Name: Analiza transkrypcji genów jednokomórkowych metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji RNA in situ (FISH) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Poznaj metodę FISH do analizy transkrypcji genów jednokomórkowych w Plasmodium falciparum. Technika ta umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu transkryptów mRNA w zakażonych erytrocytach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Michaelowi Alifrangisowi i Ulli Abildtrup za genotypowanie pasożytów oraz Christinie Holm za doskonałą pomoc techniczną. Praca ta została sfinansowana przez Howard Hughes Medical Institute (grant 55005511), The Lundbeck Foundation (grant R9-A840) oraz Niels Bohr Foundation.

1. Uzyskiwanie świeżo wyselekcjonowanych zainfekowanych erytrocytów
W przypadku tego testu najlepsze wyniki uzyskuje się, stosując świeżo wyselekcjonowane hodowle pod kątem ekspresji powierzchniowej białka PfEMP1. W tym konkretnym eksperymencie linia 3D7 P. falciparum została wyselekcjonowana przy użyciu specyficznych przeciwciał, zgodnie z wcześniejszym opisem1.
Dzień 1
<ol>
 <li>Odwirować 200 μl upakowanych komórek krwi z hodowli P. falciparum zawierającej 2-5 % IE w stadium późnym, wirując przy 800 x g przez 8 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Resuspender osad krwi w 2 ml podgrzanego do 37 °C 0,75 % roztworu żelatyny w sterylnej probówce o pojemności 14 ml i pozostawić na 15-20 min w temperaturze 37 °C, aby umożliwić sedymentację niezinfekowanych erytrocytów oraz IE w stadium pierścianowym. </li>
 <li>Zebrać IE w stadium późnym, t.j. fazę górną, do nowej probówki 14 ml i przemyć dwukrotnie 10 ml podgrzanego do 37 °C buforu do przemywania erytrocytów (RBC-wash media). </li>
 <li>Rozcieńczyć 50 μl specyficznych przeciwciał anty-PfEMP1 w 2 ml podgrzanego do 37 °C buforu RBC-wash media i przefiltrować sterylnie.</li>
 <li>Wymieszać przemyte IE w stadium późnym ze sterylnym rozcieńczonym antyserum w sterylnej probówce 14 ml i inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C przy łagodnym mieszaniu.</li>
 <li>Odwirować przy 800 x g przez 8 min w temperaturze pokojowej i przemyć dwukrotnie 10 ml podgrzanego do 37 °C buforu RBC-wash media. </li>
 <li>Przemyć 50 μl zawiesiny Dynabead Protein A dwukrotnie buforem RBC-wash media, używając magnesu DynaMaq-15.</li>
 <li>Resuspender Dynabeads w 300 μl buforu RBC-wash media i dodać je do przemytych IE w stadium późnym. Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C przy łagodnym mieszaniu. </li>
 <li>Przenieść probówkę na magnes DynaMaq-15. Pozostawić na 1-2 min i usunąć całą ciecz.</li>
 <li>Resuspender Dynabeads w 4-5 ml buforu RBC-wash media. Przenieść probówkę z powrotem na magnes i pozostawić na 1-2 min przed usunięciem całej cieczy. Powtórzyć etap przemywania raz. </li>
 <li>Przenieść przemyte kuleczki do sterylnej kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm2 zawierającej 200 μl świeżo upakowanych erytrocytów. Dodać do hodowli 5-6 ml pożywki Albumax. Przechowywać przez noc w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. </li>
</ol>
Dzień 2

