Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych i makrofagów z jelita myszy

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie wyizolowanie mysich jelitowych komórek dendrytycznych lub dc i makrofagów w celu charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie tkanki jelitowej. Drugim krokiem jest oddzielenie nabłonka jelitowego od Lamin propria.

Następnie, Lamin Propria jelitowa jest trawiona podczas końcowych etapów zabiegu. Komórki Lamin propria są barwione fluorescencją, sprzężonymi przeciwciałami i bramkowane dla określonych populacji komórek. Ostatecznie jelitowe populacje DC i makrofagów można dokładniej scharakteryzować i oczyścić do badań funkcjonalnych w celu oceny produkcji cytokin, prezentacji antygenu i regulacji komórek odpornościowych.

Tak więc główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że szybkość trawienia tkanek zapewnia optymalną ekspresję antygenu na powierzchni komórki, żywotność komórki i/lub komórkową. Po eutanazji myszy i potwierdzeniu śmierci przez odruch szczypania palca u nogi, przetestuj rozpylić 70% etanol na brzuch i klatkę piersiową zwierzęcia. Następnie użyj nożyczek, aby wykonać małe poziome nacięcie na środku brzucha i oderwij skórę, aby odsłonić otrzewną.

Otwórz otrzewną za pomocą nożyczek po przecięciu zwieracza pilo w celu oddzielenia żołądka od górnego odcinka jelita cienkiego i za pomocą kleszczy w celu usunięcia krezki. Przeciąć ponownie przy zastawce krętniczo-kątniczej, aby uwolnić całe jelito cienkie z jelita grubego. Kontynuuj oddzielanie krezki od jelita grubego i wykonaj nacięcie na krawędzi odbytu.

Użyj nożyczek, aby rozciąć okrężnicę wzdłużnie i użyj temperatury pokojowej C-M-F-P-B-S, aby wypłukać zawartość kału i śluz ze światła jelita. Następnie użyj nożyczek i kleszczy do makroskopowego pomiaru. Wyciąć plamy stosów wzdłuż antykrezkowej powierzchni jelita cienkiego i rozciąć jelito cienkie wzdłużnie.

Następnie oczyść światło jelita cienkiego z zawartości kałowej i śluzu za pomocą większej temperatury pokojowej C-M-F-P-B-S. Oddzielnie pokrój jelito cienkie i grube na około 1,5 centymetra kawałki i umieść je w pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówkach zawierających 30 mililitrów przedwojennego C-M-F-H-B-S-S z FBS i dwoma milimolowymi EDTA. Umieść każdą stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów poziomo w wytrząsarce orbitalnej, potrząsając probówkami z prędkością 250 obr./min przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie umieść sitko z pojedynczej siatki drucianej nad wiadrem na odpady. Przelej zawartość każdej 50-mililitrowej stożkowej probówki przez siatkę, aby odzyskać kawałki jelita, a następnie umieść ją w nowych pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówkach zawierających 30 mililitrów Prewarm C-M-F-H-B-S-S z FBS z dwoma milimolowymi EDTA. Na koniec umieść probówki z powrotem w wytrząsarce orbitalnej na kolejne 20 minut.

Po drugiej rundzie wstrząsania przelej zawartość każdej probówki przez sitko. Ponownie zetrzyj nadmiar pożywki za pomocą ręcznika papierowego, a następnie przenieś kawałki jelita do małej plastikowej łódeczki serwatkowej. Najtrudniejszym aspektem tej techniki jest trawienie tkanek w celu zapewnienia sukcesu, należy wziąć pod uwagę wszystkie różne parametry czasu trawienia, właściwości kolagenazy, integralność tkanki i rozmiar tkanki do trawienia Za pomocą nożyczek szybko.

