Name: Protokół pobierania próbek trzustki ludzkiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę preparowania ludzkiej trzustki z zachowaniem orientacji anatomicznej poprzez znakowanie atramentem i podział na trzy regiony. Technika umożliwia analizę składu wysp trzustkowych w badaniach nad cukrzycą typu 1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują rodzinom dawców oraz Organizacjom Pozyskiwania Organów (Organ Procurement Organizations) zaangażowanym w niniejsze badanie, a także Marii Martino i Irinie Kusmartcevie za ich ekspercką pomoc. Praca ta była finansowana przez Juvenile Diabetes Research Foundation (M.C-T., M.A.) w ramach wsparcia dla Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Oznakuj kasety do bloków parafinowych ręcznie ołówkiem lub automatycznie za pomocą drukarki do kaset. Uwzględnij identyfikator dawcy (CaseID), rodzaj próbki, numer alikwoty oraz wszelkie dodatkowe oznaczenia unikalne (arkusz sprawy, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Dodatek 1</a>).</li>
	<li>Oznakuj formy OCT w ten sam sposób co kasety, używając niezmywalnego markeru. Wytnij prostokąty z folii aluminiowej o wymiarach 5-10 cm.</li>
	<li>Wydrukuj etykiety lub ręcznie oznakuj niezmywalnym markerem wszystkie fiolki i probówki. Przygotuj odpowiednią liczbę fiolek dla rozdrobnionych próbek zamrożonych błyskawicznie oraz probówek z medium RPMI dla przesyłek świeżych. Do fiolek do szybkiego mrożenia z RNAlater dodaj 1 mL RNAlater do każdej kriofiolki.</li>
	<li>Przygotuj deski sekcyjne w komorze z laminarnym przepływem powietrza oraz blaty z wysterylizowanymi narzędziami do sekcji (pincety, skalpele, ostrza, gaziki (4x4)), a także kasety i formy OCT ułożone w kolejności użycia.</li>
	<li>Przygotuj kąpiel mrożącą, wsypując suchy lód do średniej wielkości pudełka styropianowego (10x10 cm) na głębokość co najmniej 3 cm, a następnie dolej izopentan, aż suchy lód zostanie całkowicie przykryty.</li>
	<li>Opcjonalnie: Napełnij mały naczynie typu Dewar ciekłym azotem.</li>
	<li>Jeśli trzustka jest potrzebna do mikroskopii elektronowej (EM), przygotuj utrwalacz TAAB, dodając 1,25 mL 16% paraformaldehydu, 1,25 mL 8% glutaraldehydu i 7,5 mL 0,1M PBS. Przygotuj utrwalacz Lowicryl, dodając 2,5 mL 16% paraformaldehydu do 7,5 mL 0,1M PBS.</li>
	<li>Przygotuj roztwory stosowane do izolacji komórek. Do butelki 500 ml z DMEF (z glutaminą), stosując techniki aseptyczne, dodaj następujące składniki:
	<ol>
		<li>Płodowa surowica bydlęca (FBS): dodaj 50mL, stężenie końcowe 10%.</li>
		<li>Penicylina/Streptomycyna (Pen/Strep, roztwór stokowy 10 000 U/mL / 10 000 ug/mL) – dodaj 5 mL roztworu stokowego Pen/Strep do RPMI, aby uzyskać stężenie końcowe 100 U/mL / 100ug/mL. Dodaj również 5 ml do butelki 500 ml DPBS, jeśli jest używany do przechowywania próbek węzłów chłonnych lub śledziony.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Personel
<ol>
	<li>Procedurę optymalnie wykonuje trzech członków personelu, jednak może ona zostać przeprowadzona przez jedną, dobrze przeszkoloną osobę. Dwie osoby są zazwyczaj w stanie ukończyć procedurę w 90 minut. Rzeczywisty czas zależy od liczby otrzymanych tkanek oraz łatwości zlokalizowania węzłów chłonnych trzustki. Próbki do izolacji komórek przechowuje się w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia sekcji tkanek, podczas gdy próbki surowicy są przetwarzane równolegle.</li>
	<li>Patolog, asystent patologa lub osoba o równorzędnych kwalifikacjach – doświadczony członek personelu kieruje obchodzeniem się z tkanką i przeprowadza główne sekcje, w tym podział głowy trzustki oraz pobieranie węzłów chłonnych trzustki. W pierwszej kolejności działania koncentrują się na trzustce, a następnie następuje badanie tkanki tłuszczowej okołotrzustkowej w celu znalezienia węzłów chłonnych.</li>
	<li>Technik laboratoryjny lub osoba o równorzędnych kwalifikacjach – członek personelu przeszkolony w przycinaniu tkanek, którego głównymi obowiązkami są ważenie trzustki i poszczególnych obszarów oraz przycinanie tkanek do kasetek z utrwalonym i zamrożonym materiałem oraz do probówek do szybkiego mrożenia. Odbiera dwunastnicę i śledzionę od asystenta patologa i przetwarza te organy, podczas gdy asystent patologa przetwarza trzustkę.</li>
	<li>Asystent laboratoryjny – członek personelu, który pomaga pozostałym osobom, w tym przy etykietowaniu kasetek i probówek, rozdrabnianiu próbek do krioprobówek oraz przetwarzaniu surowicy.</li>
</ol>
3. Disekcja trzustki
<ol>
	<li>Usunąć dwunastnicę oraz śledzionę, a następnie oczyścić trzustkę z nadmiaru tkanki tłuszczowej, naczyń i nerwów, stosując rozcięcie tępym i ostrym narzędziem</li>
	<li>Umieścić oczyszczoną trzustkę na stole sekcyjnym wyłożonym ręcznikami papierowymi. Zanurzyć aplikator z bawełnianą końcówką w niebieskim tuszu i rozprowadzić go na powierzchni przedniej trzustki. Odchłonąć nadmiar tuszu</li>
	<li>Opcjonalnie: zanurzyć nowy aplikator w czarnym tuszu i rozprowadzić go na powierzchni tylnej trzustki. Przywrócić trzustce normalną orientację, tak aby powierzchnia przednia była skierowana w stronę sekcjonującego</li>
	<li>Podzielić trzustkę na 3 regiony: głowę, trzon i ogon (Rycina 1). Przeciąć miejsce połączenia głowy z trzonem, a następnie podzielić pozostałą część na w przybliżeniu równe fragmenty stanowiące trzon i ogon</li>
	<li>Zważyć każdy region trzustki i zapisać masy (Arkusz analizy przypadku (<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Załącznik 1</a>))</li>
	<li>Wyciąć przekroje poprzeczne (ok. 0.5 cm) z każdego regionu trzustki metodą „kromkowania chleba” (Rycina 1)</li>
	<li>Wykorzystać przekroje z obu połączeń między regionami do przygotowania próbek rozdrobnionych. W zależności od wielkości trzustki, pobranie próbki z regionu połączenia trzonu z ogonem może być trudne, w takim przypadku można zmniejszyć liczbę bloków parafinowych w celu uzyskania próbek rozdrobnionych lub pobrać próbki wyłącznie z regionu połączenia głowy z trzonem. Oznaczyć probówki kriogeniczne jako „głowa” lub „trzon”, aby wskazać region proksymalny na połączeniu.
	<ol>
		<li>Rozdrobnić fragmenty i podzielić je równomiernie między probówki kriogeniczne (≥1 gram na probówkę). Szybko zamrozić probówki bez RNALater w ciekłym azocie lub w mieszaninie suchego lodu z izopentanem, a następnie przenieść do zamrażarki -80 °C</li>
		<li>Przechowywać probówki z RNALater w temperaturze pokojowej przez 30 minut w celu wyrównania temperatury, ponownie wymieszać i szybko zamrozić w ciekłym azocie lub w mieszaninie suchego lodu z izopentanem, a następnie przenieść do zamrażarki -80 °C</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobierać naprzemiennie przekroje do bloków parafinowych i bloków OCT, zaczynając od parafiny (Rycina 1)</li>
	<li>Ułożyć wszystkie przekroje poprzeczne z lekkim nachyleniem w prawą stronę</li>
	<li>Umieścić przekroje o wymiarach ok. 1.5 x 1.5 x 0.5 cm w kasetkach. Jeśli przekroje poprzeczne są zbyt duże, przeciąć je na pół (Rycina 2b). Oznaczyć kasetki z niebieską połową przednią jako „A” i połową tylną jako „B”</li>
	<li>Jeśli fragmenty nadal są zbyt duże, przeciąć każdy przekrój prostopadle do poprzedniego cięcia (Rycina 2c). Oznaczyć kasetki A-D zgodnie z ruchem wskazówek zegara. W razie potrzeby dodatkowo przyciąć fragmenty, aby zmieściły się w kasetkach</li>
	<li>Ponumerować bloki sekwencyjnie w obrębie regionu, zaczynając od przekroju najbardziej przyśrodkowego</li>
	<li>W przypadku bloków parafinowych ustawić kasetki tak, aby etykieta znajdowała się po lewej stronie, a następnie umieścić tkankę w kasetce, zachowując jej orientację. Zamknąć pokrywę kasetki i przenieść do pojemnika z ok. 500 ml 10% obojętnie buforowanej formaliny (NBF). Rozpocząć odliczanie czasu utrwalania w momencie umieszczenia ostatniej kasetki w utrwalaczu</li>
	<li>W przypadku bloków OCT wlać cienką warstwę medium OCT do wcześniej oznakowanej formy, następnie ułożyć tkankę w formie, dbając o zachowanie orientacji i pokryć tkankę medium OCT. Szybko zanurzyć formy OCT w mieszaninie suchego lodu z izopentanem na ok. 1 minutę. Wyjąć z mieszaniny i umieścić na suchym lodzie do tymczasowego przechowywania lub w zamrażarce -80 °C do długotrwałego przechowywania</li>
	<li>Pobrać skrawki o wymiarach ok. 0.5 x 0.5 cm z połączenia głowy z trzonem do mikroskopii elektronowej (EM). Umieścić jeden skrawki w utrwalaczu TAAB, a drugi w utrwalaczu Lowicryl. Przechowywać oba rodzaje utrwalacza z próbkami w temperaturze 4 °C przez co najmniej 48 godzin i/lub do czasu dalszego przetwarzania do EM</li>
</ol>
4. Disekcja śledziony, węzłów chłonnych i błony śluzowej dwunastnicy
<ol>
	<li>Wyizolować węzły chłonne trzustki (PLN) z tkanki tłuszczowej i usunąć całą tkankę łączną aż do torebki węzła. Umieścić w sterylnej szalce do hodowli komórkowej zawierającej DMEF. W zależności od całkowitej liczby wyizolowanych węzłów, podzielić PLN na aliquoty do wysyłek świeżych próbek, izolacji komórek kriotransformowanych, bloków parafinowych i/lub OCT oraz do probówek. Posiekać duże węzły na kawałki nie większe niż 0.5 cm.</li>
	<li>Posiekać węzły chłonne niepanukreatyczne oraz śledzionę na małe kostki (~0.5 cm). Umieścić w utrwalaczu, medium OCT i/lub DMEM w celu wysyłki świeżych próbek lub izolacji komórek kriotransformowanych, zależnie od ilości materiału wyjściowego.</li>
	<li>Otworzyć dwunastnicę i delikatnie oczyścić śluzówkę dwunastnicy z wydzieliny za pomocą zwilżonego gazika. Wyciąć fragmenty śluzówki do bloków parafinowych i/lub zamrożonych bloków OCT oraz posiekane próbki do probówek, z dodatkiem RNAlater lub bez niego. Zamrozić w taki sam sposób jak pozostałe próbki.</li>
</ol>
5. Owiń bloki OCT uprzednio oznakowaną folią aluminiową, a następnie umieść bloki OCT i probówki w pudełkach do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.
6. Przekaż utrwalone próbki do obróbki w parafinie
<ol>
	<li>Utrwalcie tkanki przez 16 godzin (zakres 20 ±4 godzin), korzystając z automatycznego procesora do parafiny lub stosując pomiar czasu manualnie. Przygotujcie bloki parafinowe za pomocą procesora automatycznego (<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix2.doc" target="_blank">Dodatek 2</a>).</li>
	<li>Zatopcie przekroje w dokładnie takiej orientacji, w jakiej zostały umieszczone przez patomorfologa, z etykietą kasety po lewej stronie. Zatopcie błonę śluzową dwunastnicy powierzchnią cięcia do dołu, aby umożliwić badanie błony śluzowej prostopadle do błony podśluzowej.</li>
</ol>
7. Wyczyść obszary sekcyjne i zdezynfekuj je. Umyj instrumenty sekcyjne i ponownie je wysterylizuj. Pozostałości tkanek ludzkich umieść w utrwalaczu z formaliną w celu przechowywania jako odpady biomedyczne. Utylizuj odpady biomedyczne zgodnie z lokalnymi przepisami w ciągu jednego miesiąca.
8. Aktualizacja systemu inwentaryzacji próbek
9. Reprezentatywne wyniki
Niniejsza procedura opisuje proces obróbki nienaruszonej ludzkiej trzustki z reprezentatywnym pobieraniem próbek z całego narządu, w tym wyznaczeniem trzech głównych obszarów: głowy, trzonu i ogona w czasie 2 godzin. Obszar haczykowaty, znajdujący się w tylnej części głowy, jest uwzględniany w sekcji głowy. Średnia masa trzustki u dawców narządów bez cukrzycy wynosiła 82,4 g (52,7 - 139,0 g). Masa poszczególnych regionów trzustki była w przybliżeniu taka sama (Rycina 3).
Niniejsza procedura umożliwia również rekonstrukcję całego trzustki z wykorzystaniem barwionych preparatów z sekwencyjnych bloków parafinowych oraz OCT. Możliwe jest zastosowanie wielu formatów, co pozwala na maksymalne wykorzystanie bieżących i przyszłych technologii. Do dyspozycji udostępniono aktualny arkusz roboczy przypadku nPOD (<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Załącznik 1</a>), który służy do dokumentowania odzyskanych próbek oraz ich późniejszego przetwarzania z podziałem na rodzaje i ilości alikwotów.
<img alt="Schemat sekcji trzustki; protokół krojenia; przygotowanie bloków parafinowych i OCT; proces chirurgiczny." src="/files/ftp_upload/4039/4039fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ogólny schemat procedury. Cała trzustka jest przetwarzana z zachowaniem orientacji anatomicznej. Obszar głowy jest dłuższy w osi górno-dolnej ze względu na obecność brzusznego płata trzustki w regionie tylnym, który obejmuje obszar haczykowaty. Zakreskowane obszary na połączeniach oznaczają regiony wykorzystane do pobrania posiekanych próbek do probówek kriogenicznych. P, parafina; O, OCT.
<img alt="Schemat procesu przekroju poprzecznego zarodka; orientacja anatomiczna; stadia rozwojowe." src="/files/ftp_upload/4039/4039fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat oznaczania sekcji trzustki. Poprzeczne plastry trzustki można dalej podzielić na połowy lub ćwiartki i oznaczyć literami zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
<img alt="Wykres słupkowy porównujący masę trzustki; cały organ w porównaniu z głową, trzonem i ogonem; waga w gramach." src="/files/ftp_upload/4039/4039fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Masa trzustki od dawców organów bez cukrzycy. Nienaruszoną trzustkę od dorosłych dawców (&gt;17 lat) zważono, a następnie podzielono na regiony i wyznaczono masę poszczególnych części. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM (N=15).

<ol><li>Brissova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).</li>
<li>Rahier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreatic+polypeptide+cells+in+the+human+pancreas%3A+the+effects+of+age+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).</li>
<li>Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+ventral+and+dorsal+pancreas%3A+a+new+insight+into+anatomy+and+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatobiliary+Pancreat.+Surg%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development.</a> J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).</li>
<li>Wittingen, J., Frey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+concentration+in+the+head%2C+body%2C+tail+and+uncinate+process+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas.</a> Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).</li>
<li>Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+the+human+diabetic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of the human diabetic pancreas.</a> Diabetologia. 24, 366-371 (1983).</li>
<li>Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NCI+perspective+on+creating+sustainable+biospecimen+resources%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst.+Monogr%22%5BJournal%5D)">An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources.</a> J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).</li>
<li>Gianani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+results+of+screening+of+nondiabetic+organ+donors+for+expression+of+islet+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).</li>
<li>Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+high-quality+pancreatic+tissue+for+experimental+study+from+organ+donors+with+signs+of+%CE%B2-cell+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab.+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity.</a> Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).</li>
<li>In't Veld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+insulitis+in+adult+autoantibody-positive+organ+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors.</a> Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).</li>
<li>Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+pancreata+in+perspective+of+the+isolation+of+the+islets+of+langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans.</a> Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Celem niniejszej procedury jest zdefiniowanie standardowego sposobu opracowania trzustki, który może zostać zharmonizowany w wielu ośrodkach pobrań, co umożliwi porównanie wyników uzyskanych przez różne grupy. Metoda sekcji opiera się na standardowych praktykach patomorfologii chirurgicznej z dodatkowymi etapami adnotacji głównych obszarów trzustki, a następnie ich podziałów wewnątrzregionalnych. Standaryzacja metod opracowywania biospecyminów jest niezbędna w celu ułatwienia gromadzenia wysokiej jakości próbek, czego pr...

<table><tbody><tr><td>Zestaw instrumentów do sekcji, w tym skalpele z ostrzami 22</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (15 i 50 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5, 430828</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>Kriotubki (1,8 ml)</td><td>VWR North America</td><td>89004-300</td><td>Sterylne, kody kreskowe opcjonalne</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Tusz do patomorfologii chirurgicznej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kasety</td><td>Mercedes Medical</td><td>CAS ECO109</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralnie buforowana formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-685</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do mrożenia OCT</td><td>TissueTek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Formy</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>58952</td><td>Różne rozmiary</td></tr><tr><td>Izopentan</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>Kąpiel chłodząca OCT</td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td>Kąpiel chłodząca OCT</td></tr><tr><td> ciekły azot w naczyniu Dewara</td><td></td><td></td><td>Szybkie mrożenie w krioszczelnych probówkach</td></tr><tr><td>Szalka do hodowli komórkowej (100 mm)</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>Hyclone DMEF</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30023.01</td><td>Sterylna, przechowywać w lodówce, zawiera glutaminę</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Cellgro</td><td>35-010-CV</td><td>Sterylna, przechowywać zmrożone alikwoty</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna/Lek przeciwgrzybiczy</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Sterylne, przechowywać zmrożone alikwoty</td></tr><tr><td>Parafina typu 9</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8337</td><td></td></tr><tr><td>1X D-PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Przygotowywać na świeżo, przechowywać w lodówce</td></tr><tr><td>8% Glutaraldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16019</td><td>Przygotowywać na świeżo, przechowywać w lodówce</td></tr><tr><td>Dygestorium klasy bezpieczeństwa biologicznego 2</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka ultra niskotemperaturowa</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drukarka do kaset Sakura</td><td>Sakura Finetek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sakura VIP300</td><td>Sakura Finetek</td><td></td><td>Automatyczny procesor do parafiny</td></tr><tr><td>Stacja do zatapiania w parafinie</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.</td></tr></tbody></table>

protokół pobierania trzustki ludzkiej

Collection Protocol for Human Pancreas

Niniejsza procedura sekcji i pobierania próbek została opracowana dla programu Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) w celu standaryzacji przygotowania trzustek pobranych od pośmiertnych dawców organów. Trzustkę dzieli się na 3 główne regiony (głowę, trzon i ogon), a następnie wykonuje seryjne przekroje poprzeczne wzdłuż osi od strony przyśrodkowej do bocznej. Naprzemienne sekcje są wykorzystywane do przygotowania bloków w parafini oraz bloków świeżo zamrożonych, natomiast pozostałe próbki są rozdrabniane do przygotowania próbek gwałtownie zamrożonych, z zastosowaniem lub bez inhibitorów RNazy, w celu izolacji DNA, RNA lub białek. Ogólnym celem procedury sekcji trzustki jest pobranie próbek z całej trzustki przy jednoczesnym zachowaniu orientacji anatomicznej.
W przypadku ludzkich wysepek w porównaniu z wysepkami gryzoni zgłasza się heterogeniczność komórek endokrynnych pod względem składu, wielkości i liczby wysepek 1. Większość ludzkich wysepek z obszarów głowy, trzonu i ogona trzustki składa się z komórek β zawierających insulinę, a następnie z mniejszych proporcji komórek α zawierających glukagon oraz komórek δ zawierających somatostatynę. Obecne są również komórki PP zawierające polipeptyd trzustkowy oraz komórki epsilon zawierające grelinę, lecz w niewielkiej liczbie. W przeciwieństwie do tego, obszar haczykowaty zawiera wysepki składające się głównie z komórek PP zawierających polipeptyd trzustkowy 2. Te regionalne różnice w budowie wysepek wynikają z różnic rozwojowych. Trzustka rozwija się z brzusznego i grzbietowego pączka trzustkowego w przedjelicie, a po rotacji żołądka i dwunastnicy płat brzuszny przemieszcza się i łączy z grzbietowym 3. Płat brzuszny tworzy tylną część głowy, w tym wyrostek haczykowaty, natomiast płat grzbietowy daje początek pozostałej części narządu. Zgłaszane są również regionalne różnice w budowie trzustki, przy czym obszar ogona charakteryzuje się wyższą gęstością wysepek w porównaniu z innymi regionami, a komponenty pochodzące z płata grzbietowego ulegają selektywnej atrofii w cukrzycy typu 14,5.
Często pobiera się dodatkowe narządy i tkanki od dawców, w tym węzły chłonne trzustki, śledzionę oraz węzły chłonne pozatrzustkowe. Próbki te są pobierane w sposób analogiczny do trzustki, z dodatkiem izolacji komórek do krio konserwacji. W przypadku, gdy wraz z trzustką pobierana jest bliższa część dwunastnicy, można zebrać błonę śluzową dwunastnicy do bloków parafinowych i mrożonych oraz do preparatów rozdrobnionych i błyskawicznie zamrożonych.