<ol start="12">
 <li>Usuń kuleczki Dynabeads z hodowli, gdy wybrane IE ponownie zainfekują świeże erytrocyty, przenosząc całą hodowlę do sterylnej probówki o pojemności 14 ml. Umieść probówkę na magnesie DynaMaq-15 i pozostaw na 1-2 min. Następnie przelej cały płyn z powrotem do kolby hodowlanej. </li>
 <li>Prowadź hodowlę przez jak najmniejszą liczbę cykli, aż do uzyskania parasitemii na poziomie 5-10 % i osiągnięcia przez pasożyty stadium pierścienia. </li>
 <li>IE należy poddać analizie FACS, aby upewnić się, że uzyskano prawidłowy fenotyp powierzchniowy, t.j. ekspresję białka PFD1235w i/lub PF11_00081. </li>
</ol>
2. Przygotowanie sond
Sondy antysensowne RNA zostały wygenerowane z najbardziej zmiennych regionów genów var PFD1235w oraz PF11_0008 z genomowego DNA P. falciparum 3D7. DNA zostało powielone metodą PCR i sklonowane odpowiednio do wektora pSPT18 lub 19 w celu transkrypcji, zgodnie z opisem producenta (Roche). Sondy (o długości odpowiednio 580 par zasad (bp) i 590 bp) zostały znakowane digoksigeniną (DIG) lub biotyną przy użyciu odpowiednio zestawu DIG RNA labeling Kit lub mieszaniny Biotin RNA labeling Mix. Specyficzność sond potwierdzono zarówno za pomocą analiz Northern blot, jak i analizy FISH z pojedynczym znakowaniem1.
3. Wykonanie cienkiego rozmazu i fiksacja pasożytów przed hybrydyzacją in situ
Dzień 1
Wszystkie etapy są wykonywane w środowisku wolnym od RNaz, a wszystkie odczynniki są wolne od RNaz lub zostały poddane wstępnej obróbce pirokarbonianem dwuetylowym (DEPC) lub preparatem RNase Zap (Invitrogen). Przedmioty szkiełka i szkiełka nakrywki należy oczyścić alkoholem, aby usunąć pozostałości tłuszczów produkcyjnych. Ważne jest, aby przeprowadzać protokół bez żadnych przerw między poszczególnymi krokami, w celu zminimalizowania ryzyka kontaminacji nukleazami.
<ol>
 <li>Przygotować cienki rozmaz krwi standardową metodą rozmazywania3. Używając obiektywu imersyjnego 100x mikroskopu, należy policzyć IE i obliczyć procentową zawartość IE w kulturze. Sprawdzić, czy stadia rozwoju pasożytów są w przybliżeniu zsynchronizowane, w stadiach pierścianowatych i wczesnych trofozoitów cyklu IE. Są to stadia przedreplikacyjne, jednojądrowe, wykazujące ekspresję mRNA genu var, odpowiednie dla tego typu analiz transkrypcyjnych metodą FISH na pojedynczych komórkach. </li>
 <li>Przenieść 50 μl kultury pasożytów, przy parasitemii 5-10 %, do 1,5 ml probówki Eppendorf wolnej od RNaz. Centryfugować przez 1 min przy 2 000 rpm w temperaturze pokojowej. </li>
 <li>Usunąć medium i dodać 50 μl PBS pH 7,2 w wodzie traktowanej DEPC. Delikatnie wymieszać zawartość probówki. Powtórzyć etap sedymentacji odśrodkowej dwukrotnie, aby oczyścić komórki z medium i szczątków komórkowych. </li>
 <li>Przygotować cztery wysokiej jakości cienkie rozmazy. Dla każdego rozmazu wykonać jeden rozmaz w jednym dołku o średnicy 11 mm na szkiełku z 4 dołkami, t.j. łącznie cztery szkiełka przedmiotowe, w komorze laminarno-ulotowej wolnej od RNaz (krok krytyczny). Krótko pomachać szkiełkami w powietrzu, aby wyschnęły. Przygotować trzy dodatkowe szkiełka do kontroli negatywnych – jedno szkiełko do barwienia pojedynczą sondą dla innego nieistotnego genu przy użyciu specyficznej sondy, drugie szkiełko do traktowania RNazą i trzecie szkiełko zawierające IE niewykazujące ekspresji badanego genu. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na blacie przez 10-20 min. </li>
 <li>Utrwalić cienkie rozmazy, dodając do dołków 60 μl roztworu utrwalającego zawierającego 4 % paraformaldehydu i 5 % lodowatego kwasu octowego. Pozostawić przez 10 min na blacie w temperaturze pokojowej. </li>
 <li>Przemyć szkiełka w buforze 2x SSPE przez 5 min przy delikatnym mieszaniu w temperaturze pokojowej. Krótko usunąć nadmiar cieczy, delikatnie dotykając dołków zawierających komórki ręcznikiem papierowym. </li>
 <li>Przykryć szkiełka roztworem 0,01 % pepsyny w 0,01 M HCl na 2 min w 37 °C (krok niezwykle krytyczny). Przemyć szkiełka w 2x SSPE przez 5 min w temperaturze pokojowej. </li>
 <li>Rozcieńczyć roztwór RNazy do końcowego stężenia 10 μg/ml. Przykryć rozmazy kontroli negatywnej 60 μl roztworu RNazy. Inkubować przez 30 min w 37 °C, a następnie przemyć szkiełka w 2x SSPE przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Bezzwłocznie przejść do etapu hybrydyzacji. </li>
</ol>
4. Hybrydyzacja sond RNA na utrwalonych preparatach 
Dzień 1

<ol>
 <li>Przygotować komorę do hybrydyzacji, taką jak ThermoStar 100 HC4 lub puste pudełko na końcówki do pipet umieszczone w czystym piekarniku, spryskując ją preparatem RNase Zap i wycierając do sucha ręcznikiem papierowym. Napełnić kanały komory do hybrydyzacji lub dno pudełka wodą traktowaną DEPC, aby upewnić się, że preparaty nie wyschną podczas hybrydyzacji. Zamknąć komorę i podgrzać do 48 °C. </li>
 <li>Rozcieńczyć sondy w roztworze do hybrydyzacji do stężenia końcowego 12 ng/μl. Zdenaturować roztwór sond w temperaturze 65 °C przez 5 min w bloku grzejnym. Natychmiast schłodzić na lodzie.</li>
 <li>Krótko wysuszyć preparaty na powietrzu po płukaniu w 2x SSPE. Ostrożnie usunąć nadmiar cieczy wokół dołków za pomocą ręcznika papierowego. </li>
 <li>Otworzyć komorę do hybrydyzacji i umieścić w niej preparaty. Nanieść jedną lub obie sondy w całkowitej objętości 60 μl na dołek. Ostrożnie przykryć kroplę cieczy wolnym od RNaz szkiełkiem zakrywającym, używając sterylnej pęsety. </li>
 <li>Zamknąć komorę i przeprowadzić hybrydyzację preparatów w temperaturze 48 °C przez co najmniej 16 hr w ciągu nocy. </li>
</ol>
5. Koniugacja przeciwciał i amplifikacja fluorescencji
Dzień 2
Poniższe kroki opierają się na systemie TSA Plus Fluorescence Palette od firmy Perkin Elmer. Wszystkie etapy przeprowadza się w temperaturze pokojowej.

