Name: Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych i makrofagów z jelita myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek dendrytycznych i makrofagów z jelita myszy. Technika ta umożliwia szybką charakterystykę fenotypową i funkcjonalną komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Aaronowi Rae (Katedra Pediatrii Uniwersytetu Emory oraz Flow Core w Children's Healthcare of Atlanta) za sortowanie komórek. Praca ta była wspierana przez grant NIH AA01787001, nagrodę Career Development Award przyznaną przez Crohn's and Colitis Foundation of America oraz grant zalążkowy Emory-Egleston Children's Research Center przyznany T.L.D.

1. Disekcja i dysocjacja komórek nabłonka jelitowego
Przygotowanie odczynników i sprzętu:
<ul>
	<li>Podgrzej PBS pozbawiony Ca2+/Mg2+ (CMF PBS) do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Podgrzej HBSS pozbawiony Ca2+/Mg2+ z 5% FBS (CMF HBSS/FBS) i 2mM EDTA do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Podgrzej wytrząsarkę orbitalną do 37 °C.</li>
</ul>
Uwaga: Kroki od 1.1 do 1.7 należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować stopień śmierci komórek i uzyskać maksymalną wydajność komórek.
<ol>
	<li>Uśmierć myszy w komorze z CO2 i spryskaj brzuch oraz klatkę piersiową 70% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wykonaj niewielkie poziome nacięcie na środku brzucha i odchyl skórę, aby odsłonić otrzewną.</li>
	<li>Oddziel żołądek od górnego odcinka jelita cienkiego, przecinając zwieracz odgrodowy. Za pomocą pincety odsuń krezkę i przetnij ponownie w miejscu zastawki krętnowo-kątniczej, aby oddzielić całe jelito cienkie od jelita grubego. Wykonaj cięcie w obrębie brzegu odbytu i ponownie rozdziel krezkę, aż jelito grube zostanie uwolnione.</li>
	<li>Rozetnij okrężnicę wzdłużno nożyczkami i wypłucz zawartość kałową oraz śluz z światła jelita w CMF PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Używając nożyczek i pincety, makroskopowo wypreparuj kępki Peyera wzdłuż powierzchni antykrezkowej jelita cienkiego, a następnie rozetnij jelito cienkie wzdłuż.</li>
	<li>Wypłucz zawartość kałową i śluz ze światła jelita cienkiego w CMF PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pokrój osobno jelito cienkie i grube na kawałki o długości około 1,5 cm i umieść je w oddzielnych probówkach stożkowych 50 ml zawierających 30 ml podgrzanego CMF HBSS/FBS i 2mM EDTA. Nie umieszczaj więcej niż jednego jelita w probówce stożkowej 50 ml.</li>
	<li>Umieść każdą probówkę stożkową 50 ml poziomo w wytrząsaczce orbitalnej i inkubuj przy 250 rpm przez 20 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieść pojedyncze sito z drucianej siatki nad naczyniem na odpady i przelej zawartość każdej probówki stożkowej 50 ml, aby odzyskać 1,5 cm kawałki jelita, a następnie umieść je w oddzielnych probówkach stożkowych 50 ml zawierających 30 ml podgrzanego CHBSS/FBS z 2 mM EDTA.</li>
	<li>Powtórz krok 1.8.</li>
</ol>
2. Trawienie tkanek i izolacja komórek jelitowych
Przygotowanie odczynników i sprzętu:
<ul>
	<li>Roztwór kolagenazy: 1.5 mg/ml kolagenazy typu VIII rozpuszczonej w uprzednio ogrzanym CMF HBSS/FBS z dodatkiem 40 μg/ml DNazy I.</li>
	<li>Uprzednio ogrzane CMF HBSS/FBS oraz 2mM EDTA.</li>
	<li>Uprzednio ogrzany inkubator z wytrząsarką orbitalną w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Lodowate CMF HBSS/FBS.</li>
</ul>
<ol>
	<li>Po drugim cyklu wstrząsania przelać zawartość każdej probówki stożkowej 50 ml przez sitko i przenieść 1,5 cm fragmenty jelita do małej plastikowej łódki wagowej, po uprzednim osuszeniu nadmiaru pożywki ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Szybko posiekać 1,5 cm fragmenty jelita nożyczkami bezpośrednio w łódce wagowej i dodać posiekane jelito do 20 ml roztworu kolagenazy. Umieścić każdą probówkę stożkową 50 ml w pozycji poziomej w wytrząsarce orbitalnej i inkubować w celu trawienia przy 200 rpm przez 10-20 min w temperaturze 37 °C. Prosimy zapoznać się z poniższą dyskusją dotyczącą optymalizacji.</li>
	<li>Krótko wymieszać na wirówce typu vortex, aby zapewnić całkowitą dysocjację pozostałej tkanki jelitowej, a następnie przefiltrować przez sitko komórkowe 100 μm bezpośrednio do probówki stożkowej 50 ml.</li>
	<li>Uzupełnić każdą probówkę stożkową 50 ml do pełna CMF HBSS/FBS i odwirować przy 1500 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C. Jeśli po odwirowaniu próbek okrężnicy nie zaobserwowano stałego osadu, próbki należy odwirować ponownie przez 3,5 min. Powtórzyć ten etap płukania jeszcze raz.</li>
