Mutageneza wodorosiarczynu pojedynczego oocytu

Ogólnym celem tej procedury jest analiza metylacji DNA w pojedynczym oocycie. Osiąga się to poprzez usunięcie najpierw komórek wzgórka i pality mydlanej z pobranych oocytów. Drugim krokiem jest osadzenie oocytu w roztworze do lizy aros dwa do jednego, aby chronić niewielką ilość DNA przed utratą lub degradacją.

Następnie przeprowadzana jest mutageneza bisiarczynowa, po której następuje amplifikacja w zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy. Ostatnim krokiem jest ligacja i sklonowanie produktu PCR. Klony są następnie wybierane metodą PCR, amplifikowane i wysyłane do sekwencjonowania.

Ostatecznie mutageneza i sekwencjonowanie bisiarczynów służy do wykazania metylacji DNA w gwinei fosforanu cytozyny lub dinukleotydach CPG w regionie zainteresowania w pojedynczym oocycie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mutageneza dwusiarczynowa dużej liczby komórek, jest to, że dane można uzyskać z pojedynczego oocytu bez łączenia cytów, błędu PCR i zanieczyszczenia komórek chemioterapii. W dniu pobrania oocytów należy świeżo przygotować roztwory wymienione w pisemnym protokole podczas sporządzania roztworów, zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia DNA, często zmieniając rękawiczki i używając końcówek filtrujących, a także trzymaj probówki pod kątem, gdy są otwarte i ponownie zakryj wszystkie probówki, gdy nie są używane.

Rozpocznij zbieranie OSI, umieszczając wypreparowane owadukty myszy w pożywce M two i rozrywając koło pasowe M, aby wyodrębnić kompleks komórek wzgórka. Następnie oddziel cyty od kompleksu komórek wzgórka za pomocą 0,3 miligrama na mililitr roztworu hialuronidazy w 30-mikrolitrowej kropli pożywki M2. Utrzymuj cyty w roztworze tylko tak długo, jak jest to potrzebne do usunięcia komórek wzgórka, ponieważ długa ekspozycja może je uszkodzić.

Umyj oocyty w 30 mikrolitrowych kroplach pożywki M2, przenosząc oocyty z kropli do kropli. Okresowe usuwanie komórek wzgórka przez łącznie trzy płukania. Usunąć literę Z z leku LUCITA za pomocą kwaśnego roztworu tyro.

Najpierw umieść oocyty w jednej 30-mikrolitrowej kropli roztworu, a następnie przenieś do kolejnej 30-mikrolitrowej kropli. Jak każde przenoszone medium rozcieńczy kwas i zmniejszy jego wydajność. Cyty należy przechowywać w roztworze tylko tak długo, jak jest to potrzebne do usunięcia strefy, ponieważ długa ekspozycja może je uszkodzić.

Po usunięciu zony ponownie umyj cyty w 30-mikrolitrowej kropli pożywki M2, aby wykonać osadzanie agros, najpierw umieść roztwór do lizy na bloku grzewczym o temperaturze 70 stopni Celsjusza. Dodaj podgrzany roztwór o niskiej temperaturze topnienia lub LMP Agros do roztworu do lizy, tworząc roztwór AGROS do lizy dwa do jednego. Następnie umieść pojedynczy oocyt na czystym szklanym szkiełku w pożywce o minimalnej zawartości M dwa.

Następnym krokiem jest osadzenie pojedynczego cytu w roztworze Agros i roztworze do lizy. Należy to zrobić szybko, ponieważ agros stwardnieje w temperaturach poniżej 65 stopni Celsjusza. Pobrać 10 mikrolitrów roztworu do lizy Agros do końcówki pipety pod mikroskopem.

Delikatnie wylej około jednego mikrolitra lub mniej roztworu do lizy agros na szklane szkiełko, pozwalając mu wymieszać się z minimalną ilością podłoża. Delikatnie nabierz oocyt do końcówki pipety. Następnie włóż wszystkie 10 mikrolitrów do rurki einor z 300 mikrolitrami oleju mineralnego, aby powstały koralik nabrał kulistego kształtu.

