Name: Wholemount Immunohistochemistry do ujawniania złożonej topografii mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę wholemount immunohistochemistry do wizualizacji złożonych wzorców ekspresji genów w mózgu. Technika ta pozwala na trójwymiarowe obserwacje struktur mózgu, w tym móżdżku, bez konieczności rekonstrukcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RVS jest wspierany przez fundusze startowe dla nowych badaczy z Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University.

1. Perfuzja zwierzęcia i wyizolowanie móżdżku
<ol>
 <li>W zależności od białka, perfuzja może być niezbędna do uzyskania skutecznego barwienia1,2. Perfuzja przezsercowa jest inwazyjnym zabiegiem terminalnym, który wymaga właściwego zastosowania środków znieczulających. Przed przystąpieniem do procedury konieczne jest odpowiednie przeszkolenie, zgoda instytucjonalna oraz zatwierdzenie przez IACUC. Zawsze warto skonsultować się z lekarzami weterynaryjnymi danej instytucji, aby uzyskać pomoc w określeniu wymagań eksperymentalnych i zdobyciu odpowiedniego przeszkolenia. Przed procedurą zwierzę powinno być głęboko znieczulone i niewrażliwe na bodźce, takie jak uciskanie łapy lub ogona. Za pomocą nożyczek należy naciąć skórę brzucha i ścianę mięśniową, a następnie otworzyć klatkę piersiową, przecinając tkanki bezpośrednio przy mostku po obu stronach. Dodatkowo eksperymentator może stworzyć większą wewnętrzną przestrzeń roboczą poprzez przecięcie powięzi otaczającej przeponę. Po uniesieniu ściany brzusznej i klatki piersiowej ku górze serce zostanie odsłonięte. Należy wykonać małe nacięcie w prawym przedsionku, aby umożliwić wypływ krwi, a następnie natychmiast wprowadzić igłę do perfuzji do lewej komory. Do podawania roztworów perfuzyjnych zaleca się stosowanie podstawowej pompy hydrostatycznej (szczegóły w Tabeli 1). Najpierw należy wypłukać krew za pomocą 0,1M soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS, patrz Tabela 3) aż do momentu, gdy wypływająca ciecz będzie przejrzysta. Następnie należy wyłączyć pompę hydrostatyczną, szybko przełączyć rurkę doprowadzającą roztwór do pojemnika z 4% paraformaldehydem (PFA, patrz Tabela 3) rozcieńczonym w PBS, a następnie ponownie włączyć pompę, aby podać utrwalacz. Użycie pompy nie jest konieczne: przy wprawie można użyć dwóch strzykawek wypełnionych PBS i 4% PFA, aby powoli podawać roztwory.</li>
 <li>Kluczowe jest ostrożne wyjęcie mózgu z czaszki, bez powodowania jakichkolwiek uszkodzeń tkanki. Nawet niewielkie nacięcia mózgu podczas dysekcji stopniowo przekształcą się w widoczne szczeliny, które zatrzymują przeciwciała i powodują artefakty barwienia podczas przetwarzania tkanki (np. czerwone gwiazdki na Rys. 2). W przypadku dysekcji móżdżku typowe jest nacięcie skóry wzdłuż środka głowy, a następnie delikatne rozdzielenie płatów skóry w celu odsłonięcia czaszki. Należy przeciąć czaszkę od przodu do tyłu wzdłuż linii środkowej grzbietowej oraz bocznie po obu stronach czaszki. Nie należy przecinać poza obszar bregma, ponieważ grozi to uszkodzeniem móżdżku. Za pomocą pincety należy delikatnie unieść przednią część czaszki od mózgu, uważając, aby nie oderwać tkanki mózgowej przytwierdzonej do opon. Należy przeciąć nerwy czaszkowe po stronie brzusznej mózgu.</li>
