Name: Przygotowanie wycinków ostrej strefy podkomorowej do obrazowania wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-19T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Naucz się obrazowania aktywności wapniowej w komórkach strefy podkomorowej myszy poporodowej przy użyciu wskaźników wapniowych i mikroskopii konfokalnej. Ta technika ujawnia wzorce komunikacji międzykomórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantów NIH (DC007681, A.B.), grantu CT Stem Cell (A.B.), fundacji Pardee (A.B.), przeddoktorskich stypendiów NRSA (Predoctoral Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards) (S.Z.Y.) oraz stypendium badawczego dla doktorantów NSF (B.L.). Dziękujemy członkom laboratorium Bordey za pomocne uwagi do rękopisu. Niniejszy materiał opiera się na pracy częściowo wspieranej przez stan Connecticut w ramach programu grantowego Connecticut Stem Cell Research Grants Program. Jego treść jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie musi odzwierciedlać oficjalnych stanowisk stanu Connecticut, Departamentu Zdrowia Publicznego stanu Connecticut ani firmy CT Innovations, Incorporated.

1. Przygotowanie roztworów, sekcja i mikrotom wibracyjny
<ol>
	<li>Roztwory należy przygotować przy odpowiedniej osmoliarności i pH (Tabela 1). W porównaniu do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), roztwór do sekcji przygotowuje się z niższymi stężeniami sodu i wapnia oraz wyższym stężeniem magnezu. Ma to na celu zminimalizowanie efektów ekscytotoksyczności podczas krojenia.</li>
	<li>Zarówno roztwór do sekcji, jak i ACSF muszą zostać nasycone mieszaniną 95% O2/5% CO2 poprzez napowietrzanie przez co najmniej 10 min w celu osiągnięcia pożądanego pH 7,3.</li>
	<li>W tacy należy przygotować kąpiel lodową. Płytkę do sekcji należy umieścić w kąpieli lodowej i wypełnić roztworem do sekcji. Następnie należy napowietrzyć zawartość płytki.</li>
	<li>Wibratom należy przygotować, tworząc kąpiel lodową. Naczynie do sekcjonowania należy umieścić w kąpieli lodowej, wypełnić roztworem do sekcji i napowietrzyć.</li>
	<li>Komorę do przechowywania skrawków należy wypełnić ACSF i napowietrzyć, aby zapewnić odpowiednie natlenienie roztworu niezależnie od miejsca umieszczenia skrawków.</li>
</ol>
2. Usunięcie tkanki mózgowej
Przekroje mózgu otrzymywane na świeżo wykazują tendencję do lepszego stanu zdrowotnego u młodszych myszy. Architektura komórkowa SVZ w okresie ponatalnym u gryzoni osiąga dojrzałość około 20. dnia (P) po urodzeniu1. Dlatego staramy się ograniczać nasze eksperymenty do myszy w wieku P20-P30, choć z powodzeniem przeprowadziliśmy badania na myszach w wieku do 3 miesięcy. Podczas obróbki tkanki należy dbać o minimalizację ruchów mechanicznych i nacisku na mózg, utrzymywać warunki chłodnicze oraz jak najszybciej po uśmierzeniu zwierzęcia poddać SVZ działaniu roztworu.
<ol>
	<li>Po wstrzyknięciu pentobarbitalu mysz zostaje szybko zdekapitowana. Usunięto sierść i wykonano nacięcia u podstawy czaszki. Głowę umieściło się następnie w tacy wypełnionej roztworem do sekcji.</li>
	<li>Stabilizując głowę pęsetą, wykonuje się ciągłe cięcia wokół czaszki, a niekiedy wzdłuż linii środkowej za pomocą mikronoareczek. Należy uważać, aby zminimalizować kontakt z tkanką. Ponieważ opuszka węchowa jest docelowym miejscem dla nowo powstałych neuronów z SVZ, należy pamiętać o zachowaniu tego obszaru, szczególnie podczas usuwania kości w tej okolicy. Cięcia mikronoareczkami wokół czaszki powinny być wykonywane po stronie grzbietowej, aby umożliwić łatwe usunięcie czaszki.</li>
	<li>Czaszka pokrywająca mózg zostaje teraz oddzielona od kości znajdujących się pod mózgiem. Jeśli cięcia w poprzednim kroku zostały wykonane prawidłowo, ta górna warstwa kostna może zostać łatwo usunięta pęsetą lub kleszczykami.</li>
	<li>Trzymając nadal głowę pęsetą, można użyć skalpela, aby przed krojonim czysto usunąć kilka fragmentów tkanki mózgowej, na przykład w następujący sposób. Cięcie koronalne można wykonać na poziomie lambda. Cięcia strzałkowe można wykonać po obu stronach mózgu, bocznie w stosunku do SVZ. Ostrożny szacunek to ~2.5 mm od linii środkowej. Jeśli jest to pożądane, mózg można tutaj również przedzielić na pół. Cięcia te ułatwią montaż tkanki i pozwolą szybciej dotrzeć do SVZ podczas krojenia mózgu. Ważne jest, aby przyłożyć minimalną siłę mechaniczną do mózgu (np. nie naciskać ani nie ciągnąć).</li>