Inkubuj probówkę na lodzie przez 10 minut, aby przeprowadzić lizę. Usuń 300 mikrolitrów oleju mineralnego i dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy SDS. Drugiego dnia inkubować próbkę przez noc w łaźni wodnej ustawionej na 50 stopni Celsjusza.

Roztwory mutagenezy dwusiarczkowej należy przygotować na świeżo, zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Rozpocznij mutagenezę od całkowitego usunięcia 500 mikrolitrów buforu do lizy SDS. Należy pamiętać, że pozostały bufor do lizy rozcieńczy agros po podgrzaniu, a kulka będzie bardziej podatna na rozpuszczenie w kolejnych etapach.

Po całkowitym usunięciu buforu do lizy dodać 300 mikrolitrów oleju mineralnego. Inkubować próbkę przez dwie i pół minuty w bloku grzewczym o temperaturze 90 stopni Celsjusza. Weź karat, aby wymieszać lub wymieszać, rozszerzyć lub zmienić temperaturę.

Po dwóch i pół minutach. Inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut. Aby przeprowadzić denaturację, usuń olej mineralny i dodaj jeden mililitr 0,1-molowego wodorotlenku sodu do probówki i odwróć probówkę pięć do sześciu razy.

Inkubować próbkę przez 15 minut. W łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza odwracającej się co trzy do czterech minut, kulka powinna unosić się w wodorotlenku sodu. Zwróć uwagę, że koralik nie znajduje się już na dnie tuby.

Aby przeprowadzić obróbkę siarczynami, najpierw delikatnie odkręć rurkę po usunięciu wodorotlenku sodu. Dodać 300 mikrolitrów oleju mineralnego i 500 mikrolitrów roztworu siarczynu BIS. Uważaj, aby nie wystawić na działanie światła i inkubować probówkę przez trzy i pół godziny w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Teraz wykonaj desynację. Najpierw inkubować próbkę na lodzie przez trzy minuty, a następnie usunąć olej mineralny i roztwór siarczynu BIS. Po delikatnym odwirowaniu dodaj jeden mililitr 0,3 molowego wodorotlenku sodu i odwróć rurkę pięć do sześciu razy.

Inkubować próbkę przez 15 minut. W łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza odwracającej się co trzy do czterech minut, ponownie kulka powinna unosić się w wodorotlenku sodu przed rozpoczęciem PCR. Umyj próbki, najpierw delikatnie je obracając.

Następnie usuń wodorotlenek sodu i dodaj jeden mililitr jednego xte pH 7,5. Wstrząsaj przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. Po drugim delikatnym zakręceniu wyjmij ten XTE.

Powtórz ten proces prania dwukrotnie. Następnie dodaj jeden mililitr autoklawu, podwójnie destylowanej wody. Wstrząsaj przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wiruj po raz trzeci i usuń wodę.

Powtórz dwukrotne mycie wodą destylowaną. Na koniec usuń cały supernatant, pozostawiając tylko koralik aros. Sprawdzić, czy pH supernatantu wynosi 5,0.

Jeśli supernatant jest nadal zbyt zasadowy, ponownie umyj kulki wodą podwójnie destylowaną. W międzyczasie dodaj pierwszą rundę mieszanki PCR do probówki PCR zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Wsuń stałą prędkość agro do krawędzi rurki einor.

Następnie ostrożnie przenieś prędkość agro do probówki PCR, podgrzej do 70 stopni Celsjusza na jedną minutę i wymieszaj, a następnie amplifikuj sugerowane w pisemnym protokole. Po amplifikacji w pierwszej rundzie przygotować reakcję PCR w drugiej rundzie, używając pięciu mikrolitrów produktu z pierwszej rundy jako szablonu. Pamiętaj, aby bipa poniżej warstwy oleju mineralnego.

