Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego za pomocą znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Ogólnym celem poniższej procedury jest pomiar kinetyki i progresji cyklu komórkowego. Pierwsze komórki są znakowane impulsowo romo, deoksy, urydyną lub BRDU, który jest wprowadzany do DNA komórki w miejsce tymidyny. Komórki są następnie barwione immunologicznie przeciwciałami przeciwko BRDU i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej natychmiast po barwieniu.

Tylko komórki w fazie S są znakowane, gdy znakowane komórki przechodzą przez cykl komórkowy do G dwa. Wykrywa się, że po mitozie mają cztery treści NDNA. Zawartość DNA jest redukowana do dwóch N. W ten sposób analiza profili fluorescencyjnych generowanych przez cytometrię przepływową może być wykorzystana do określenia kinetyki progresji cyklu komórkowego.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi protokołami, które wykorzystują substancje chemiczne do synchronizacji komórek, jest to, że nie ma zaburzeń fizjologicznych, które mogłyby nieumyślnie wpłynąć na maszynerię podziału komórek. Po raz pierwszy zastosowaliśmy tę metodę, gdy nasze próby zbadania tempa progresji cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji chemicznej dały nam nieoczekiwane wyniki, które zakłóciły naszą analizę. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki.

Na przykład, co jest podstawą różnych temp wzrostu między różnymi typami komórek? Rozpocznij ten protokół od pulsacyjnego Chase'a, oznaczając komórki BRDU, aby to zrobić. Zacznij od oznaczenia jednej 10-centymetrowej tabliczki dla każdego punktu czasowego oraz po jednej dla każdej z poniższych kontrolek.

BRDU tylko PI tylko BRDU ujemny PI ujemny wysiew każdej płytki z pięciokrotnością 10 do piątej. Siedem komórek MCF w uzupełnionym DMEM inkubuje płytki przez 24 do 48 godzin, aby umożliwić komórkom regenerację i przyłączenie. Gdy komórki osiągną płynność 60% conf, zastąp pożywkę świeżym DMEM zawierającym 10 mikromolowców.

BRDU inkubuje komórki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% CO2, aby umożliwić włączenie BRDU do DNA. Należy pamiętać, że po upływie godziny jedna płytka nie została poddana działaniu środka kontroli ujemnej lub punktu zerowego. Usunąć pożywkę do etykietowania impulsowego i krótko przepłukać komórki PBS do punktów czasowych od dwóch do ośmiu godzin.

Dodaj świeżą pożywkę wzrostową i umieść je z powrotem w inkubatorze. Następnie natychmiast zbierz płytki z punktem zerowym i godzinnym, jak opisano w następnej sekcji. Aby zebrać komórki, odessać pożywkę i opłukać płytkę.

Po użyciu PBS, trypsyna obserwuje komórki, aby oderwać je od płytki i zebrać je w wirówce DMEM w trzech 90 razy G przez pięć minut. Odrzucić supernatant. Następnie przepłucz komórki w jednej do pięciu mililitrów lodowatej wirówki PBS przy trzech 90 razy G przez pięć minut po wirowaniu, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w stu mikrolitrach lodu.

Zimny PBS zawierający 1% FBS. FBS pomaga zapobiegać zlepianiu się komórek. Jednym z najważniejszych aspektów tej procedury jest upewnienie się, że masz zawiesinę pojedynczej komórki z pobranych komórek.

Dla faktów. Aby to osiągnąć, możesz dodawać swoje ogniwa bezpośrednio do etanolu kropla po kropli. Ma to kluczowe znaczenie Następnie, aby naprawić komórki, użyj pipety, aby dodać komórki kroplami do pięciu mililitrów kodu lodu.

70% etanolu w stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut lub przechowuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jest to idealny krok, w którym aby zatrzymać pobieranie próbek z różnych punktów czasowych, próbki można pozostawić w etanolu na kilka dni, co pozwala na ich jednoczesne przetwarzanie przez pozostałą część protokołu w celu przeprowadzenia barwienia BRDU i jodku propidyny.

Usuń komórki z czterech stopni Celsjusza i odwiruj je w temperaturze trzech 90 razy G przez pięć minut. Po wirowaniu odessać większość utrwalacza, pozostawiając około 50 mikrolitrów. Potem wir.

Aby poluzować osad w celu denaturacji DNA podczas wirowania. Powoli dodawaj kroplami jeden mililitr dwóch normalnych HCL Triton X 100, a następnie inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Osadzać komórki, wirując próbki przez pięć minut w temperaturze trzech 90 razy G, następnie zassać i odrzucić supernatant.

Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze 0,1-molowego tetraboranu sodu. Po odwirowaniu komórki ponownie zasysają i odrzucają supernatant. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 75 mikrolitrach barwienia BRDU.

Mieszać inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut, chroniąc przed światłem po inkubacji. Osadzać komórki przez wirowanie jak poprzednio i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze PBS zawierającym pięć mikrogramów na mililitr na jodek perdu. Podczas przepuszczania próbki PI dodatniej przez cytometr przepływowy utwórz wykres rozproszenia do przodu w stosunku do bocznego, aby zapewnić prawidłowy rozkład wielkości komórek.

Oba te parametry powinny być wykreślone na skali liniowej. Jednocześnie wyświetl wykres FL trzy H w porównaniu z FL dwa W, aby wyświetlić barwienie PI w funkcji szerokości impulsu fluorescencji. Ten wykres służy do tworzenia chodu w celu wyizolowania frakcji komórek, które uważa się za mieszczące się w normalnym wzorcu rozkładu cyklu komórkowego.

Ogólnie rzecz biorąc, ten wzorzec dystrybucji charakteryzuje się dwoma klastrami komórek z dwóch N i czterech NDNA zawartości barwienia PI reprezentujących odpowiednio jedną i G dwie fazy cyklu komórkowego. Ciąg komórek znajdujących się pomiędzy tymi dwoma klastrami jest reprezentatywny dla trwającej replikacji DNA, która zachodzi w fazie S cyklu komórkowego. Utwórz wykres przedstawiający bramkowane komórki z FL, jednym H lub FITC na skali logarytmicznej na osi Y i PI na skali liniowej na osi X.

Ten wykres zostanie wykorzystany do ustawienia pozostałych parametrów za pomocą różnych elementów sterujących, a także do zbierania danych. Do analizy umieść próbkę barwienia tylko PI w porcie ładowania cytometru przepływowego, wyreguluj wzmocnienie, aby umieścić G one na około 200 na osi x. Będzie to łatwiejsze do zobrazowania na wykresie histogramu barwienia PI.

Następnie umieść tylko próbkę BRDU w porcie ładowania i uruchom. Dostosuj wzmocnienie tak, aby na wykresie pojawiły się dwie populacje komórek, BRDU dodatnia i BRDU ujemna. Idealnie, ujemne ogniwa BRDU są umieszczone tuż na poziomie lub poniżej 10 do jednego.

Końcową kontrolą jest próbka ujemna BDU slash PI. Uruchom tę kontrolę negatywną, aby upewnić się, że komórki nie pojawiają się w żadnym z górnych lub prawych kwadrantów. Po ustawieniu parametrów różnych wykresów, cytometr przepływowy jest kalibrowany i gotowy do przetwarzania BRDU i PI. Barwione komórki zbierają dane z co najmniej 10 000 komórek bramkowanych PI dla każdej próbki.

Następnie za pomocą oprogramowania, takiego jak FlowJo lub fax diva, utwórz wykres FITC w funkcji PI z komórkami bramkowanymi jako PI dodatnie z wykresu PI w porównaniu z FL dwa W. Aby rozróżnić populację rowerzystów. Następnie wygeneruj drugą bramkę, aby wyizolować populację BRDU dodatnią.

Następnie, aby śledzić przebieg w czasie progresji cyklu komórkowego, wykreśl liczbę komórek BRDU dodatnich z zawartością G jeden lub G dwa w funkcji czasu, aby porównać cykl progresji komórki. Kinetyka między dwiema liniami komórek jelita grubego HT 29 i LS 180. Komórki pobierano co godzinę przez osiem godzin po usunięciu impulsu A-B-R-D-U.

Porównując kinetykę obu profili, pojawienie się piku G one jest widoczne przy t równym cztery godziny po BRDU w komórkach LS 180 w porównaniu z odpowiednim punktem czasowym dla linii komórkowej HT 29, w której brakuje tego piku. Wskazuje to na przyspieszony postęp cyklu komórkowego przez dwie fazy G cyklu komórkowego. W linii komórkowej jelita grubego LS 180 w celu wygenerowania profilu cyklicznego linii komórkowej raka piersi.

MC siedem komórek pobierano co godzinę przez osiem godzin. Po usunięciu impulsu BRDU. Komórki znakowane immunologicznie i przeciwbarwiące DNA zostały następnie posortowane na podstawie ich sygnałów fluorescencyjnych.

Jak widać tutaj, siedem komórek mukowiscydozy zmieniało się znacznie wolniej niż którakolwiek z dwóch testowanych linii komórek jelita grubego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób metaboliczne znakowanie DNA w połączeniu ze zbiorem punktów czasowych pozwala śledzić kinetykę cyklu komórkowego.