</ol>
3. Przygotowanie ostrych skrawków mózgu
<ol>
	<li>W celu przygotowania do kolejnych etapów należy upewnić się, że super glue używany do montowania tkanki nie jest zapchany i jest gotowy do nałożenia na płytkę wibratomu. Ważne jest, aby działać tak szybko, jak to możliwe, nie uszkadzając mózgu.</li>
	<li>Tkankę mózgową można następnie podebrać od spodu, co oddziela tkankę od leżącej pod nią kości, jednocześnie oddzielając nerwy.</li>
	<li>Tkanka zostaje zamontowana i przyklejona do płytki, a następnie umieszczona w wibratomie. Ze względu na anatomię rostralno-kaudalną SVZ, skupiliśmy się na wykonywaniu przekrojów strzałkowych, ponieważ zachowują one ścieżkę migracyjną neuroblastów, pochewkę glejową oraz układ naczyniowy, które są w dużej mierze zorientowane w tym kierunku. Można zamontować tkankę w linii środkowej lub na płaskiej powierzchni powstałej po wykonaniu cięć strzałkowych bocznie od SVZ. Opcjonalnym krokiem jest umieszczenie za tkanką bloku 3% agarozy, który będzie służył jako podparcie dla ostrza podczas odcinania plastrów. Preferencyjnie stosowaliśmy super glue na bazie cyjanoakrylanu.</li>
	<li>Przepłucz ostrze etanolem, aby usunąć tłuszcze, a następnie przepłucz wodą destylowaną. Umieść ostrze w uchwycie. Zamontuj uchwyt ostrza w wibratomie.</li>
	<li>Ustaw parametry wibratomu tak, aby przecinać tkankę z grubością 250-350 μm na plaster. Ważne jest, aby ciąć przy użyciu wibracji o wysokiej częstotliwości i niskiej prędkości.</li>
	<li>Wykonuj sekcje progresywnie przez tkankę. Pojawienie się opary węchowej jest dobrym wskaźnikiem zbliżania się do SVZ w przekrojach strzałkowych, ponieważ najbardziej bocznych plastrów nie będzie zawierać żadnego z tych obszarów. Inne punkty orientacyjne, na które należy zwrócić uwagę, to komora mózgu oraz pogrubienie ciała modzelowatego, pod którym znajduje się SVZ. SVZ pojawi się najpierw w bardziej bocznych przekrojach strzałkowych. RMS będzie widoczny w przyśrodkowych przekrojach strzałkowych.</li>
	<li>Usuń plastry zawierające SVZ za pomocą plastikowej pipety Pasteura z odciętą końcówką. Przenieś je do komory przechowującej plastry. Często otrzymujemy więcej plastrów, niż jesteśmy w stanie wykorzystać w ciągu jednego dnia pracy. Jednak plastry różnią się ilością komórek zawierających SVZ. Czasami konieczne jest przejrzenie kilku plastrów, aby znaleźć ten pożądany do obrazowania.</li>
</ol>
4. Przygotowanie mikroskopu i barwników
Platki wymagają jednej godziny inkubacji w ACSF, aby zregenerować się po dysekcji i cięciu. W czasie regeneracji platków można wykonać kilka kolejnych kroków.
<ol>
	<li>Przygotowanie pipet do aplikacji barwnika wapniowego i/lub leku
	<ol class="lalpha">
		<li>Szklane pipety powinny mieć końcówkę o średnicy 2-3 μm oraz długość końcówki (~2 mm) i kąt (~16° dla uchwytu pipety), które zapobiegają kontaktowi z komorą perfuzyjną i pozostawiają miejsce na umieszczenie obiektywu.</li>
		<li>Zazwyczaj można przygotować 6-8 pipet ciśnieniowych na każdy dzień eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie barwnika wapniowego
	<ol class="lalpha">
		<li>Podczas przygotowywania roztworu roboczego (4-5 μM do kąpieli, 250 μM do aplikacji ciśnieniowej) najlepiej ograniczyć ekspozycję komórek na DMSO do minimum. Można to osiągnąć poprzez sporządzenie wysoko stężonych roztworów zapasowych. Na przykład w przypadku Fluo-4, jednego dnia wykorzystuje się jedną probówkę zawierającą 50 μg. Można przygotować 10 mM roztwór zapasowy z tej porcji, dodając 4,6 μl 20% roztworu Pluronic F-127 w DMSO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie ustawienia mikroskopu (Rysunek 2).
	<ol class="lalpha">
		<li>Zastosowanie pompy perystaltycznej do przepływu roztworu pomogło zminimalizować dryf obrazu. Uruchom pompę perystaltyczną wcześniej, aby ACSF przepłynął przez linie perfuzyjne i upewnić się, że są one wolne od pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Zamocuj wlot rurki w komorze perfuzyjnej i upewnij się, że nie ma wycieków.</li>
		<li>Ustaw końcówkę próżniową tak, aby roztwór był odsysany z komory perfuzyjnej. Upewnij się, że znajduje się ona na odpowiednim poziomie, aby obiektyw był zanurzony na właściwej odległości roboczej, ale nie tak wysoko, aby roztwór mógł wylać się z komory. Niski poziom roztworu zminimalizuje również zniekształcenia przepływu. Stałość aspiracji można również zweryfikować, nasłuchując stabilności pracy urządzenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ładowanie barwnika
