Name: Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego za pomocą znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Poznaj metodę pomiaru kinetyki cyklu komórkowego przy użyciu znakowania metabolicznego BrdU i cytometrii przepływowej. Technika ta eliminuje konieczność chemicznej synchronizacji, zmniejszając ryzyko uszkodzeń DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Andy'emu Johnsonowi z Centrum Badań Biomedycznych na UBC za pomoc w analizie FACS. Finansowanie badań nad rakiem w laboratorium Wonga jest zapewniane przez Instytut Badawczy Kanadyjskiego Towarzystwa Walki z Rakiem (grant operacyjny nr 019250) oraz z funduszy reinwestycji badawczych Wydziału Nauk Farmaceutycznych UBC. JMYW jest wspierany przez programy Canada Research Chairs oraz Michael Smith Foundation for Health Research Career Development.

1. Przygotowanie komórek
<img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="Morfologia komórek pod mikroskopem w kontraście fazowym; analiza struktury komórkowej i wzorców wzrostu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 0"> 
<ol>
 <li> Wysiać komórki, aby uzyskać gęstość odpowiadającą około 60% konfluencji. W momenciey zbierania komórki muszą znajdować się w fazie logarytmicznej. W przypadku komórek mcf7 osiąga się to poprzez wysianie 5 x 105 komórek / płytkę 10 cm w odpowiednim medium. Komórki HT29 i LS180 wysiewa się w zagęszczeniu 6 x 105 komórek / płytkę 6 cm. Zastosowano medium DMEM uzupełnione o 10% FBS i 1x penicylinę/streptomycynę. Należy pamiętać o wysianiu płytek dla odpowiednich kontroli pozytywnych i negatywnych oprócz próbek badawczych. Obejmują one następujące elementy: </li>
</ol>
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>i</td> 
 <td>kontrolna próbka pozytywna</td>
 <td>wyłącznie BrdU</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ii</td>
 <td>kontrolna próbka pozytywna</td>
 <td>wyłącznie PI</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>iii</td>
 <td>kontrola negatywna</td>
 <td>BrdU-ujemne, PI-ujemne</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
(Należy zauważyć, że wstępny eksperyment z wieloma punktami czasowymi, taki jak opisany w niniejszym protokole, może zostać wykorzystany do zawężenia ram czasowych, w których należy przeprowadzić przyszłe zbiory.) 
<ol start="2">
 <li>Posiane komórki inkubuje się w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 przez 24-48 h, aby umożliwić ich regenerację i przytwierdzenie. </li>
 <li>W celu pulsacyjnego znakowania komórek bromodeoksyurydyną (BrdU), DMEM zastępuje się świeżą pożywką zawierającą 10 μM BrdU. Komórki inkubuje się przez 1 h w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2, aby umożliwić wbudowanie BrdU do DNA. Należy pozostawić jedną płytkę niepoddaną działaniu związku, która posłuży jako kontrola negatywna. </li>
 <li>Pożywkę do znakowania pulsacyjnego usuwa się, a komórki krótko płucze 1X PBS.</li>
 <li>Dodaje się świeżą pożywkę wzrostową (bez BrdU) i inkubuje komórki w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 aż do osiągnięcia odpowiedniego punktu czasowego dla zbioru materiału. </li>
</ol>
2. Zbieranie i utrwalanie
<ol>
 <li>Nieleczone komórki z kroku 1.3 uznaje się za punkt czasowy zero. Próbkę tę można zebrać wraz z próbką z punktu czasowego 1 h, którą pobiera się bezpośrednio po traktowaniu BrdU.</li>
 <li>Aby zebrać komórki, usuwa się medium, a płytki płucze się raz w 1X PBS.</li>
 <li>Komórki poddaje się trypsynizacji, zbiera w medium hodowlanym, a następnie pelletuje przez wirowanie przy 1500 rpm przez 5 min. Nadpływ zostaje odlany.</li>
 <li>Przemywa się 1-10 x 106 komórek w 5 ml lodowatego 1X PBS. Wirować przy 1500 rpm przez 5 min. Nadpływ zostaje odlany.</li>
 <li>Pellet komórkowy resuspendsuje się następnie w 100 μl lodowatego PBS/1% FBS. Dodatek 1% FBS do PBS pomaga zapobiec aglomeracji komórek.</li>
 <li>Komórki dodaje się kroplami do 5 ml 70% etanolu o temperaturze -20 °C w celu ich utrwalenia.</li>
 <li>Inkubować na lodzie przez 30 min lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Jest to idealny moment na przerwanie zbierania próbek z poszczególnych punktów czasowych. Próbki mogą pozostać w etanolu przez kilka dni, co pozwala na ich jednoczesne przetwarzanie w pozostałych krokach protokołu.</li>
</ol>
3. Barwienie BrdU i PI
<ol>
 <li> Wirować komórki przez 5 min przy 1500 rpm w celu uzyskania osadu.</li>
 <li> Usunąć utrwalacz, pozostawiając ok. 50 μl, w których należy rozbić osad poprzez wstrząsanie w vorteksie.</li>
 <li> W celu denaturacji DNA powoli dodawać po kropli 1 ml 2N HCL/Triton X-100 podczas wstrząsania w vorteksie. Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
 <li> Wirować próbki przez 5 min przy 1500 rpm w celu uzyskania osadu komórkowego. Odessać i usunąć nadsącz.</li>
 <li> Resuspendować osad komórkowy w 1 ml 0,1M tetraboranu sodu o pH 8,5, aby zneutralizować etap denaturacji.</li>
 <li> Wirować komórki przez 5 min przy 1500 rpm. Odessać i usunąć nadsącz.</li>
 <li> Resuspendować osad komórkowy w 75 μl mieszaniny barwiącej BrdU (50 μl 0,5% tween 20/1% BSA/PBS + 20 μl przeciwciała anty-BrdU sprzężonego z FITC + 5 μl 10 mg/ml RNase).</li>
 <li> Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 min, chroniąc przed światłem.</li>
