.

Po perfuzji roztworem PBS szybko zanurz mózgi w izop pentanie i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Należy zauważyć, że mózgi myszy mogą być również perfundowane 4% aldehydem paraformowym, w zależności od planowanych badań immunohistochemicznych. Następnie za pomocą kriostatu wytnij 17-mikronowe odcinki koronalne mózgu za pomocą 30 szkiełek.

Umieść jedną sekcję z każdych 30 na tym samym slajdzie. Następnie zabarwić pierwsze i 15. szkiełko fioletem wyrostka zębodołowego. Aby dokładniej oszacować objętość urazu, użyj systemu analizy obrazu, takiego jak obraz Scion z NIH, aby ocenić delikatesy zmian, obszar zawału, który wydaje się biały w lewej i prawej półkuli mózgu.

Powtórz to ograniczenie D na wszystkich wycinkach mózgu. Oblicz objętość zawału w dowolnych jednostkach i wyraź je jako procent przeciwległego obszaru nieuszkodzonego dla każdej sekcji. Utrzymuj pozostałe szkiełka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do badań immunohistochemicznych.

Ocena punktacji neurologicznej potwierdza sukces T-M-C-A-O u mnie poddanego zabiegowi śródświetlnemu. Jak widać tutaj, obserwuje się konsekwentne, silne i pośrednie zwijanie się, a mysz utrzymuje zwiniętą pozycję przez ponad jedną do dwóch sekund, a jej nos prawie sięga ogona. W naszym eksperymencie wszystkie myszy wykazywały co najmniej łagodne, konsekwentne zwijanie się, co odpowiada punktowi neurologicznemu wynoszącemu dwa w całym okresie testowym.

Barwienie fioletem Kressel wykonano w celu oceny stopnia zawału mózgu. Po T-M-C-A-O pokazano tutaj reprezentatywne przekroje koronalne mózgu myszy zabarwione fioletowym grzebieniem po 72 godzinach od reperfuzji. Obszar zawału, głównie prążkowie i kora mózgowa oraz przyległe obszary mózgu, które są oznaczone, pojawia się na biało, ponieważ nie jest zabarwiony grzebieniem.

Na fioletowo pokazano tutaj objętość urazu, która jest białą częścią prawej półkuli wyrażoną jako procent przeciwległego obszaru nieuszkodzonego na lewej półkuli. Objętość zawału u sześciu czarnych samców myszy C 57 po udarze niedokrwiennym stanowi około 70% półkuli nieodciągającej. Ta procedura zapewnia silną powtarzalność zmiany.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać przemijający udar niedokrwienny u myszy. Ponadto, podejście quizowe do pomiaru objętości mózgu w rzeczywistości oferuje wielką zaletę posiadania dużej ilości materiałów do testowania odpowiednich markerów za pomocą immunochemii. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.