 <li>Oddzielenie móżdżku od reszty mózgu jest ważne z dwóch powodów. Po pierwsze, pozwala to na badanie wzorców ekspresji w przednich częściach zakładów, które in situ są przesłonięte przez wzgórka. Po drugie, podzielenie tkanki na mniejsze, odseparowane regiony umożliwia pełniejsze utrwalenie, co może ułatwić barwienie niektórych białek. Podczas tego końcowego etapu dysekcji należy uważać, aby nie dotykać móżdżku końcówkami pincety. Należy wprowadzić końcówki pincety pomiędzy wzgórki górne i dolne. Drugą pincetą należy powoli oddzielić wzgórki dolne od móżdżku. Następnie należy ułożyć móżdżek tak, aby jego strona przednia była skierowana w dół, a pień mózgu był skierowany do góry. Należy wprowadzić pincetę do czwartej komory pomiędzy pień mózgu a zakłady IX/X móżdżku. Należy przeciąć nóżki móżdżku, ściskając je pincetą po obu stronach, a następnie delikatnie unieść móżdżek od pnia mózgu. Po wyizolowaniu móżdżku należy go poddać dofixacji poprzez zanurzenie w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez minimum 24-48 godzin. Móżdżek może być przechowywany w 4% PFA przez dłuższy czas. Opony powinny zostać usunięte przed lub po barwieniu dla lepszej widoczności wzorców ekspresji. Jeśli eksperymentator zdecyduje się usunąć opony przed barwieniem, istnieje duże prawdopodobieństwo przypadkowego nacięcia móżdżku podczas tego procesu. Odrywanie opon na koniec procedury barwienia jest znacznie prostsze, ponieważ są one łatwiejsze do zlokalizowania po tym, jak przejmą słabe barwienie tła i staną się kruche po procesowaniu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanki do barwienia całego preparatu
Ponieważ podejście polegające na barwieniu całego preparatu trwa dłużej niż barwienie immunohistochemiczne przekrojów tkankowych, pomocne jest zaplanowanie harmonogramu dla każdego z eksperymentów, zgodnie z przedstawionym przykładowym kalendarzem (Tabela 2). Przed rozpoczęciem należy pamiętać o kilku kluczowych kwestiach. 1) Mikroprobówki zawierające tkankę powinny być stale obracane na nutatorze, z wyjątkiem procesu zamrażania i rozmrażania. 2) Kilka roztworów musi być przygotowanych na świeżo dla każdego eksperymentu (przepisy na roztwory znajdują się w Tabeli 3). 3) W trakcie całego protokołu, podczas wymiany roztworów, należy delikatnie wylać zużyty roztwór zamiast wyjmować móżdżek pęsetą, aby uniknąć dotykania tkanki. Następnie, po wymieszaniu nowego roztworu w innym naczyniu, należy użyć pipety, aby delikatnie dodać świeży roztwór do probówki.
2.1 Dzień 1:
<ol class="lalpha">
 <li>Utrwal móżdżek w utrwalaczu Dent's fix3 w temperaturze pokojowej przez 6-8 godzin, delikatnie kołysząc na nutatorze. Jeśli metanol niszczy dany antygen, rozważ zastąpienie kroków od 2.1a do 2.3a metodą odzyskiwania antygenu. Ciepło i bufory stosowane podczas odzyskiwania antygenu pomogą przygotować tkankę do penetracji przeciwciał.</li>
 <li>Odbarw móżdżek w roztworze Dent's Bleach3 przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2.2 Dzień 2:
<ol class="lalpha">
 <li>Odwodnij móżdżek w dwóch etapach w 100% MeOH w temperaturze pokojowej po 30 min każdy.</li>
 <li>Następnie, aby zwiększyć penetrację roztworów, poddaj tkankę serii cykli zamrażania i rozmrażania. Ostrożnie umieść probówkę w pojemniku z suchym lodem i zamrażaj przez 30 min. Następnie wyjmij probówkę i pozostaw ją w temperaturze pokojowej na blacie przez 15 min. Etap zamrażania i rozmrażania należy powtórzyć cztery razy (minimum).</li>
 <li>Po ostatnim rozmrożeniu tkanki umieść probówkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C na noc.</li>
 <li>Tkankę można przechowywać przez dłuższy czas w temperaturze -80 °C bezpośrednio przed lub po etapach zamrażania i rozmrażania. W przeciwnym razie należy kontynuować protokół.</li>
</ol>
2.3 Dzień 3:
<ol class="lalpha">
 <li>Rehydratuj móżdżek, płukząc go w 50% MeOH/50% PBS, 15% MeOH/85% PBS oraz 100% PBS przez 60-90 minut w każdym z tych roztworów w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Następnie, w przypadku móżdżków myszy dorosłych, poddaj tkankę trawieniu enzymatycznemu za pomocą 10μg/ml Proteinazy K w PBS przez 2-3 minuty. W przypadku móżdżków młodych zwierząt (myszy P5 lub młodszych) etap trawienia nie jest konieczny. W przypadku większych mózgów zaleca się dłuższy czas trawienia; na przykład w przypadku mózgów naczelnych czas ten może wynosić od 5-6 minut4.</li>