 <li> W celu uzyskania osadu komórkowego wirować próbki przez 5 min przy 1500 rpm. Odessać i usunąć nadsącz.</li>
 <li> Resuspendować osad komórkowy w 1 ml PBS zawierającego 5 μg/ml jodku propidyny.</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa
<ol>
 <li> Do analizy komórek niezbędny jest cytometr przepływowy wyposażony w laser 488 nm oraz odpowiednie filtry. Do utworzenia wykresów przedstawionych poniżej wymagane jest oprogramowanie analityczne, takie jak CellQuest. </li>
 <li> Podczas analizy próbki w cytometrze przepływowym należy utworzyć wykres rozrzutu bocznego (SSC-H) względem rozrzutu przedniego (FSC-H), aby upewnić się co do prawidłowego rozkładu wielkości komórek (Rycina 1A). Oba te parametry są przedstawione w skali liniowej. </li>
 <li> Równocześnie należy wyświetlić wykres FL3-H (barwienie PI) względem FL2-W (Rycina 1B). Wykres ten służy do utworzenia bramki (R3) w celu wyizolowania frakcji komórek mieszczących się w normalnym wzorcu rozkładu cyklu komórkowego. Generalnie wzorzec ten charakteryzuje się dwiema grupami komórek o zawartości DNA 2N i 4N w barwieniu PI, reprezentującymi odpowiednio fazy G1 i G2 cyklu komórkowego. Pasmo komórek znajdujące się między tymi dwiema grupami reprezentuje trwającą replikację DNA, która zachodzi w fazie S cyklu komórkowego. </li>
 <li> Należy utworzyć wykres przedstawiający komórki z bramki (R3) z punktu 4.3, z FL1-H (FITC, wykres logarytmiczny) na osi y i PI (wykres liniowy) na osi x (Rycina 1C). Wykres ten będzie służył do ustawienia pozostałych parametrów przy użyciu różnych kontroli opisanych w punkcie 1.1, a także do zbierania danych do analizy. </li>
 <li> Należy wprowadzić do cytometru próbkę barwioną wyłącznie PI. Należy dostosować wzmocnienie (gain) tak, aby faza G1 znajdowała się na poziomie ~200 na osi x. Będzie to łatwiejsze do wizualizacji na histogramie barwienia PI. </li>
 <li> Druga kontrola polega na analizie w cytometrze przepływowym próbki barwionej wyłącznie BrdU. Należy dostosować wzmocnienie tak, aby na wykresie pojawiły się dwie populacje komórek (BrdU dodatnie i BrdU ujemne). Idealnie komórki BrdU ujemne powinny znajdować się tuż poniżej 10-1. </li>
 <li> Ostatnią kontrolą jest próbka ujemna dla BrdU/PI. Należy przeprowadzić tę kontrolę ujemną, aby upewnić się, że komórki nie pojawiają się w żadnym z górnych lub prawych kwadrantów. </li>
 <li> Po ustawieniu parametrów poszczególnych wykresów cytometr przepływowy jest skalibrowany i gotowy do analizy komórek barwionych BrdU i PI. Podczas każdego pomiaru należy odczytać minimum 10 000 komórek, które znajdują się w odpowiedniej bramce frakcji PI (patrz punkt 4.3). </li>
 <li> Do analizy zebranych danych wykorzystuje się oprogramowanie takie jak FlowJo lub FacsDiva. Każdy z wyżej wymienionych wykresów można odtworzyć w tych programach, a następnie przeprowadzić analizę ilościową i statystyczną. </li>
 <li> Etap końcowy analizy obejmuje kilka następujących po sobie kroków. Utworzenie wykresu FITC względem PI z komórkami wybranymi jako PI dodatnie z wykresu PI względem FL2-W pozwala wyróżnić populację komórek w cyklu. Na tym wykresie tworzy się drugą bramkę, izolując populację BrdU dodatnią. Przedstawienie tej charakterystycznej populacji na histogramie z PI na osi x pozwala śledzić przebieg progresji cyklu komórkowego w czasie. Można to dodatkowo zwizualizować, wykreślając liczbę komórek BrdU-dodatnich o zawartości G1 lub G2 jako funkcję czasu. </li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Zwykle komórki w cyklu komórkowym barwione jodkiem propidyny wykazują wyraźne piki w fazach G1 i G2, odpowiadające odpowiednio komórkom o zawartości DNA 2N i 4N (Rysunek 2). Markerowanie pulsacyjne BrdU pozwala na selektywne znakowanie subpopulacji komórek aktywnie syntetyzujących DNA (tj. w fazie S). Krótko po usunięciu odczynnika BrdU wszystkie znakowane komórki znajdują się w fazie S (Rysunek 3). Ograniczenie znakowania do krótkiego impulsu pozwala śledzić tę teraz odrębną subpopulację komórek w wielu punktach czasowych podczas przechodzenia przez kolejne fazy cyklu komórkowego. Można to zaobserwować w punkcie czasowym 1 h na Rysunku 3 jako wyraźny brak pików G1 i G2.
Dodatkowych informacji można uzyskać z etapu znakowania BrdU. Można nie tylko zmierzyć odsetek aktywnie dzielących się komórek, ale także określić szacunkowy rozkład etapów cyklu komórkowego pomiędzy dwiema próbkami. Poprzez zbieranie komórek w równych odstępach czasu po usunięciu odczynnika BrdU, można śledzić komórki w trakcie dalszego przebiegu cyklu, przejścia do fazy G2 i ostatecznie do podziału komórek wyjściowych, w wyniku czego powstają BrdU-dodatnie komórki potomne z zawartością DNA charakterystyczną dla fazy G1 (Rycina 4). Przykład ilościowego oznaczenia faz cyklu komórkowego oraz analizy kinetycznej przedstawiono na Rycini 5.
