Name: Mutageneza wodorosiarczynu pojedynczego oocytu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Poznaj metodę analizy metylacji DNA w pojedynczych oocytach z wykorzystaniem mutagenezy bisulfitowej. Technika ta umożliwia badanie regulacji epigenetycznej we wczesnym rozwoju bez zanieczyszczenia komórkami cumulus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez University of Western Ontario, Departament Położnictwa i Ginekologii oraz grant ER06-02-188 z Ministerstwa Badań i Innowacji w ramach nagrody Early Researcher Award. MMD otrzymał wsparcie w ramach stypendium doktoranckiego CIHR Training Program in Reproduction, Early Development and the Impact on Health (REDIH).

<ol><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Rodenhiser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+human+disease%3A+translating+basic+biology+into+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22CMAJ%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications.</a> CMAJ. 174, 341-348 (2006).</li>
<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+analysis+on+individual+chromosomes%3A+improved+protocol+for+bisulphite+genomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).</li>
<li>Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bisulfite+method+of+5-methylcytosine+mapping+that+minimizes+template+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation.</a> Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).</li>
<li>Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Methylation%3A+Bisulphite+Modification+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis.</a> J. Vis. Exp. (56), e3170(2011).</li>
<li>Olek, A., Oswald, J., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+and+improved+method+for+bisulphite+based+cytosine+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis.</a> Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).</li>
<li>Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loss+of+imprinting+in+the+placenta+following+preimplantation+development+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture.</a> Development. 131, 3727-3735 (2004).</li>
<li>Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effects+of+superovulation%3A+loss+of+maternal+and+paternal+imprinted+methylation+in+a+dose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).</li>
<li>Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+on+bisulfite+sequencing+method+for+methylation+status+of+imprinted+genes+in+single+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Yi+Xue+Yi+Chuan+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes.</a> Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).</li>
<li>Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+imprinting+perturbations+do+not+originate+from+superovulation-induced+defects+in+DNA+methylation+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition.</a> Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).</li>
<li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Hajj, N. E. l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dilution+bisulfite+%28pyro%29sequencing+reveals+parent-specific+methylation+patterns+in+single+early+mouse+embryos+and+bovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes.</a> Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy test pojedynczego oocyta składa się z wielu etapów, z których kilka jest krytycznych i wymaga szczególnej uwagi. Pierwszym z nich jest płukanie oocytów. Szczególnie ważne jest wielokrotne płukanie każdego oocytu w świeżych kroplach medium poyobróbce hialuronidazą, aby usunąć jak najwięcej komórek cumulus. Ponadto podczas przenoszenia oocytów do zakwaszonego roztworu Tyrode'a w celu usunięcia błony przejrzystej (zona pellucida), należy upewnić się, że w otaczającym medium nie ma komórek cumulus. Po usunięciu bło...

<table><tbody><tr><td>&lt;silny&gt;Pozyskiwanie oocytów&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td></td></tr><tr><td>Zakwaszony roztwór Tyrode'a</td><td>Sigma</td><td>T1788</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma</td><td>P5568</td><td></td></tr><tr><td>10% IGEPAL</td><td>Bioshop</td><td>NON999.500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Bufor do lizy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 7,5</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.5</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>LiDS</td><td>Bioshop</td><td>LDS701.10</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Bufor lizujący SDS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE pH 7,5 </td><td>Bioshop(Tris)Sigma (EDTA)</td><td>TRS001.5 E5134</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Konwersja pirosiarczynowa&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Wodorosiarczyn sodu (pirosiarczyn sodu)</td><td>Sigma</td><td>243973</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochinon </td><td>Sigma</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa (LMP)</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka M2</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana GIBCO </td><td>Invitrogen</td><td>15230-196</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawowana woda podwójnie destylowana (dd)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustra Hot Start Mix RTG</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9006-54</td><td></td></tr><tr><td>240 ng/ml tRNA drożdżowej</td><td>Invitrogen</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>Wewnętrzne i zewnętrzne primery zagnieżdżone</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Ligacja&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wektor Promega pGEM-T Easy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Klonowanie TA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kompetentne &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; komórki</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>T3009</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;deg;C i 90 &amp;deg;C Bloki grzejne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C i 50 &amp;deg;C Kąpiele wodne (42 &amp;deg;C dla transformacji)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolebka laboratoryjna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>termocykler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mutageneza z użyciem pirosiarczynu w pojedynczych oocytach