 <li>Po trawieniu niezwłocznie przemyj móżdżek w PBS trzy razy po 10 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć Proteinazę K.</li>
 <li>Zablokuj tkankę w PMT (patrz Tabela 3) przez noc w temperaturze 4 °C. Mleko w proszku jest często preferowanym wyborem przy doborze czynnika blokującego w badaniach nad białkami, ponieważ jest niedrogie, skutecznie obniża tło barwienia i zazwyczaj nie zakłóca wiązania przeciwciał ani dostępu do antygenu. Można również stosować surowice zwierzęce, choć badacz powinien mieć na uwadze dodatkowe koszty i najpierw sprawdzić jakość surowicy pod kątem obecności przeciwciał krzyżowo reagujących oraz zdolność do uzyskania optymalnego stosunku sygnału do szumu.</li>
</ol>
2.4 Dzień 4-5:
<ol class="lalpha">
 <li>Inkubować tkankę w przeciwciałach pierwotnych rozcieńczonych w PMT z dodatkiem 5% DMSO przez 48 godzin w temperaturze 4 °C (większe móżdżki będą wymagały dłuższego czasu inkubacji).</li>
</ol>
2.5 Dzień 6:
<ol class="lalpha">
 <li>Przemyj móżdżek 2-3 razy po 2-3 godziny każdy w PMT w temperaturze 4 °C, aby usunąć niezwiązane przeciwciała pierwotne.</li>
 <li>Następnie inkubuj tkankę z przeciwciałami wtórnymi w roztworze PMT z dodatkiem 5% DMSO w temperaturze 4 °C przez noc (większe móżdżki mogą wymagać wydłużonego czasu inkubacji).</li>
</ol>
2.6 Dzień 7:
<ol class="lalpha">
 <li>Przemyć móżdżek 2-3 razy, po 2-3 godziny każdego płukania, w PMT w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Przeprowadzić końcowe płukanie tkanki w PBT (patrz Tabela 3) przez 1-2 godziny. Ten krok usuwa nadmiar mleka i poprawia klarowność barwienia.</li>
 <li>Na koniec inkubować tkankę w roztworze DAB (3,3'-diaminobenzydyny) aż do uzyskania optymalnego natężenia barwienia. Brązowy produkt reakcji powinien być wyraźnie widoczny w ciągu ~10 minut. Zaleca się stosowanie DAB w ciemności, ponieważ światło powoduje precypitację chromogenu, co może zwiększyć barwienie tła.</li>
</ol>
2.7
Po osiągnięciu optymalnego natężenia barwienia należy przerwać reakcję, umieszczając móżdżek w PBS z 0,04% azotkiem sodu. Tkanka może być przechowywana w tym roztworze przez dłuższy czas. Azotek sodu jest silnym inhibitorem wzrostu bakterii, jednak należy unikać jego stosowania aż do tego etapu, ponieważ hamuje on również aktywność peroksydazy chrzanowej.
2.8 Opcjonalna procedura amplifikacji:
należy postępować zgodnie ze standardowym protokołem, jednak poniższe kroki powinny zostać wykonane zamiast kroków 2.5b-2.7 opisanych powyżej.
<ol class="lalpha">
 <li>Inkubować tkankę przez noc w temperaturze 4 °C w przeciwciałach wtórnych konjugowanych z biotyną w PBST (patrz Tabela 3) z dodatkiem 5% DMSO.</li>
 <li>Płukać tkankę przez 2-3 godziny w każdym z 3-4 cykli wymiany PBST w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Inkubować móżdżek przez noc w temperaturze 4 °C w roztworze kompleksu ABC w PBST.</li>
 <li>Płukać tkankę przez 2-3 godziny w każdym z 3-4 cykli wymiany PBS w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Inkubować tkankę w świeżo przygotowanym roztworze DAB, zgodnie z powyższym opisem.</li>
 <li>Po uzyskaniu optymalnego zabarwienia przerwać reakcję, przemywając móżdżek w PBS z 0,04% azotkiem sodu.</li>
</ol>
3. Obrazowanie barwionej tkanki
<ol>
