Immunohistochemia całego preparatu w celu ujawnienia złożonej topografii mózgu

Ogólnym celem tej procedury jest ujawnienie złożonych wzorów ekspresji genów w całej, nienaruszonej strukturze mózgu. Osiąga się to poprzez najpierw przeprowadzenie perfuzji zwierzęcia i usunięcie mózgu. Następnie wycina się móżdżek i poddaje go obróbce zgodnie z protokołem barwienia całych preparatów.

Ostatnim krokiem jest wizualizacja ekspresji genów za pomocą histochemicznej reakcji barwnej. W końcowym etapie do obrazowania powierzchniowych wzorów ekspresji genów wykorzystuje się mikroskopię w polu jasnym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia w skrawkach tkanek, jest możliwość wizualizacji złożonych wzorów w trzech wymiarach bez konieczności ich rekonstrukcji.

Procedurę demonstruje Joshua White, doktorant z mojego laboratorium. Po uśmierceniu zwierzęcia i wyjęciu mózgu z czaszki, oddziel móżdżek od reszty mózgu, wprowadzając najpierw końcówki pęsety w środek ciała modzelowatego górnego i dolnego. Następnie, używając drugiej pęsety, ostrożnie oddziel ciała modzelowate oraz korę od móżdżku.

Ustaw móżdżek tak, aby strona przednia była skierowana w dół, a pień mózgu był skierowany do góry. Następnie wprowadź pęsetę do czwartej komory między pień mózgu a płaty dziewiąty i dziesiąty móżdżku. Przetnij nóżki móżdżku, ściskając je pęsetą z obu stron, a następnie delikatnie oddziel móżdżek od pnia mózgu.

Przeprowadź postfiksację móżdżku poprzez zanurzenie w 4%paraldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez minimum od 24 do 48 godzin. Móżdżek może być przechowywany w 4%paraldehydzie przez dłuższy czas podczas pracy w dygestorium. Delikatnie odlej roztwór paraldehydu i zastąp go utrwalaczem o wysokiej gęstości (dense fix).

Umieść probówkę zawierającą móżdżek i roztwór utrwalający na rotatorze i delikatnie kołysz przez sześć do ośmiu godzin. Po upływie czasu inkubacji zlej gęsty utrwalacz i zastąp go gęstym wybielaczem. Inkubuj móżdżek w tym roztworze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsius, kontynuując kołysanie następnego dnia.

Zastąp roztwór w probówce 100% methanol. Umieść probówkę na mutatorze i delikatnie kołysz w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po upływie czasu inkubacji zastąp roztwór świeżym 100% methanol i powtórz inkubację, aby zapewnić odwodnienie móżdżku.

Następnie przeprowadź cykle zamrażania i rozmrażania tkanki w 100% methanolu, umieszczając probówkę w pojemniku z suchym lodem i mrożąc przez 30 minut. Po tym czasie za pomocą pęsety wyjmij probówkę z suchego lodu, a następnie odstaw ją na blat laboratoryjny do rozmrożenia przez 15 minut. Powtórz procedurę zamrażania i rozmrażania co najmniej cztery razy, aby zwiększyć penetrację roztworów barwiących.

Po ostatnim rozmrożeniu umieść probówkę w zamrażarce w temperaturze -80 °C na noc. Tkankę można przechowywać przez dłuższy czas w temperaturze -80 °C, zarówno bezpośrednio przed, jak i po etapach zamrażania i rozmrażania. W przeciwnym razie należy kontynuować protokół.

Następnego dnia. Rehydratyzuj móżdżek poprzez imersję z kołysaniem w 50% methanol 50% PBS, 15% methanol 85% PBS, a następnie w 100% PBS przez 60 do 90 minut w każdym etapie w temperaturze pokojowej. Następnie, w przypadku móżdżku myszy dorosłej, poddaj tkankę trawieniu enzymatycznemu z użyciem 10 µg/mL proteinazy K w PBS przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej z kołysaniem.

Ten etap trawienia nie jest konieczny w przypadku móżdżku myszy w wieku 5 dni lub młodszych. Po trawieniu natychmiast odlej proteinazę K i przemyj móżdżek w PBS 3 razy przez 10 minut każdy, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu. Po ostatnim przemyciu zastąp roztwór PBS-MT i inkubuj z ROCK przez noc w temperaturze 4°C, aby zablokować tkankę przed następnym dniem.