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetyka obejmuje wszystkie dziedziczne i odwracalne modyfikacje chromatyny, które zmieniają dostępność genów, a tym samym stanowią podstawowe mechanizmy regulacji transkrypcji genów1. Metylacja DNA jest modyfikacją epigenetyczną, która działa przede wszystkim jako znacznik represyjny. Poprzez kowalencyjne przyłączenie grupy metylowej do cytozyn w dinukleotydach CpG może ona rekrutować dodatkowe białka represyjne i modyfikacje histonów, aby zainicjować procesy odpowiedzialne za kondensację chromatyny i wyciszanie genów2. Metylacja DNA jest niezbędna dla prawidłowego rozwoju, ponieważ odgrywa kluczową rolę w programowaniu rozwojowym, różnicowaniu komórek, represji elementów retrowirusowych, inaktywacji chromosomu X oraz imprintingowi genomicznemu.
Jedną z najpotężniejszych metod analizy metylacji DNA jest mutageneza pirosiarczynowa. Pirosiarczyn sodu jest mutagenem DNA, który deaminuje cytozyny do uracyli. Po amplifikacji PCR i sekwencjonowaniu zdarzenia konwersji te są wykrywane jako tyminy. Metylowane cytozyny są chronione przed deaminacją i pozostają zatem cytozynami, co umożliwia identyfikację metylacji DNA na poziomie pojedynczych nukleotydów3. Rozwój testów mutagenezy pirosiarczynowej ewoluował od pierwotnie opisanych metod4-6 w stronę rozwiązań bardziej czułych i powtarzalnych7. Jednym z kluczowych usprawnień było osadzanie mniejszych ilości DNA w kuleczce agarozy, co chroni DNA przed drastyczną obróbką pirosiarczynem8. Umożliwiło to przeprowadzenie analizy metylacji na pulach oocytów i embrionów w stadium blastocysty9. Najbardziej zaawansowany do tej pory protokół mutagenezy pirosiarczynowej jest przeznaczony dla pojedynczych embrionów w stadium blastocysty10. Jednakże, ponieważ blastocysty mają średnio 64 komórki (zawierające 120-720 pg genomowego DNA), metoda ta nie jest skuteczna w badaniach metylacji pojedynczych oocytów lub embrionów w stadium podziału.
Czerpiąc z doświadczeń związanych z zatapianiem niewielkich ilości DNA w agarozie, w tym w przypadku oocytów11, przedstawiamy tutaj metodę, w której oocyty są bezpośrednio zatapiane w kuleczce z agarozy i roztworu lizującego niezwłocznie po ich pobraniu i usunięciu z oocytu strefy przejrzystej. Pozwala to nam uniknąć dwóch głównych problemów związanych z mutagenezą pirosiarczynową pojedynczego oocytu: ochrony minimalnej ilości DNA przed degradacją oraz późniejszej utraty materiału podczas licznych etapów protokołu. Co istotne, ponieważ dane pozyskiwane są z pojedynczych oocytów, wyeliminowano problem błędu PCR w obrębie pul materiału. Ponadto, nieumyślna kontaminacja komórkami cumulus jest wykrywalna za pomocą tej metody, gdyż każda próbka z więcej niż jednym wzorem metylacji może zostać wykluczona z analizy12. Niniejszy protokół stanowi ulepszoną metodę prowadzenia skutecznych i powtarzalnych analiz metylacji DNA na poziomie pojedynczej komórki i jest idealnie dostosowany do pojedynczych oocytów, jak również do embrionów w stadium podziału.