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę sekcji służącą do przetwarzania ludzkiej trzustki w celu uzyskania wielu formatów przechowywania. Orientacja anatomiczna jest zachowana we wszystkich obszarach trzustki, aby umożliwić określenie regionalnego składu i gęstości wysepek.

Protokół pobierania trzustki ludzkiej

Niniejsza procedura sekcji i pobierania próbek została opracowana dla programu Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) w celu standaryzacji przygotowania...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie sekcji trzustki ludzkiej w sposób zachowujący orientację anatomiczną. Osiąga się to poprzez oddzielenie dwunastnicy i śledziony od trzustki, a następnie usunięcie nadmiaru tkanki tłuszczowej oraz naczyń krwionośnych z narządu. Drugim krokiem jest pomalowanie powierzchni przedniej niebieskim tuszem, a powierzchni tylnej czarnym tuszem.Następnie trzustkę dzieli się na trzy obszary. Każdy obszar jest następnie krojony w poprzek na równe plastry i umieszczany w kasetkach do parafiny, formach OCT lub rozdrabniany i przenoszony do probówek. W końcowym etapie próbki są pobierane z trzech obszarów trzustki, przy jednoczesnym zachowaniu prawidłowej orientacji anatomicznej na potrzeby przyszłych analiz.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad cukrzycą typu pierwszego, takie jak mechanizmy leżące u podstaw utraty masy lub funkcji komórek beta, a także charakter ataku komórek odpornościowych. Wizualna prezentacja metody przetwarzania trzustki jest kluczowa, ponieważ zachowanie orientacji trzustki in vivo wymaga dbałości o szczegóły. Procedurę zaprezentują Linda Snyder, histotechnik oraz Emily Montgomery, naukowiec biologiczny w moim laboratorium.Należy rozpocząć od przygotowania wszystkich materiałów niezbędnych do przeprowadzenia procedury. Najpierw należy opisać kasety, w których znajdą się bloki parafinowe, podając identyfikator dawcy, rodzaj próbki, numer alikwoty oraz wszelkie dodatkowe informacje. Następnie w ten sam sposób należy opisać formy OCT.Wytnij odpowiednią liczbę kawałków folii aluminiowej do owinięcia każdego bloczka OCT i odłóż je do późniejszego użycia. Przygotuj wszystkie probówki niezbędne do przechowywania próbek świeżych i zamrożonych. W odpowiednim momencie dodaj RNA later oraz pożywkę RPMI.Następnie należy przygotować obszary robocze, umieszczając deski sekcyjne, wysterylizowane narzędzia oraz wszystkie pozostałe materiały niezbędne do procedury zarówno w komorze z laminarnym przepływem powietrza, jak i na blacie roboczym. Wszystkie kasety i formy OCT należy ułożyć w kolejności użycia w zasięgu ręki. Przygotować kąpiel mrożącą, dolewając odpowiednią ilość izopentanu, aby przykryć suchy lód na dnie styropianowego pudełka.Aby rozpocząć sekcję, należy usunąć dwunastnicę i śledzionę. Należy zacząć od oddzielania dwunastnicy od trzustki na jednym z jej końców i kontynuować czynność aż do całkowitego rozdzielenia tych organów. Śledziona jest przytwierdzona luźno, przez co można ją łatwo oddzielić od tkanki tłuszczowej i trzustki.Następnie należy oczyścić trzustkę z nadmiaru tkanki tłuszczowej, naczyń i nerwów, stosując kombinację tępej i ostrej dyssekcji. Odłożyć tłuszcz oraz węzły chłonne w celu ich późniejszej obróbki. Po oczyszczeniu umieścić trzustkę na stole sekcyjnym wyłożonym ręcznikami papierowymi.Zachowanie prawidłowej orientacji trzustki jest najtrudniejszym elementem tej procedury. Aby zapewnić sukces, powierzchnie przednią i tylną oznacza się tuszami w różnych kolorach. Zanurz aplikator z bawełnianą końcówką w niebieskim tuszu, rozprowadź go na powierzchni przedniej trzustki, a następnie odsącz nadmiar.Następnie zanurz nowy aplikator w czarnym tuszu i rozprowadź go na tylnej powierzchni trzustki. Przywróć trzustkę do jej normalnej orientacji. Z powierzchnią przednią skierowaną do góry trzustka jest teraz gotowa do pocięcia na trzy sekcje.Najpierw przetnij miejsce połączenia głowy z trzonem. Następnie podziel pozostałą część na w przybliżeniu równe fragmenty, aby oddzielić trzon od ogona, a następnie zmierz i zapisz masę każdego z obszarów trzustki, zaczynając od sekcji głowy.Podziel każdy region na sekcje o długości około 0.5 centymetra, wykonując cięcia poprzeczne, podobnie jak przy krojeniu bochenka chleba. Po pokrojeniu każdego regionu trzustki odetnij ostatnią sekcję regionu głowy, która jest sekcją połączenia głowy z trzonem, i umieść ją na oddzielnej desce sekcyjnej. Posiekaj tę sekcję na małe kawałki i rozdziel je równomiernie pomiędzy oznakowane probówki kriogeniczne z RNA i bez RNA.Następnie probówki zostają zamrożone zgodnie ze standardowymi procedurami. Powtórz tę procedurę dla sekcji połączenia ciała z ogonem.Po zebraniu posiekanych próbek należy przechylić wszystkie przekroje poprzeczne w prawo. Następnie usuwa się naprzemienne przekroje z każdego regionu. W przypadku bloków parafinowych i OCT należy usunąć pierwszy przekrój dla blokowania parafiną.Jeśli sekcja jest zbyt duża, należy przeciąć ją na pół. Kasety należy oznaczyć jako A i B. Jeśli fragment nadal jest zbyt duży, należy przeciąć każdą sekcję prostopadle do poprzedniego cięcia, a następnie oznaczyć kasety od A do D zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Jak widać tutaj, należy ustawić kasetę tak, aby etykieta znajdowała się po lewej stronie.Następnie umieść tkankę w kasecie i zamknij pokrywę. Przenieś kasetę do pojemnika z neutralnym buforem formaliny. Ponumeruj bloki sekwencyjnie w obrębie każdego regionu, zaczynając od sekcji najbardziej przyśrodkowej w przypadku bloków OCT.Wlej cienką warstwę medium OCT do wcześniej oznakowanego modelu. Przed wprowadzeniem tkanki pokryj ją medium OCT i szybko zamroź próbkę do późniejszego wykorzystania, wracając do tkanki odłożonej wcześniej. Wyizoluj węzły chłonne trzustki, odcinając tłuszcz i tkankę łączną otaczającą torebkę węzła. Umieść węzły w sterylnym naczyniu zawierającym DMEF; duże węzły rozdrabnij na kawałki nie większe niż 0.5 centymetrów.Po wyizolowaniu węzłów chłonnych trzustki należy podzielić tkankę pomiędzy przygotowane probówki i kasety do dalszej obróbki. Po opracowaniu węzłów chłonnych śledzionę należy posiekać i przechowywać w podobny sposób. W celu opracowania dwunastnicy należy użyć zwilżonego gazika do oczyszczenia błony śluzowej z treści śluzowej, odciąć błonę śluzową, a następnie pociąć ją na sekcje.Podziel próbki błony śluzowej zgodnie z wcześniejszym opisem. Stosując tę procedurę, pobiera się reprezentatywne próbki z każdego obszaru trzustki, co przedstawiono tutaj. Masa tkanek z głowy, trzonu i ogona była w przybliżeniu taka sama.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przetwarzać ludzką trzustkę na różne rodzaje próbek, w szczególności w zakresie zachowania ich orientacji, a także wiedzieć, jak izolować węzły chłonne z tłuszczu okołotrzustkowego.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Protokół pobierania tkanek trzustki u ludzi