<ol>
 <li>Przemyć preparaty 3 razy w buforze TNT przez 5 min przy łagodnym wstrząsaniu. </li>
 <li>Zablokować dołki w 150 μl buforu TNB przez 30 min. </li>
 <li>Rozcieńczyć przeciwciało α-DIG sprzężone z HRP w buforze TNB w stosunku 1:100 oraz przeciwciało α-biotynowe sprzężone z HRP w buforze TNB w stosunku 1:500. Usunąć nadmiar buforu TNB z preparatów za pomocą chusteczki papierowej. W przypadku jednoczesnej detekcji dwóch transkryptów można zastosować oba przeciwciała jednocześnie. Nanieść całkowitą objętość 100 μl roztworu przeciwciała w TNB na dołek i ostrożnie przykryć szkiełkiem nakrywką. Inkubować preparaty przez 2 hr.</li>
 <li>Ostrożnie zdjąć szkiełka nakrywki. Przemyć preparaty w buforze TNT 3 razy przez 5 min. </li>
 <li>Rozcieńczyć fluorofor FITC w odczynniku do amplifikacji tyramidowej w stosunku 1:500 i nanieść 100 μl roztworu do każdego dołka. Przykryć dołki szkiełkami nakrywką i inkubować przez 12 min. </li>
 <li>Ostrożnie zdjąć szkiełka nakrywki i przemyć preparaty 3 razy przez 5 min w buforze TNT przy łagodnym wstrząsaniu. </li>
 <li>Rozcieńczyć fluorofor Cyan3 w odczynniku do amplifikacji tyramidowej w stosunku 1:500. Dodać 100 μl tego roztworu na dołek. Przykryć dołki szkiełkami nakrywka i inkubować przez 12 min. </li>
 <li>Ostrożnie zdjąć szkiełka nakrywki, a następnie szybko opłukać preparaty poprzez zanurzenie w buforze TNT. </li>
 <li>Przemyć preparaty 3 razy buforem TNT przez 5 min.</li>
 <li>Szybko zanurzyć preparaty w wodzie traktowanej DEPC.</li>
 <li>Pozostawić preparaty do wyschnięcia na powietrzu. Zamontować preparaty przy użyciu odczynnika anty-fade zawierającego DAPI. Uszczelnić rogi szkiełek nakrywka lakierem do paznokci. </li>
 <li>Preparaty są teraz gotowe do analizy mikroskopowej. Przykryć preparaty folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli eksperyment ma zostać ukończony następnego dnia. Pełne uszczelnienie boków preparatów można przeprowadzić 24 hr po zastosowaniu odczynnika anty-fade. Pozwoli to na obrazowanie preparatów do jednego tygodnia po zakończeniu protokołu. </li>
</ol>
6. Wizualizacja zhybrydyzowanych sond
<ol>
 <li>Włącz mikroskop. Do tego rodzaju eksperymentu wystarczający jest standardowy mikroskop immunofluorescencyjny, jednak w przypadku dostępu do mikroskopu konfokalnego można go wykorzystać do uzyskania obrazów 3D lub nagrań wideo zabarwionych komórek. Pozostaw mikroskop do rozgrzania na 15-30 min. Włącz komputer oraz oprogramowanie.</li>
 <li>Sprawdź jakość barwienia pod mikroskopem immunofluorescencyjnym. Wybierz obszar zawierający kilka pasożytów.</li>
 <li>Ręcznie dostosuj wzmocnienie (gain) każdego lasera. Ustaw czas przebywania piksela (pixel dwell) na 4-6 m-1s-1, a rozdzielczość na 512 x 512 pikseli.</li>
 <li>Wykonaj zdjęcie testowe przy użyciu Frame Lambda. Ponownie dostosuj wzmocnienie lasera.</li>
 <li>Wykonaj minimum 20 wysokiej jakości zdjęć fluorescencyjnych pojedynczych komórek. Aby uzyskać rzetelny przegląd odsetka pasożytów pozytywnych, konieczne jest wykonanie co najmniej 2-5 zdjęć pola zawierającego 5-20 pasożytów.</li>
</ol>

<ol><li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCheeseborough%2C+M+%22District+Laboratory+Practice+in+Tropical+Countries%22">District Laboratory Practice in Tropical Countries</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (2006).</li>
<li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117(2009).</li>
<li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li>
<li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li>
<li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li>
<li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li>
<li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mole+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li>
<li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Analiza RNA FISH, w przeciwieństwie do metod takich jak Northern blotting i RT-PCR, umożliwia rozróżnienie konkretnych transkryptów mRNA na poziomie pojedynczej komórki. Pozwala to na odróżnienie komórek transkrypcyjnie aktywnych od nieaktywnych – w tym przykładzie pierwotniaków P. falciparum znajdujących się wewnątrz ludzkich erytrocytów. Takie obserwacje całych komórek są często niezbędne i mogą ujawnić istotne oraz nowe wzorce transkrypcyjne1.
Choć opisano inne metody RN...

