Protokół pobierania próbek trzustki ludzkiej
23 maja 2012
Ten film demonstruje procedurę preparacji ludzkiej trzustki do wielu formatów przechowywania. Orientacja anatomiczna jest zachowana w całym obszarze trzustki, aby umożliwić określenie regionalnego składu i gęstości wysp trzustkowych.
Ogólnym celem tej procedury jest wypreparowanie ludzkiej trzustki w sposób pozwalający zachować orientację anatomiczną. Osiąga się to poprzez usunięcie dwunastnicy i śledziony z trzustki, a następnie usunięcie nadmiaru tłuszczu i naczyń z trzustki. Drugim krokiem jest pomalowanie przedniej powierzchni niebieskim tuszem, a tylnej powierzchni czarnym tuszem.
Następnie trzustka jest podzielona na trzy regiony. Każdy region jest następnie krojony w poprzek na równe płyty i umieszczany na kasetach parafinowych, formach OCT lub dalej mielony i umieszczany w fiolkach. Ostatecznie pobiera się próbki ze wszystkich trzech obszarów trzustki, przy zachowaniu prawidłowej orientacji anatomicznej do przyszłej analizy.
Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad cukrzycą typu pierwszego, takie jak mechanizmy leżące u podstaw utraty masy lub funkcji komórek beta oraz charakter ataku komórek odpornościowych. Wizualna demonstracja metody przetwarzania trzustki ma kluczowe znaczenie, ponieważ utrzymanie orientacji trzustki in vivo wymaga dbałości o szczegóły. Procedurę zademonstrują Linda Snyder, technolog histo i Emily Montgomery, biolog w moim laboratorium.
Zacznij od przygotowania wszystkich materiałów potrzebnych do zabiegu. Najpierw oznacz kasety, w których będą znajdować się bloki parafiny, identyfikatorem dawcy, typem próbki, numerem podwielokrotności i wszelkimi dodatkowymi informacjami. Następnie oznacz formy OCT w ten sam sposób.
Wytnij wystarczającą ilość kawałków folii aluminiowej, aby owinąć każdy blok OCT i odłóż je na bok do późniejszego wykorzystania. Przygotować wszystkie fiolki potrzebne do przechowywania świeżych i mrożonych próbek. Dodaj RNA później i pożywkę RPMI, jeśli to konieczne.
Następnie przygotuj miejsca pracy, umieść deski rozbiorowe, wysterylizowane narzędzia i wszystkie inne materiały potrzebne do zabiegu zarówno w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, jak i na blacie. Ustaw wszystkie kasety i formy OCT w kolejności użycia. Pobliski. Stwórz kąpiel zamrażającą, dodając tyle izop pentanu, aby pokryć suchy lód na dnie styropianowego pudełka.
Aby rozpocząć preparację, usuń dwunastnicę i śledzionę. Rozpocznij oddzielanie dwunastnicy i trzustki na jednym końcu i kontynuuj aż do całkowitego odłączenia. Śledziona jest luźno przyczepiona i można ją łatwo usunąć z tłuszczu i trzustki.
Następnie oczyść trzustkę z obcych naczyń tłuszczowych i nerwów, stosując kombinację i ostrego rozwarstwienia. Odłóż na bok tłuszcz i węzły chłonne do późniejszego przetworzenia. Po oczyszczeniu umieść trzustkę na desce preparacyjnej pokrytej ręcznikami papierowymi.
Utrzymanie prawidłowej orientacji trzustki jest najtrudniejszym aspektem tej procedury. Aby zapewnić sukces, przednia i tylna powierzchnia są malowane różnymi kolorowymi tuszami. Zanurz aplikator z bawełnianą końcówką w niebieskim tuszu, rozprowadź tusz na przedniej powierzchni trzustki i zetrzyj nadmiar.
Następnie zanurz nowy aplikator w czarnym tuszu i rozprowadź go na tylnej powierzchni trzustki. Przywróć trzustkę do normalnej orientacji. Z przednią powierzchnią skierowaną do góry, trzustka jest teraz gotowa do pocięcia na trzy sekcje.
Najpierw przetnij połączenie między głową a ciałem. Następnie podziel pozostałą część na mniej więcej równe porcje, aby oddzielić ciało i ogon, zapisz wagę każdego obszaru trzustki. Zaczynając od sekcji głowy.