Posiekaj kawałki jelita, a następnie dodaj zmielone jelito do 50-milimetrowej stożkowej rurki zawierającej 20 mililitrów roztworu kolagenazy. Umieść stożkową rurkę poziomo w wytrząsarce orbitalnej i traw kawałki jelita z prędkością 200 obr./min przez 10 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Teraz krótko przekręć rurkę, aby zapewnić dokładną dysocjację pozostałej tkanki jelitowej, a następnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o średnicy 100 mikronów bezpośrednio do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Na koniec uzupełnij stożkową probówkę C-M-F-H-B-S-S z FBS i odwiruj roztwór komórek dwa razy przez pięć minut w temperaturze 425 razy G w czterech stopniach Celsjusza. Następnie odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w lodowatym C-M-F-H-B-S-S z FBS i umieścić próbki na lodzie. Po wybarwieniu komórek pod kątem interesujących nas białek powierzchniowych.

Zacznij od utworzenia wykresu kropkowego z wyłączeniem komórek, które są dodatnie dla barwienia martwych komórek, jak pokazano tutaj. Następnie wyklucz zdarzenia dubletowe, jak pokazano tutaj i tutaj. Teraz użyj przednich i bocznych kanałów rozpraszania, aby wejść do interesujących komórek, upewniając się, że wykluczyłeś zanieczyszczenia.

Następnie utwórz kolejny wykres kropkowy bramkujący na antygenie CD 45 dodatnim i dodatnim IAB. Prezentując komórki na osobnym wykresie kropkowym, tworzysz regiony do rozróżniania określonych podzbiorów DC i makrofagów. Pokazany tutaj obszar R one przechwytuje ujemne komórki CD 11 C dodatnie CD 11 B.

Region R dwa wyznacza komórki, które mają podobny poziom ekspresji powierzchniowej dla CD 11 C jak komórki w regionie R jeden, ale które również wyrażają CD 11 B. Trzy regiony R oznaczają komórki, które są CD 11, B dodatnie i CD 11 C matowo ujemne. Te trzy regiony można dalej analizować pod kątem ekspresji F czterech, 80 i CD 1, 0, 3 w celu zróżnicowania odpowiednio makrofagów i populacji DC. Jak widać na tym wykresie punktowym, CD 11 C dodatnie CD 11 B ujemne komórki w regionie R one będą wyrażać wysokie poziomy alfa ein CD 1 0 3 i niskie poziomy F cztery 80.

Ten wykres punktowy pokazuje, że CD 11 B dodatnie CD 11 C dodatnie komórki w regionie R dwa będą składać się zarówno z DCS, jak i makrofagów w oparciu o ich dychotomiczną ekspresję CD 1, 0, 3 i F cztery 80. Wreszcie, w oparciu o ich F four 80 dodatni i CD 1 0 3 ujemny profil fenotypowy R trzy, bramkowane CD 11 B dodatnie CD 11 C del ujemne komórki będą składać się z makrofagów, związek między czasem trawienia tkanek a całkowitą wydajnością komórek a ekspresją CD 11 B i CD 11 C zilustrowano na poniższych sześciu rysunkach. Tkanka jelitowa, która jest trawiona przez trzy minuty, daje niską całkowitą liczbę komórek, co skutkuje niewielką liczbą dc i makrofagów dostępnych do scharakteryzowania trawienia tkanek przez 11 minut daje solidny plon żywych komórek, dając populacje dcs i makrofagów, które wyrażają wysokie poziomy CD 11 B i CD 11 C, które są fenotypowo różne.

Natomiast trawienie przez 50 minut daje podobną wydajność komórek w porównaniu z trawieniem zoptymalizowanym. Jednak wyznaczenie różnych populacji komórek za pomocą CD 11 B i CD 11 C staje się trudniejsze. Wraz ze spadkiem ekspresji CD 11 C i wzrostem liczby martwych komórek.

Tak więc, po zoptymalizowaniu parametrów trawienia tkanek jelitowych, można szybko osiągnąć solidną wydajność komórek. W rezultacie, szybka izolacja mysich jelit dc i makrofagów może być przydatna do oceny właściwości funkcjonalnych komórek odpornościowych z nienaruszonymi antygenami powierzchniowymi.