 <li>Obrazy całego preparatu można zarejestrować, używając na przykład kamery Leica DFC3000 FX zamontowanej na stereomikroskopie Leica MZ16 FA z oprogramowaniem Leica Application Suite FX. W razie potrzeby można zastosować mikroskopię dekonwolucyjną do pozyskania wielu następujących po sobie obrazów w różnych płaszczyznach ogniskowania, tak aby na każdym obrazie tylko jeden zakładka była w ostrym focusie. Następnie obrazy można skompresować w jeden stos i przetworzyć programowo w celu usunięcia zniekształceń. Końcowy obraz złożony będzie przedstawiał wzorce ekspresji na powierzchni móżdżku z wszystkimi widocznymi strukturami w wyraźnej ostrości.</li>
 <li>Barwioną tkankę całego preparatu należy obrazować podczas zanurzenia w PBS (lub innym medium zapewniającym optymalny współczynnik załamania światła). Aby ułatwić pozycjonowanie preparatu do obrazowania, przygotuj 1% żel agarowy w plastikowej szalce Petriego. W żelu wykonaj małe otwory. Otwory te pozwolą na zaklinowanie móżdżku w pożądanej orientacji.</li>
 <li>Surowe dane są importowane do programu Adobe Photoshop CS4, a następnie dostosowuje się ich poziomy kontrastu i jasności.</li>
</ol>
Zwierzęta
Wszystkie badania na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Albert Einstein College of Medicine. W wszystkich badaniach wykorzystano myszy outbred Swiss Webster (Taconic, Albany, NY) płci męskiej i żeńskiej, utrzymywane w naszej kolonii. Uśpione dorosłe szczury zostały udostępnione przez dr. Bryena Jordana (Albert Einstein College of Medicine). Wszystkie zwierzęta miały co najmniej miesiąc.
4. Reprezentatywne wyniki
Móżdżek jest podzielony pod względem ekspresji cząsteczkowej na cztery strefy poprzeczne: strefę przednią (AZ: ~listki I-V), strefę środkową (CZ: ~listki VI-VII), strefę tylną (PZ: ~listki VIII-grzbietowa część IX) oraz strefę guzkową (NZ: ~brzuszna część listków IX i listek X)5. Każda strefa zawiera unikalny układ pasów parasagitalnych1,2,5,6 (Rys. 1). Ekspresja ZebrinII w komórkach Purkinjego ujawnia pasy w strefach AZ i PZ (Rys. 2) oraz jednorodną ekspresję w strefach CZ i NZ (Rys. 2). Parasagitalna organizacja komórek Purkinjego odzwierciedla topografię pól końcowych włókien doprowadzających. Peptyd transkryptu regulowanego przez kokainę i amfetaminę (CART) jest ekspresowany w podzbiorach włókien pnących (Rys. 3a), które projektują do pasów dendrytów komórek Purkinjego w warstwie cząsteczkowej kory móżdżku7 (Rys. 3b). Przy zastosowaniu odpowiednich modyfikacji, takich jak amplifikacja7, protokół preparacji całego organu (wholemount) pozwala na wizualizację wzorców oliwowo-móżdżkowych bez konieczności żmudnej i czasochłonnej rekonstrukcji z barwionych przekrojów tkankowych (Rys. 3b).
<img alt="Histological section, cerebellar cortex, cell layer distribution, microscopic structure analysis." src="/files/ftp_upload/4042/4042fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Rycina 1. A. Ekspresja ZebrinII/aldolazy C ujawnia pasma strzałkowe w przekrojach poprzecznych móżdżku. Pasek skali = 500 μm. B. ZebrinII/aldolaza C jest ekspresowana wyłącznie w somatach i dendrytach komórek Purkinjego. Pasek skali = 150μm (gl = warstwa ziarnista; pcl = warstwa komórek Purkinjego; ml = warstwa molekularna).
<img alt="Schemat sekcjonowania mózgu z oznaczonymi strefami móżdżku i regionami anatomicznymi do badań neuroanatomicznych." src="/files/ftp_upload/4042/4042fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Cały móżdżek barwiony na ZebrinII/aldolazaC, przedstawiający prążki komórek Purkinjego na obrazach strefy przedniej (AZ), środkowej (CZ) i tylnej (PZ) móżdżku. Przedstawiono tutaj również przykład negatywnego skutku nacięcia móżdżku. Wynikowe zabarwienie artefaktowe zaznaczono czerwonymi gwiazdkami. Pasek skali = 1 mm (LS = lobulus simplex; PML = paramedian lobule; COP = copula pyramidis).
<img alt="Przekrój histologiczny i obraz anatomiczny; mikroskopia, struktura komórkowa, anatomia organizmu." src="/files/ftp_upload/4042/4042fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3">
 
