Name: Obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach przodomózgowia dorosłej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj metodę obrazowania poklatkowego migracji neuroblastów w ostrych wycinkach przodomózgowia dorosłej myszy. Technika ta pozwala analizować dynamikę migracji komórek nerwowych i mechanizmy rozwoju neuronalnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez grant Canadian Institutes of Health Research (CIHR) przyznany A.S. J.K otrzymał częściowe wsparcie w ramach stypendium Université Laval. A.S. jest laureatem Canada Research Chair w dziedzinie postnatalnej neurogenezy.

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Kaneko, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+clear+the+path+of+astrocytic+processes+for+their+rapid+migration+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain.</a> Neuron. 67, 213-223 (2010).</li>
<li>Lois, C., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+neuronal+migration+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain.</a> Science. 264, 1145-1148 (1994).</li>
<li>Snapyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
<li>Lledo, P. M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+new+neurons+into+the+adult+olfactory+bulb%3A+joining+the+network%2C+life-death+decisions%2C+and+the+effects+of+sensory+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience.</a> Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).</li>
<li>Bolteus, A. J., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+release+and+uptake+regulate+neuronal+precursor+migration+in+the+postnatal+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone.</a> J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).</li>
<li>Martini, F. J., Valdeolmillos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+contraction+at+the+cell+rear+drives+nuclear+translocation+in+migrating+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons.</a> J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).</li>
<li>Murase, S., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li>
<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).</li>
<li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li>
<li>Bovetti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+scaffold+for+neuroblast+migration+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Nam, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+subventricular+zone+stem+and+progenitor+cells+are+sessile+and+epidermal+growth+factor+receptor+negatively+regulates+neuroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration.</a> PLoS One. 4, e8122(2009).</li>
<li>Bortone, D., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCC2+expression+promotes+the+termination+of+cortical+interneuron+migration+in+a+voltage-sensitive+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner.</a> Neuron. 62, 53-71 (2009).</li>
<li>Comte, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Prawidłowe kierowanie prekursorami neuronów do odpowiednich obszarów mózgu jest fundamentalnym procesem leżącym u podstaw właściwego montażu i funkcjonowania obwodów neuronalnych. Przeważająca większość komórek migruje podczas rozwoju embrionalnego, a w mózgu pozajęczym przemieszczanie neuronów wciąż zachodzi tylko w kilku obszarach, takich jak OB, zakręt zębaty i móżdżek. Mechanizmy koordynujące migrację komórek w mózgu pozajęczym pozostają jednak słabo poznane. Wiedza na temat mechanizmów i szlaków molekularnych zaanga...