	<li>Odlać supernatant, resuspender osad komórkowy w lodowatym CMF HBSS/FBS i umieścić próbki na lodzie.</li>
	<li>Przejść do sekcji 3 w celu akwizycji/analizy FACS lub do sekcji 4 w celu wzbogacania za pomocą kulek magnetycznych do szybkich sortowań komórek.</li>
</ol>
3. Barwienie przeciwciałami do wielokolorowej analizy cytometrycznej komórek dendrytycznych i makrofagów
Przygotowanie odczynników i sprzętu:
<ul>
	<li>Schłodzony w lodzie bufor CMF PBS.</li>
	<li>Schłodzony w lodzie bufor do barwienia (CMF PBS + 5% FBS).</li>
	<li>Przygotować barwnik do martwych komórek w schłodzonym w lodzie buforze CMF PBS w rozcieńczeniu 1:1000, używając zestawu LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit.</li>
	<li>Przygotować koktajl przeciwciał do barwienia, dodając następujące znakowane fluorescencyjnie przeciwciała monoklonalne (mAbs) do schłodzonego w lodzie buforu do barwienia: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700, CD11b-eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.</li>
</ul>
<ol>
	<li>Przenieś komórki do polistyrenowej probówki o okrągłym dnie (FACS) o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Przemyj komórki dwukrotnie w schłodzonym do temperatury lodu CMF PBS.</li>
	<li>Inkubuj próbki z barwnikiem do martwych komórek przez 15 min na lodzie w ciemności.</li>
	<li>Przemyj komórki dwukrotnie w schłodzonym do temperatury lodu CMF PBS.</li>
	<li>Zablokuj komórki przeciwciałem 2.4G2 anti-FcγRIII/II w schłodzonym do temperatury lodu buforze do barwienia przez 10 min na lodzie.</li>
	<li>Przemyj komórki w schłodzonym do temperatury lodu buforze do barwienia.</li>
	<li>Inkubuj próbki z koktajlem przeciwciał barwiących przez 20 min na lodzie w ciemności.</li>
	<li>Przemyj komórki dwukrotnie schłodzonym do temperatury lodu buforem do barwienia, resuspenduj próbki w 400 μl schłodzonego do temperatury lodu buforu do barwienia i przefiltruj przez nakrętkę z filtrem 40 μm na probówkach FACS.</li>
	<li>Przeprowadź pomiar próbek na cytometrze LSR II (BD) zgodnie ze strategią bramkowania opisaną w sekcji 5 oraz na Rysunku 1.</li>
</ol>
4. Wzbogacanie frakcji komórek dendrytycznych i makrofagów z jelita
Przygotowanie odczynników i sprzętu:
<ul>
	<li>Lodowaty bufor barwiący (CMF PBS + 5% FBS).</li>
</ul>
<ol>
	<li>Inkubować zawiesinę pojedynczych komórek otrzymaną w kroku 2.5 z kuleczkami MACS CD11b i CD11c zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Przemyć komórki lodowatym buforem do barwienia, a następnie odwirować.</li>
	<li>Odlać supernatant i resuspendować osad komórkowy w 1 mL lodowatego buforu do barwienia, a następnie przepuścić przez sitko komórkowe 100 μm, a następnie przez sitko komórkowe 40 μm.</li>
	<li>Wzbogacić frakcję komórek związanych z kuleczkami magnetycznymi poprzez selekcję pozytywną przy użyciu kolumny magnetycznej MACS LS.</li>
	<li>Powtórzyć krok 4.2 i odlać supernatant.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałami monoklonalnymi (mAbs) przeciwko markerom powierzchniowym, zgodnie z opisem w kroku 3.7.</li>
	<li>Dwukrotnie przemyć komórki wzbogacone kuleczkami magnetycznymi lodowatym buforem do barwienia. Resuspendować osady komórkowe w 500 μL lodowatego buforu do barwienia bez azotku sodu i przepuścić przez sitko komórkowe 40 μm do probówki do FACS.</li>
	<li>Przeprowadzić sortowanie FACS za pomocą sortera komórek BD ARIA II w celu wyizolowania interesujących podgrup jelitowych komórek dendrytycznych (DC) i/lub makrofagów.</li>
</ol>
5. Strategia bramkowania dla APC z płata wątrobowego
Uwaga: Należy pamiętać, że niebarwione komórki jelitowe mogą zostać wykorzystane jako kontrola negatywna, aby pomóc w prawidłowym ustawieniu bram rozdzielających populacje pozytywne i negatywne.
<ol>
	<li>Zgodnie z Rysunkiem 1, należy utworzyć wykres kropkowy i wykluczyć komórki wykazujące pozytywny wynik barwienia na martwe komórki (Rys. 1A), a następnie wykluczyć zdarzenia będące dubletami (Rys. 1B i C). Następnie należy wyznaczyć bramkę dla interesujących nas komórek na podstawie rozpraszania światła w przód (FSC) i pod kątem (SSC), upewniając się, że wykluczono debris (Rys. 1D).</li>
	<li>Należy utworzyć kolejny wykres kropkowy i dodatkowo wyznaczyć bramkę dla komórek CD45+ oraz I-Ab+, co pozwala na fenotypową charakterystykę APC (Rys. 1E).</li>