Ta metoda została szczegółowo opisana w innym manuskrypcie2. Prosimy o zapoznanie się z tamtejszymi rysunkami.
<ol>
	<li>Ładowanie barwnika do kąpieli
	<ol class="lalpha">
		<li>Przygotować 1-2 ml roztworu roboczego barwnika. W przypadku Fluo-4 AM stężenie 4-5 μM jest wystarczające do znakowania neuroblastów SVZ.</li>
		<li>Skrawki przenosi się najpierw do 35 mm naczynia hodowlanego z dnem z siatki, które jest już wypełnione ACSF. Należy wymienić roztwór, używając 3 ml plastikowej pipety transferowej do delikatnego usunięcia ACSF, jednocześnie dodając roboczy roztwór barwnika wapniowego.</li>
		<li>Inkubować przy 37 °C przez 30-60 min w środowisku z kontrolowaną zawartością 5% CO2.</li>
		<li>Umieścić skrawek z powrotem w komorze holdingowej wypełnionej ACSF, aby wypłukać barwnik, który nie wniknął do komórek. Alternatywnie można go umieścić bezpośrednio w komorze perfuzyjnej mikroskopu, w której przepływa ACSF. Ten okres płukania trwa 30-45 min.</li>
		<li>Przenieść skrawek do komory perfuzyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aplikacja barwnika pod ciśnieniem
	<ol class="lalpha">
		<li>Przenieść skrawek z komory holdingowej do komory perfuzyjnej w układzie mikroskopowym.</li>
		<li>Wypełnić szklaną pipetę roztworem roboczym o stężeniu 250 μM i umieścić ją w mikromanipulatorze.</li>
		<li>Obniżyć pipetę do obszaru zainteresowania. Pipetę można umieścić tak, aby jej końcówka znajdowała się kilka mikrometrów powyżej powierzchni skrawka lub była zanurzona kilka mikrometrów poniżej powierzchni skrawka, ale z dala od rejestrowanego obszaru. Kąt nachylenia pipety nie wpływał na wydajność ładowania. Przy obrazowaniu poniżej powierzchni skrawka stwierdzono, że umieszczenie końcówki pipety poniżej płaszczyzny obrazowania lepiej znakuje pożądany obszar obrazowania.</li>
		<li>Podczas aplikacji barwnika pod ciśnieniem ustawić Picospritzer tak, aby ciśnienie wynosiło &lt;3 psi. Nie oszacowano objętości dyfuzji barwnika, ponieważ zależy ona od zmienności średnicy końcówki pipety, zastosowanego ciśnienia i gęstości tkanki, w którą wstrzykiwany jest barwnik. Aplikację prowadzi się po prostu do momentu osiągnięcia pożądanego ładowania ocenianego wzrokowo. Należy zminimalizować uszkodzenia skrawka podczas aplikacji, zwłaszcza gdy końcówka znajduje się pod powierzchnią skrawka. Aplikować przez 1-2 min. Czasami, w zależności od stopnia znakowania ocenianego wzrokowo, konieczne są powtórne aplikacje. Przy tym stężeniu i czasie aplikacji stwierdzono, że aplikacja powierzchniowa barwnika preferencyjnie znakuje neuroblasty, natomiast aplikacja poniżej powierzchni preferencyjnie znakuje astrocyty. Jednakże aplikacja trwająca &gt;3 min przy stężeniu 500 μM znakuje neuroblasty niezależnie od tego, czy końcówka znajduje się powyżej, czy poniżej powierzchni skrawka (JC Platel, niepublikowana obserwacja). Pozostawić do wypłukania i regeneracji skrawka przez 30-45 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Obrazowanie konfokalne aktywności wapniowej
<ol>
	<li>Najpierw zlokalizuj obszar zainteresowania, używając obiektywu o mniejszym powiększeniu, np. 4x lub 10x. Umieść go w centrum pola widzenia przed przełączeniem na obiektyw o większym powiększeniu. Na tym etapie można ocenić ogólną kondycję skrawka, obserwując wygląd komórek SVZ w kontraście fazowym z różnicą interferencyjną (DIC). Zdrowe komórki są okrągłe i pełne. Ponadto zdrowe komórki wykazują słabe obciążenie Fluo-4, w przeciwieństwie do całkowitego braku obciążenia lub silnej fluorescencji (komórka obumierająca).</li>
	<li>Obniż obiektyw imersyjny wodny na obszar zainteresowania, który jest już obciążony barwnikiem. Do naszych potrzeb wystarczający był obiektyw 40x lub 60x, przy czym 40x zapewnia szersze pole widzenia i ułatwia dostęp pipetą. Podczas obrazowania poniżej powierzchni często schodzimy co najmniej 15 μm pod powierzchnię skrawka, gdzie architektura trójwymiarowa i kondycja komórek są lepiej zachowane.</li>
	<li>Upewnij się, że perfuzja i próżnia działają prawidłowo.</li>