<img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig1.jpg" alt="Diagramy cytometrii przepływowej; analiza populacji komórek; FSC-H vs SSC-H, FL2-W vs FL3-H-PI, FL3-H-PI vs FL1-H-FITC." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. (A) Wykres rozproszenia przedniego (Forward Scatter) względem rozproszenia bocznego (Side Scatter) reprezentatywnej populacji komórek mcf7. (B) Wykres PI względem szerokości impulsu (FL-W) reprezentatywnej populacji komórek mcf7. Przedstawiono bramkowanie w celu wykluczenia dubletów komórek w analizie końcowej (R3). Dublety komórek charakteryzują się większą szerokością impulsu niż pojedyncze komórki, ponieważ potrzebują więcej czasu na przejście przez wiązkę lasera, a zatem mogą zostać wykluczone z analizy. (C) Wykres PI względem FITC (BrdU) reprezentatywnej populacji komórek mcf7. Przedstawiono bramkowanie w celu uwzględnienia wyłącznie komórek FITC (BrdU) dodatnich (R4).
<img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig2.jpg" alt="Wykres cytometrii przepływowej; analiza cyklu komórkowego; barwienie jodkiem propidyny; identyfikacja faz G1 i G2." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywny wykres histogramu całkowitej populacji komórek w normalnym cyklu komórkowym.
<img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig3.jpg" alt="Histogram cytometrii przepływowej; liczba komórek w stosunku do fluorescencji PI; analiza danych populacji komórek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wykres histogramu komórek zebranych 1h po usunięciu impulsu BrdU, po bramkowaniu komórek FITC (BrdU)-dodatnich. Komórki BrdU-dodatnie w wczesnym punkcie czasowym po usunięciu znacznika wykazują profile PI odpowiadające próbkom z zawartością DNA zgodną z komórkami w fazie S cyklu komórkowego, co potwierdza pomyślne znakowanie komórek wyłącznie podczas syntezy DNA.
<img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig4.jpg" alt="Analiza cyklu komórkowego, histogramy cytometrii przepływowej, barwienie PI FL3-H, dane z przebiegu czasowego, odstępy 1h-8h." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Porównanie kinetyki progresji cyklu komórkowego między liniami komórkowymi nowotworu: jelita grubego HT29 (A) i LS180 (B) oraz raka piersi mcf7 (C). Komórki zbierano co godzinę przez 8 godzin po usunięciu impulsu BrdU. W tym eksperymencie zaobserwowano wyraźny profil przyspieszonej progresji cyklu komórkowego przez fazę G2 w linii komórkowej jelita grubego LS180. Porównując kinetykę dwóch profili komórek raka jelita grubego, w komórkach LS180 pojawienie się piku G1 jest widoczne w czasie T= 4h po BrdU, w przeciwieństwie do odpowiadającego punktu czasowego dla linii HT-29, w której brakuje tego piku. W porównaniu z obiema liniami komórkowymi jelita grubego, komórki mcf7 dzielą się w znacznie wolniejszym tempie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig4large.jpg">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię</a>.
<img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig5.jpg" alt="Analiza cyklu komórkowego; wykresy gęstości i wykres słupkowy; linie komórkowe HT29, LS180, mcf7; zależność od czasu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. (A) Ilościowa analiza faz cyklu komórkowego komórek nowotworowych znakowanych BrdU. Algorytm Dean/Jett/Fox zastosowano dla linii HT29, LS180 oraz mcf7 (zaznaczone na zielono). Wynikowe rozkłady faz cyklu komórkowego z każdej próbki wyrażono jako % całkowitej liczby komórek BrdU-dodatnich dla każdej fazy. Przedstawiono jedynie wybrane punkty czasowe dla każdej linii komórkowej, ponieważ analizy dla niektórych wcześniejszych punktów czasowych dały nieważne wyniki. W tych wcześniejszych punktach czasowych wszystkie komórki BrdU-dodatnie znajdują się w fazie S, a zatem brakuje wyraźnych pików G1 i G2, które są niezbędne do zastosowania algorytmu. (B) Histogramy komórek nowotworowych pokazujące kinetykę przejścia przez fazy G2/M cyklu komórkowego. Przejście przez fazy G2/M jest najszybsze dla komórek LS180, następnie dla HT29 i mcf7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig5large.jpg">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img src="/files/ftp_upload/4045/4045figS1.jpg" alt="Analiza cytometrii przepływowej, wykresy rozrzutu FL1-H:FITC względem FL3-H:PI oraz histogram liczby komórek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina S1"> 
Rycina S1. Kontrole cytometrii przepływowej. Komórki mcf7 przedstawiono jako (A) kontrolę negatywną, w której komórki nie zostały zabarwione ani PI, ani BrdU. (B) Barwienie samym PI. (C) Próbki znakowane BrdU-FITC.
<img src="/files/ftp_upload/4045/4045figS2.jpg" alt="Wykres widma fluorescencji, emisja FITC i PI, długość fali 400-800 nm, analiza optyczna." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina S2"> 
Rycina S2. Schematyczny rysunek przedstawiający relację między widmem emisji fluorescencyjnej PI a FITC (BrdU). Okna detekcji widma dla kanału fluorescencyjnego 1 (FL1, dla FITC) oraz kanału fluorescencyjnego 3 (FL3, dla PI) przedstawiono w odpowiednich polach. Między detekcją w kanałach FL1 a FL3 nie występuje nakładanie się widm fluoroforów. Oczywiście kompensacja fluorescencji nie jest konieczna, gdy dane eksperymentalne z komórek podwójnie znakowanych PI i FITC-BrdU są zbierane odpowiednio w kanałach FL1/FL3. Widma fluorescencji pobrano ze strony internetowej BD BioSciences: <a href="http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer</a>. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045figS2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę</a>.