Rysunek 3. A. CART jest wykazany w zakończeniach włókien wspinających w warstwie molekularnej. Pasek skali = 100 μm (ml = warstwa molekularna; pcl = warstwa komórek Purkinjego; gl = warstwa ziarnista). B. Immunohistochemia całego preparatu dla ekspresji CART w NZ. Pasek skali = 2 mm (COP = copula pyramidis; PML = guzek paramedialny; PFL = paraflokukul; FL = flokukul).

<ol><li>Sillitoe, R. V., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+Immunohistochemistry%3A+A+high-throughput+screen+for+patterning+defects+in+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).</li>
<li>Kim, S. -H., Che, P., Chung, S. -H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Immunohistochemistry+of+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Immunohistochemistry of the Brain.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2006).</li>
<li>Dent, J. A., Polson, A. G., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-mount+immunocytochemical+analysis+of+the+expression+of+the+intermediate+filament+protein+vimentin+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus.</a> Development. 105, 61-74 (1989).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Malz, C. R., Rockland, K., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+compartmentation+of+the+primate+and+tree+shrew+cerebellum%3A+a+common+topography+of+zebrin+II+in+Macaca+mulatta+and+Tupaia+belangeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Antigenic compartmentation of the primate and tree shrew cerebellum: a common topography of zebrin II in Macaca mulatta and Tupaia belangeri.</a> J. Anat. 204, 257-269 (2004).</li>
<li>Ozol, K., Hayden, J. M., Oberdick, J., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+zones+in+the+vermis+of+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transverse zones in the vermis of the mouse cerebellum.</a> J. Comp. Neurol. 412, 95-111 (1999).</li>
<li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine-regulated+transcript+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> J. Comp. Neurol. 519, 1781-1796 (2011).</li>
<li>Sarna, J. R., Marzban, H., Watanabe, M., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+stripes+of+phospholipase+Cbeta3+and+Cbeta4+expression+by+Purkinje+cell+subsets+in+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Complementary stripes of phospholipase Cbeta3 and Cbeta4 expression by Purkinje cell subsets in the mouse cerebellum.</a> J. Comp. Neurol. 496, 303-313 (2006).</li>
<li>Demilly, A., Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+heavy+chain+expression+reveals+a+unique+parasagittal+stripe+topography+in+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Neurofilament heavy chain expression reveals a unique parasagittal stripe topography in the mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 10, 409-421 (2011).</li>
<li>Larouche, M., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+clusters+to+stripes%3A+the+developmental+origins+of+adult+cerebellar+compartmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">From clusters to stripes: the developmental origins of adult cerebellar compartmentation.</a> Cerebellum. 5, 77-88 (2006).</li>
<li>Marzban, H., Chung, S., Watanabe, M., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+Cbeta4+expression+reveals+the+continuity+of+cerebellar+topography+through+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Phospholipase Cbeta4 expression reveals the continuity of cerebellar topography through development.</a> J. Comp. Neurol. 502, 857-871 (2007).</li>
<li>Blank, M. C., Grinberg, I., Aryee, E., Laliberte, C., Chizhikov, V. V., Henkelman, R. M., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+developmental+programs+are+altered+by+loss+of+Zic1+and+Zic4+to+cause+Dandy-Walker+malformation+cerebellar+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multiple developmental programs are altered by loss of Zic1 and Zic4 to cause Dandy-Walker malformation cerebellar pathogenesis.</a> Development. 138, 1207-1216 (2011).</li>
<li>Sawada, K., Sakata-Haga, H., Fukui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+array+of+tyrosine+hydroxylase+and+heat+shock+protein+25+immunopositive+Purkinje+cell+stripes+in+zebrin+II-defined+transverse+zone+of+the+cerebellum+of+rolling+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nagoya.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Alternating array of tyrosine hydroxylase and heat shock protein 25 immunopositive Purkinje cell stripes in zebrin II-defined transverse zone of the cerebellum of rolling mouse.</a> Nagoya. Brain Res. 1343, 46-53 (2010).</li>