	<li>Skonfiguruj mikroskop tak, aby rozdzielczość czasowa (time-lapse) i przestrzenna były ustawione na pożądane wartości. W przypadku mikroskopii konfokalnej czynniki te muszą być zrównoważone, ponieważ zwiększenie rozdzielczości czasowej zazwyczaj prowadzi do utraty rozdzielczości przestrzennej ze względu na skanujący charakter systemu. W celu obrazowania aktywności wapniowej rejestrowaliśmy klatkę mniej więcej co sekundę z rozdzielczością 512x512 pikseli. Jeśli konieczne jest osobne pozyskiwanie obrazów z wielu kanałów, wpłynie to również na tempo akwizycji. Ustaw czas trwania filmu (2-10 min).</li>
	<li>Rozpocznij pomiar. W przypadku badań farmakologicznych podawaj antagonisty lub agoniści niedesensybilizujące przez co najmniej 5-10 min, a następnie nagraj kolejny film z czasu trwania 5-10 min. Agoniści, którzy mogą desensybilizować receptory, mogą być podawani gwałtownie, na przykład za pomocą pipety ciśnieniowej sterowanej mikromanipulatorem.</li>
</ol>
7. Analiza zawartości wapnia
Analiza przebiega zgodnie ze standardowymi procedurami opisanymi w naszych poprzednich publikacjach2-4. F0 (t.j. poziom bazowy) oraz F to średnie intensywności fluorescencji mierzone odpowiednio we wszystkich obszarach zainteresowania (ROI) oraz w każdym pojedynczym ROI. Zmianę fluorescencji uznano za wzrost poziomu Ca2+, jeśli wzrost F/F0 był &gt;15%. Zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ obliczono przy użyciu programu Calsignal5.
8. Reprezentatywne wyniki
Udało nam się uzyskać selektywne ładowanie komórek SVZ w zależności od opisanych powyżej i w innych publikacjach2-4,6 protokołów wprowadzania barwnika. Ładowanie kąpielowe lub aplikacja pod ciśnieniem Fluo-4 AM (odpowiednio 4-5 lub 250 μM) na powierzchnię skrawka barwi głównie neuroblasty. Chociaż aplikacja pod ciśnieniem pozwala na szybsze ładowanie neuroblastów w pojedynczym skrawku niż ładowanie kąpielowe, to ładowanie kąpielowe umożliwia jednoczesne ładowanie wielu skrawków. Tożsamość zabarwionych komórek jako neuroblastów potwierdzamy poprzez (1) sprawdzenie, czy wykazują one zachowanie migracyjne4,7, (2) analizę ich morfologii, (3) negatywne barwienie sulforhodaminą 101, barwnikiem specyficznym dla astrocytów3 lub (4) pozytywne barwienie ekspresją DCX-DsRed (JC Platel, nieopublikowana obserwacja). Neuroblasty migrują szybko (średnio 60 μm/hr) w temperaturze fizjologicznej4,7-9, ale ich ruch można łatwo zaobserwować nawet w temperaturze pokojowej. Ruch neuroblastów nie stanowi problemu w kontekście wyznaczania obszarów zainteresowania (ROI) do śledzenia aktywności wapniowej, ponieważ nasze filmy są zazwyczaj krótkie. Jednak w przypadku długich okresów oczekiwania, np. podczas wymiany roztworów leków, badacze muszą uważać, aby dopasować ROI w okresach kontrolnych i traktowania. Nie jest rzadkością, że neuroblasty migrują do pola obrazowania lub płaszczyzny ogniskowania bądź z nich wychodzą.
Aplikacja pod ciśnieniem Fluo-4 AM (250 μM) głęboko w skrawku i przez ograniczony czas (&lt;2 min) preferencyjnie znakuje astrocyty SVZ2. Znakowanie astrocytów zostało zweryfikowane poprzez pozytywne znakowanie sulforhodaminą 101 oraz ich morfologię, w szczególności poprzez obecność wypustek i stóp naczyniowych na naczyniach krwionośnych, co opisaliśmy niedawno3. Stosując te metody, zaobserwowaliśmy aktywność spontaniczną zarówno w populacji neuroblastów SVZ, jak i astrocytów (Rysunek 1). Aktywność astrocytów często przybiera formę fal obejmujących naczynia krwionośne3. Ponadto, wykorzystując obrazowanie wapnia jako test, aplikacja agonistów farmakologicznych ujawniła lub potwierdziła ekspresję receptorów GABAA na neuroblastach i astrocytach6 oraz receptorów AMPA i NMDA na neuroblastach4.
Rysunki
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna z zapisami obrazowania wapnia; wykres pokazujący F/F₀ w czasie dla aktywności neuronów." src="/files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Propagująca aktywność wapniowa w astrocytach. (A) Reprezentatywny obraz uśredniony z rejestracji time-lapse aktywności wapniowej. Astrocytów w SVZ obciążono Fluo-4 AM poprzez aplikację ciśnieniową głęboko w skrawku. Filmy rejestrowano w odstępach czasu 0,75 s. Obszary zainteresowania (ROI) wyznaczono nad komórkami wykazującymi aktywność. (B) Zapisy z obszarów ROI wyznaczonych nad komórkami z filmu przedstawionego na (A). Zapisy przefiltrowano za pomocą średniej ruchomej i znormalizowano. Skala pionowa reprezentuje 2 x ΔF/F0, gdzie F to intensywność sygnału, F0 to średni sygnał bazowy, a ΔF= F-F0.
 