<ol><li>Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+D+as+a+therapeutic+target+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cyclin D as a therapeutic target in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).</li>
<li>Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+is+balancing+development%2C+differentiation+and+de-differentiation+to+assure+cancer+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention.</a> Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).</li>
<li>Dickson, M. A., Schwartz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-cycle+inhibitors+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy.</a> Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).</li>
<li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).</li>
<li>van Opstal, A., Boonstra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+phosphatidylinositol+3-kinase+activity+prevent+cell+cycle+progression+and+induce+apoptosis+at+the+M%2FG1+transition+in+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells.</a> Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).</li>
<li>Gasnereau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+to+sort+mammalian+cells+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis.</a> Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).</li>
<li>Harper, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+cell+populations+in+G1%2FS+and+G2%2FM+phases+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle.</a> Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).</li>
<li>Pedrali-Noy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+HeLa+cell+cultures+by+inhibition+of+DNA+polymerase+alpha+with+aphidicolin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin.</a> Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).</li>
<li>Merrill, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization.</a> Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).</li>
<li>Fleisig, H. B., Wong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+promotes+efficient+cell+cycle+kinetics+and+confers+growth+advantage+to+telomerase-negative+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells.</a> Oncogene. , (2011).</li>
<li>Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AZ703%2C+an+imidazo%5B1%2C2-a%5Dpyridine+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1+and+2%2C+induces+E2F-1-dependent+apoptosis+enhanced+by+depletion+of+cyclin-dependent+kinase+9%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9.</a> Cancer Res. 66, 435-444 (2006).</li>
<li>Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+cycle+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell cycle by flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).</li>
<li>Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Łącząc cytometrię przepływową z wbudowywaniem BrdU, zyskujemy niezbędne narzędzia do badania kinetyki cyklu komórkowego. Wyjątkowa właściwość BrdU, polegająca na pełnieniu funkcji analogu tymidyny, umożliwia ilościowe oznaczenie zawartości DNA w komórce cyklicznej. Wbudowywanie BrdU w rosnącą potomną nić DNA podczas fazy syntezy cyklu komórkowego pozwala na śledzenie subpopulacji komórek cyklicznych od momentu replikacji DNA w fazie S, poprzez okres wzrostu w fazie G2, aż do ostatecznego podziału komórki. Komórki potomne...

