Name: Mutageneza wodorosiarczynu pojedynczego oocytu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Poznaj metodę analizy metylacji DNA w pojedynczych oocytach z wykorzystaniem mutagenezy bisulfitowej. Technika ta umożliwia badanie regulacji epigenetycznej we wczesnym rozwoju bez zanieczyszczenia komórkami cumulus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez University of Western Ontario, Departament Położnictwa i Ginekologii oraz grant ER06-02-188 z Ministerstwa Badań i Innowacji w ramach nagrody Early Researcher Award. MMD otrzymał wsparcie w ramach stypendium doktoranckiego CIHR Training Program in Reproduction, Early Development and the Impact on Health (REDIH).

<ol><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Rodenhiser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+human+disease%3A+translating+basic+biology+into+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22CMAJ%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications.</a> CMAJ. 174, 341-348 (2006).</li>
<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+analysis+on+individual+chromosomes%3A+improved+protocol+for+bisulphite+genomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).</li>
<li>Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bisulfite+method+of+5-methylcytosine+mapping+that+minimizes+template+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation.</a> Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).</li>
<li>Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Methylation%3A+Bisulphite+Modification+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis.</a> J. Vis. Exp. (56), e3170(2011).</li>
<li>Olek, A., Oswald, J., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+and+improved+method+for+bisulphite+based+cytosine+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis.</a> Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).</li>
<li>Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loss+of+imprinting+in+the+placenta+following+preimplantation+development+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture.</a> Development. 131, 3727-3735 (2004).</li>
<li>Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effects+of+superovulation%3A+loss+of+maternal+and+paternal+imprinted+methylation+in+a+dose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).</li>
<li>Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+on+bisulfite+sequencing+method+for+methylation+status+of+imprinted+genes+in+single+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Yi+Xue+Yi+Chuan+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes.</a> Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).</li>
<li>Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+imprinting+perturbations+do+not+originate+from+superovulation-induced+defects+in+DNA+methylation+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition.</a> Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).</li>
<li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Hajj, N. E. l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dilution+bisulfite+%28pyro%29sequencing+reveals+parent-specific+methylation+patterns+in+single+early+mouse+embryos+and+bovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes.</a> Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy test pojedynczego oocyta składa się z wielu etapów, z których kilka jest krytycznych i wymaga szczególnej uwagi. Pierwszym z nich jest płukanie oocytów. Szczególnie ważne jest wielokrotne płukanie każdego oocytu w świeżych kroplach medium poyobróbce hialuronidazą, aby usunąć jak najwięcej komórek cumulus. Ponadto podczas przenoszenia oocytów do zakwaszonego roztworu Tyrode'a w celu usunięcia błony przejrzystej (zona pellucida), należy upewnić się, że w otaczającym medium nie ma komórek cumulus. Po usunięciu bło...

<table><tbody><tr><td>&lt;silny&gt;Pozyskiwanie oocytów&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td></td></tr><tr><td>Zakwaszony roztwór Tyrode'a</td><td>Sigma</td><td>T1788</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma</td><td>P5568</td><td></td></tr><tr><td>10% IGEPAL</td><td>Bioshop</td><td>NON999.500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Bufor do lizy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 7,5</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.5</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>LiDS</td><td>Bioshop</td><td>LDS701.10</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Bufor lizujący SDS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE pH 7,5 </td><td>Bioshop(Tris)Sigma (EDTA)</td><td>TRS001.5 E5134</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Konwersja pirosiarczynowa&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Wodorosiarczyn sodu (pirosiarczyn sodu)</td><td>Sigma</td><td>243973</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochinon </td><td>Sigma</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa (LMP)</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka M2</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana GIBCO </td><td>Invitrogen</td><td>15230-196</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawowana woda podwójnie destylowana (dd)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustra Hot Start Mix RTG</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9006-54</td><td></td></tr><tr><td>240 ng/ml tRNA drożdżowej</td><td>Invitrogen</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>Wewnętrzne i zewnętrzne primery zagnieżdżone</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Ligacja&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wektor Promega pGEM-T Easy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Klonowanie TA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kompetentne &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; komórki</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>T3009</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;deg;C i 90 &amp;deg;C Bloki grzejne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C i 50 &amp;deg;C Kąpiele wodne (42 &amp;deg;C dla transformacji)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolebka laboratoryjna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>termocykler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mutageneza z użyciem pirosiarczynu w pojedynczych oocytach

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetyka obejmuje wszystkie dziedziczne i odwracalne modyfikacje chromatyny, które zmieniają dostępność genów, a tym samym stanowią podstawowe mechanizmy regulacji transkrypcji genów1. Metylacja DNA jest modyfikacją epigenetyczną, która działa przede wszystkim jako znacznik represyjny. Poprzez kowalencyjne przyłączenie grupy metylowej do cytozyn w dinukleotydach CpG może ona rekrutować dodatkowe białka represyjne i modyfikacje histonów, aby zainicjować procesy odpowiedzialne za kondensację chromatyny i wyciszanie genów2. Metylacja DNA jest niezbędna dla prawidłowego rozwoju, ponieważ odgrywa kluczową rolę w programowaniu rozwojowym, różnicowaniu komórek, represji elementów retrowirusowych, inaktywacji chromosomu X oraz imprintingowi genomicznemu.
Jedną z najpotężniejszych metod analizy metylacji DNA jest mutageneza pirosiarczynowa. Pirosiarczyn sodu jest mutagenem DNA, który deaminuje cytozyny do uracyli. Po amplifikacji PCR i sekwencjonowaniu zdarzenia konwersji te są wykrywane jako tyminy. Metylowane cytozyny są chronione przed deaminacją i pozostają zatem cytozynami, co umożliwia identyfikację metylacji DNA na poziomie pojedynczych nukleotydów3. Rozwój testów mutagenezy pirosiarczynowej ewoluował od pierwotnie opisanych metod4-6 w stronę rozwiązań bardziej czułych i powtarzalnych7. Jednym z kluczowych usprawnień było osadzanie mniejszych ilości DNA w kuleczce agarozy, co chroni DNA przed drastyczną obróbką pirosiarczynem8. Umożliwiło to przeprowadzenie analizy metylacji na pulach oocytów i embrionów w stadium blastocysty9. Najbardziej zaawansowany do tej pory protokół mutagenezy pirosiarczynowej jest przeznaczony dla pojedynczych embrionów w stadium blastocysty10. Jednakże, ponieważ blastocysty mają średnio 64 komórki (zawierające 120-720 pg genomowego DNA), metoda ta nie jest skuteczna w badaniach metylacji pojedynczych oocytów lub embrionów w stadium podziału.
Czerpiąc z doświadczeń związanych z zatapianiem niewielkich ilości DNA w agarozie, w tym w przypadku oocytów11, przedstawiamy tutaj metodę, w której oocyty są bezpośrednio zatapiane w kuleczce z agarozy i roztworu lizującego niezwłocznie po ich pobraniu i usunięciu z oocytu strefy przejrzystej. Pozwala to nam uniknąć dwóch głównych problemów związanych z mutagenezą pirosiarczynową pojedynczego oocytu: ochrony minimalnej ilości DNA przed degradacją oraz późniejszej utraty materiału podczas licznych etapów protokołu. Co istotne, ponieważ dane pozyskiwane są z pojedynczych oocytów, wyeliminowano problem błędu PCR w obrębie pul materiału. Ponadto, nieumyślna kontaminacja komórkami cumulus jest wykrywalna za pomocą tej metody, gdyż każda próbka z więcej niż jednym wzorem metylacji może zostać wykluczona z analizy12. Niniejszy protokół stanowi ulepszoną metodę prowadzenia skutecznych i powtarzalnych analiz metylacji DNA na poziomie pojedynczej komórki i jest idealnie dostosowany do pojedynczych oocytów, jak również do embrionów w stadium podziału.

Mutageneza z użyciem pirosiarczynu jest złotym standardem analizy metylacji DNA. Nasz zmodyfikowany protokół umożliwia analizę metylacji DNA na poziomie pojedynczych komórek i został zaprojektowany specjalnie dla poszczególnych oocytów. Może być on również stosowany w przypadku embrionów w stadium przedziałowym.

Mutageneza z użyciem pirosiarczynu w pojedynczych oocytach

Epigenetyka obejmuje wszystkie dziedziczne i odwracalne modyfikacje chromatyny, które zmieniają dostępność genów, a tym samym stanowią główne mechanizmy dla ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza metylacji DNA w pojedynczym oocycie. Osiąga się to poprzez uprzednie usunięcie komórek cumulus oraz soap palita z pobranych oocytów. Drugim krokiem jest osadzenie oocytu w roztworze lizującym aros w stosunku dwa do jednego, aby chronić niewielką ilość DNA przed utratą lub degradacją.Następnie przeprowadzana jest mutogeneza z użyciem pirosiarczynu, po której następuje amplifikacja za pomocą zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy. Ostatnim etapem jest ligacja i klonowanie produktu PCR. Następnie wyselekcjonowane klony są amplifikowane metodą PCR i przekazane do sekwencjonowania.Ostatecznie, mutageneza z użyciem pirosiarczynu i sekwencjonowanie są wykorzystywane do wykazania metylacji DNA w obrębie cytozyny-fosforanu-guaniny, czyli dinukleotydów CpG w regionie zainteresowania w pojedynczym oocycie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mutageneza z użyciem pirosiarczynu w dużych populacjach komórek, jest możliwość uzyskania danych z pojedynczego oocytu bez konieczności łączenia komórek, co eliminuje błąd PCR oraz kontaminację komórkami somatycznymi. W dniu pobierania oocytów należy na świeżo przygotować roztwory wymienione w protokole pisemnym; podczas przygotowywania roztworów należy zmniejszyć ryzyko kontaminacji DNA poprzez częstą zmianę rękawiczek i stosowanie końcówek z filtrem, a także utrzymywać otwarte probówki pod kątem i zakręcać je wszystkie, gdy nie są używane.Rozpocznij pobieranie oocytów poprzez umieszczenie wypreparowanych jajowodów myszy w pożywce M2 i użycie pęsety M do wyodrębnienia kompleksów cumulus-oocyt. Następnie oddziel oocyty od kompleksów cumulus, wykorzystując roztwór hialuronidazy o stężeniu 0,3 mg/mL w kropli 30 µL pożywki M2. Pozostaw oocyty w roztworze tylko na czas niezbędny do usunięcia komórek cumulus, ponieważ długotrwała ekspozycja może im zaszkodzić.Przemyj oocyty w kroplach 30 µL pożywki M two, przenosząc oocyty z kropli do kropli. Okresowo usuwaj komórki cumulus podczas łącznie trzech przemyć. Usuń Z z LUCITA, używając kwaśnego roztworu tyrozyny.Najpierw umieść oocyty w jednej kropli 30 µl roztworu, a następnie przenieś je do kolejnej kropli 30 µl. Zapobiegnie to rozcieńczeniu kwasu przez przeniesione medium, co mogłoby obniżyć jego wydajność. Pozostaw komórki w roztworze tylko na czas niezbędny do usunięcia strefy błonowej, ponieważ długotrwała ekspozycja może doprowadzić do ich uszkodzenia.Po usunięciu błony przejrzystej ponownie przemyj oocyty w 30 µL kropli medium M2. Aby przeprowadzić zatapianie w agarozie, w pierwszej kolejności umieść roztwór lizujący na bloku grzewczym ustawionym na 70 °C. Dodaj podgrzaną agarozę o niskiej temperaturze topnienia (LMP) do roztworu lizującego, zachowując stosunek agarozy do roztworu lizującego 2:1. Następnie umieść pojedynczy oocyt na czystym szkiełku przedmiotowym w minimalnej ilości medium M2.Kolejnym krokiem jest osadzenie pojedynczej komórki w roztworze Agros i lizy. Należy wykonać to szybko, ponieważ Agros twardnieje w temperaturach poniżej 65 °C. Pod mikroskopem pobierz 10 µL roztworu Agros do lizy za pomocą końcówki pipety.Delikatnie nanieś około 1 µL lub mniej roztworu lizującego agros na szkiełko przedmiotowe, pozwalając mu zmieszać się z minimalnym medium. Ostrożnie pobierz oocyt do końcówki pipety. Następnie przenieś całe 10 µL do probówki typu einor zawierającej 300 µL oleju mineralnego, tak aby powstała kropla przybrała kształt sferyczny.Inkubuj probówkę na lodzie przez 10 minut w celu przeprowadzenia lizy. Usuń 300 µL oleju mineralnego i dodaj 500 µL buforu do lizy SDS. Inkubuj próbkę przez noc w kąpieli wodnej ustawionej na 50 °C w drugim dniu.Przygotuj świeże roztwory do mutogenezy siarczkiem bismutu zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Rozpocznij mutogenezę od całkowitego usunięcia 500 µL buforu do lizy SDS. Należy pamiętać, że jakikolwiek pozostały bufor do lizy rozcieńczy agros podczas podgrzewania, a kuleczki będą bardziej podatne na rozpuszczenie w kolejnych etapach.Po całkowitym usunięciu buforu lizującego należy dodać 300 µL oleju mineralnego. Próbkę inkubuje się przez dwie i pół minuty w bloku grzewczym ustawionym na 90 °C. Należy zachować ostrożność, aby nie mieszać, nie wstrząsać ani nie powodować wahań temperatury.Po dwóch i pół minutach inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut. Aby przeprowadzić denaturację, usunąć olej mineralny i dodać do probówki 1 ml 0,1 M wodorotlenku sodu, a następnie lekko uderzyć w probówkę i odwrócić ją pięć do sześciu razy.Inkubować próbkę przez 15 minut. W kąpieli wodnej ustawionej na 37 °C, odwracając probówkę co trzy do czterech minut, kuleczka powinna unosić się w wodorotlenku sodu. Należy zwrócić uwagę, że kuleczka nie znajduje się już na dnie probówki.Aby przeprowadzić obróbkę siarczynową, najpierw delikatnie odwiruj probówkę po usunięciu wodorotlenku sodu. Dodaj 300 µL oleju mineralnego oraz 500 µL roztworu siarczynu BIS. Należy unikać ekspozycji na światło i inkubować probówkę przez trzy i pół godziny w kąpieli wodnej o temperaturze 50 °C.Następnie przeprowadź denaturację. Najpierw inkubuj próbkę na lodzie przez trzy minuty, a następnie usuń olej mineralny i roztwór siarczynu BIS. Po delikatnym wirowaniu dodaj 1 ml 0,3 M wodorotlenku sodu, a następnie delikatnie uderz w dno probówki i odwróć ją pięć do sześciu razy.Inkubować próbkę przez 15 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, odwracając probówki co trzy do czterech minut; ponownie przypominamy, że przed rozpoczęciem reakcji PCR kuleczki powinny unosić się w wodorotlenku sodu. Przemyć próbki, rozpoczynając od delikatnego wirowania.Następnie usunąć wodorotlenek sodu i dodać 1 ml 1x TE pH 7,5. Wstrząsać przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej. Po drugim delikatnym wirowaniu usunąć 1x TE.Powtórz ten proces płukania dwukrotnie. Następnie dodaj 1 mL autoklawowanej wody dwukrotnie destylowanej. Mieszaj przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej, odwiruj delikatnie po raz trzeci i usuń wodę.Powtórzyć płukanie wodą podwójnie destylowaną dwukrotnie. Na koniec usunąć cały nadsącz, pozostawiając jedynie kuleczki aros. Sprawdzić, czy pH nadsączu wynosi 5.0.Jeśli nadsącz jest nadal zbyt zasadowy, należy ponownie przemyć kuleczki wodą dwukrotnie destylowaną. W międzyczasie do probówki PCR należy dodać mieszaninę do pierwszej rundy PCR zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Przesuń solid agro speed do krawędzi probówki einor.Następnie ostrożnie przenieś agro speed do probówki PCR, podgrzej do 70 °C przez jedną minutę i wymieszaj, a następnie przeprowadź amplifikację zgodnie z zaleceniami w protokole pisemnym. Po pierwszej rundzie amplifikacji przygotuj reakcję PCR dla drugiej rundy, używając 5 µL produktu z pierwszej rundy jako matrycy. Należy upewnić się, że pipetowanie odbywa się poniżej warstwy oleju mineralnego.Należy przeprowadzić drugą rundę amplifikacji zgodnie z instrukcją w tekście w ramach testu diagnostycznego. Próbki z drugiej rundy można poddać trawieniu enzymem restrykcyjnym specyficznym dla metylacji lub szczepu, a następnie przeprowadzić elektroforezę produktów trawienia na żelu z 8% akryloamidu. Wszelkie powstałe heterogeniczne prążki reprezentują więcej niż jedną sekwencję. Aby sklonować produkt drugiej rundy, należy go ligować z wektorem i przeprowadzić klonowanie TA, zgodnie z opisem w manuskrypcie towarzyszącym temu filmowi. Po klonowaniu TA całą mieszaninę reakcyjną należy wysiać na płytkę z agarem LB z dodatkiem ampicyliny, X-gal i IPTG, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.Następnie do probówki PCR należy dodać mieszaninę reakcyjną (master mix) do kolonialnej PCR, zgodnie z listą w protokole pisemnym. Za pomocą końcówki pipety należy pobrać białą kolonię bakterii z płytki i zawiesić ją w 35 µL mieszaniny reakcyjnej do kolonialnej PCR w probówce PCR. Następnie należy przeprowadzić amplifikację zawiesiny zgodnie z opisem w tekście; po amplifikacji PCR należy nanieść 4 µL produktu PCR na żel AGROS 1,5% w celu przeprowadzenia elektroforezy.Na koniec należy przesłać około 30 µL produktu PCR w celu sekwencjonowania pięciu reakcji colony PCR na cyte. Po uzyskaniu wyników sekwencjonowania można odczytać wzory metylacji; każda oryginalna cytozyna-guanina, która pozostała w niezmienionej formie, była zmetylowana. I odwrotnie, każda oryginalna cytozyna-guanina, która obecnie jest tyminą-guaniną, była niezmetylowana po amplifikacji nested PCR z użyciem starterów konwertowanych siarczynem.Możliwe jest potwierdzenie pomyślnej konwersji poprzez wizualizację fragmentu o prawidłowej wielkości w pojedynczej metafazie na żelu agarozowym. Dwa oocyty reprezentują jeden allel rodzicielski i teoretycznie posiadają jeden wzór metylacji imprintingowej. W ten sposób produkty drugiej rundy PCR mogą zostać przetestowane pod kątem niezamierzonej kontaminacji.Enzym restrykcyjny wrażliwy na metylację DNA może zostać wykorzystany do trawienia produktu drugiej rundy PCR w celu oceny, czy zawiera on allel zmetylowany czy niezmetylowany. W tym przypadku rozcinana jest zmetylowana cytozyna w obrębie sekwencji rozpoznawanej przez enzym. Z kolei niezmetylowana cytozyna, która została przekształcona w tyminę, nie jest już rozpoznawana przez enzym i pozostaje nierozcięta; każda próbka oocytu w metafazie II zawierająca zarówno allele zmetylowane, jak i niezmetylowane, powinna zostać odrzucona, ponieważ świadczy to o kontaminacji komórkami cumulus lub obecności ciałka polarnego po ligacji i transformacji.Pomyślną amplifikację kolonii metodą PCR można zwizualizować na żelu AROS, aby upewnić się, że do sekwencjonowania zostaną wysłane próbki o prawidłowej wielkości produktu. W tym przykładzie oczekiwana wielkość amplikonu po ligacji wynosi 56 par zasad. W tym przypadku klon pięć ma nieprawidłową wielkość amplikonu i nie powinien zostać wysłany do sekwencjonowania.Sekwencjonowanie pięciu pojedynczych klonów z oocytu w metafazie II powinno wykazać pięć identycznych wzorów metylacji oraz identyczne wskaźniki konwersji poza miejscami CpG. Wszelkie próbki zawierające więcej niż jeden wzór należy odrzucić. Ponieważ owulowane oocyty w metafazie II posiadają dwie kopie chromosomów lub przytwierdzone ciałko polarne, istnieje możliwość uzyskania dwóch podobnych wzorów sekwencji.Należy odrzucić dane z wszystkich komórek wykazujących wysoce odmienne wzorce metylacji. Ponieważ podczas wykonywania tej procedury nie można wykluczyć zanieczyszczenia komórkami cumulus, ważne jest, aby po pierwsze kilkukrotnie przemyć oocyty w świeżym medium po obróbce HI IDE, w celu usunięcia jak największej liczby komórek cumulus. Po drugie, agar o niskiej temperaturze topnienia twardnieje w temperaturach poniżej 65 °C, dlatego należy pracować ostrożnie, lecz szybko.Na koniec należy pamiętać, że wodorosiarczan sodu oraz hydrochinon są światłoczułe, dlatego probówki z reakcją oraz roztwory powinny zostać owinięte folią.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Optogenetyczna mutageneza losowa z wykorzystaniem histonów-miniSOG u C. elegans