	<li>Na osobnym wykresie kropkowym należy przeanalizować ekspresję CD11b i CD11c w celu odróżnienia specyficznych podzbiorów DC i makrofagów (R1, R2 i R3; Rys. 1F). Komórki w obszarze R1 to komórki CD11c+ CD11bdull/-. Obszar R2 został wyznaczony tak, aby komórki te posiadały poziom ekspresji powierzchniowej CD11c podobny do komórek w R1, ale komórki z R2 wykazują również ekspresję CD11b. Następnie obszar R3 został wyznaczony dla komórek, które są CD11b+ oraz CD11cdull/-.</li>
	<li>Obszary R1, R2 i R3 należy poddać dalszej analizie pod kątem ekspresji F4/80 i CD103, aby odpowiednio zróżnicować populacje makrofagów i DC. Komórki CD11c+ CD11bdull/- z R1 wykazują wysoką ekspresję integryny αE (CD103) oraz niską ekspresję F4/80 (Rys. 1G). Komórki CD11b+CD11c+ z R2 składają się zarówno z DC, jak i makrofagów, co wynika z ich dychotomicznej ekspresji CD103 i F4/80 (Rys. 1H). Na koniec, komórki CD11b+CD11cdull/- z R3 stanowią makrofagi, bazując na profilu fenotypowym F4/80+ i CD103- (Rys. 1I)16.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
<img alt="Wykresy rozrzutu cytometrii przepływowej analizujące populacje komórek, w tym markery CD i barwienie komórek martwych." src="/files/ftp_upload/4040/4040fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Strategia bramkowania dla komórek dendrytycznych i makrofagów jelitowych. W pierwszej kolejności z analizy wykluczono komórki martwe (A) oraz dublety (B i C), a następnie komórki jelita cienkiego bramkowano odpowiednio według rozproszenia światła przedniego i bocznego (D); komórki APC zdefiniowano jako CD45+I-Ab+(E). Makrofagi i komórki dendrytyczne zidentyfikowano na podstawie ekspresji CD11b i CD11c (F). Przeanalizowano ekspresję CD103 i F4/80 dla komórek uprzednio bramkowanych na populacje R1 (G), R2 (H) i R3 (I).
<img alt="Diagramy cytometrii przepływowej (A-C) dla CD11c, CD11b; Wykres wpływu trawienia komórek na całkowitą liczbę komórek (D-F)." src="/files/ftp_upload/4040/4040fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wydajność uzyskiwania komórek i jakość barwienia przeciwciał zależą od czasu trawienia. Wzór barwienia CD11b i CD11c oraz całkowita wydajność komórek w przypadku tkanki jelitowej niedostatecznie (A, D), optymalnie (B, E) lub nadmiernie strawionej (C, F).
Komórki jelitowe wyizolowano z jelita cienkiego myszy C57BL/6, a komórki DC i makrofagi analizowano metodą FACS przy użyciu BD LSR II. Napięcie i kompensację ustawiono z wykorzystaniem niebarwionych oraz barwionych pojedynczym fluorochromem splenocytów. Z analizy w pierwszej kolejności wykluczono martwe komórki (Ryc. 1A) oraz dublety (Ryc. 1B i C). Następnie analizowano komórki zainteresowania pod kątem rozpraszania światła w przód i pod kątem (Ryc. 1D), a następnie wyznaczono bramkę dla komórek CD45+ i I-Ab+ (Ryc. 1E). Następnie oceniono ekspresję CD11b i CD11c wśród komórek CD45+I-Ab+, aby wyznaczyć trzy regiony (R1, R2 i R3; Ryc. 1F). W trzech regionach oceniono ekspresję CD103 i F4/80, aby odpowiednio odróżnić komórki DC od makrofagów. Komórki CD11c+ CD11bdull/- z regionu R1 wykazywały wysoką ekspresję integryny αE, CD103 oraz niską ekspresję F4/80 (Ryc. 1G). Komórki CD11b+CD11c+ z regionu R2 składały się zarówno z komórek DC, jak i makrofagów, co oparto na dychotomicznej ekspresji CD103 i F4/80 (Ryc. 1H), podczas gdy komórki CD11b+CD11cdull/- z regionu R3 stanowią makrofagi na podstawie profilu fenotypowego F4/80+ i CD103- (Ryc. 1I)16. Makrofagi w bramce R2 oraz makrofagi w bramce R3 mają podobne właściwości rozpraszania światła w przód i pod kątem i są rozróżnialne na podstawie ekspresji CD11c. Funkcjonalna dychotomia tych subpopulacji pozostaje nie do końca poznana.
Zależność między czasem trawienia tkanki a całkowitą liczbą uzyskanych komórek oraz ekspresją CD11b i CD11c przedstawiono na Rysunku 2. Tkanka jelitowa trawiona przez 3 min (niedostateczne trawienie) dała niską całkowitą liczbę komórek (Rys. 2D), a w konsekwencji niewielką liczbę komórek dendrytycznych (DCs) i makrofagów dostępnych do charakterystyki (Rys. 2A). Trawienie tkanki przez 11 min pozwoliło uzyskać wysoką wydajność żywych komórek (Rys. 2E), przy czym populacje DCs i makrofagów wykazywały wysoką ekspresję CD11b i CD11c oraz były od siebie wyraźnie odróżnialne fenotypowo (Rys. 2C). W przeciwieństwie do tego, trawienie przez 50 min (nadmierne trawienie) doprowadziło do uzyskania podobnej liczby komórek w porównaniu z trawieniem zoptymalizowanym (Rys. 2E i F), jednak rozróżnienie poszczególnych populacji komórek przy użyciu CD11b i CD11c stało się mniej wyraźne, ponieważ ekspresja CD11c zmalała (Rys. 2C), a liczba martwych komórek wzrosła (dane nie zostały przedstawione).