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy </td><td>Sigma/Aldrich</td><td>338826-100ml</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pożywka Albumax: &lt;/strong&gt;roztwór RPMI 1640 z glutaminą </td><td>Lonza</td><td>BE12-115F</td><td>500 ml RPMI 1640 &lt;br/&gt; 5 ml roztworu glutaminy</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pożywka Albumax: &lt;/strong&gt;Siarczan gentamycyny, roztwór Albumax</td><td>Lonza</td><td>BE02-012E</td><td>2,5 ml siarczanu gentamycyny &lt;br/&gt; 50 ml roztworu Albumax</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;roztwór Albumax: &lt;/strong&gt;Hypoksantamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9377</td><td>0,8 g hypoksantyny </td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;roztwór Albumax:&lt;/strong&gt; AlbuMAX II</td><td>Invitrogen</td><td>11021-037</td><td>200 g Albumaxu</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;roztwór Albumax: &lt;/strong&gt; RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-115F</td><td> 4 litry pożywki RPMI 1640 &lt;br/&gt; Rozpuścić przy użyciu magnesa w temp. maks. 50°C &amp;deg;C. Przefiltruj przez sterylny filtr i przechowuj w temperaturze -20°C &amp;deg;C w alikwotach.</td></tr><tr><td>Amberlite</td><td>Sigma</td><td>A5710-110G</td><td>Żywica do dejonizacji formamidu.</td></tr><tr><td>Koniugat peroksydazowy przeciwbiotynowych przeciwciał poliklonalnych kozich</td><td>Calbiochem</td><td>203206</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-digL</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-41330</td><td></td></tr><tr><td>Odczyn antyblaknący z DAPI </td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td>Medium montażowe musi utwardzać się przez 24 h przed całkowitym zamknięciem preparatu.</td></tr><tr><td>Mieszanina do znakowania RNA biotyną</td><td>Roche</td><td>11685597910</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Cyfrowa kamera Nikon Digital Sight DC-F11</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krywinki</td><td>Menzel-glaser</td><td>631-1570</td><td></td></tr><tr><td>kolba hodowlana 25 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;powierzchnia Nunclon</td><td>Nunc</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Fluka/Sigma</td><td>32490-100ml</td><td>1 ml DEPC w 1000 ml wody dejonizowanej. Dodać mieszadło magnetyczne i mieszać przez 12 h. Autoklawować przez 30 min.</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Nikon digital sight DC-F11</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Magnes DynaMaq-15</td><td>Invitrogen</td><td>123-01D</td><td></td></tr><tr><td>Formamid bioultra 99%</td><td>Fluka/Sigma</td><td>47671-1l-F</td><td>Dejonizowana formamida: 5 g żywicy jonowymiennej na 100 ml formamidy. Mieszać przez 30 min. Przefiltrować przez papier Whatmana.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Żelatyna 0.&lt;/strong&gt;&lt;strong&gt;roztwór 75%: &lt;/strong&gt;Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>3,75 g żelatyny w 500 ml RPMI 1640. Podgrzać do 56 &amp;deg;C do rozpuszczenia. Sterylizować przez filtrowanie, gdy 56 &amp;deg;C. Przechowywać w temperaturze -20°C &amp;deg;C w alikwotach.</td></tr><tr><td> &lt;strong&gt;Żelatyna 0.&lt;/strong&gt;&lt;strong&gt;roztwór 75%:&lt;/strong&gt; RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-115F</td><td>3,75 g żelatyny w 500 ml RPMI 1640. Podgrzać do 56 &amp;deg;C do rozpuszczenia. Sterylizować przez filtr w przypadku 56 &amp;deg;C. Przechowywać w temperaturze -20°C &amp;deg;C w aliquotach.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Roztwór glutaminy:&lt;/strong&gt; L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td>14,6 g L glutaminy w 500 ml 0,9% NaCl. Rozpuścić, wysterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze -20°C &amp;deg;C w alikwotach.</td></tr><tr><td> &lt;strong&gt;Roztwór glutaminy:&lt;/strong&gt; HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td>14,6 g L glutaminy w 500 ml 0,9% NaCl. Rozpuścić, wysterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze -20°C &amp;deg;C w alikwotach.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Roztwór do hybrydyzacji:&lt;/strong&gt; Formamid Bio ultra, 99% SSC 20x</td><td>Fluka/Sigma</td><td>47671-1l-F</td><td>Łącznie 20 ml, przechowywać w zamrożeniu w temperaturze -20°C &amp;deg;C w alikwotach &lt;br/&gt; 10 ml zdejonizowanego formamidu</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Roztwór do hybrydyzacji:&lt;/strong&gt; 50-krotny koncentrat roztworu Denhardta</td><td>Sigma</td><td>D2532</td><td>5 ml 20xSSC</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Roztwór do hybrydyzacji:&lt;/strong&gt; tRNA drożdżowa
odczyn blokujący Roche</td><td>Sigma</td><td>R-6750</td><td>2 ml 50x roztworu Denhardta &lt;br/&gt; 250 &amp;mu;20 mg/ml tRNA drożdżowej</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Roztwór do hybrydyzacji:&lt;/strong&gt; DNA z plemników łososia </td><td>Fluka/Sigma</td><td>31149-106GF</td><td>0,4 g odczynnika blokującego Roche &lt;br/&gt; 1 ml 10 mg/ml DNA z plemni łososia (Kluczowe: zdenaturować DNA z plemni łososia w temperaturze 96°C) &amp;deg;C przez 5 min przed dodaniem do roztworu hybrydyzacyjnego)</td></tr><tr><td>Hybrydyzator ThermoStar 100 HC4</td><td>Quantifoil Instruments GmbH</td><td>1004-0011</td><td>Można zastąpić piecem do hybrydyzacji oraz wolnymi od RNazy komorami do hybrydyzacji zwilżonymi wodą z DEPC.</td></tr><tr><td>Olej immersyjny transparentny w UV, wolny od fluorescencji</td><td>Sigma</td><td>10976-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny lub konfokalny</td><td>Nikon D-Eclipse TE2000C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Dostępne w każdej aptece</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 20x: NaCl &lt;br/&gt; KCl &lt;br/&gt; Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; x 2h&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O &lt;br/&gt; KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; odjonizowana woda z DEPC&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>Dostosować pH do 7,4 &lt;br/&gt; 160 g &lt;br/&gt; 4 g &lt;br/&gt; 23 g &lt;br/&gt; 4 g &lt;br/&gt; 1 l</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 4%</td><td>Fluka/chemika</td><td>76240</td><td>4 g PFA w 80 ml PBS/DEPC. Podgrzać do 65 &amp;deg;C aż do rozpuszczenia PFA. Dodać 20 ml PBS, pozwolić roztworowi ostygnąć. Dostosować pH do wartości 7,4. Przefiltrować. Przechowywać w alikwotach w temperaturze -20°C. &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 4 %/ Kwas octowy 5 %</td><td></td><td></td><td>950 &amp;mu;l paraformaldehydu + 50 &amp;mu;kwas octowy</td></tr><tr><td>Pepsyna</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>P7000</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko biotynie sprzężone z peroksydazą</td><td>Calbiochem</td><td>203206</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;pożywka do przemywania erytrocytów: &lt;/strong&gt;roztwór glutaminy RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-115F</td><td>500 ml RPMI 1640
5 ml roztworu glutaminy</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Medium do płukania erytrocytów:&lt;/strong&gt; Siarczan gentamycyny</td><td>Lonza</td><td>BE02-012E</td><td> 2,5 ml siarczanu gentamycyny </td></tr><tr><td>RNaza</td><td>Sigma/Aldrich</td><td></td><td>Przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 10 mg/ml.</td></tr><tr><td>probówka 1,5 ml wolna od RNaz</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>RNaza Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Przeszkła z 4 dołkami 11 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>MENZXER306W</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SSC 20x:&lt;/strong&gt; NaCl</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>S9625</td><td>3 M NaCl (175 g/l) 0,3 M Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; cytrynian x H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (88 g/l) Doprowadzić do pH 7,0 za pomocą 1M HCl</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SSC 20x:&lt;/strong&gt; Cytrynian sodu uwodniony</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>W302600</td><td>3 M NaCl (175 g/l) 0,3 M Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; cytrynian x H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (88 g/l) Doprowadzić do pH 7,0 przy użyciu 1M HCl</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SSPE 20x:&lt;/strong&gt; NaCl </td><td>Sigma/Aldrich</td><td>S9625</td><td>175,3 g NaCl </td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SSPE 20x:&lt;/strong&gt; NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>S0751</td><td> 27,6 g NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SSPE 20x:&lt;/strong&gt;&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; proszek EDTA </td><td></td><td></td><td>9,4 g proszku EDTA &lt;br/&gt; Dodać wodę z DEPC, dostosować pH do 7,4. Autoklawować przez 20 min.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bufor TNB:&lt;/strong&gt; bufor TNT </td><td></td><td></td><td>10 ml buforu TNT </td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bufor TNB:&lt;/strong&gt; Odczynnik blokujący</td><td></td><td></td><td> 0,05 g odczynnika blokującego&lt;br/&gt; Aby rozpuścić odczyn blokujący, należy podgrzać roztwór do 60 &amp;deg;C przez jedną godzinę przy mieszaniu. Przechowywać w temperaturze -20°C &amp;deg;C. (Opracowano na podstawie protokołu TSA firmy Perkin Elmer.)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;bufor TNT:&lt;/strong&gt; Tris/HCl </td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>1M Tris/HCl, pH 8,0</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bufor TNT: &lt;/strong&gt;NaCl </td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td>100 ml&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;bufor TNT:&lt;/strong&gt; Tween20</td><td>Sigma</td><td>93773</td><td> 30 ml 5 M NaCl&lt;br/&gt; 1 ml dH2O z DEPC&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 869 Ml &lt;br/&gt; Dostosować pH do wartości 7,5 w temperaturze pokojowej. (Opracowano na podstawie protokołu TSA firmy Perkin Elmer).</td></tr><tr><td>System TSA plus Cyanine3/ Fluorescein</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL753000IKT</td><td>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy dokładnie zapoznać się z protokołem dołączonym do systemu TSA Plus Fluorescence Palette System.</td></tr><tr><td> Probówki sterylne 14 ml </td><td>Almeco - CM LAB Aps</td><td>91016</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza transkrypcji genów w pojedynczych komórkach metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (fish) rna