<img alt="Układ do fizjologii komórki z komorą kąpieli Warnera, rurkami Tygon, wlotem roztworu i aspiratorem próżniowym." src="/files/ftp_upload/4071/4071fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zdjęcie systemu perfuzyjnego. Jeden koniec rurki jest zanurzony w roztworze napowietrzanym mieszaniną 95% O2/5% CO2. Roztwór jest następnie perfundowany przez rurkę do komory kąpieli za pomocą pompy perystaltycznej (nie pokazano). Drugi koniec jest wprowadzony do wlotu roztworu komory kąpieli zamontowanej na platformie. Końcówka aspiracyjna jest następnie podłączona do wylotu roztworu z komory i ustawiona na poziomie określającym wysokość roztworu. Od wylotu końcówka aspiracyjna jest połączona z linią próżniową, która aspiruje roztwór z komory do pojemnika na odpady. System perfuzyjny przedstawiono poza stolikiem mikroskopu dla lepszej przejrzystości wizualnej.

<ol><li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction-mediated+calcium+waves+define+communication+networks+among+murine+postnatal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells.</a> Eur. J. Neurosci. , (2011).</li>
<li>Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchrony+of+spontaneous+calcium+activity+in+mouse+neocortex+before+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis.</a> Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).</li>
<li>Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+increases+calcium+in+subventricular+zone+astrocyte-like+cells+through+L-+and+T-type+voltage-gated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels.</a> Front. Cell. Neurosci. 4, 8(2010).</li>
<li>Bolteus, A. J., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+Release+and+Uptake+Regulate+Neuronal+Precursor+Migration+in+the+Postnatal+Subventricular+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone.</a> J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).</li>
<li>Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+a+whole+mount+preparation+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone.</a> J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. Neuroscience Meeting Planner, San Diego, CA, , Society for Neuroscience. (2007).</li>
<li>Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP-expressing+cells+in+the+postnatal+subventricular+zone+display+a+unique+glial+phenotype+intermediate+between+radial+glia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes.</a> Glia. 54, 394-410 (2006).</li>
<li>Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+and+ionic+signature+of+neuronal+progenitors+of+the+postnatal+subventricular+zone+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ.</a> J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).</li>
<li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca%282%29+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators.</a> Science. 333, 1888-1891 (2011).</li>
<li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Obrazowanie wapnia w komórkach SVZ było wykorzystywane do badania wzorców aktywności spontanicznej w neuroblastach10, ekspresji kanałów receptorowych zarówno w neuroblastach, jak i astrocytach4,6,8 oraz astrocytarnych fal wapniowych3. Ponieważ komórki w SVZ są albo niedojrzałe, albo posiadają właściwości glejowe, nie generują one potencjałów czynnościowych11,12, co oznacza, że milisekundowe zmiany potencjału napięciowego, wskazujące na aktywność w dojrzałych sieciach, nie mają ...

<table><tbody><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Disekcja: 147 mM&lt;br/&gt; ACSF: 0 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Disekcja: 42 mM&lt;br/&gt; ACSF: 126 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td>Disekcja: 2,5 mM&lt;br/&gt; ACSF: 2,5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td>Disekcja: 4,33 mM&lt;br/&gt; ACSF: 1 mM</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Procedura operacyjna&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Disekcja: 1,25 mM&lt;br/&gt; ACSF: 1,25 mM</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Disekcja: 10 mM&lt;br/&gt; ACSF: 10 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td>Disekcja: 26 mM&lt;br/&gt; ACSF: 26 mM</td></tr><tr><td>CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td>Disekcja: 1,33 mM&lt;br/&gt; ACSF: 2 mM</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Lista odczynników oraz receptury roztworu do sekcji i ACSF.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Wibrotom</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Klej szybki</td><td>Surehold lub 3M</td><td>Klej super szybki Surehold 3G lub 3M Vet-Bond</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do dysekcji</td><td>Roboz lub Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>barwnik wrażliwy na jony wapnia Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>barwnik wrażliwy na wapń Oregon Green BAPTA-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td></td></tr><tr><td>20% roztwór Pluronic F-127 w DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z obiektywem skierowanym w dół</td><td>Olympus</td><td>FV300 lub FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Obiektywy imersyjne w wodzie</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0,90)</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatory</td><td>Sutter</td><td>MPC-200/MPC-325/MPC-385</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler ciśnienia</td><td>Parker Hannifin</td><td>Pikospritzer</td><td>&amp;< 3 PSI podczas aplikacji</td></tr><tr><td>Wytciągacz pipet</td><td>Sutter lub Narshige</td><td>Sutter P-97 lub Narshige PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Pipety szklane</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-10</td><td>I.D.: 1,10, O.D.: 1,50</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Model 720</td><td>przepływ: 1 ml/min</td></tr><tr><td>Kąpiel w komorze</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26 GLP</td><td>Niski profil zapewnia odpowiedni prześwit dla obiektywu</td></tr><tr><td>Przewody</td><td>Tygon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B/344B</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Lista materiałów i sprzętu.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

przygotowanie ostrych skrawków strefy podkomorowej do obrazowania wapnia

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Strefa podkomorowa (SVZ) jest jedną z dwóch stref neurogennych w mózgu postnatalnym. SVZ zawiera gęsto upakowane komórki, w tym neuralne komórki progenitorowe o cechach astrocytarnych (zwane astrocytami SVZ), neuroblasty oraz pośrednie komórki progenitorowe. Neuroblasty powstające w SVZ migrują stycznie na dużą odległość do opuszki węchowej, gdzie różnicują się w interneurony. Sygnalizacja międzykomórkowa za pośrednictwem cząsteczek adhezyjnych i sygnałów dyfuzyjnych odgrywa istotną rolę w kontrolowaniu neurogenezy. Wiele z tych sygnałów wywołuje międzykomórkową aktywność wapniową, która przekazuje informacje wewnątrz i pomiędzy komórkami. Aktywność wapniowa odzwierciedla zatem działanie sygnałów zewnątrzkomórkowych i stanowi optymalny sposób zrozumienia funkcjonalnej sygnalizacji międzykomórkowej wśród komórek SVZ.
Aktywność wapnia była badana w wielu innych regionach i typach komórek, w tym w dojrzałych astrocytach i neuronach. Jednak tradycyjna metoda wprowadzania do komórek barwnika wskaźnikowego wapnia (i.e. ładowanie w kąpieli) nie była skuteczna w przypadku wszystkich typów komórek SVZ. W rzeczywistości gęstość komórkowa w SVZ uniemożliwia dyfuzję barwnika wewnątrz tkanki. Ponadto przygotowanie przekrojów strzałkowych pozwoli lepiej zachować trójwymiarowy układ komórek SVZ, w szczególności strumień migracji neuroblastów wzdłuż osi rostralno-kaudalnej.
W niniejszej pracy opisujemy metody przygotowywania przekrojów strzałkowych zawierających SVZ, wprowadzania barwnika wskaźnikowego wapnia do komórek SVZ oraz rejestracji aktywności wapniowej za pomocą filmów time-lapse. Do znakowania astrocytów SVZ wykorzystaliśmy barwnik Fluo-4 AM, aplikowany do tkanki pod ciśnieniem. Aktywność wapniową rejestrowano przy użyciu skaningowego mikroskopu konfokalnego, co pozwoliło na uzyskanie precyzyjnej rozdzielczości niezbędnej do rozróżnienia poszczególnych komórek. Nasze podejście można zastosować do innych stref neurogennych, w tym do podziarnistej warstwy hipokampa dorosłych osobników oraz embrionalnych stref neurogennych. Ponadto opisaną metodą można aplikować inne rodzaje barwników.

Opisano metodę wprowadzania barwników wskaźnikowych wapnia do komórek strefy podkomorowej (SVZ) w celu rejestracji aktywności wapniowej. Potnatalna SVZ zawiera gęsto upakowane komórki, w tym komórki progenitorowe neuronów oraz neuroblasty. Zamiast ładowania metodą kąpielową, barwnik wstrzykiwano pod ciśnieniem bezpośrednio do tkanki, co pozwoliło na lepszą dyfuzję barwnika.

Przygotowanie ostrych skrawków strefy podkomorowej do obrazowania wapnia

Strefa podkomorowa (SVZ) jest jedną z dwóch stref neurogennych w mózgu po urodzeniu. SVZ zawiera gęsto upakowane komórki, w tym komórki neuronalne...

Celem niniejszej procedury jest obrazowanie aktywności wapniowej komórek w ponatalnej strefie podkomorowej. Jest to realizowane poprzez wstępne, ostrożne usunięcie tkanki mózgowej z ponatalnej myszy. Drugim krokiem jest wykonanie żywych, ostrych skrawków mózgu zawierających strefę podkomorową.Następnie skrawki mózgu ładuje się barwnikiem wrażliwym na wapń. Ostatnim krokiem jest obrazowanie aktywności przy użyciu konfokalnego mikroskopu w trybie time-lapse. Ostatecznie obrazowanie time-lapse aktywności wapnia w komórkach strefy komórkowej służy do wykazania dynamiki aktywności międzykomórkowej w celu ujawnienia wzorców komunikacji pomiędzy różnymi typami komórek a układem naczyniowym.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neurogenezy, takie jak sposób komunikacji między różnymi typami komórek oraz wpływ komórek na układ naczyniowy. Po uśmierceniu i odcięciu głowy szczenięcia myszy w wieku od P 20 do P 30, zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi, należy umieścić głowę na tacy z roztworem do sekcji. Głowę należy ustabilizować pęsetą, a następnie za pomocą mikronożyczek wykonać ciągłe nacięcia wokół czaszki i w linii środkowej.Należy upewnić si

preparation-of-acute-subventricular-zone-slices-for-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przygotowanie ostrego stężenia strefy podkomorowej do obrazowania wapnia

Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.

Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

W niniejszym protokole aktualizujemy opis ostatnich postępów w obrazowaniu sygnałów Ca2+ w neuronach znakowanych GFP w skrawkach tkanki mózgowej z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+.

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Ten film demonstruje protokół rejestracji całej komórki i dwufotonowego obrazowania wapnia w wycinkach hipokampa mózgu. Metoda ta pozwala na badanie dynamiki lokalnych stanów przejściowychCa2+ (CaT) w dendrytach różnych typów neuronów w ostrych wycinkach mózgu.

Ustalenie konfiguracji całej komórki do dwufotonowego obrazowania wapnia wycinków mózgu

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Używając wielu kątów do cięcia mózgu szczeniaka myszy, ulepszamy poprzednio opisany ostry wycinek mózgu, który rejestruje połączenia między większością głównych struktur słuchowych śródmózgowia i przodomózgowia.

Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Naucz się obrazowania aktywności wapniowej w komórkach strefy podkomorowej myszy poporodowej przy użyciu wskaźników wapniowych i mikroskopii konfokalnej. Ta technika ujawnia wzorce komunikacji międzykomórkowej.

Przygotowanie ostrych skrawków strefy podkomorowej do obrazowania wapnia

Przeglądaj więcej filmów