Name: Preparaty do liofilizacji bakterii i ich wpływ na przeżywalność komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj wpływ różnych preparatów do liofilizacji na przeżywalność komórek bakteryjnych. Ta metoda pozwala zrozumieć kluczowe właściwości fizyczne i strukturalne dla zachowania żywotności mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została sfinansowana przez Szwedzką Fundację Strategicznych Badań nad Środowiskiem (MISTRA) w ramach programu DOM oraz z grantu 211684 (BACSIN) z programu ramowego FP7 Wspólnoty Europejskiej. Dziękujemy J. Engstrand za pomoc w filmowaniu analizy rentgenowskiej oraz L. Tang za pomoc w opracowaniu koncepcji narracyjnej.

1. Hodowla i pozyskiwanie P. putida
<ol>
	<li>Przygotować kulturę startową Pseudomonas putida, szczepiąc 100 ml bulionu sojowo-kazeinowego (TSB) kolonią komórek P. putida hodowanych na agarze z bulionem sojowo-kazeinowym (TSA). Hodowlę inkubować w temperaturze 30 °C na inkubatorze wytrząsowym ustawionym na 130 rpm.</li>
	<li>Po 7 hr przenieść do świeżego medium TSB alikwot z kultury startowej odpowiadający 1/10 końcowej objętości kultury głównej. Komórki inkubować w temperaturze 30 °C na inkubatorze wytrząsowym przy 130 rpm przez 16 hr.</li>
	<li>Po 16 hr wzrostu zebrać komórki poprzez wirowanie kultury przy 1,500 x g przez 20 min w RT. Odlać nadsącz i przemyć komórki, resuspendując osad komórkowy w roztworze NaCl izotonicznym względem medium wzrostowego. W tym przypadku zastosowano roztwór 150 mM NaCl. Następnie komórki ponownie odwirować i odlać nadsącz przed resuspensją komórek w medium formulacyjnym, patrz krok 3.2.</li>
</ol>
2. Hodowla innych gatunków
<ol>
	<li>Aby dostosować protokół do innych gatunków bakterii, procedury hodowli i zbioru należy zmienić zgodnie z wymaganiami danego gatunku. Aby uniknąć szoku osmotycznego podczas manipulacji komórkami w trakcie zbioru i etapów płukania, osmolalność roztworów musi odpowiadać osmolalności pożywki w momencie zbioru.</li>
</ol>
3. Formułowanie komórek
<ol>
	<li>Przygotować roztwory formulacji, odważając odpowiednie składniki matrycy i rozpuszczając je w wodzie. Aby uzyskać warunki izotoniczne, należy skorygować ilość substancji pomocniczej lub dodać NaCl bądź inny kompatybilny z komórkami rozpuszczalnik, aby osiągnąć pożądaną osmolalność. W przypadku substancji o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak disacharydy, ilości można łatwo dostosować w celu uzyskania warunków izotonicznych. W przypadku substancji o wysokiej masie cząsteczkowej, takich jak polimery, toniczność należy skorygować za pomocą kompatybilnych z komórkami substancji rozpuszczalnych, np. NaCl lub disacharydów. Należy pamiętać, że dodanie jakiejkolwiek substancji wpłynie na właściwości fizyczne formulacji, co z kolei może wpłynąć na przebieg liofilizacji i przeżywalność komórek.</li>
	<li>Odlać roztwór piorący (w tym przypadku NaCl) i ponownie zawiesić komórki w odpowiednich mediach formulacyjnych.</li>
	<li>Upewnić się, że komórki są homogenicznie rozproszone. Formulacje o niskiej lepkości poddaje się mieszaniu w wortexie, natomiast formulacje o wyższej lepkości miesza się, dodając np. magnesy mieszające i wstrząsając pojemnikiem do momentu uzyskania homogenicznego zmieszania.</li>
	<li>Rozdzielić formulacje do fiolek do liofilizatora. Fiolki należy zważyć przed napełnieniem, z próbką przed liofilizacją oraz po liofilizacji, aby obliczyć ilość wody usuniętej podczas procesu.</li>
	<li>Założyć gumowe korki do fiolek, jeżeli mają one zostać zamknięte wewnątrz liofilizatora (patrz krok 4.3).</li>
	<li>Policzyć komórki w każdej formulacji przed liofilizacją (patrz krok 6).</li>
</ol>
4. Liofilizacja
<ol>
	<li>Warunki liofilizacji muszą być dostosowane do właściwości fizycznych formulacji. Najważniejszym parametrem jest w tym przypadku temperatura przejścia szklistego, Tg, formulacji, oznaczana jako Tg' dla próbki zamrożonej w procesie koncentracji, aby wskazać na obecność wody. Tg' formulacji zamrożonej w procesie koncentracji można łatwo zmierzyć za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), patrz krok 7.</li>
	<li>Należy dostosować parametry procesu liofilizacji w taki sposób, aby temperatura próbki była zawsze niższa od jej temperatury przejścia szklistego (Tg), a ciśnienie w komorze umożliwiało szybką sublimację lodu.tj. suszenie pierwotne oraz pozostała zawartość wody w formulacji, t. j. suszenie wtórne. Jeśli podczas procesu suszenia temperatura próbki przekroczy wartość Tg', istnieje duże ryzyko zapadnięcia się struktury próbki, co może znacząco obniżyć przeżywalność komórek.</li>