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhezja erytrocytów (IE) zainfekowanych Plasmodium falciparum do ludzkich receptorów śródbłonka podczas infekcji malarią jest pośredniczona przez ekspresję wariantów białka PfEMP1 kodowanych przez geny var.
Haploidalny genom P. falciparum zawiera około 60 różnych genów var, z których dotychczas uważano, że tylko jeden jest transkrybowany w jednej komórce w danym czasie podczas stadium krwistego infekcji. Nie jest jasne, w jaki sposób osiągana jest taka wzajemnie wykluczająca się regulacja transkrypcji genów var, podobnie jak identyfikacja poszczególnych genów var lub podgrup genów var związanych z różnymi receptorami oraz wpływ różnicowego wiązania na wynik kliniczny infekcji P. falciparum. Niedawno paradygmat wzajemnie wykluczającej się transkrypcji został zakwestionowany przez testy transkrypcyjne oparte na identyfikacji pojedynczych transkryptów P. falciparum w pojedynczych zakażonych komórkach erytrocytarnych przy użyciu analizy fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ RNA (FISH) transkrypcji genów var przez pasożyta w pojedynczych jądrach P. falciparum IE1.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprowadzania metody RNA-FISH w celu analizy transkrypcji genów var w pojedynczych jądrach ludzkich erytrocytów zainfekowanych P. falciparum. Metoda ta opiera się na zastosowaniu sond RNA antysensownych znakowanych digoksigeniną i biotyną przy użyciu systemu TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), analizach mikroskopowych oraz świeżo wyselekcjonowanych IE P. falciparum. Metoda hybrydyzacji in situ może być wykorzystana do monitorowania transkrypcji i regulacji szeregu genów ekspresjonowanych w różnych stadiach cyklu życiowego P. falciparum i jest możliwa do zaadaptowania do innych gatunków pasożytów malarii oraz innych organizmów i typów komórek.

Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy głównych etapów oraz czas trwania procedury RNA FISH.
Seria reprezentatywnych obrazów dobrze i słabo zachowanych eksperymentów mRNA FISH z barwieniem pojedynczych IE P. falciparum została przedstawiona na Rysunku 2. Ten wewnątrzkomórkowy pierwotniak posiada małe jądro (o średnicy 1-1,5 μm), które jest barwione na niebiesko za pomocą DAPI. Dwadzieścia cztery godziny po inwazji erytrocytów przez P. falciparum</e...

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) służąca do identyfikacji transkryptów mRNA w pojedynczych komórkach umożliwia analizę aktywności poligenowej, takiej jak jednoczesna transkrypcja więcej niż jednego członka wielogenowej rodziny var w erytrocytach zakażonych Plasmodium falciparum 1. Technika ta jest adaptowalna i może być stosowana w odniesieniu do różnych typów genów, komórek i organizmów.

Analiza transkrypcji genów w pojedynczych komórkach metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) RNA

Adhezja erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum (IE) do ludzkich receptorów śródbłonkowych podczas infekcji malarią jest zapośredniczona przez ekspresję wariantów białka PfEMP1 kodowanych przez geny var. Haploidalny genom P. falciparum zawiera około 60 różnych genów var, z których dotychczas uważano, że w jednej komórce w danym czasie podczas krwistego stadium infekcji transkrybowany jest tylko jeden. Nie jest jasne, w jaki sposób osiągana jest taka wzajemnie wykluczająca się regulacja transkrypcji genów var, podobnie jak identyfikacja poszczególnych genów var lub podgrup genów var związanych z różnymi receptorami oraz wpływ różnicowego wiązania na wynik kliniczny infekcji P. falciparum. Niedawno paradygmat wzajemnie wykluczającej się transkrypcji został zakwestionowany w testach transkrypcyjnych opartych na identyfikacji pojedynczych transkryptów P. falciparum w pojedynczych zakażonych komórkach erytrocytarnych przy użyciu analizy RNA-FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ) transkrypcji genów var przez pasożyta w pojedynczych jądrach P. falciparum IE1. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół przeprowadzania metodologii RNA-FISH do analizy transkrypcji genów var w pojedynczych jądrach ludzkich erytrocytów zakażonych P. falciparum. Metoda ta opiera się na zastosowaniu sond RNA antysensownych znakowanych digoksygeniną i biotyną przy użyciu systemu TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), analizach mikroskopowych oraz świeżo wyselekcjonowanych P. falciparum IE. Metoda hybrydyzacji in situ może być stosowana do monitorowania transkrypcji i regulacji wielu genów ekspresjonowanych podczas różnych stadiów cyklu życiowego P. falciparum i jest możliwa do zaadaptowania do innych gatunków pasożytów malarii oraz innych organizmów i typów komórek.