<table><tbody><tr><td>bromodeoksyurydyna</td><td>BD Biosciences</td><td>55089</td><td></td></tr><tr><td>jodek propidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>287075</td><td>roztwór stokowy 1mg/ml</td></tr><tr><td>FITC przeciwko BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347583</td><td></td></tr><tr><td>tetraboran sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S80172</td><td>0.1M, pH 8.5</td></tr><tr><td>FACS Caliber</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precyzyjna kontrola inicjacji i późniejszego przejścia przez poszczególne fazy cyklu komórkowego ma kluczowe znaczenie w komórkach proliferujących. Podział w cyklu komórkowym jest integralną częścią wzrostu i reprodukcji, a deregulacja kluczowych komponentów cyklu komórkowego jest wiązana z zdarzeniami inicjującymi kancerogenezę 1,2. Środki molekularne stosowane w terapiach przeciwnowotworowych często celują w szlaki biologiczne odpowiedzialne za regulację i koordynację podziału w cyklu komórkowym 3. Chociaż kinetyka cyklu komórkowego wykazuje tendencję do różnicowania się w zależności od typu komórek, rozkład komórek pomiędzy cztery stadia cyklu komórkowego jest dość spójny w obrębie danej linii komórkowej ze względu na stały wzorzec ekspresji mitogenów i czynników wzrostu. Zdarzenia genotoksyczne i inne stresory komórkowe mogą prowadzić do tymczasowej blokady progresji cyklu komórkowego, co skutkuje zatrzymaniem lub tymczasową pauzą w konkretnej fazie cyklu w celu umożliwienia uruchomienia odpowiedniego mechanizmu odpowiedzi.
Możliwość eksperymentalnej obserwacji zachowania populacji komórek w odniesieniu do etapu ich cyklu komórkowego stanowi istotny postęp w biologii komórki. Do izolacji komórek w konkretnych fazach cyklu komórkowego stosuje się powszechne procedury, takie jak odrywanie mitotyczne (mitotic shake off), wirowanie różnicowe lub sortowanie metodą cytometrii przepływowej 4-6. Tak ufrakcjonowane populacje, wzbogacone w komórki w określonej fazie cyklu, są następnie poddawane działaniom eksperymentalnym. Wydajność, czystość i żywotność oddzielonych frakcji mogą być często obniżone przy zastosowaniu tych fizycznych metod separacji. Ponadto odstęp czasu między separacją populacji komórek a rozpoczęciem zabiegu eksperymentalnego, podczas którego ufrakcjonowane komórki mogą przejść do kolejnego etapu cyklu komórkowego, może stanowić istotne wyzwanie dla pomyślnej realizacji i interpretacji tych eksperymentów.
Inne podejścia do badania etapów cyklu komórkowego obejmują stosowanie środków chemicznych w celu synchronizacji komórek. Traktowanie komórek chemicznymi inhibitorami kluczowych procesów metabolicznych dla każdego etapu cyklu komórkowego jest użyteczne w blokowaniu progresji cyklu do kolejnego etapu. Na przykład inhibitor reduktazy rybonukleotydowej, hydroksymocznik, zatrzymuje komórki na przejściu G1/S poprzez ograniczenie podaży deoksynukleotydów, będących budulcem DNA. Inne istotne środki chemiczne to afidikolina, inhibitor polimerazy alfa służący do zatrzymania w fazie G1, kolchicyna i nocodazol, które zakłócają tworzenie wrzeciona mitotycznego w celu zatrzymania komórek w fazie M, a wreszcie 5-fluorodeoksyrydyna, terminator łańcucha DNA, stosowany w celu zainicjowania zatrzymania w fazie S 7-9. Traktowanie tymi substancjami chemicznymi jest skuteczną metodą synchronizacji całej populacji komórek w konkretnej fazie. Po usunięciu odczynnika chemicznego komórki jednocześnie powracają do cyklu komórkowego. Podanie badanego czynnika po uwolnieniu komórek z blokady chemicznej gwarantuje, że wywołana odpowiedź na lek pochodzi od jednorodnej populacji specyficznej dla danego etapu cyklu komórkowego. Jednakże, ponieważ wiele synchronizatorów chemicznych to znane związki genotoksyczne, oddzielenie udziału różnych szlaków odpowiedzi (na synchronizatory w porównaniu z badanymi czynnikami) jest trudne.
W niniejszej pracy opisujemy metodę znakowania metabolicznego służącą do śledzenia subpopulacji aktywnych komórek w trakcie ich przejścia z fazy replikacji DNA aż do podziału i separacji komórek potomnych. W połączeniu z ilościową analizą cytometryczną, protokół ten umożliwia pomiar kinetyki przebiegu cyklu komórkowego bez konieczności stosowania stresów komórkowych indukowanych mechanicznie lub chemicznie, które są powszechnie związane z innymi metodami synchronizacji cyklu komórkowego 10. W następnych sekcjach omówimy metodologię oraz niektóre z jej zastosowań w badaniach biomedycznych.