<li>Sawada, K., Fukui, Y., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distribution+of+corticotropin-releasing+factor+immunopositive+climbing+fibers+in+the+mouse+cerebellum%3A+Analysis+by+whole+mount+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial distribution of corticotropin-releasing factor immunopositive climbing fibers in the mouse cerebellum: Analysis by whole mount immunohistochemistry.</a> Brain Res. 1222, 106-117 (2008).</li>
<li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+architecture+of+the+posterior+zone+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">On the architecture of the posterior zone of the cerebellum.</a> Cerebellum. 10, 422-434 (2011).</li>
<li>Pakan, J. M., Graham, D. J., Wylie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+visual+mossy+fiber+projections+and+zebrin+expression+in+the+pigeon+vestibulocerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization of visual mossy fiber projections and zebrin expression in the pigeon vestibulocerebellum.</a> J. Comp. Neurol. 518, 175-198 (2010).</li>
<li>Iwaniuk, A. N., Marzban, H., Pakan, J. M., Watanabe, M., Hawkes, R., Wylie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+cerebellar+cortex+of+hummingbirds+%28Aves%3A+Trochilidae%29+revealed+by+the+expression+of+zebrin+II+and+phospholipase+C+beta+4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the cerebellar cortex of hummingbirds (Aves: Trochilidae) revealed by the expression of zebrin II and phospholipase C beta 4.</a> J. Chem. Neuroanat. 37, 55-63 (2009).</li>
<li>Sarna, J. R., Larouche, M., Marzban, H., Sillitoe, R. V., Rancourt, D. E., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Purkinje+cell+degeneration+in+mouse+models+of+Niemann-Pick+type+C+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Patterned Purkinje cell degeneration in mouse models of Niemann-Pick type C disease.</a> J. Comp. Neurol. 456, 279-291 (2003).</li>
<li>Sarna, J. R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Purkinje+cell+loss+in+the+ataxic+sticky+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterned Purkinje cell loss in the ataxic sticky mouse.</a> Eur. J. Neurosci. 34, 79-86 (2011).</li>
<li>El-Bizri, N., Guignabert, C., Wang, L., Cheng, A., Stankunas, K., Chang, C. P., Mishina, Y., Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SM22alpha-targeted+deletion+of+bone+morphogenetic+protein+receptor+1A+in+mice+impairs+cardiac+and+vascular+development%2C+and+influences+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">SM22alpha-targeted deletion of bone morphogenetic protein receptor 1A in mice impairs cardiac and vascular development, and influences organogenesis.</a> Development. 135, 2981-2991 (2008).</li>
<li>Mondrinos, M. J., Koutzaki, S., Lelkes, P. I., Finck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-engineered+model+of+fetal+distal+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A tissue-engineered model of fetal distal lung tissue.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, 639-650 (2007).</li>
<li>Coppola, E., Rallu, M., Richard, J., Dufour, S., Riethmacher, D., Guillemot, F., Goridis, C., Brunet, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epibranchial+ganglia+orchestrate+the+development+of+the+cranial+neurogenic+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epibranchial ganglia orchestrate the development of the cranial neurogenic crest.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 2066-2071 (2010).</li>
<li>Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+guidance+of+embryonic+corneal+innervation%3A+roles+of+Semaphorin3A+and+Slit2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental guidance of embryonic corneal innervation: roles of Semaphorin3A and Slit2.</a> Dev. Biol. 344, 172-184 (2010).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain Struct. Funct. 216, 159-169 (2011).</li>
<li>Davis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry.</a> Methods Enzymol. 225, 502-516 (1993).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisaliśmy szczegóły techniczne niezbędne do skutecznego barwienia całych preparatów z wykorzystaniem wszechstronnego podejścia immunohistochemicznego w celu ujawnienia ekspresji białek w rozwijającym się i dorosłym mózgu. Dzięki zastosowaniu tej metody można analizować złożone wzorce ekspresji molekularnej oraz oceniać topografię mózgu bez konieczności przeprowadzania żmudnych i czasochłonnych procedur krojenia tkanek.
Niniejszy protokół był wykorzystywany do ujawnienia wzorców ekspresji kilk...