Nazywam się Elena Rand i pracuję w Centrum Patologii Medycznej na Uniwersytecie Kopenhaskim w Danii. Pracuje tutaj około 60 osób z różnych stron świata, zajmujących się malarią. Nasza grupa bada pasożyty z rodzaju Plasmodium.Są to najbardziej zjadliwe gatunki wywołujące malarię u ludzi. Plasmodium falciparum wykazuje białka powierzchniowe o różnych funkcjach, takich jak adhezja do komórek gospodarza. Największą grupę białek adhezyjnych stanowią tzw. białka błony erytrocytarnej Plasmodium falciparum 1, czyli PfMP1.Istnieje co najmniej 60 wariantów, z których dotychczas uważano, że tylko jeden jest transkrybowany w danej komórce w czasie etapu krwiożerności zakażenia. W naszym oddziale uważamy, że w pasożytach jednocześnie transkrybowanych może być więcej niż jedno białko. Jedną z metod wykrywania takiej aktywności jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ mRNA.W niniejszej pracy przedstawiamy dostosowaną metodę detekcji mRNA, transkrypcji dwóch różnych genów w pojedynczym jądrze erytrocytów zakażonych odum FCI. Realizacja metody zajmuje dwa dni. Pierwszy dzień obejmuje przygotowanie sond RNA, naniesienie ich na utrwalone pasożyty na szkiełkach przedmiotowych oraz hybrydyzację w warunkach nocnych.Drugi dzień obejmuje gromadzenie przeciwciał, amplifikację fluorescencyjną oraz wizualizację zabarwionych pasożytów za pomocą mikroskopu konfokalnego. Aby przedstawić ogólny przebieg eksperymentu, pokazano schemat blokowy operacji oraz kluczowe odczynniki i materiały użyte w badaniu. Zestaw do znakowania RNA DIG biotyną, RNA, mieszanina do znakowania, paraformaldehyd, lodowaty kwas octowy, pepsyna, przeciwciało anty-DIG, przeciwciało anty-biotynowe, system palety fluorescencyjnej TSA PL plus, RNA DPI, mikroprobówki, etanol ETH, przetarte szkiełka przedmiotowe, autoklawowane szkiełka nakrywkowe, sprzęt sterylny, taki jak nożyczki i pęseta, szklany słoik do inkubacji.Należy sprawdzić zakażone erytrocyty za pomocą barwienia Giemsy, aby upewnić się, że znajdują się one na właściwym etapie rozwoju. Chodzi o zsynchronizowane stadia pierścieniowe w dobrym stanie, w których zachodzi transkrypcja VAR. Kluczowe jest wybranie dokładnego etapu cyklu życiowego, w którym odbywa się transkrypcja.Ponieważ poszczególne rodzaje RNA są etapowe, specyficznie transkrybowane i szybko degradowane, komórki należy delikatnie wypłukać przed przygotowaniem wysokiej jakości cienkich rozmazów krwi na czystych szkiełkach przedmiotowych. Równomierną monowarstwę zakażonych erytrocytów na szkiełku utrwala się w roztworze 4% paraformaldehydu i 5% octu lodowego przez 10 minut. Następnie szkiełka przemywa się dwukrotnie w PBS, delikatnie usuwając ciecz z powierzchni szkiełek za pomocą chusteczki. Następnie komórki poddaje się permeabilizacji w uprzednio podgrzanym 10 millimolarnym roztworze chlorku wodoru przed dodaniem Pepsi.Inkubować w temperaturze 37 °C przez dwie minuty przed hybrydyzacją. Sondy denaturuje się w temperaturze 65 °C przez pięć minut, następnie szybko schładza na lodzie i dodaje do komórek unieruchomionych na szkiełku przedmiotowym. Na komórki nałożyć szkiełko nakrywkowe i usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki małej pipety. Nawilżyć komorę hybrydyzacyjną, dodając krople wody dwukrotnie destylowanej na obrzeżach komory, aby szkiełka pozostały w niej wilgotne.Podczas procedury hybrydyzacji należy umieścić szkiełka przedmiotowe w komorze i inkubować je przez noc w temperaturze 48 °C. Po 16 do 17 godzinach hybrydyzacji szkiełka są ostrożnie wyjmowane z komory hybrydyzacyjnej. Od tego momentu środowisko wolne od RNA nie jest już bezwzględnie wymagane.Przemyj preparaty na szkiełkach w szklanym słoiku wypełnionym buforem TNT, upewniając się, że szkiełka nakrywkowe oddzieliły się od szkiełek przedmiotowych. Powtórz procedurę płukania trzykrotnie, a następnie inkubuj je w buforze TNB w celu blokowania przez pół godziny. Dodaj do komórek przeciwciała sprzężone z HRP przeciwko digoksgenowi lub przeciwciała znakowane antybiotyną.Oba rodzaje znakowanych przeciwciał można dodać jednocześnie. Jeśli celem eksperymentu jest wykrycie dwóch transkryptów mRNA w komórkach, przeciwciała należy uprzednio rozcieńczyć. Należy inkubować w buforze TNB od jednej do dwóch godzin, przemyć trzykrotnie buforem TNT, a następnie dodać do przemytych komórek jeden fluorochrom, rozcieńczony FSE lub cyjanowy.Należy świeżo przygotować trzy roztwory. Od tego momentu ważne jest, aby nie wystawiać szkiełek bezpośrednio na działanie silnego światła. Inkubować szkiełka przedmiotowe z fluorochromem przez 10 do 15 minut.W przypadku wykrywania dwóch transkryptów mRNA po pierwszej inkubacji, należy wypłukać pierwszy barwnik i dodać drugi. Wykonać końcowe płukanie w buforze TNT. Przed wysuszeniem na powietrzu zanurzyć preparaty w wodzie dwukrotnie destylowanej.Nanieś preparat i nałóż szkiełko nakrywkowe na przedmiotowy. Usuń pęcherzyki powietrza i zabezpiecz krawędzie szkiełka nakrywkowego szybko schnącym lakierem do paznokci. Tutaj widzimy pojedynczy zakażony erytrocyt zawierający jednego pasożyta.Kolor niebieski (DPE) reprezentuje DNA pasożyta, a kolor zielony reprezentuje mRNA jednego z transkrybowanych genów. Na drugim obrazie kolor czerwony reprezentuje mRNA drugiego genu, a na trzecim obrazie widoczne jest podwójne barwienie transkrypcji obu genów. Obrazy ujawniają również, że przyłączone cząsteczki mRNA nakładają się na jądrowe DNA, a nie leżą zazwyczaj nad nim lub obok niego.W 99% zakażonych erytrocytów możemy wykryć transkrypcję mRNA dwóch genów. Ważnym aspektem tego eksperymentu jest sprawdzenie, czy sondy nie przyłączają się do innych genów. Na tym obrazie zinkubowano zakażone erytrocyty z obiema sondami, ale tylko jedna sonda przyłącza się do IE. Pozostałe geny nie są tutaj transkrybowane.Sytuacja ta jest odwrotna na pozostałych obrazach w przypadku wizualizowanych zainfekowanych erytrocytów. Pasożyty odium phos palm mają zazwyczaj dobrze zachowane błony z wyraźnym barwieniem zarówno DNA, jak i RNA. Jeśli komórki z jakiegoś powodu są słabej jakości, barwienie również będzie słabe.Jak pokazano na tym obrazie, DNA i RNA będą wyglądać na rozproszone, zamglone i stosunkowo nieokreślone. Podsumowując, można stwierdzić, że metodę tę można łatwo zastosować do innych pasożytów przenoszonych przez krew. Nasze dane transkrypcyjne zostały również potwierdzone eksperymentami w celu wykrycia białek przetłumaczonych z analizowanych mRNA przy użyciu specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko białkom pf EMP one eksponowanym na powierzchni zainfekowanych komórek.