<table><tbody><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza (ACSF)</td><td>EMD</td><td>DX0145-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCI</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCI</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCI&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;x6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;xH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>EMD</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCI&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;x2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran TexasRed</td><td>Invitrogen</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran CascadeBlue</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza (roztwór 40X)</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma</td><td>D-5025</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>EMD</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina/Ksylazyna</td><td>CDMV</td><td>5230</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.553.205</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane (do wtryskiwania stereotaktycznego)</td><td>WPI</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Olejna parafina</td><td>EMD</td><td>PX0045-3</td><td></td></tr><tr><td>Proviodine</td><td>Rougier</td><td>65655-1370</td><td></td></tr><tr><td>Szew</td><td>Stoelting</td><td>50487</td><td></td></tr><tr><td>Anafen</td><td>CDMV</td><td>11508</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 20 cc</td><td>VWR</td><td>SS-20L2</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-094</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Laboratoire Mat</td><td>AP-0108</td><td></td></tr><tr><td>Klej</td><td>Permabond</td><td>910</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Linde</td><td>24068835</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>WPI</td><td>501901</td><td></td></tr><tr><td>Siatka nylonowa</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5702 000.019</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica pipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Iniektor nanolitrowy</td><td>WPI</td><td>B203MC4</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do wtryskiwania stereotaktycznego</td><td>WPI</td><td>502900</td><td></td></tr><tr><td>System mikrowiertarki</td><td>WPI</td><td>501819</td><td></td></tr><tr><td>Wibrotom</td><td>Thermo Scientific</td><td>920110</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop szerokopolowy</td><td>Olympus</td><td>BX61WIF</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Photometrics</td><td>CS-HQ2-D</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-cicha komora obrazowania</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-1487</td><td></td></tr><tr><td>Platforma grzewcza PH-1 serii 20</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-0284</td><td></td></tr><tr><td>System grzewczy</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw imersyjny wodny 40X</td><td>Olympus</td><td>1-UM587</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw imersyjny wodny 10X</td><td>Olympus</td><td>1-UM583</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4</td><td>Sutter Instruments</td><td>DG-4/OF</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>40000</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Imaris</td><td>Bitplane</td><td>BPI-IM70-F1</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Istnieje obszerny zestaw dowodów wskazujących na to, że nowe funkcjonalne neurony są stale generowane z endogennej puli komórek macierzystych neuronów w ograniczonych obszarach dorosłego mózgu ssaków. Nowo powstałe neuroblasty z strefy podkomorowej (SVZ) migrują wzdłuż rostralnego prądu migracyjnego (RMS) do miejsca docelowego w opłocie węchowym (OB)1. W RMS neuroblasty migrują stycznie w łańcuchach otoczonych wypustkami astrocytów2,3, wykorzystując naczynia krwionośne jako wsparcie strukturalne oraz źródło czynników molekularnych niezbędnych do migracji4,5. W OB neuroblasty oddzielają się od łańcuchów i migrują promieniście do różnych warstw opłotu, gdzie różnicują się w interneurony i integrują z istniejącą siecią1, 6.
W niniejszym manuskrypcie opisujemy procedurę monitorowania migracji komórek w ostrych skrawkach mózgu gryzoni. Zastosowanie ostrych skrawków umożliwia ocenę migracji komórek w mikrośrodowisku ściśle przypominającym warunki in vivo oraz w regionach mózgu, które są trudnodostępne dla obrazowania in vivo. Ponadto pozwala to uniknąć długotrwałej hodowli, jak ma to miejsce w przypadku hodowli organotypowych i komórkowych, co mogłoby ostatecznie zmienić właściwości migracyjne komórek. Prekursory neuronalne w ostrych skrawkach można wizualizować za pomocą optyki DIC lub białek fluorescencyjnych. Wirusowe znakowanie prekursorów neuronalnych w SVZ, przeszczepianie neuroblastów z myszy reporterowych do SVZ myszy typu dzikiego oraz wykorzystanie myszy transgenicznych wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego w neuroblastach to odpowiednie metody wizualizacji neuroblastów i śledzenia ich migracji. Ta ostatnia metoda nie pozwala jednak na śledzenie pojedynczych komórek przez długi czas ze względu na wysoką gęstość znakowanych komórek. Użyliśmy szerokopolowego fluorescencyjnego mikroskopu pionowego wyposażonego w kamerę CCD, aby uzyskać stosunkowo krótki interwał akwizycji (jeden obraz co 15 lub 30 sec), co pozwoliło na wiarygodną identyfikację faz stacjonarnych i migracyjnych. Precyzyjne określenie czasu trwania faz stacjonarnych i migracyjnych jest kluczowe dla jednoznacznej interpretacji wyników. Przeprowadziliśmy również wielokrotne akwizycje w krokach z, aby monitorować migrację neuroblastów w 3D. Szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne jest szeroko stosowane do wizualizacji migracji neuronalnej7-10. Opisujemy tutaj szczegółowy protokół znakowania neuroblastów, przeprowadzania wideo-obrazowania migracji neuroblastów w czasie rzeczywistym w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy oraz analizy migracji komórek. Choć opisany protokół ilustruje migrację neuroblastów w dorosłym RMS, może on być również wykorzystany do śledzenia migracji komórek w mózgach embrionalnych i we wczesnym okresie postnatalnym.

Opisujemy protokół obrazowania wideo w czasie rzeczywistym migracji neuronów w przedmózgowiu myszy. Migrację prekursorów neuronalnych oznakowanych wirusowo lub przeszczepionych rejestrowano w ostrych żywych skrawkach, wykorzystując szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne z relatywnie krótkim odstępem między akwizycjami, aby zbadać różne fazy migracji komórek, w tym czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz prędkość migracji.