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Ten artykuł przedstawia dwie metody oparte na fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu określenia zawartości chromosomu X komórek jajnika w nieprzeszczepionej i przeszczepionej tkance kory jajnika od kobiet z aberracjami chromosomu X.

Badanie aberracji chromosomowych X w komórkach jajnika za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

W tym protokole, metoda oczyszczania powinowactwa do rybosomów (TRAP) i izolacja jąder oznaczonych określonymi typami komórek (INTACT) zostały zoptymalizowane pod kątem sparowanego przesłuchania specyficznego dla komórki transkryptomu i epigenomu jajnika przy użyciu mysiego modelu NuTRAP skrzyżowanego z myszą linią Cyp17a1-Cre.

Specyficzne dla komórki sparowane badanie epigenomu jajnika myszy i transkryptomu

Utrzymanie integralności genomu oocytu jest niezbędne do zapewnienia genetycznej wierności powstałego zarodka. W tym miejscu przedstawiamy dokładny protokół wykrywania pęknięć dwuniciowych DNA w żeńskich komórkach rozrodczych ssaków.

Wykrywanie dwuniciowych pęknięć DNA w oocytach myszy

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Poznaj metodę analizy metylacji DNA w pojedynczych oocytach z wykorzystaniem mutagenezy bisulfitowej. Technika ta umożliwia badanie regulacji epigenetycznej we wczesnym rozwoju bez zanieczyszczenia komórkami cumulus.

Mutageneza z użyciem pirosiarczynu w pojedynczych oocytach

Przeglądaj więcej filmów