Przystąp do wykonania drugiej rundy amplifikacji zgodnie z zaleceniami w tekście jako testu diagnostycznego. Próbki drugiej rundy można ciąć za pomocą enzymu restrykcyjnego, który jest metylacją lub elektroforezą specyficzną dla szczepu, produktami trawienia na 8% żelu akrylowym. Wszelkie heterogeniczne prążki, które powstają, reprezentują więcej niż jedną sekwencję w celu sklonowania produktu drugiej rundy, ligacji do wektora i przeprowadzenia klonowania TA, jak opisano w manuskrypcie dołączonym do tego filmu, po płytce klonowania TA, cała mieszanina reakcyjna miesza się na płytce agarowej i LB, uzupełniona ampicyliną, ex gal i IPTG i inkubuje płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnie dodaj główną mieszankę kolonii PCR do probówki PCR, jak podano w pisemnym protokole. Za pomocą końcówki do pipet wybierz białą kolonię bakterii z płytki i zamieszaj ją w 35 mikrolitrach głównej mieszanki kolonii PCR w probówce do PCR. Przystąp do amplifikacji zawiesiny zgodnie z opisem w tekście po elektroforezie amplifikacji PCR cztery mikrolitry produktu PCR na 1,5% żelu AGROS.

Na koniec wyślij około 30 mikrolitrów produktu PCR do sekwencjonowania pięciu PCR kolonii na cyt. Po uzyskaniu wyników sekwencjonowania, wzorce metylacji można odczytać każdą oryginalną guaninę cytozyny, która pozostała jako taka, została zmetylowana. I odwrotnie, każda oryginalna guanina cytozynowa, która jest teraz guaniną tiaminową, została niemetylowana po zagnieżdżonej amplifikacji PCR przy użyciu starterów przekształconych w bisiarczyn.

Możliwe jest potwierdzenie udanej konwersji poprzez wizualizację prawidłowego rozmiaru fragmentu na indywidualnej metafazie żelu aros. Dwa oocyty reprezentują jeden allel rodzicielski i teoretycznie mają jeden nadrukowany wzór metylacji Jako taki. Produkty drugiej rundy PCR mogą być testowane pod kątem niezamierzonego zanieczyszczenia.

Enzym restrykcyjny wrażliwy na metylację DNA może być użyty do trawienia produktu drugiej rundy PCR w celu oceny, czy zawiera on allel metylowany czy niemetylowany. W tym przypadku metylowana cytozyna w sekwencji rozpoznawania enzymów jest rozszczepiana. Podczas gdy niemetylowana cytozyna, która jest przekształcana w tyminę, nie jest już rozpoznawana przez enzym i nie jest cięta, każda próbka oocytów metafazy drugiej, zawierająca zarówno metylowane, jak i niemetylowane allele, powinna zostać odrzucona, ponieważ wskazuje to na zanieczyszczenie komórek wzgórka lub włączenie ciała polarnego Po podwiązaniu i transformacji.

Udaną amplifikację PCR kolonii można zwizualizować na żelu AROS, aby zapewnić, że próbki o odpowiedniej wielkości produktu zostaną wysłane do sekwencjonowania. W tym przykładzie oczekiwany rozmiar amplikonu po ligacji wynosi sto 56 par zasad. W tym przypadku klon piąty ma nieprawidłowy rozmiar amplikonu i nie powinien być wysyłany do sekwencjonowania.

Sekwencja pięciu pojedynczych klonów z oocytu metafazy drugiej powinna wytworzyć pięć identycznych wzorców metylacji i identyczne współczynniki konwersji inne niż CPG. Wszelkie próbki, które zawierają więcej niż jeden wzór, należy wyrzucić. Ponieważ owulowane cyty metafazy drugiej mają dwie kopie chromosomów lub dołączone ciało biegunowe, istnieje możliwość uzyskania dwóch podobnych wzorców sekwencji.

Należy odrzucić dane ze wszystkich cytów, które mają bardzo różne wzorce metylacji. Ponieważ nie można wykluczyć zanieczyszczenia komórek wzgórka Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby najpierw wielokrotnie umyć oocyty w świeżej pożywce, po zabiegu HI IDE, aby usunąć jak najwięcej komórek kłębka. Po drugie, agros o niskiej temperaturze topnienia stwardnieje w temperaturach poniżej 65 stopni Celsjusza, więc pracuj ostrożnie, ale szybko.

I wreszcie, bissiarczan sodu i hydrochinon są wrażliwe na światło, dlatego probówki i roztwory reakcyjne należy zawinąć w folię.