<ol><li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li>
<li>Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+antigen+presentation+and+the+control+of+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity.</a> Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).</li>
<li>Abraham, C., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+host+innate+immune+system+and+microbes+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease.</a> Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).</li>
<li>Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regula+tine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regula tine.</a> Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).</li>
<li>Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal dendritic cells.</a> Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).</li>
<li>Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+independent+subset+of+TLR+expressing+CCR2-dependent+macrophages+promotes+colonic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation.</a> J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).</li>
<li>Coombes, J. L., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+intestinal+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in intestinal immune regulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).</li>
<li>Kelsall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+understanding+the+phenotype+and+function+of+intestinal+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages.</a> Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).</li>
<li>Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor%2C+plasticity%2C+and+crosstalk+between+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).</li>
<li>Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamina+propria+macrophages+and+dendritic+cells+differentially+induce+regulatory+and+interleukin+17-producing+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses.</a> Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).</li>
<li>Niess, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1-mediated+dendritic+cell+access+to+the+intestinal+lumen+and+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance.</a> Science. 307, 254-258 (2005).</li>
<li>Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+DCs+interact+with+intestinal+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">How do DCs interact with intestinal antigens.</a> Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).</li>
<li>Bilsborough, J., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+dendritic+cells+play+a+role+in+immunity%2C+tolerance%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease.</a> Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).</li>
<li>Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell%3A+its+role+in+intestinal+inflammation+and+relationship+with+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria.</a> Gut. 52, 1522-1529 (2003).</li>
<li>Medina-Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+regulates+intestinal+macrophage+homeostasis%2C+bacterial+translocation%2C+and+colitogenic+Th17+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice.</a> J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).</li>
<li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Specializations+of+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+That+Control+Th17+and+Regulatory+T+Cell+Responses+Are+Dependent+on+the+T+Cell%2FAPC+Ratio%2C+Source+of+Mouse+Strain%2C+and+Regional+Localization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization.</a> J. Immunol. , 187-733 (2011).</li>
<li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nod2+sensor+promotes+intestinal+pathogen+eradication+via+the+chemokine+CCL2-dependent+recruitment+of+inflammatory+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes.</a> Immunity. 34, 769-780 (2011).</li>
<li>Schulz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+CD103%2B%2C+but+not+CX3CR1%2B%2C+antigen+sampling+cells+migrate+in+lymph+and+serve+classical+dendritic+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions.</a> J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).</li>
<li>Jaensson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestinal+CD103%2B+dendritic+cells+display+unique+functional+properties+that+are+conserved+between+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans.</a> J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).</li>
<li>Uematsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+humoral+and+cellular+gut+immunity+by+lamina+propria+dendritic+cells+expressing+Toll-like+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5.</a> Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).</li>
<li>Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1--expressing+intestinal+macrophages+crucially+amplify+chronic+inflammation+in+experimental+colitis+and+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases.</a> J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).</li>
<li>Sun, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestine+lamina+propria+dendritic+cells+promote+de+novo+generation+of+Foxp3+T+reg+cells+via+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid.</a> J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).</li>
<li>Kamada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormally+differentiated+subsets+of+intestinal+macrophage+play+a+key+role+in+Th1-dominant+chronic+colitis+through+excess+production+of+IL-12+and+IL-23+in+response+to+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria.</a> J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).</li>
<li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+Th+cells+resembling+regulatory+T+cells+that+inhibit+chronic+colitis+differentiate+in+the+absence+of+interactions+between+CD4+and+class+II+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC.</a> J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

<img src="/files/ftp_upload/4040/4040fig3.jpg" alt="Schemat optymalizacji uzysku komórek: czynniki takie jak kolagenaza, trawienie tkanek, integralność, rozmiar." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Czynniki istotne dla optymalizacji uzysku komórek i ekspresji antygenów powierzchniowych. Uzysk komórek oraz ekspresja antygenów powierzchniowych zależą bezpośrednio od czasu trwania trawienia tkanki, specyficznych właściwości kolagenazy, stopnia rozdrobnienia tkanki oraz obec...

<table><tbody><tr><td>1X PBS, Ca2+&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;- i Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-wolny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) z czerwienią fenolową</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3001603</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES w 0,85% NaCl</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td>Inaktywowany termicznie</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu VIII </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Grupa Roche</td><td>14785000</td><td>Roztwór zapasu: 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia martwych komórek LIVE/DEAD Fixable Aqua do wzbudzenia 405 nm</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne CD45-PerCP (30F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:100</td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne CD103-PE (M290)</td><td>BD Biosciences</td><td>557495</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:100</td></tr><tr><td>Fc&amp;#947;przeciwciało monoklonalne RIII/II (2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:200</td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne CD11c-APC (N418)</td><td>eBioscience</td><td>17-0114-82</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:100</td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne przeciwko MHC-II (I-Ab) znakowane Alexa Fluor 700 </td><td>eBioscience</td><td>56-5321-82</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:100</td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne CD11b-eFluor 450 (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-82</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:200 </td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne F4/80-PE-Cy7 (BM8)</td><td>eBioscience</td><td>25-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>mikrokule CD11b</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-601</td><td></td></tr><tr><td>mikrokule CD11c</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td></td></tr><tr><td>probówki stożkowate 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Sito z pojedynczą siatką drucianą</td><td>Chefmate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mała łódeczka ważeniowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-116</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;sito do komórek o oczkach m</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;sito do komórek m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>probówki polistyrenowe z okrągłym dnem o pojemności 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:100</td></tr><tr><td>stołowy wytrząsarka orbitalna MaxQ 4450</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kolumna LS MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych oraz makrofagów z jelit myszy

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

W jelitach znajdują się unikalne populacje wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które biorą udział w promowaniu tolerancji wobec flory komensalnej i antygenów pokarmowych, pozostając jednocześnie w gotowości do wywołania odpowiedzi zapalnej przeciwko patogenom inwazyjnym1,2. Komórki prezentujące antygen, w szczególności komórki dendrytyczne (DCs) i makrofagi, odgrywają kluczową rolę w utrzymywaniu homeostazy immunologicznej jelit dzięki zdolności do wykrywania mikrobioty i odpowiedniego reagowania na nią3-14. Efektywna izolacja jelitowych komórek dendrytycznych i makrofagów jest krytycznym krokiem w charakteryzowaniu fenotypu i funkcji tych komórek. Choć opisano wiele skutecznych metod izolacji odpornościowych komórek jelitowych, w tym komórek dendrytycznych i makrofagów6,10,15-24, wiele z nich opiera się na długim czasie trawienia, co może negatywnie wpływać na ekspresję antygenów powierzchniowych, żywotność i/lub wydajność komórkową. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy metodologię szybkiej izolacji dużych liczb żywotnych komórek dendrytycznych i makrofagów jelitowych. Charakteryzacja fenotypowa jelitowych komórek dendrytycznych i makrofagów jest przeprowadzana poprzez bezpośrednie barwienie izolowanych komórek jelitowych specyficznymi przeciwciałami monoklonalnymi znakowanymi fluorescencyjnie do wielokolorowej analizy cytometrycznej. Ponadto, do badań funkcjonalnych izolowane są wysokiej czystości populacje komórek dendrytycznych i makrofagów z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek przy użyciu kulek CD11c i CD11b, a następnie za pomocą sortowania komórkowego.

W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano metodologię szybkiej izolacji komórek dendrytycznych (DCs) oraz makrofagów z jelit myszy. Charakterystyka fenotypowa jelitowych komórek dendrytycznych i makrofagów jest przeprowadzana za pomocą wielokolorowej analizy cytometrycznej, natomiast wzbogacanie za pomocą kulek magnetycznych z następującym po nim sortowaniem komórek jest stosowane w celu uzyskania populacji o wysokiej czystości do badań funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych oraz makrofagów z jelit myszy

W jelitach znajdują się unikalne populacje komórek odporności wrodzonej i nabytej, które biorą udział w promowaniu tolerancji wobec flory komensalnej oraz ...

Ogólnym celem tej procedury jest szybka izolacja komórek dendrytycznych (dcs) oraz makrofagów z jelit myszy w celu ich charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej. Osiąga się to najpierw poprzez pobranie tkanki jelitowej. Drugim krokiem jest oddzielenie nabłonka jelitowego od blaszki właściwej.Następnie, w końcowych etapach procedury, przeprowadzany jest trawienie blaszki właściwej jelita. Komórki blaszki właściwej są barwione fluorescencyjnie za pomocą koniugowanych przeciwciał, a następnie poddawane bramkowaniu w celu wyodrębnienia specyficznych populacji komórkowych. W efekcie populacje komórek dendrytycznych jelit oraz makrofagów mogą zostać dokładniej scharakteryzowane i oczyszczone do badań funkcjonalnych w celu oceny produkcji cytokin, prezentacji antygenów oraz regulacji komórek odpornościowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że szybkość trawienia tkanek zapewnia optymalną ekspresję antygenów powierzchniowych komórek, żywotność komórek oraz ich integralność komórkową. Po eutanazji myszy i potwierdzeniu zgonu za pomocą odruchu uciskania palca, spryskać brzuch i klatkę piersiową zwierzęcia 70% ethanol. Następnie za pomocą nożyczek wyko

isolation-characterization-dendritic-cells-macrophages-from-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych i makrofagów z jelita mysiego

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami.  W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Opisujemy tutaj metodę izolowania i oczyszczania komórek dendrytycznych z różnych anatomicznych przedziałów w ludzkim żeńskim układzie rozrodczym w celu oceny ich cech fenotypowych i funkcjonalnych. Metodę tę można dostosować do izolowania innych komórek odpornościowych lub komórek dendrytycznych z innych tkanek błony śluzowej.

Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek jednojądrzastych, które znajdują się w blaszce właściwej jelita grubego, poprzez enzymatyczne trawienie tkanki za pomocą kolagenazy. Protokół ten pozwala na efektywną izolację komórek jednojądrzastych, w wyniku której powstaje zawiesina pojedynczej komórki, która z kolei może być wykorzystana do solidnego immunofenotypowania.

Izolacja komórek jednojądrzastych blaszki właściwej z mysiej okrężnicy przy użyciu kolagenazy E

To badanie wykorzystuje cytometrię przepływową i dwie różne strategie bramkowania na izolowanych perfundowanych splotach naczyniówkowych mózgu myszy; ten protokół identyfikuje główne podzbiory komórek odpornościowych, które wypełniają tę strukturę mózgu.

Izolacja i charakterystyka komórek odpornościowych z mikropreparowanych splotów naczyniówkowych myszy

Poznaj metodę izolacji komórek dendrytycznych i makrofagów z jelita myszy. Technika ta umożliwia szybką charakterystykę fenotypową i funkcjonalną komórek immunologicznych.

Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych oraz makrofagów z jelit myszy

Przeglądaj więcej filmów