Mutageneza z użyciem pirosiarczynu jest złotym standardem analizy metylacji DNA. Nasz zmodyfikowany protokół umożliwia analizę metylacji DNA na poziomie pojedynczych komórek i został zaprojektowany specjalnie dla poszczególnych oocytów. Może być on również stosowany w przypadku embrionów w stadium przedziałowym.

Mutageneza z użyciem pirosiarczynu w pojedynczych oocytach

Epigenetyka obejmuje wszystkie dziedziczne i odwracalne modyfikacje chromatyny, które zmieniają dostępność genów, a tym samym stanowią główne mechanizmy dla ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza metylacji DNA w pojedynczym oocycie. Osiąga się to poprzez uprzednie usunięcie komórek cumulus oraz soap palita z pobranych oocytów. Drugim krokiem jest osadzenie oocytu w roztworze lizującym aros w stosunku dwa do jednego, aby chronić niewielką ilość DNA przed utratą lub degradacją.Następnie przeprowadzana jest mutogeneza z użyciem pirosiarczynu, po której następuje amplifikacja za pomocą zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy. Ostatnim etapem jest ligacja i klonowanie produktu PCR. Następnie wyselekcjonowane klony są amplifikowane metodą PCR i przekazane do sekwencjonowania.Ostatecznie, mutageneza z użyciem pirosiarczynu i sekwencjonowanie są wykorzystywane do wykazania metylacji DNA w obrębie cytozyny-fosforanu-guaniny, czyli dinukleotydów CpG w regionie zainteresowania w pojedynczym oocycie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mutageneza z użyciem pirosiarczynu w dużych populacjach komórek, jest możliwość uzyskania danych z pojedynczego oocytu bez konieczności łączenia komórek, co eliminuje błąd PCR oraz kontaminację komórkami somatycznymi. W dniu pobierania oocytów należy na świeżo przygotow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Optogenetyczna mutageneza losowa z wykorzystaniem histonów-miniSOG u C. elegans

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Ten artykuł przedstawia dwie metody oparte na fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu określenia zawartości chromosomu X komórek jajnika w nieprzeszczepionej i przeszczepionej tkance kory jajnika od kobiet z aberracjami chromosomu X.

Badanie aberracji chromosomowych X w komórkach jajnika za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

W tym protokole, metoda oczyszczania powinowactwa do rybosomów (TRAP) i izolacja jąder oznaczonych określonymi typami komórek (INTACT) zostały zoptymalizowane pod kątem sparowanego przesłuchania specyficznego dla komórki transkryptomu i epigenomu jajnika przy użyciu mysiego modelu NuTRAP skrzyżowanego z myszą linią Cyp17a1-Cre.

Specyficzne dla komórki sparowane badanie epigenomu jajnika myszy i transkryptomu

Utrzymanie integralności genomu oocytu jest niezbędne do zapewnienia genetycznej wierności powstałego zarodka. W tym miejscu przedstawiamy dokładny protokół wykrywania pęknięć dwuniciowych DNA w żeńskich komórkach rozrodczych ssaków.

Wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA w oocytach myszy

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Mutageneza celowana całych plazmidów to prosty sposób na stworzenie nieco odmiennych wariantów oryginalnego plazmidu. W niniejszej pracy demonstrujemy łatwą i kosztowo efektywną metodę wprowadzania substytucji zasad w plazmidzie przy użyciu standardowych odczynników.

Własna metoda mutagenezy celowanej całych plazmidów

Poznaj metodę analizy metylacji DNA w pojedynczych oocytach z wykorzystaniem mutagenezy bisulfitowej. Technika ta umożliwia badanie regulacji epigenetycznej we wczesnym rozwoju bez zanieczyszczenia komórkami cumulus.

Mutageneza z użyciem pirosiarczynu w pojedynczych oocytach

Przeglądaj więcej filmów