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

Istnieje obszerny zbiór dowodów wskazujących na to, że nowe funkcjonalne neurony są stale generowane z endogennej puli komórek macierzystych układu nerwowego ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie migracji neuroblastów w ostrych skrawkach mózgu dorosłej myszy. Zostaje to osiągnięte poprzez uprzednie znakowanie prekursorów neuronalnych w strefie podkomorowej dorosłego osobnika, a następnie, od pięciu do ośmiu dni po znakowaniu neuroblastów, przygotowanie ostrych skrawków mózgu myszy. W kolejnym kroku przeprowadzane jest obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów.W ostateczności mikroskopia szerokopolowa w czasie rzeczywistym jest wykorzystywana do obrazowania dynamiki migracji neuroblastów w skrawkach ostrych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju neuronów poprzez badanie roli różnych sygnałów molekularnych i mechanizmów komórkowych związanych z migracją komórek. Obecnie metoda ta pozwala na zgłębienie procesów fizjologicznych regulujących migrację neuronalną w dorosłym mózgu, ale może być również stosowana w innych układach, takich jak badanie migracji neuronalnej w mózgu niedokrwionym oraz podczas rozwoju embrionalnego.Zacznij procedurę od przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (A CSF) na bazie sacharozy do wycinania plastrów oraz A CSF na bazie chlorku sodu o temperaturze 32°C do utrzymania plastrów do czasu obrazowania, a następnie natlenij roztwory poprzez ciągłe bąbelkowanie mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Następnie znieczul mysz z fluorescencyjnie znakowanym neuroblastem, podając domięśniowo ketaminę i ksylazynę. Po tym szybko przygotuj lodowaty roztwór do wycinania o żelowatej konsystencji, wykorzystując ciekły azot.Następnie, za pomocą strzykawki 20 cc, pobierz od 15 do 20 mililitrów lodowatego roztworu do krojenia i wykonaj perfuzję myszy drogą wewnątrzsercową. Jeśli konieczne jest oznakowanie naczyń krwionośnych zamiast perfuzji roztworem do krojenia, wstrzyknij transkardialnie do lewej komory serca 200 mikrolitrów dekstranu Texas Red w stężeniu 10 mg/mL i odczekaj dwie do trzech minut. Po zakończeniu perfuzji transkardialnej szybko zdekapituj mysz, zanurz głowę w lodowatym roztworze do krojenia i przenieś ją na wibrotom. Przetnij czaszkę nożyczkami wzdłuż szwu strzałkowego od móżdżku do opłazki węchowej.Następnie, delikatnie usuń płaty czaszkowe za pomocą pęsety. Po tym wycinij część podstawna mózgu, używając skalpela. Następnie wykonaj dwa cięcia strzałkowe w najbardziej bocznej części każdej półkuli i przetnij mózg wzdłuż szczeliny międzypółkulowej. Następnie delikatnie wyjmij mózg za pomocą szpatułki i umieść go w schłodzonym roztworze do cięcia.Umieścić obie półkule oddzielnie na bloku z 4% agaru, tak aby strona grzbietowa dotykała agaru. Następnie przykleić blok, stroną bocznego cięcia obu półkul, do platformy wibratora Vibram, tak aby strona przyśrodkowa była skierowana do góry. Po tym czasie umieścić platformę w komorze Vibram.Napełnić ją roztworem do cięcia. Następnie przez cały czas przygotowywania plastrów utrzymywać natlenowanie roztworu poprzez przerywanie go mieszanką 95% oxygen, 5% carbon dioxide. Teraz przygotować przekroje o grubości 250 micron za pomocą wibratomu.W celu uzyskania wysokiej jakości przekrojów należy zastosować niską prędkość cięcia oraz wysoką częstotliwość wibracji ostrza. Natychmiast po zwolnieniu plastra z ostrza należy go delikatnie wyjąć z roztworu do cięcia i umieścić w komorze inkubacyjnej wypełnionej natlenionym A CSF, utrzymywanym w temperaturze 32 stopni Celsjusza w kąpieli wodnej. W tej procedurze plaster należy ostrożnie umieścić w komorze obrazowej mikroskopu, aby uniknąć przesuwania się preparatu podczas obrazowania.Ustabilizuj preparat, ostrożnie kładąc na nim siatkę nylonową. Upewnij się, że przez plaster stale przepływa A CSF. Następnie użyj obiektywu 10x, aby zlokalizować interesujący obszar.Otwórz oprogramowanie Metamorph i upewnij się, że nylonowa siatka nie zasłania pola obrazowania. Następnie użyj obiektywu 40 x i ustaw ostrość. Upewnij się, że między obiektywem a przekrojem znajduje się wystarczająca ilość roztworu.Używając oprogramowania Metamorph, ustaw parametry akwizycji time-lapse, takie jak czas trwania wzbudzenia, liczbę płaszczyzn Z, odległość między poszczególnymi sekcjami Z, interwał czasowy oraz czas trwania rejestracji. Następnie rozpocznij akwizycję time-lapse. Dane są automatycznie zapisywane przez program Metamorph jako pliki TIFF, przy czym każdy plik odpowiada jednemu punktowi czasowemu zarejestrowanego filmu time-lapse; otwórz film w programie MRS.Załaduj pozyskane obrazy, przeciągając i upuszczając obraz z pierwszego punktu czasowego filmu na ikonę programu. Po załadowaniu filmu dostosuj jasność i kontrast sygnału w oknie regulacji wyświetlania. W ustawieniach właściwości obrazu zdefiniuj parametry pozyskanego filmu, takie jak rozmiar woksela i odstęp czasu, a następnie ustaw okna dla równoodległych punktów czasowych.Po określeniu rozmiaru woksela możliwe jest wyświetlenie klatki w 3D, a także czasu i skali filmu w celu automatycznego śledzenia zarejestrowanych komórek. W oknie surpass, korzystając z funkcji spotów, utwórz punkt dla każdej komórki w polu widzenia, a następnie zmierz średnicę śledzonej komórki w oknie przekroju. Ustaw parametry śledzenia i zatwierdź.Sprawdź niezawodność wykrytych obiektów w czasie. Jeśli wszystkie migrujące komórki nie zostaną wykryte automatycznie, zmień próg detekcji i upewnij się, że wszystkie komórki zostały zaznaczone punktami we wszystkich punktach czasowych. Należy określić maksymalną odległość oraz maksymalną wielkość przerwy między dwoma punktami reprezentującymi sąsiednie punkty czasowe tego samego śladu, aby program mógł połączyć te punkty czasowe.Po utworzeniu ścieżek możliwe jest ich przefiltrowanie i usunięcie nieistotnych torów poprzez ich proste skasowanie. Ścieżki można korygować, łącząc i rozłączając różne tory oraz różne punkty czasowe tej samej ścieżki. Po wprowadzeniu wszystkich poprawek należy dokonać końcowego przeglądu ścieżek i wyeksportować dane do pliku Excel, w tym przemieszczenie komórek w każdym punkcie czasowym, długość ścieżki, długość przemieszczenia oraz czas trwania ścieżki.Niniejszy film przedstawia obrazowanie poklatkowe migracji zielonego neuroblasta wzdłuż naczyń krwionośnych znakowanych dekstranem Texas Red. Należy zauważyć, że migrujący neuroblast wykazuje zachowanie saltatoryczne, w którym fazy migracji są przerywane okresami stacjonarnymi. Film ten ukazuje również śledzenie migracji neuroblasta za pomocą oprogramowania IMAS.Sfery i linie reprezentują odpowiednio ciała komórek oraz ścieżki migracji poszczególnych komórek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uzyskać wysokiej jakości świeże skrawki przedmózgowia dorosłej myszy. Dodatkowo skrawki powinny zostać dobrze ustabilizowane w komorze obrazowania poprzez staranne umieszczenie siatki nylonowej, aby zapobiec przesuwaniu się skrawka podczas obrazowania.Wszelkie zmiany w szybkości perfuzji płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), nieregularna perfuzja lub drastyczne wahania temperatury mogą powodować dryft i zmiany w płaszczyźnie ogniskowej podczas obrazowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak rejestrować i analizować migrację neuroblastów w ostrych skrawkach tkanek dorosłych osobników. Zalecamy stosowanie krótkich odstępów czasu w przedziale od 15 do 30 sekund, aby wiarygodnie zidentyfikować początek i koniec fazy migracyjnej oraz stacjonarnej.

time-lapse-imaging-neuroblast-migration-acute-slices-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przestrzenne i czasowe obrazy migracji neuroblastów w ostrych przekrojach przedniego mózgu dorosłych myszy

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Źródło: Wiegreffe, C., et. al.,  Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu {{}}W macicy elektroporacji. J. Vis. exp.{{TAG_ 44}} (2017) Ten film przedstawia poklatkową mikroskopię konfokalną w celu obserwacji radialnej migracji neuronów korowych ze strefy podkomorowej do płytki korowej za pomocą promieniowych rusztowań glejowych w transdukowanych wycinkach mózgu myszy embrionalnych.

Obrazowanie poklatkowe migracji radialnej neuronów korowych w transdukowanych wycinkach mózgu embrionalnego myszy

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) stało się coraz popularniejszym narzędziem do badania fenotypu myszy z modyfikacjami genetycznymi. Niniejszy artykuł przedstawia metody niezbędne do przeprowadzenia wysokoprzepustowego fenotypowania myszy z modyfikacjami genetycznymi przy użyciu MRI dla wielu osobników jednocześnie.<br...

Neuroanatomiczny obrazowanie magnetycznemu rezonansem dla wielu myszy

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Opisano metodę wprowadzania barwników wskaźnikowych wapnia do komórek strefy podkomorowej (SVZ) w celu rejestracji aktywności wapniowej. Potnatalna SVZ zawiera gęsto upakowane komórki, w tym komórki progenitorowe neuronów oraz neuroblasty. Zamiast ładowania metodą kąpielową, barwnik wstrzykiwano pod ciśnieniem bezpośrednio do tkanki, co pozwoliło na lepszą dyfuzję barwnika.

Przygotowanie ostrych skrawków strefy podkomorowej do obrazowania wapnia

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Poznaj metodę obrazowania poklatkowego migracji neuroblastów w ostrych wycinkach przodomózgowia dorosłej myszy. Technika ta pozwala analizować dynamikę migracji komórek nerwowych i mechanizmy rozwoju neuronalnego.

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

Przeglądaj więcej filmów