Śledzenie subtelnych zmian w progresji i kinetyce etapów cyklu komórkowego można przeprowadzić, stosując połączenie metabolicznego znakowania kwasów nukleinowych BrdU oraz barwienia całkowitej genomowej DNA jodeczkiem propidyny. Metoda ta eliminuje konieczność chemicznej synchronizacji dzielących się komórek, zapobiegając tym samym wprowadzaniu nieswoistych uszkodzeń DNA, które z kolei wpływają na przebieg cyklu komórkowego.

Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Precyzyjna kontrola inicjacji oraz późniejszej progresji przez poszczególne fazy cyklu komórkowego ma kluczowe znaczenie w proliferujących ...

Ogólnym celem następującej procedury jest pomiar kinetyki i przebiegu cyklu komórkowego. Najpierw komórki poddawane są znakowaniu metodą pulse-chase przy użyciu romo, deoxyurydyny lub BrDU, które zostają włączone do DNA komórek w miejsce tymidyny. Następnie komórki poddawane są immunobarwieniu przeciwciałami przeciwko BrDU i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej bezpośrednio po barwieniu.Jedynie komórki w fazie S zostają oznakowane, a następnie przechodzą one przez cykl komórkowy do fazy G2. Po mitozie są one wykrywane jako komórki o zawartości DNA równej 4N. Zawartość DNA jest następnie redukowana do 2N. W związku z tym analiza profili fluorescencji uzyskanych metodą cytometrii przepływowej może być wykorzystana do określenia kinetyki progresji cyklu komórkowego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi protokołami wykorzystującymi związki chemiczne do synchronizacji komórek jest brak zaburzeń fizjologicznych, które mogłyby niezamierzenie wpłynąć na mechanizm podziału komórkowego. Po raz pierwszy zastosowaliśmy tę metodę, gdy nasze próby badania tempa progresji cyklu komórkowego przy użyciu synchronizacji chemicznej przyniosły nieoczekiwane wyniki, które zakłócały naszą analizę. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki.Na przykład, co jest podstawą różnic w tempie wzrostu między różnymi typami komórek? Aby to zbadać, rozpocznij ten protokół od znakowania impulsowego (pulse-chase) komórek BRDU. Zacznij od przygotowania jednej płytki o średnicy 10 centymetrów dla każdego punktu czasowego oraz jednej dla każdej z poniższych kontroli.wyłącznie BRDU, wyłącznie PI, BRDU negatywne, PI negatywne. Wysiać na każdą płytkę 5 × 10⁵ komórek MCF-7 w uzupełnionym medium DMEM. Inkubować płytki przez 24 do 48 godzin, aby umożliwić komórkom regenerację i przytwierdzenie. Po osiągnięciu przez komórki 60% konfluencji, wymienić medium na świeże DMEM zawierające 10 µM.Inkubuj komórki z BrdU przez jedną godzinę w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2, aby umożliwić wbudowanie BrdU do DNA. Należy pozostawić jedną płytkę niepoddaną działaniu odczynnika, aby służyła jako kontrola negatywna lub punkt czasowy zero po upływie jednej godziny. Usuń podłoże do znakowania impulsowego i krótko przepłucz komórki buforem PBS w punktach czasowych od dwóch do ośmiu godzin.Dodać świeżą pożywkę wzrostową i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze. Następnie niezwłocznie zebrać materiał z płytek dla punktów czasowych zero i jednej godziny, zgodnie z opisem w następnej sekcji. Aby zebrać komórki, należy odessać pożywkę i przepłukać płytkę.Najpierw opłucz komórki roztworem PBS, a następnie zastosuj trypsynę, aby odłączyć je od płytki. Zbierz komórki w pożywce DMEM i odwiruj przy 390 ×g przez pięć minut. Odlej nadsącz. Następnie przemyj komórki 1–5 ml lodowatego PBS i odwiruj przy 390 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 100 µl lodu.Zimny PBS zawierający 1% FBS. FBS pomaga zapobiegać agregacji komórek. Jednym z najważniejszych aspektów tej procedury jest zapewnienie otrzymania zawiesiny pojedynczych komórek z zebranego materiału komórkowego.W celu utrwalenia próbek należy dodawać komórki bezpośrednio do etanolu, kropla po kropli. Jest to etap krytyczny. Następnie, aby unieruchomić komórki, należy za pomocą pipety dodawać je kroplami do 5 mL schłodzonego do temperatury lodu roztworu.70% etanol w 15 mililitrowej probówce stożkowej. Inkubować komórki na lodzie przez 30 minut lub przechowywać je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Jest to idealny moment na przerwanie pobierania próbek z różnych punktów czasowych; próbki mogą pozostawać w etanolu przez kilka dni, co pozwala na ich jednoczesne przetworzenie w pozostałych etapach protokołu w celu przeprowadzenia barwienia BRDU oraz jodkiem propidyny.Wyjąć komórki z temperatury 4°C i wirować je przy 90×g przez 5 minut (trzykrotnie). Po wirowaniu odessać większość utrwalacza, pozostawiając około 50 µL. Następnie wymieszać na vortexie.Aby rozluźnić pellet w celu denaturacji DNA podczas mieszania w wstrząsarzu wirówkowym. Powoli, kroplami, dodać 1 mL 2N HCl z Tritonem X 100, a następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Zpelletować komórki, wirując próbki przez 5 minut przy 390 ×g, po czym odessać i usunąć nadsącz.Następnie resuspenduj pellet komórkowy w jednym mililitrze 0,1 molarnego boranu sodu. Po odwirowaniu ponownie odessać i usunąć nadsącz. Następnie resuspenduj pellet komórkowy w 75 mikrolitrach barwnika BRDU.Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 45 minut, chroniąc ją przed światłem po zakończeniu inkubacji. Komórki odwirowano w sposób opisany wcześniej, a osad komórkowy zawieszono w jednym mililitrze PBS zawierającego pięć mikrogramów na mililitr jodku propidyny. Podczas analizy próbki dodatniej pod kątem PI w cytometrze przepływowym, należy utworzyć wykres rozrzutu scatter (FSC vs SSC), aby upewnić się co do prawidłowego rozkładu wielkości komórek.Oba te parametry należy przedstawić na skali liniowej. Jednocześnie należy wyświetlić wykres FL three H względem FL two W, aby przeanalizować barwienie PI w odniesieniu do szerokości impulsu fluorescencji. Wykres ten służy do stworzenia bramki w celu wyizolowania frakcji komórek, które uznaje się za mieszczące się w normalnym wzorcu rozkładu cyklu komórkowego.Ogólnie ten wzorzec rozkładu charakteryzuje się dwiema grupami komórek z dwiema i czterema zawartościami NDNA po barwieniu PI, reprezentującymi odpowiednio fazy G1 i G2 cyklu komórkowego. Ciąg komórek znajdujący się pomiędzy tymi dwiema grupami reprezentuje trwającą replikację DNA, która zachodzi w fazie S cyklu komórkowego. Utwórz wykres przedstawiający wyselekcjonowane komórki z FL1-H lub FITC w skali logarytmicznej na osi Y oraz PI w skali liniowej na osi X.Wykres ten posłuży do ustawienia pozostałych parametrów za pomocą różnych elementów sterujących, a także do zbierania danych. W celu przeprowadzenia analizy należy umieścić próbkę barwioną wyłącznie PI w porcie załadowania cytometru przepływowego i dostosować wzmocnienie tak, aby G1 znajdowało się na poziomie około 200 na osi x. Będzie to łatwiejsze do zwizualizowania na wykresie histogramu barwienia PI.Następnie umieść próbkę zawierającą wyłącznie BRDU w porcie załadunkowym i uruchom pomiar. Dostosuj wzmocnienie w taki sposób, aby na wykresie pojawiły się dwie populacje komórek: BRDU-dodatnie oraz BRDU-ujemne. W idealnym przypadku komórki BRDU-ujemne powinny znajdować się dokładnie na poziomie 10¹ lub poniżej tej wartości.Ostatnią kontrolą jest próbka negatywna BrDU/PI. Należy przeprowadzić tę kontrolę negatywną, aby upewnić się, że komórki nie pojawiają się w żadnej z górnych ani prawych ćwiartek. Po ustawieniu parametrów poszczególnych wykresów cytometr przepływowy jest skalibrowany i gotowy do analizy komórek barwionych BrDU i PI. Dla każdej próbki należy zebrać dane z minimum 10 000 komórek wyselekcjonowanych za pomocą bramkowania PI.Następnie, korzystając z oprogramowania takiego jak FlowJo lub FACSDiva, należy stworzyć wykres FITC względem PI, bramkując komórki jako PI-dodatnie na podstawie wykresu PI względem FL2, aby wyodrębnić populację komórek w cyklu. Następnie należy utworzyć drugą bramkę w celu izolacji populacji BrDU-dodatniej.Następnie, aby prześledzić przebieg cyklu komórkowego w czasie, należy przedstawić liczbę komórek dodatnich pod kątem BRDU z zawartością DNA charakterystyczną dla fazy G1 lub G2 w funkcji czasu, aby porównać kinetykę progresji cyklu komórkowego między dwiema liniami komórkowymi raka jelita grubego HT 29 i LS 180. Komórki zbierano co godzinę przez osiem godzin po usunięciu impulsu A-B-R-D-U.Porównując kinetykę obu profili, w komórkach LS 180 w czwartym punkcie czasowym po podaniu BRDU widoczny jest szczyt fazy G1, podczas gdy w odpowiadającym mu punkcie czasowym dla linii komórkowej HT 29 szczyt ten nie występuje. Wskazuje to na przyspieszoną progresję cyklu komórkowego przez fazę G2. W linii komórkowej raka jelita grubego LS 180, aby wygenerować profil cyklu dla linii komórkowej raka piersi.Komórki MC seven zbierano co godzinę przez osiem godzin, po usunięciu impulsu BRDU. Następnie komórki z immunoznakowaniem i kontrastowaniem DNA sortowano na podstawie ich sygnałów fluorescencyjnych.Jak widać, komórki CF seven cyklowały w znacznie wolniejszym tempie niż każda z dwóch badanych linii komórkowych raka jelita grubego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre zrozumienie tego, w jaki sposób znakowanie metaboliczne DNA w połączeniu z pobieraniem próbek w określonych punktach czasowych pozwala śledzić kinetykę cyklu komórkowego.

