Protokół pobierania próbek trzustki ludzkiej
May 23rd, 2012
Ten film demonstruje procedurę preparacji ludzkiej trzustki do wielu formatów przechowywania. Orientacja anatomiczna jest zachowana w całym obszarze trzustki, aby umożliwić określenie regionalnego składu i gęstości wysp trzustkowych.
Ogólnym celem tej procedury jest wypreparowanie ludzkiej trzustki w sposób pozwalający zachować orientację anatomiczną. Osiąga się to poprzez usunięcie dwunastnicy i śledziony z trzustki, a następnie usunięcie nadmiaru tłuszczu i naczyń z trzustki. Drugim krokiem jest pomalowanie przedniej powierzchni niebieskim tuszem, a tylnej powierzchni czarnym tuszem.
Następnie trzustka jest podzielona na trzy regiony. Każdy region jest następnie krojony w poprzek na równe płyty i umieszczany na kasetach parafinowych, formach OCT lub dalej mielony i umieszczany w fiolkach. Ostatecznie pobiera się próbki ze wszystkich trzech obszarów trzustki, przy zachowaniu prawidłowej orientacji anatomicznej do przyszłej analizy.
Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad cukrzycą typu pierwszego, takie jak mechanizmy leżące u podstaw utraty masy lub funkcji komórek beta oraz charakter ataku komórek odpornościowych. Wizualna demonstracja metody przetwarzania trzustki ma kluczowe znaczenie, ponieważ utrzymanie orientacji trzustki in vivo wymaga dbałości o szczegóły. Procedurę zademonstrują Linda Snyder, technolog histo i Emily Montgomery, biolog w moim laboratorium.
Zacznij od przygotowania wszystkich materiałów potrzebnych do zabiegu. Najpierw oznacz kasety, w których będą znajdować się bloki parafiny, identyfikatorem dawcy, typem próbki, numerem podwielokrotności i wszelkimi dodatkowymi informacjami. Następnie oznacz formy OCT w ten sam sposób.
Wytnij wystarczającą ilość kawałków folii aluminiowej, aby owinąć każdy blok OCT i odłóż je na bok do późniejszego wykorzystania. Przygotować wszystkie fiolki potrzebne do przechowywania świeżych i mrożonych próbek. Dodaj RNA później i pożywkę RPMI, jeśli to konieczne.
Następnie przygotuj miejsca pracy, umieść deski rozbiorowe, wysterylizowane narzędzia i wszystkie inne materiały potrzebne do zabiegu zarówno w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, jak i na blacie. Ustaw wszystkie kasety i formy OCT w kolejności użycia. Pobliski. Stwórz kąpiel zamrażającą, dodając tyle izop pentanu, aby pokryć suchy lód na dnie styropianowego pudełka.
Aby rozpocząć preparację, usuń dwunastnicę i śledzionę. Rozpocznij oddzielanie dwunastnicy i trzustki na jednym końcu i kontynuuj aż do całkowitego odłączenia. Śledziona jest luźno przyczepiona i można ją łatwo usunąć z tłuszczu i trzustki.
Następnie oczyść trzustkę z obcych naczyń tłuszczowych i nerwów, stosując kombinację i ostrego rozwarstwienia. Odłóż na bok tłuszcz i węzły chłonne do późniejszego przetworzenia. Po oczyszczeniu umieść trzustkę na desce preparacyjnej pokrytej ręcznikami papierowymi.
Utrzymanie prawidłowej orientacji trzustki jest najtrudniejszym aspektem tej procedury. Aby zapewnić sukces, przednia i tylna powierzchnia są malowane różnymi kolorowymi tuszami. Zanurz aplikator z bawełnianą końcówką w niebieskim tuszu, rozprowadź tusz na przedniej powierzchni trzustki i zetrzyj nadmiar.
Następnie zanurz nowy aplikator w czarnym tuszu i rozprowadź go na tylnej powierzchni trzustki. Przywróć trzustkę do normalnej orientacji. Z przednią powierzchnią skierowaną do góry, trzustka jest teraz gotowa do pocięcia na trzy sekcje.
Najpierw przetnij połączenie między głową a ciałem. Następnie podziel pozostałą część na mniej więcej równe porcje, aby oddzielić ciało i ogon, zapisz wagę każdego obszaru trzustki. Zaczynając od sekcji głowy.
Podziel każdy region na około 0,5 centymetra części, krojąc w poprzek , podobnie jak kroi się bochenek chleba. Po pokrojeniu każdego obszaru trzustki usuń ostatnią część obszaru głowy, która jest sekcją połączenia głowy z ciałem, i umieść ją na osobnej desce preparcyjnej. Zmiel tę sekcję na małe kawałki i podziel je równomiernie między oznakowane fiolki kriogeniczne z RNA i bez.
Później fiolki są zamrażane. Postępowanie zgodnie ze standardowymi procedurami. Powtórz tę procedurę dla sekcji skrzyżowania ogona nadwozia.
Po zebraniu zmielonych próbek pochyl wszystkie przekroje poprzeczne w prawo. Naprzemienne sekcje każdego regionu zostaną usunięte. W przypadku bloków parafiny i OCT należy usunąć pierwszą sekcję dotyczącą blokowania parafiny.
Jeśli sekcja jest zbyt duża, przetnij ją na pół. Oznacz kasety jako A i B. Jeśli kawałek jest nadal zbyt duży, przytnij każdą sekcję prostopadle do poprzedniego cięcia, a następnie oznacz kasety od A do D w sposób zgodny z ruchem wskazówek zegara. Jak pokazano tutaj, umieść kasetę tak, aby etykieta znajdowała się po lewej stronie.
Następnie umieść chusteczkę w kasecie i zamknij pokrywę. Przenieść kasetę do pojemnika zawierającego obojętną buforowaną forminę. Ponumeruj blok sekwencyjnie w każdym regionie, zaczynając od najbardziej środkowej sekcji dla bloków OCT.
Wlej cienką warstwę pożywki OCT do wstępnie oznakowanej formy Przed wprowadzeniem tkanki przykryj tkankę pożywką OCT i szybko zamroź próbkę do późniejszego wykorzystania, wracając do tkanki, która została wcześniej odłożona na bok. Odizoluj węzły chłonne trzustki, odcinając tłuszcz i tkankę łączną otaczającą torebkę węzła. Umieść węzły w sterylnym naczyniu zawierającym DMEF, zmiel duże węzły na kawałki nie większe niż 0,5 centymetra.
Po wyizolowaniu węzłów chłonnych trzustki należy podzielić tkankę między przygotowane fiolki i kasety w celu dalszego przetwarzania. Po zakończeniu węzłów chłonnych śledziona jest mielona i przechowywana w podobny sposób. Aby przetworzyć dwunastnicę, użyj zwilżonej gaziki, aby wytrzeć błonę śluzową ze śluzu, odetnij błonę śluzową, a następnie pokrój ją na sekcje.
Podziel próbki błony śluzowej, jak pokazano wcześniej. Za pomocą tej procedury pobiera się reprezentatywne próbki każdego regionu trzustki, jak pokazano tutaj. Waga głowy, tułowia i ogona była w przybliżeniu równa.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przetwarzać ludzką trzustkę na różne typy próbek, w szczególności zdolność do utrzymania orientacji, a także jak izolować węzły chłonne od tłuszczu wokół trzustki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To wideo przedstawia procedurę sekcjonowania służącą do przetwarzania ludzkiej trzustki w wielu formatach przechowywania, zachowując orientację anatomiczną. Metoda ta pozwala na określenie regionalnej kompozycji i gęstości wysepek.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Anatomia człowieka
Tło
- Trzustka jest kluczowa dla funkcji metabolicznych.
- Zrozumienie kompozycji wysepek jest ważne dla badań nad cukrzycą.
- Zachowanie orientacji anatomicznej jest niezbędne do dokładnej analizy.
- Techniki sekcji mogą różnić się pod względem efektywności.
Cel badania
- Aby seckjonować ludzką trzustkę zachowując strukturę anatomiczną.
- Aby ułatwić zbieranie próbek z różnych regionów trzustki.
- Aby umożliwić przyszłą analizę kompozycji i gęstości wysepek.
Zastosowanie metod
- Usunięcie dwunastnicy i śledziony z trzustki.
- Oczyszczenie nadmiaru tkanki tłuszczowej i naczyń z trzustki.
- Pomarszczenie przedniej i tylnej powierzchni atramentem dla orientacji.
- Podział trzustki na trzy regiony i krojenie w plasterki.
Główne wyniki
- Próbki zostały pomyślnie zebrane ze wszystkich trzech regionów trzustki.
- Orientacja anatomiczna została zachowana podczas całej procedury.
- Metoda ta pozwala na szczegółową analizę kompozycji wysepek.
- Wykorzystano wiele formatów przechowywania dla przyszłych badań.
Konkluzje
- Procedura sekcjonowania jest skuteczna w zachowaniu anatomii trzustki.
- Ta metoda może poprawić badania nad wysepkami trzustkowymi.
- Przyszłe badania mogą budować na tej technice dla analizy metabolicznej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized human pancreas dissection and sampling protocols are critical for generating reproducible, anatomically precise biospecimens that underpin diabetes and metabolic disease research. This protocol enables consistent regional sampling, supporting high-confidence target validation and mechanistic studies across discovery and translational pipelines. Enterprise-wide adoption of such standardized workflows reduces biological ambiguity and enhances cross-study comparability for portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of regional islet cell heterogeneity for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by preserving anatomical context in biospecimens.
- Facilitates hypothesis-driven studies on beta cell loss and immune cell infiltration in type 1 diabetes.
Screening & Assay Development
- Provides validated, orientation-maintained tissue blocks for downstream histological and molecular assays.
- Ensures reproducibility and standardization in sample preparation for quantitative analysis.
- Enables scalable preparation of paraffin, OCT, and snap-frozen samples for multi-platform screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biospecimen collection with disease-relevant anatomical regions for translational biomarker studies.
- Supports continuity from human tissue analysis to preclinical model validation.
- Reduces risk of sampling bias in studies linking human pathology to therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of biospecimen acquisition and downstream molecular, cellular, and histological analyses, supporting workflows from early discovery through translational research.
- Discovery Biology: Enables robust hypothesis testing on islet cell composition and immune infiltration by region.
- Screening: Delivers reproducible, orientation-maintained samples for assay development and validation.
- Analytics: Supports quantitative comparison of regional differences in islet density and cell type distribution.
- Translational Research: Provides anatomically precise samples for biomarker alignment and preclinical model correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized protocol for multi-study and multi-site biospecimen generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in diabetes research.
- Operational Value: Drives standardization, reproducibility, and scalability in human tissue processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling high-quality, comparable datasets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of diabetes and metabolic disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in anatomical dissection and biospecimen handling.
- Needs access to histology, cryopreservation, and molecular analysis infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for labeling, orientation, and sample tracking.
- Must be adaptable to variations in donor anatomy and tissue quality.
- Dependent on strict adherence to protocol to avoid loss of anatomical context.