immunohistochemia całego preparatu w celu ujawnienia złożonej topografii mózgu

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

Powtarzalna i dobrze poznana architektura komórkowa móżdżku sprawia, że stanowi on idealny system modelowy do badania topografii mózgu. Pod jego stosunkowo jednolitą cytoarchitekturą kryje się złożony układ parasagitalnych domen ekspresji genów i białek. Molekularna kompartymentacja móżdżku odzwierciedla anatomiczną i funkcjonalną organizację włókien doprowadzających. Aby w pełni zrozumieć złożoność organizacji móżdżku, opracowaliśmy wcześniej metodę barwienia preparatów całych (wholemount) do wysokoprzepustowej analizy defektów wzorowania w móżdżku myszy. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje odczynniki, narzędzia oraz praktyczne kroki niezbędne do skutecznego ujawnienia wzorów ekspresji białek w móżdżku dorosłej myszy przy użyciu immunobarwienia preparatów całych. Przedstawione tutaj etapy demonstrują użyteczność tej metody na przykładzie ekspresji zebrinII/aldolaseC, pokazując, w jaki sposób można ujawnić precyzyjną topografię mózgu w jego natywnej konformacji trójwymiarowej. Opisano również modyfikacje protokołu umożliwiające wizualizację ekspresji białek w projekcjach doprowadzających oraz w dużych móżdżkach na potrzeby porównawczych badań topografii molekularnej. Aby zilustrować te zastosowania, dołączono dane z barwienia włókien doprowadzających w móżdżku szczura.

Obwody neuronalne są zorganizowane topograficznie w przedziały funkcjonalne o specyficznych profilach molekularnych. W niniejszej pracy przedstawiamy praktyczne i techniczne kroki służące do ujawnienia globalnej topografii mózgu z wykorzystaniem wszechstronnego podejścia opartego na barwieniu immunohistochemicznym całych preparatów (wholemount). Demonstrujemy użyteczność tej metody, wykorzystując dobrze poznaną cytoarchitekturę i obwody móżdżku.

Immunohistochemia całego preparatu w celu ujawnienia złożonej topografii mózgu

Powtarzalna i dobrze poznana architektura komórkowa móżdżku sprawia, że stanowi on idealny system modelowy do badania topografii mózgu. U podstaw jego...