Odlać roztwór blokujący P-B-S-M-T i inkubować tkankę w przeciwciałach pierwszorzędowych rozcieńczonych w P-B-S-M-T z dodatkiem 5% DMSO przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy ciągłym kołysaniu. Po upływie czasu inkubacji przemyć móżdżek dwa do trzech razy, przez dwie do trzech godzin każdego razu, w P-B-S-M-T w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy kołysaniu, aby usunąć niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe.

Następnie inkubować tkankę z przeciwciałem wtórnym w roztworze P-B-S-M-T z 5%DMSO w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia, przy ciągłym kołysaniu, przemyć móżdżek w P-B-S-M-T w sposób opisany wcześniej. Następnie przeprowadzić końcowe przemywanie w PBT przez jedną do dwóch godzin z kołysaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ten etap pozwala usunąć nadmiar mleka i poprawić klarowność barwienia. Na koniec inkubuje się tkankę w roztworze DAB. Do momentu uzyskania optymalnego natężenia barwienia zaleca się stosowanie DAB w ciemności.

Ponieważ światło powoduje wytrącanie się chromogenu, co może zwiększyć tło barwienia, brązowy produkt reakcji powinien stać się wyraźnie widoczny w ciągu 10 minut, gdy osiągnięta zostanie optymalna intensywność barwienia. Reakcję należy zatrzymać, umieszczając móżdżek w PBS z 0,4% azotkiem sodu.

Tkankę można przechowywać długoterminowo w tym roztworze. Tkankę barwioną metodą całościową (whole mount) należy obrazować podczas zanurzenia w PBS lub innym medium zapewniającym optymalny współczynnik załamania światła. Aby ułatwić pozycjonowanie preparatu całościowego do obrazowania, należy przygotować 1% żel agarowy w plastikowej szalce Petriego.

Następnie należy wyciąć w żelu małe otwory, a następnie umieścić w nich próbkę móżdżku w pożądanej orientacji do obrazowania i przykryć ją PBS. Barwiona tkanka jest teraz gotowa do obrazowania przy użyciu mikroskopii świetlnej. ZEIN two Adelaide c.

Immunohistochemia ujawnia pasma strzałkowe w przekrojach poprzecznych móżdżku. Na schemacie oznaczono prążki czwarty, piąty i trzeci. W celu orientacji skala reprezentuje 500 mikronów.

ZEIN dwa. C z Adelaide jest wyrażane wyłącznie w podzbiorach ciał komórek i dendrytów kinji. Na tym obrazie pasek skali reprezentuje 150 mikronów.

Na tym obrazie przedstawiono preparat całego móżdżku barwionego na zein two, Adela C, ukazujący prążki komórek bikini w obrazach stref przedniej, środkowej i tylnej móżdżku. Rzymskie cyfry oznaczają płaty móżdżku. LS to loist simplex.

Skrót PML oznacza paramedian labial. COP oznacza parametry kopularne i etykiety. Crust one oraz crust two to nazwy dwóch LOE półkul; oznaczenia P one i P three opierają się na standardowej nomenklaturze służącej do wskazywania konkretnych prążków BR two.

Więcej szczegółów znajduje się w publikacji Sillitoe i Hawks 2002. Pasek skali reprezentuje jeden milimetr. Przedstawione tutaj móżdżek został poddany immunobarwieniu z użyciem przeciwciała przeciwko peptydowi transkryptu regulowanego przez kokainę i amfetaminę.

Można zauważyć, że białko to jest wyrażane w podzbiorach włókien wspinających, które przebiegają przez warstwę komórek Purkinjego oznaczoną jako PCL i kończą się w warstwie ziarnistej oznaczonej jako ml. Tutaj pasek skali reprezentuje 100 micronów.

Na tym obrazie widać, że włókna dodatnie rzutują pasma dendrytów komórek koszyczkowych w warstwie molekularnej kory móżdżku, w tym w obszarach takich jak Oculus oznaczony jako PFL oraz Oculus oznaczony jako fl. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby unikać nacinania móżdżku. Wszelkie uszkodzenia zewnętrzne utrudnią widoczność złożonych wzorów barwienia.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ujawniać złożone i interesujące wzorce ekspresji genów w neuronach oraz w włóknach, które z nimi kontaktują w nienaruszonym mózgu.