	<li>Aby chronić produkty suche po liofilizacji, należy kontrolować atmosferę w próbkach. Jeśli to możliwe, należy zamknąć szczelnie próbki w liofilizatorze przed zwolnieniem próżni pod koniec cyklu liofilizacji. Alternatywnie fiolki można napełnić wybraną atmosferą. Ważne jest, aby unikać wystawiania próbek na warunki otoczenia, ponieważ każda wilgoć lub tlen obecny w atmosferze przechowywania wpłynie na przeżywalność komórek.</li>
	<li>Zważ fiolki.</li>
</ol>
5. Rehydratacja
<ol>
	<li>Rehydratuj próbki za pomocą sterylnej wody dejonizowanej. Ilość dodanej wody powinna być taka sama, jak ilość usuniętej podczas liofilizacji; oblicza się ją na podstawie masy pustej fiolki oraz tej samej fiolki z próbką przed i po liofilizacji. Próbki należy mieszać w wortexie w odstępach czasu, aż roztwory staną się jednorodne.</li>
</ol>
6. Wyliczanie
<ol>
	<li>Pobrać 100 μl z każdej próbki i przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne. Z wybranych rozcieńczeń 100 μl nanosi się na płytki TSA. Płytki inkubuje się w wymaganej temperaturze i czasie.</li>
</ol>
7. Charakterystyka zachowania podczas zamrażania sformułowania
<ol>
	<li>Odważ niewielką ilość próbki, 5 - 10 mg, i umieść ją w aluminiowym tyglu do DSC z pokrywką. Przygotuj pusty tygiel jako referencję.</li>
	<li>Ustaw program skanowania temperatury w DSC. Program chłodzenia należy ustawić tak, aby odwzorowywał etap zamrażania w programie liofilizacji. Jest to konieczne, ponieważ kinetyka chłodzenia może wpływać na Tg' uwodnionych formulacji. Przed rozpoczęciem skanowania grzewczego obniż temperaturę znacznie poniżej oczekiwanego Tg' badanych formulacji, zazwyczaj do -100 °C.</li>
	<li>Wybierz odpowiednią szybkość grzania; zazwyczaj stosuje się szybkość grzania od 5 - 40 °C/min. Rejestrowany sygnał przepływu ciepła wyrażony jest w watach i zależy od szybkości grzania. Wyższa szybkość grzania spowoduje uzyskanie wyraźniejszego sygnału Tg'.</li>
	<li>Ustaw zakres temperatury tak, aby obejmował zarówno Tg', jak i topnienie formulacji.</li>
</ol>
8. Pomiary napięcia powierzchniowego uwodnionych formulacji
<ol>
	<li>Układ doświadczalny wykorzystany w tym eksperymencie jest zgodny z metodą du Noüya do pomiaru napięcia powierzchniowego.</li>
	<li>Należy starannie oczyścić pierścień platynowy oraz naczynie pomiarowe. Naczynie płucze się acetonem, wyciera tkanką beztkankową, a następnie wypala od wewnątrz bezbarwnym płomieniem. Pierścień rozgrzewa się do czerwoności w bezbarwnym płomieniu.</li>
	<li>Naczynie należy napełnić roztworem i odczekać do ustabilizowania się powierzchni przed przystąpieniem do pomiaru. W przypadku roztworów, w których stan równowagi jest osiągany dopiero po długim czasie, np. polimerów, zastosowany tutaj prosty układ dostarczy danych jakościowych.</li>
	<li>W przypadku formulacji o wysokiej lepkości, np. roztworów 2% (w/w) HEC lub HPMC, napięcie powierzchniowe należy zmierzyć dla roztworów o niższych stężeniach, a następnie dokonać ekstrapolacji. Można to zrobić, korzystając z faktu, że spadek napięcia powierzchniowego stabilizuje się przy stężeniach poniżej 0,5% (w/w).</li>
</ol>
9. Analiza rentgenowska preparatów w formie suchej
<ol>
	<li>Pobrać niewielką ilość matrycy/bakterii i umieścić ją w uchwycie na próbkę.</li>
	<li>Zamontować uchwyt z próbką w dyfraktometrze rentgenowskim.</li>
	<li>W celu analizy obecnych w próbce faz krystalicznych można wykorzystać pakiet programistyczny EVA firmy Bruker.</li>
</ol>
10. Mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Pobierz niewielką ilość matrycy/bakterii z probówek i przymocuj ją do podstawka SEM.</li>
	<li>Umieść uchwyt SEM w napylaczu (w niniejszej pracy użyto Thermo VGScientific Polaron SC7640) i pokryj próbkę kilkoma nm Au/Pd lub Pt. W tych eksperymentach parametry napylania wynosiły: 1 900 V, 20 mA oraz 20 s, co pozwoliło uzyskać powłokę Au/Pd o grubości ~ 5 - 10 nm. Powłoka ta ogranicza ładowanie elektryczne podczas akwizycji obrazu. Zaleca się rozpoczęcie od cienkiej powłoki; jeśli ładowanie nadal występuje i powoduje artefakty obrazu, próbkę należy napylić ponownie.</li>
	<li>Wprowadź uchwyt SEM do komory SEM. Dobierz odpowiednie parametry obrazowania. Dla urządzenia użytego na Rysunku 2 (FEI Strata DB235) zastosowano napięcie przyspieszające 5 kV, rozmiar plamki (spotsize) 3, odległość roboczą 5 mm oraz detektor elektronów wtórnych.</li>
	<li>Opcjonalnie można wykorzystać skupioną wiązkę jonów (FIB) do wykonania przekrojów bakterii zatopionych w polimerze w celu ujawnienia dalszych szczegółów.</li>
</ol>

<ol><li>Wessman, P., Mahlin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+matrix+properties+on+the+survival+of+freeze-dried+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sci.+Food+Agric%22%5BJournal%5D)">Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria.</a> J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).</li>
<li>Ablett, S., Izzard, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Scanning+Calorimetric+Study+of+Frozen+Sucrose+and+Glycerol+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Chemical+Society-Faraday+Transactions%22%5BJournal%5D)">Differential Scanning Calorimetric Study of Frozen Sucrose and Glycerol Solutions.</a> Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions. 88 (6), 789-794 (1992).</li>
<li>Knopp, S. A., Chongprasert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+type+TMDSC+curve+of+frozen+sucrose+solutions+and+collapse+during+freeze-drying%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Analysis+and+Calorimetry%22%5BJournal%5D)">The relationship between type TMDSC curve of frozen sucrose solutions and collapse during freeze-drying.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 54 (2), 659-672 (1998).</li>
<li>Crowe, J. H., Leslie, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+Vitrification+Sufficient+to+Preserve+Liposomes+during+Freeze-Drying%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Is Vitrification Sufficient to Preserve Liposomes during Freeze-Drying.</a> Cryobiology. 31 (4), 355-366 (1994).</li>
<li>Jain, P., Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glass-forming+biopreservatives+on+head+group+rotational+dynamics+in+freeze-dried+phospholipid+bilayers%3A+A+P-31+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Effect of glass-forming biopreservatives on head group rotational dynamics in freeze-dried phospholipid bilayers: A P-31 NMR study.</a> Journal of Chemical Physics. 131 (2), (2009).</li>
<li>Stock, J. B., Rauch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+Space+in+Salmonella-Typhimurium+and+Escherichia-Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Periplasmic Space in Salmonella-Typhimurium and Escherichia-Coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 252 (21), 7850-7861 (1977).</li>
<li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anhydrobiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Anhydrobiosis.</a> Annual Review of Physiology. 54, 579-599 (1992).</li>
<li>Leslie, S. B., Israeli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+and+Sucrose+Protect+Both+Membranes+and+Proteins+in+Intact+Bacteria+during+Drying%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61 (10), 3592-3597 (1995).</li>
<li>Nesarikar, V. V., Nassar, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cations+and+anions+on+glass+transition+temperatures+in+excipient+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Development+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effect of cations and anions on glass transition temperatures in excipient solutions.</a> Pharmaceutical Development and Technology. 12 (3), 259-264 (2007).</li>
<li>You, Y., Ludescher, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sodium+chloride+on+molecular+mobility+in+amorphous+sucrose+detected+by+phosphorescence+from+the+triplet+probe+erythrosin+B%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of sodium chloride on molecular mobility in amorphous sucrose detected by phosphorescence from the triplet probe erythrosin B.</a> Carbohydr. Res. 343 (2), 350-363 (2008).</li>
<li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Nguyen, K. H. N., Crowe, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+vitrification+involved+in+depression+of+the+phase+transition+temperature+in+dry+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Is vitrification involved in depression of the phase transition temperature in dry phospholipids.</a> Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1280, 187-196 (1996).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Celem niniejszego badania było zbadanie niektórych właściwości formulacji, które mogą mieć znaczenie dla przeżywalności komórek podczas liofilizacji. Chociaż wewnętrzna tolerancja na suszenie różni się w zależności od gatunku, co zilustrowano na Ryc. 1A, trend dotyczący tego, jak dobrze różne formulacje wspierają przeżywalność komórek, jest podobny. Warto rozpocząć od porównania sacharozy i Ficollu. Uważa się, że kluczowym czynnikiem warunkującym wsparcie przeżywalności komórek przez formulację jest zdol...

<table><tbody><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>GE-healthcare</td><td>17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>HEC (Natrosol-M stopień farmaceutyczny)</td><td>Ashland</td><td></td><td>Dar od firmy Ashland</td></tr><tr><td>HPMC (Methocel F4M)</td><td>Dow</td><td></td><td>Dar od Wydziału Farmacji Uniwersytetu w Uppsali</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2395</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Tryptic Soy broth</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>Agar Tryptic Soy</td><td>Merck</td><td>105458</td><td></td></tr><tr><td>Lyostar II</td><td>FTS Kinetics</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Pyris Diamond DSC</td><td>Perkin-Elmer</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Dyfraktometr Bruker AXS SMART CCD 1k</td><td>Bruker</td><td>N.A</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwiązkowy FEI Strata DB235 FIB/SEM</td><td>FEI</td><td>N.A</td><td></td></tr><tr><td>Tensiometr edukacyjny Kr&amp;#252;ss</td><td>Kr&amp;#252;ss</td><td>N.A.</td><td></td></tr></tbody></table>

składy do liofilizacji bakterii i ich wpływ na przeżywalność komórek

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

Wodę komórkową można usunąć, aby odwracalnie dezaktywować mikroorganizmy w celu ułatwienia ich przechowywania. Jedną z takich metod usuwania wody jest liofilizacja, uważana za łagodną metodę odwadniania. Aby zwiększyć przeżywalność komórek podczas suszenia, są one często poddawane wcześniejszemu formułowaniu. Formuła tworzy matrycę, w której osadzone są komórki, co chroni je przed różnymi szkodliwymi stresami wywołanymi podczas mrożenia i suszenia. Przedstawiamy tutaj ogólną metodę oceny przeżywalności komórek po liofilizacji i ilustrujemy ją, porównując wyniki uzyskane dla czterech różnych formuł: disacharydu sacharozy, polimeru pochodnego sacharozy Ficoll PM400 oraz odpowiednich polisacharydów: hydroksyetylocelulozy (HEC) i hydroksypropylometylocelulozy (HPMC), na dwóch szczepach bakterii, P. putida KT2440 i A. chlorophenolicus A6. W niniejszej pracy ilustrujemy, jak przygotować formuły do liofilizacji oraz jak badać mechanizmy przeżywalności komórek po rehydratacji poprzez charakterystykę formuły z wykorzystaniem różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), pomiarów napięcia powierzchniowego, analizy rentgenowskiej i mikroskopii elektronowej oraz odnoszenie tych danych do wskaźników przeżywalności. Polimery wybrano tak, aby struktura monomerów poszczególnych polisacharydów w różnym stopniu przypominała sacharozę. Korzystając z tej konfiguracji metody, wykazaliśmy, że polimery mogą wspierać przeżywalność komórek równie skutecznie jak disacharydy, pod warunkiem kontrolowania określonych właściwości fizycznych formuły1.

Tabela 1 przedstawia dane dotyczące składu formulacji, zdarzeń termicznych zarejestrowanych metodą DSC podczas ogrzewania zamrożonych formulacji, struktury próbek suchych oraz napięcia powierzchniowego roztworów formulacji. Wartość Tg' sacharozy została określona na -40 °C 2, 3 i może być trudna do wykrycia przy stężeniach sacharozy poniżej 20% w/w. Zdarzenie termiczne przy -35 °C prawdopodobnie wiąże się z początkiem rozpuszczania lodu2. Struktura krystaliczna w...

Liofilizacja jest często łatwym i wygodnym sposobem pozyskiwania suchych produktów zawierających żywe komórki bakteryjne. Kluczowym problemem w tym procesie jest przeżywalność komórek. Opisujemy tutaj procedurę pozwalającą zbadać, w jaki sposób przeżywalność komórek podczas liofilizacji jest kształtowana przez właściwości zastosowanej formulacji.

Składy do liofilizacji bakterii i ich wpływ na przeżywalność komórek

Wodę komórkową można usunąć, aby odwracalnie dezaktywować mikroorganizmy w celu ułatwienia ich przechowywania. Jedną z takich metod usuwania wody jest liofilizacja, która jest...

Celem poniższego eksperymentu jest zaobserwowanie wpływu różnych składów formulacji do liofilizacji na przeżywalność komórek. W pierwszej kolejności przygotowywane są różne formulacje do liofilizacji hodowli komórkowych. Następnie każda z formulacji jest mieszana z hodowlą komórkową, poddawana liofilizacji, a później rehydratacji, po czym mierzy się wskaźniki przeżywalności.Wyniki wykazują różnice w przeżywalności, które można powiązać z określonymi właściwościami. Ta metoda może pomóc zrozumieć, które właściwości fizyczne i strukturalne formulacji są istotne dla przeżycia komórek podczas odwodnienia. Aby przygotować kulturę startową Pseudomonas putida, należy zaszczepić 100 ml bulionu sojowego tryptone, czyli TSB, kolonią komórek hodowanych na agarze uzupełnionym bulionem sojowym tryptone lub TSB; kulturę należy inkubować w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 130 RPM przez siedem godzin.Przenieś alikwot kultury do świeżej pożywki TSB i inkubuj przez 16 godzin. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 1 500 ×g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj osad komórkowy, resuspensując go w 150 mM chlorku sodu.Odwiruj komórki i resuspenduj je w medium do formulacji. W celu przygotowania roztworów formulacyjnych do liofilizacji komórek.Odważ odpowiednie składniki matrycy i rozpuść je w wodzie, aby uzyskać warunki izotoniczne. Dostosuj roztwór za pomocą substancji pomocniczej, chlorku sodu lub innych substancji rozpuszczalnych kompatybilnych z komórkami. Aby jednorodnie resuspenderć komórki w roztworze o niskiej lepkości, poddaj roztwory o wysokiej lepkości mieszaniu w wortexie.Dodaj mieszadło magnetyczne i wymieszaj zawiesinę. Następnie podziel formulacje do wcześniej zważonych fiolek do liofilizatora i zważ fiolki. Pobierz 100 µL z każdej próbki i wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne, wysiej odpowiednie rozcieńczenia i inkubuj je w temperaturze pokojowej; jeśli fiolki zostaną zamknięte wewnątrz liofilizatora, załóż gumowy korek na każdą fiolkę z wysianymi komórkami.Policz komórki w każdej formulacji. Użyj metody pierścienia Du Noüy do pomiaru napięcia powierzchniowego poddanych suszeniu mieszanin bakteryjnych. Oczyść pierścień platynowy, umieszczając go w bezbarwnym płomieniu, aż stanie się czerwony.Używając acetonu i tkaniny niepozostawiającej włókien, opłucz i przetrzyj naczynie pomiarowe, a następnie wypal jego wnętrze przy użyciu płomienia. Napełnij naczynie roztworem i odczekaj, aż powierzchnia się ustabilizuje, w przypadku roztworów wymagających czasu na osiągnięcie stanu równowagi. Zastosowana tutaj konfiguracja dostarczy danych jakościowych dla formulacji o wysokiej lepkości.Należy użyć roztworu o niższym stężeniu do pomiaru napięcia powierzchniowego i ekstrapolacji, aby dostosować warunki liofilizacji do właściwości fizycznych formulacji. Najważniejszym parametrem jest temperatura przejścia szklistego lub TG formulacji, oznaczana jako TG prim dla próbki mrożonej w celu zagęszczenia, co wskazuje na obecność wody. Aby określić zachowanie formulacji podczas zamrażania, należy umieścić od 5 do 10 mg próbki w aluminiowym tyglu do różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) z pokrywką.Przygotuj pustą panewkę jako referencję. Ustaw program skanowania temperatury DSC tak, aby odwzorowywał etap zamrażania w programie liofilizacji. Jest to konieczne, ponieważ kinetyka chłodzenia może wpływać na TG prime formulacji niewysuszonych przed rozpoczęciem skanowania grzania.Obniż temperaturę znacznie poniżej oczekiwanego tg. Dla badanych formulacji dobierz odpowiednią szybkość grzania. Odnotowany sygnał przepływu ciepła wyrażony jest w watach i będzie zależny od szybkości grzania.Wyższa szybkość nagrzewania zapewni silniejszy sygnał TG Prime; należy ustawić zakres temperatur tak, aby obejmował zarówno TG prime, jak i topnienie formulacji. Po określeniu charakterystyki zamrażania należy dostosować parametry procesu liofilizacji w taki sposób, aby temperatura próbki była zawsze niższa niż TG próbki, a ciśnienie w komorze umożliwiało szybką sublimację lodu oraz pozostałej wody w formulacji. W celu zabezpieczenia produktów suchych po liofilizacji.Kontroluj atmosferę próbek poprzez zapieczętowanie ich w liofilizatorze przed zwolnieniem próżni na koniec cyklu liofilizacji. Alternatywnie fiolki można napełnić wybraną atmosferą. Ważne jest, aby nie wystawiać próbek na działanie warunków otoczenia, ponieważ jakakolwiek wilgoć lub tlen obecny w atmosferze przechowywania wpłynie na przeżywalność komórek.Na koniec zważ probówki, aby przeanalizować próbki za pomocą promieniowania rentgenowskiego. Nanieś niewielką ilość matrycy bakteryjnej na uchwyt do próbek, a następnie zamontuj uchwyt w refraktometrze rentgenowskim. Użyj oprogramowania kompatybilnego z urządzeniem rentgenowskim, aby przeanalizować każdą fazę krystaliczną obecną w próbce.Aby przeanalizować macierz bakteryjną za pomocą mikroskopii elektronowej, nanieś niewielką ilość materiału na taśmę węglową przymocowaną do stubu do skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Umieść uchwyt SEM w urządzeniu do napylania i pokryj próbkę złotem i palladem lub platyną w celu obrazowania. Włóż uchwyt SEM do komory i wybierz odpowiednie parametry obrazowania.Na przykład w tym urządzeniu stosujemy napięcie przyspieszające wynoszące 5 kV, rozmiar wiązki równy 3, odległość roboczą 5 mm oraz detektor elektronów wtórnych. W tej tabeli wymieniono dane dla różnych formulacji, w tym zdarzenia termiczne zarejestrowane za pomocą DSC podczas ogrzewania zamrożonych formulacji, strukturę próbek suchych oraz napięcie powierzchniowe roztworów formulacji. TG prime sacharozy wynosi -40 °C, co może utrudniać wykrywanie stężeń sacharozy poniżej 20% w/w.Zjawisko termiczne przy minus 35 stopniach Celsjusza jest prawdopodobnie związane z początkiem rozpuszczania lodu przedstawionym tutaj. Dane dotyczące przeżywalności dla gram-ujemnych P putter oraz gram-dodatnich, a CHLOROPHYL cus sformułowanych w różnych preparatach na bazie sacharydów. Należy zauważyć, że trend dotyczący stopnia wspierania przeżywalności komórek przez dany preparat jest podobny dla obu gatunków bakterii.Wykres ten ilustruje korelację między przeżywalnością po liofilizacji a napięciem powierzchniowym formulacji, co wskazuje, że wyższe napięcie powierzchniowe skutkuje wyższym wskaźnikiem przeżywalności. Przedstawione tutaj obrazy SEM reprezentują suche formulacje czterech różnych polimerów, których macierze mają wygląd kruchego papieru lub połączonych gładkich arkuszy z pofalowanymi wzorami zatopionych bakterii w przypadku fi, ccal i sacharozy. Arkusze mają grubość około 1 µm i szerokość od 10 do 20 µm, przy czym fi ccal posiada gładszą powierzchnię, a HPMC i HEC tworzą znacznie cieńsze arkusze.Bakterie są łatwiejsze do zauważenia, prawdopodobnie dlatego, że stosunek polimeru do bakterii jest niższy w tych formulacjach opartych na celulozie. Ponadto w przypadku HEC i HPMC zaobserwowano kryształy soli, przy czym w przypadku tego drugiego na powierzchni arkuszy polimerowych widoczna była większa ilość osadów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, w jaki sposób przeżywalność komórek zależy od właściwości formulacji przy zastosowaniu przedstawionych tutaj technik.

formulations-for-freeze-drying-bacteria-their-influence-on-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowania do liofilizacji bakterii i ich wpływ na przeżywalność komórek

Hodowlane komórki ssaków są szeroko wykorzystywane w badaniach z zakresu biologii komórki. Niniejszy film opisuje podstawowe umiejętności niezbędne do zamrażania i przechowywania komórek oraz sposób regeneracji zamrożonych zapasów.

Mrożenie, rozmrażanie i pakowanie komórek do transportu

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Źródło: Lea-Smith, D. J., i in. Generowanie mutantów oznaczonych i bezznacznikowych u modelowych gatunków cyjanobakterii. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje krioprezerwację szczepów cyjanobakterii poprzez łączenie skoncentrowanych zawiesin komórkowych z glicerolem lub DMSO i przechowywanie ich w niskich temperaturach, co umożliwia długoterminowe utrzymanie żywotnych hodowli do fotosyntezy i badań genetycznych.

Długoterminowa krioprezerwacja szczepów cyjanobakterii z użyciem glicerolu lub dimetylosulfoksydu

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Opisano protokół określania gęstości fazy szklistej mikro- do pikolitrowych kropli mieszanin wodnych w temperaturach kriogenicznych.

Pomiar gęstości szkieł wodnych w temperaturach kriogenicznych

Ten protokół ilustruje ważne kolejne kroki wymagane do oceny znaczenia monitorowania parametrów żywotności i procesów naprawy DNA w ożywianiu zarodników Bacillus subtilis po leczeniu osoczem niskociśnieniowym poprzez śledzenie znakowanych fluorescencyjnie białek naprawczych DNA za pomocą czasowo-rozdzielczej mikroskopii konfokalnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Badanie szkodliwego wpływu niskociśnieniowej sterylizacji plazmowej na przeżywalność zarodników Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii żywych komórek

Opisujemy niezawodną metodę przygotowania ekstraktów z całych komórek z drożdży lub innych komórek za pomocą kriogenicznego młyna zamrażającego, który minimalizuje degradację i denaturację białek. Ekstrakty komórkowe nadają się do oczyszczania funkcjonalnych kompleksów białkowych, analiz proteomicznych, badań koimmunoprecypitacji i wykrywania labilnych modyfikacji białek.

Przygotowanie ekstraktów komórkowych metodą kriomielenia w automatycznym młynie zamrażarkowym

Tutaj pokazujemy, jak używać urządzenia do zamrażania kanapek do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazujemy również, jak przygotować próbki do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu.

Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej

Demonstrujemy metodę izolowania trudnych do wyhodowania członków nowego typu bakterii, Saccharibacteria, poprzez filtrowanie płytki nazębnej i wspólną hodowlę z bakteriami gospodarza.

Ustanawianie stabilnych kultur binarnych symbiotycznych bakterii sacharycznych z jamy ustnej

Phormidium lacuna to nitkowata cyjanobakteria, która została wyizolowana z morskich basenów skalnych. W artykule opisano izolację włókien ze źródeł naturalnych, ekstrakcję DNA, sekwencjonowanie genomu, naturalną transformację, ekspresję sfGFP, kriokonserwację i metody ruchliwości.

Naturalna przemiana, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy związane z produkcją i charakterystyką fizykochemiczną suszonego rozpyłowo produktu probiotycznego.

Opracowanie procesu suszenia rozpyłowego bakterii probiotycznych i ocena jakości produktu

Poznaj wpływ różnych preparatów do liofilizacji na przeżywalność komórek bakteryjnych. Ta metoda pozwala zrozumieć kluczowe właściwości fizyczne i strukturalne dla zachowania żywotności mikroorganizmów.

Składy do liofilizacji bakterii i ich wpływ na przeżywalność komórek

Przeglądaj więcej filmów