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek trzustkowych jest jednym z głównych warunków koniecznych do pomyślnego przeszczepienia wysepek. W niniejszym filmie opisujemy krok po kroku procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część I: trawienie i pobieranie tkanki trzustki) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek jest jednym z głównych warunków pomyślnego przeszczepienia wysepek. W tym filmie krok po kroku opisujemy procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część II: oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja ludzkich wysepek trzustkowych: Część II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek

Dostępność wysepek trzustkowych od osób z cukrzycą typu 2 do celów badawczych jest niewystarczająca. Przedstawiamy tutaj nasz protokół izolacji wysepek od pacjentów poddawanych częściowej pankreatektomii. Podejście to stanowi unikalną możliwość pozyskania wysepek od osób z cukrzycą typu 2 oraz klinicznie dopasowanych osób niediabetycznych w liczbie odpowiedniej do badań podstawowych i klinicznych.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka od pacjentów po częściowej pankreatektomii

W niniejszym filmie zaprezentowano procedury charakterystyki ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) oraz immunohistochemii (IHC). Przekroje trzustki z obszarów głowy, trzonu i ogona poddaje się barwieniu H&amp;E oraz IHC w celu określenia składu endokrynnego wysepek (insulina, glukagon i polipeptyd trzustkowy), replikacji komórek (Ki67) oraz nacieków zapalnych (H&amp;E, CD3). Obszar haczykowaty jest lokalizowany za pomocą IHC w kierunku...

Protokoły barwienia dla ludzkich wysepek trzustkowych

Opisano protokół izolacji, hodowli i obrazowania klastrów komórek wysp trzustkowych (ICC) pochodzących z ludzkich komórek trzustki płodu. Metoda szczegółowo opisuje kroki niezbędne do wygenerowania ICC z tkanki, hodowli jako monowarstw lub w zawiesinie jako agregatów, oraz obrazu dla markerów proliferacji i decyzji o losie komórek trzustki.

Izolacja, hodowla i obrazowanie klastrów ludzkich płodowych komórek trzustkowych

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania sekcji ludzkiej trzustki w trzech wymiarach (3D) przy użyciu zoptymalizowanych metod pasywnego oczyszczania. Niniejszy manuskrypt demonstruje te procedury pasywnego oczyszczania optycznego, a następnie wielokrotnego barwienia immunofluorescencyjnego w celu zidentyfikowania kluczowych elementów autonomicznych i czuciowych sieci neuronowych unerwiających ludzkie wyspy trzustkowe.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości sieci neurowyspiowej ludzkiej trzustki

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek wysp trzustkowych myszy w celu badania indukcji ROS przez ksenobiotyki w celu zidentyfikowania potencjalnych cukrzycopochodnych ksenobiotycznych substancji chemicznych.

Badania przesiewowe oparte na komórkach wysp trzustkowych trzustki pod kątem cukrzycopochodnych substancji chemicznych

Ten protokół opisuje metodę synchronicznego pozyskiwania i korejestracji wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych oraz wydzielania insuliny i glukagonu przez pierwotne ludzkie pseudowyspy za pomocą adenowirusowego dostarczania cyklicznego biosensora monofosforanu adenozyny (cAMP), detektora różnic cAMP in situ (cADDis) oraz systemu mikroperyfuzji.

Ludzki system pseudowysp do synchronicznej oceny dynamiki biosensorów fluorescencyjnych i profili wydzielania hormonów

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Poznaj metodę preparowania ludzkiej trzustki z zachowaniem orientacji anatomicznej poprzez znakowanie atramentem i podział na trzy regiony. Technika umożliwia analizę składu wysp trzustkowych w badaniach nad cukrzycą typu 1.

Protokół pobierania trzustki ludzkiej

Przeglądaj więcej filmów