Podziel każdy region na około 0,5 centymetra części, krojąc w poprzek , podobnie jak kroi się bochenek chleba. Po pokrojeniu każdego obszaru trzustki usuń ostatnią część obszaru głowy, która jest sekcją połączenia głowy z ciałem, i umieść ją na osobnej desce preparcyjnej. Zmiel tę sekcję na małe kawałki i podziel je równomiernie między oznakowane fiolki kriogeniczne z RNA i bez.
Później fiolki są zamrażane. Postępowanie zgodnie ze standardowymi procedurami. Powtórz tę procedurę dla sekcji skrzyżowania ogona nadwozia.
Po zebraniu zmielonych próbek pochyl wszystkie przekroje poprzeczne w prawo. Naprzemienne sekcje każdego regionu zostaną usunięte. W przypadku bloków parafiny i OCT należy usunąć pierwszą sekcję dotyczącą blokowania parafiny.
Jeśli sekcja jest zbyt duża, przetnij ją na pół. Oznacz kasety jako A i B. Jeśli kawałek jest nadal zbyt duży, przytnij każdą sekcję prostopadle do poprzedniego cięcia, a następnie oznacz kasety od A do D w sposób zgodny z ruchem wskazówek zegara. Jak pokazano tutaj, umieść kasetę tak, aby etykieta znajdowała się po lewej stronie.
Następnie umieść chusteczkę w kasecie i zamknij pokrywę. Przenieść kasetę do pojemnika zawierającego obojętną buforowaną forminę. Ponumeruj blok sekwencyjnie w każdym regionie, zaczynając od najbardziej środkowej sekcji dla bloków OCT.
Wlej cienką warstwę pożywki OCT do wstępnie oznakowanej formy Przed wprowadzeniem tkanki przykryj tkankę pożywką OCT i szybko zamroź próbkę do późniejszego wykorzystania, wracając do tkanki, która została wcześniej odłożona na bok. Odizoluj węzły chłonne trzustki, odcinając tłuszcz i tkankę łączną otaczającą torebkę węzła. Umieść węzły w sterylnym naczyniu zawierającym DMEF, zmiel duże węzły na kawałki nie większe niż 0,5 centymetra.
Po wyizolowaniu węzłów chłonnych trzustki należy podzielić tkankę między przygotowane fiolki i kasety w celu dalszego przetwarzania. Po zakończeniu węzłów chłonnych śledziona jest mielona i przechowywana w podobny sposób. Aby przetworzyć dwunastnicę, użyj zwilżonej gaziki, aby wytrzeć błonę śluzową ze śluzu, odetnij błonę śluzową, a następnie pokrój ją na sekcje.
Podziel próbki błony śluzowej, jak pokazano wcześniej. Za pomocą tej procedury pobiera się reprezentatywne próbki każdego regionu trzustki, jak pokazano tutaj. Waga głowy, tułowia i ogona była w przybliżeniu równa.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przetwarzać ludzką trzustkę na różne typy próbek, w szczególności zdolność do utrzymania orientacji, a także jak izolować węzły chłonne od tłuszczu wokół trzustki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę sekcji służącą do przetwarzania ludzkiej trzustki na wiele formatów przechowywania przy jednoczesnym zachowaniu orientacji anatomicznej. Metoda ta pozwala na określenie regionalnego składu i gęstości wysepek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Anatomia człowieka
Wstęp
- Trzustka ma kluczowe znaczenie dla funkcji metabolicznych.
- Zrozumienie składu wysepek trzustkowych jest istotne dla badań nad cukrzycą.
- Zachowanie orientacji anatomicznej jest niezbędne dla dokładnej analizy.
- Techniki sekcji mogą różnić się pod względem skuteczności.
Cel badania
- Przeprowadzenie sekcji ludzkiej trzustki przy zachowaniu jej struktury anatomicznej.
- Umożliwienie pobrania próbek z różnych obszarów trzustki.
- Zapewnienie możliwości późniejszej analizy składu i gęstości wysepek trzustkowych.
Zastosowane metody
- Usunięcie dwunastnicy i śledziony z trzustki.