measuring-cell-cycle-progression-kinetics-with-metabolic-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Określanie kinetyki postępowania cyklu komórkowego za pomocą metod metabilizowania i cytometrii przepływowej

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Skuteczne zastosowanie barwników do śledzenia komórek w celu monitorowania funkcji i proliferacji komórek odpornościowych obejmuje kilka krytycznych etapów. Opisujemy metody: 1) uzyskiwania jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania barwnikami błonowymi; 2) wyboru fluorochromów i warunków akwizycji danych; oraz 3) wyboru modelu do ilościowego określania proliferacji komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Film opisuje stopniowy test znakowania impulsowego komórek ssaków za pomocą bromodeoksyurydyny (BrdU) do pomiaru proliferacji komórek. Wychwyt BrdU pozwala na czasowe śledzenie komórek, które znajdowały się w fazie syntezy w określonym momencie, bez konieczności synchronizacji komórek.

Test znakowania impulsowego bromodeoksyurydyny: technika pomiaru proliferacji komórek

Ten protokół opisuje wykorzystanie wychwytu bromodeoksyurydyny (BrdU), aby umożliwić czasowe śledzenie komórek, które były w fazie S w określonym momencie. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciałami ułatwia szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Prezentowana metoda łączy ilościową analizę pęknięć dwuniciowych DNA (DSB), dystrybucji cyklu komórkowego i apoptozy, aby umożliwić specyficzną dla cyklu komórkowego ocenę indukcji i naprawy DSB, jak również konsekwencji niepowodzenia naprawy.

Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczone czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym FM 4-64 do pomiaru tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych neuronów hipokampa w hodowli.

Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania

W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy, stosując system Dual-GloTM Luciferase Assay System firmy Promega.

Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Poznaj metodę pomiaru kinetyki cyklu komórkowego przy użyciu znakowania metabolicznego BrdU i cytometrii przepływowej. Technika ta eliminuje konieczność chemicznej synchronizacji, zmniejszając ryzyko uszkodzeń DNA.

Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów