Składy do liofilizacji bakterii i ich wpływ na przeżywalność komórek

Celem poniższego eksperymentu jest zaobserwowanie wpływu różnych składów formulacji do liofilizacji na przeżywalność komórek. W pierwszej kolejności przygotowywane są różne formulacje do liofilizacji hodowli komórkowych. Następnie każda z formulacji jest mieszana z hodowlą komórkową, poddawana liofilizacji, a później rehydratacji, po czym mierzy się wskaźniki przeżywalności.

Wyniki wykazują różnice w przeżywalności, które można powiązać z określonymi właściwościami. Ta metoda może pomóc zrozumieć, które właściwości fizyczne i strukturalne formulacji są istotne dla przeżycia komórek podczas odwodnienia. Aby przygotować kulturę startową Pseudomonas putida, należy zaszczepić 100 ml bulionu sojowego tryptone, czyli TSB, kolonią komórek hodowanych na agarze uzupełnionym bulionem sojowym tryptone lub TSB; kulturę należy inkubować w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 130 RPM przez siedem godzin.

Przenieś alikwot kultury do świeżej pożywki TSB i inkubuj przez 16 godzin. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 1 500 ×g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj osad komórkowy, resuspensując go w 150 mM chlorku sodu.

Odwiruj komórki i resuspenduj je w medium do formulacji. W celu przygotowania roztworów formulacyjnych do liofilizacji komórek.

Odważ odpowiednie składniki matrycy i rozpuść je w wodzie, aby uzyskać warunki izotoniczne. Dostosuj roztwór za pomocą substancji pomocniczej, chlorku sodu lub innych substancji rozpuszczalnych kompatybilnych z komórkami. Aby jednorodnie resuspenderć komórki w roztworze o niskiej lepkości, poddaj roztwory o wysokiej lepkości mieszaniu w wortexie.

Dodaj mieszadło magnetyczne i wymieszaj zawiesinę. Następnie podziel formulacje do wcześniej zważonych fiolek do liofilizatora i zważ fiolki. Pobierz 100 µL z każdej próbki i wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne, wysiej odpowiednie rozcieńczenia i inkubuj je w temperaturze pokojowej; jeśli fiolki zostaną zamknięte wewnątrz liofilizatora, załóż gumowy korek na każdą fiolkę z wysianymi komórkami.

Policz komórki w każdej formulacji. Użyj metody pierścienia Du Noüy do pomiaru napięcia powierzchniowego poddanych suszeniu mieszanin bakteryjnych. Oczyść pierścień platynowy, umieszczając go w bezbarwnym płomieniu, aż stanie się czerwony.

Używając acetonu i tkaniny niepozostawiającej włókien, opłucz i przetrzyj naczynie pomiarowe, a następnie wypal jego wnętrze przy użyciu płomienia. Napełnij naczynie roztworem i odczekaj, aż powierzchnia się ustabilizuje, w przypadku roztworów wymagających czasu na osiągnięcie stanu równowagi. Zastosowana tutaj konfiguracja dostarczy danych jakościowych dla formulacji o wysokiej lepkości.

Należy użyć roztworu o niższym stężeniu do pomiaru napięcia powierzchniowego i ekstrapolacji, aby dostosować warunki liofilizacji do właściwości fizycznych formulacji. Najważniejszym parametrem jest temperatura przejścia szklistego lub TG formulacji, oznaczana jako TG prim dla próbki mrożonej w celu zagęszczenia, co wskazuje na obecność wody. Aby określić zachowanie formulacji podczas zamrażania, należy umieścić od 5 do 10 mg próbki w aluminiowym tyglu do różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) z pokrywką.

Przygotuj pustą panewkę jako referencję. Ustaw program skanowania temperatury DSC tak, aby odwzorowywał etap zamrażania w programie liofilizacji. Jest to konieczne, ponieważ kinetyka chłodzenia może wpływać na TG prime formulacji niewysuszonych przed rozpoczęciem skanowania grzania.

Obniż temperaturę znacznie poniżej oczekiwanego tg. Dla badanych formulacji dobierz odpowiednią szybkość grzania. Odnotowany sygnał przepływu ciepła wyrażony jest w watach i będzie zależny od szybkości grzania.

Wyższa szybkość nagrzewania zapewni silniejszy sygnał TG Prime; należy ustawić zakres temperatur tak, aby obejmował zarówno TG prime, jak i topnienie formulacji. Po określeniu charakterystyki zamrażania należy dostosować parametry procesu liofilizacji w taki sposób, aby temperatura próbki była zawsze niższa niż TG próbki, a ciśnienie w komorze umożliwiało szybką sublimację lodu oraz pozostałej wody w formulacji. W celu zabezpieczenia produktów suchych po liofilizacji.

Kontroluj atmosferę próbek poprzez zapieczętowanie ich w liofilizatorze przed zwolnieniem próżni na koniec cyklu liofilizacji. Alternatywnie fiolki można napełnić wybraną atmosferą. Ważne jest, aby nie wystawiać próbek na działanie warunków otoczenia, ponieważ jakakolwiek wilgoć lub tlen obecny w atmosferze przechowywania wpłynie na przeżywalność komórek.

Na koniec zważ probówki, aby przeanalizować próbki za pomocą promieniowania rentgenowskiego. Nanieś niewielką ilość matrycy bakteryjnej na uchwyt do próbek, a następnie zamontuj uchwyt w refraktometrze rentgenowskim. Użyj oprogramowania kompatybilnego z urządzeniem rentgenowskim, aby przeanalizować każdą fazę krystaliczną obecną w próbce.

Aby przeanalizować macierz bakteryjną za pomocą mikroskopii elektronowej, nanieś niewielką ilość materiału na taśmę węglową przymocowaną do stubu do skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Umieść uchwyt SEM w urządzeniu do napylania i pokryj próbkę złotem i palladem lub platyną w celu obrazowania. Włóż uchwyt SEM do komory i wybierz odpowiednie parametry obrazowania.

Na przykład w tym urządzeniu stosujemy napięcie przyspieszające wynoszące 5 kV, rozmiar wiązki równy 3, odległość roboczą 5 mm oraz detektor elektronów wtórnych. W tej tabeli wymieniono dane dla różnych formulacji, w tym zdarzenia termiczne zarejestrowane za pomocą DSC podczas ogrzewania zamrożonych formulacji, strukturę próbek suchych oraz napięcie powierzchniowe roztworów formulacji. TG prime sacharozy wynosi -40 °C, co może utrudniać wykrywanie stężeń sacharozy poniżej 20% w/w.

Zjawisko termiczne przy minus 35 stopniach Celsjusza jest prawdopodobnie związane z początkiem rozpuszczania lodu przedstawionym tutaj. Dane dotyczące przeżywalności dla gram-ujemnych P putter oraz gram-dodatnich, a CHLOROPHYL cus sformułowanych w różnych preparatach na bazie sacharydów. Należy zauważyć, że trend dotyczący stopnia wspierania przeżywalności komórek przez dany preparat jest podobny dla obu gatunków bakterii.

Wykres ten ilustruje korelację między przeżywalnością po liofilizacji a napięciem powierzchniowym formulacji, co wskazuje, że wyższe napięcie powierzchniowe skutkuje wyższym wskaźnikiem przeżywalności. Przedstawione tutaj obrazy SEM reprezentują suche formulacje czterech różnych polimerów, których macierze mają wygląd kruchego papieru lub połączonych gładkich arkuszy z pofalowanymi wzorami zatopionych bakterii w przypadku fi, ccal i sacharozy. Arkusze mają grubość około 1 µm i szerokość od 10 do 20 µm, przy czym fi ccal posiada gładszą powierzchnię, a HPMC i HEC tworzą znacznie cieńsze arkusze.

Bakterie są łatwiejsze do zauważenia, prawdopodobnie dlatego, że stosunek polimeru do bakterii jest niższy w tych formulacjach opartych na celulozie. Ponadto w przypadku HEC i HPMC zaobserwowano kryształy soli, przy czym w przypadku tego drugiego na powierzchni arkuszy polimerowych widoczna była większa ilość osadów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, w jaki sposób przeżywalność komórek zależy od właściwości formulacji przy zastosowaniu przedstawionych tutaj technik.