- Usunięcie nadmiaru tłuszczu i naczyń z trzustki.
- Oznakowanie powierzchni przedniej i tylnej tuszem w celu orientacji.
- Podział trzustki na trzy regiony i pocięcie na plastry.
Główne wyniki
- Próbki zostały pomyślnie pobrane z trzech obszarów trzustki.
- Orientacja anatomiczna była zachowana przez cały czas trwania procedury.
- Metoda ta umożliwia szczegółową analizę składu wy wysp.
- Do przyszłych badań wykorzystano wiele formatów przechowywania.
Wnioski
- Procedura sekcji jest skuteczna w zachowaniu anatomii trzustki.
- Metoda ta może usprawnić badania nad wysepkami trzustkowymi.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej technice w celu przeprowadzenia analiz metabolicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Ustandaryzowane protokoły sekcji i pobierania próbek z trzustki ludzkiej są kluczowe dla uzyskania powtarzalnych, anatomicznie precyzyjnych biospektimenów, które stanowią podstawę badań nad cukrzycą i chorobami metabolicznymi. Niniejszy protokół umożliwia spójne pobieranie próbek regionalnych, co wspiera wysoką wiarygodność walidacji celów oraz badania mechanistyczne w ramach procesów odkrywania i badań translacyjnych. Wdrożenie takich ustandaryzowanych schematów postępowania w całej organizacji redukuje niejednoznaczność biologiczną i zwiększa porównywalność między badaniami, co ułatwia podejmowanie decyzji w zakresie rozwoju portfolio.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biopharmy
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną analizę regionalnej heterogeniczności komórek wysepek w celu mechanistycznej minimalizacji ryzyka.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez zachowanie kontekstu anatomicznego w biospektimenach.
- Ułatwia badania oparte na hipotezach dotyczących utraty komórek beta i infiltracji komórek odpornościowych w cukrzycy typu 1.
Przesiew i opracowanie analizy
- Zapewnia zwalidowane bloki tkankowe z zachowaną orientacją do dalszych analiz histologicznych i molekularnych.
- Zapewnia powtarzalność i standaryzację przygotowania próbek do analizy ilościowej.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie próbek w parafinie, OCT oraz próbek zamrożonych błyskawicznie do badań przesiewowych na wielu platformach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie pobierania materiału biologicznego do obszarów anatomicznych istotnych dla danej choroby w ramach translacyjnych badań nad biomarkerami.
- Zapewnia ciągłość od analizy tkanek ludzkich do walidacji w modelach przedklinicznych.
- Zmniejsza ryzyko błędu próbkowania w badaniach łączących patologię ludzką z hipotezami terapeutycznymi.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół integruje etap pozyskiwania biospecymentów z późniejszymi analizami molekularnymi, komórkowymi i histologicznymi, wspierając procesy badawcze od wczesnej fazy odkryć po badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia rzetelną weryfikację hipotez dotyczących składu komórkowego wysepek oraz infiltracji immunologicznej w poszczególnych regionach.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, zachowujące orientację próbki do opracowywania i walidacji testów.
- Analityka: Wspiera ilościowe porównywanie regionalnych różnic w gęstości wysepek oraz rozkładzie typów komórek.
- Badania translacyjne: Zapewnia anatomicznie precyzyjne próbki do dopasowania biomarkerów i korelacji z modelami przedklinicznymi.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Ustanawia powtarzalny, zestandaryzowany protokół do generowania biospekimenów w ramach wielu badań i ośrodków.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad cukrzycą.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji, powtarzalności i skalowalności w przetwarzaniu tkanek ludzkich.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie pozyskania wysokiej jakości, porównywalnych zestawów danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowaną do ryzyka priorytetyzację oraz rozwój programów badawczych dotyczących cukrzycy i chorób metabolicznych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie sekcji anatomicznej i obchodzenia się z biomateriałami.
- Wymaga dostępu do infrastruktury histologicznej, krio konserwacyjnej oraz analizy molekularnej.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w zakresie etykietowania, orientacji i śledzenia próbek.
- Musi być dostosowany do różnic w anatomii dawców i jakości tkanek.
- Zależy od ścisłego przestrzegania protokołu w celu uniknięcia utraty kontekstu anatomicznego.