Ogólnym celem tej procedury jest ujawnienie złożonych wzorów ekspresji genów w całej, nienaruszonej strukturze mózgu. Osiąga się to poprzez najpierw przeprowadzenie perfuzji zwierzęcia i usunięcie mózgu. Następnie wycina się móżdżek i poddaje go obróbce zgodnie z protokołem barwienia całych preparatów.Ostatnim krokiem jest wizualizacja ekspresji genów za pomocą histochemicznej reakcji barwnej. W końcowym etapie do obrazowania powierzchniowych wzorów ekspresji genów wykorzystuje się mikroskopię w polu jasnym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia w skrawkach tkanek, jest możliwość wizualizacji złożonych wzorów w trzech wymiarach bez konieczności ich rekonstrukcji.Procedurę demonstruje Joshua White, doktorant z mojego laboratorium. Po uśmierceniu zwierzęcia i wyjęciu mózgu z czaszki, oddziel móżdżek od reszty mózgu, wprowadzając najpierw końcówki pęsety w środek ciała modzelowatego górnego i dolnego. Następnie, używając drugiej pęsety, ostrożnie oddziel ciała modzelowate oraz korę od móżdżku.Ustaw móżdżek tak, aby strona przednia była skierowana w dół, a pień mózgu był skierowany do góry. Następnie wprowadź pęsetę do czwartej ko

wholemount-immunohistochemistry-for-revealing-complex-brain-topography

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Barwienie immunohistochemiczne całościowe w celu ujawnienia złożonej topografii mózgu

Wielkoskalowa immunodetekcja białek docelowych w całym mózgu naczelnych jest możliwa dzięki zastosowaniu nowatorskich metod zatapiania i krojenia tkanek w połączeniu z wykorzystaniem innowacyjnego urządzenia do masowego barwienia wielu wolnopływających skrawków jednocześnie.

Seryjne barwienie immunohistochemiczne do wielkoskalowej detekcji białek w całym mózgu małpy

Przedstawiamy praktyczny przewodnik po wprowadzaniu tracerów in vivo, wykorzystując drogę rdzeniowo-móżdżkową jako system modelowy do zaprezentowania kluczowych kroków niezbędnych do skutecznej analizy obwodów neuronalnych u myszy. Szczegółowo opisujemy nasz wszechstronny protokół śledzenia, który wykorzystuje aglutyninę z zarodków pszenicy (WGA) sprzężoną z fluoroforami Alexa.

Ujawnianie topografii obwodów neuronalnych w wielu kolorach

Ten film przedstawia procedurę barwienia immunologicznego utrwalonego wycinka tkanki mózgowej myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych astrocytów przy użyciu przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych oraz przechwytywania obrazów barwionych astrocytów za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Barwienie immunologiczne znakowanych fluorescencyjnie astrocytów w wycinku tkanki mózgowej myszy

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Ten artykuł przedstawia eksperymentalny protokół wykorzystujący technologię skanowania 3D, łączący dwie skale przestrzenne: makroskopową skalę przestrzenną anatomii całego mózgu obrazowaną przez MRI na &gt;100 μm oraz mikroskopijną skalę przestrzenną rozkładów neuronalnych przy użyciu barwienia immunohistochemicznego i systemu wieloelektrodowego oraz innych metod (~10 μm).

Technologia skanowania 3D łącząca mikroukłady i obrazy mózgu w makroskali w nowatorskim protokole osadzania nakładania się 3D

Ten protokół opisuje krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119, oprócz analizy gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy.

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Seryjna tomografia dwufotonowa (STPT) to technika obrazowania masy tkanki w jej trójwymiarowym kształcie poprzez połączenie obrazowania dwufotonowego z automatyczną kontrolą etapu i krojeniem mikrotomów. Tutaj opisujemy protokół jego implementacji dla mózgów marmozet, aby lepiej zrozumieć ich cechy strukturalne.

Seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych

Poznaj metodę wholemount immunohistochemistry do wizualizacji złożonych wzorców ekspresji genów w mózgu. Technika ta pozwala na trójwymiarowe obserwacje struktur mózgu, w tym móżdżku, bez konieczności rekonstrukcji.

Immunohistochemia całego preparatu w celu ujawnienia złożonej topografii mózgu

Przeglądaj więcej filmów