analysis-single-cell-gene-transcription-rna-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza transkrypcji genów w pojedynczych komórkach przez fluorescencyjną hybrydyzację in situ RNA (FISH)

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Łącząc metody hybrydyzacji in situ i histologii całego RNA, ekspresja genów może być powiązana z decyzjami dotyczącymi losu komórki w rozwijającym się zarodku.  Metody te zostały dostosowane do morskich zwierząt spodoustych i ułatwiają wykorzystanie tych zwierząt jako organizmów modelowych do badań biomedycznych, toksykologicznych i porównawczych.

Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) pozwala na wykrywanie kwasów nukleinowych w ich naturalnym środowisku w komórkach. Opisujemy tutaj protokół połączonego, jednoczesnego wykrywania RNA i DNA za pomocą FISH, który może być wykorzystany do badania inaktywacji chromosomu X w embrionalnych komórkach macierzystych myszy.

Połączona fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA-RNA (FISH) w celu zbadania inaktywacji chromosomu X w zróżnicowanych żeńskich embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Olbrzymie komórki trofoblastu (TGC) odgrywają kluczową rolę w łożysku, zapewniając zdrową ciążę. Przedstawiamy protokół oceny statusu transkrypcyjnego genów w TGC poprzez powstającą fluorescencyjną hybrydyzację in situ na skriostatach zarodków poimplantacyjnych lub krótkoterminowych hodowlach embrionalnych czopków ektołożyskowych dnia 7.

Analiza transkrypcyjna za pomocą powstającego RNA FISH gigantycznych komórek trofoblastu in vivo lub krótkoterminowe hodowle in vitro eksplantatów czopków ektołożyskowych

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Poznaj metodę FISH do analizy transkrypcji genów jednokomórkowych w Plasmodium falciparum. Technika ta umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu transkryptów mRNA w zakażonych erytrocytach.

Analiza transkrypcji genów w pojedynczych komórkach metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) RNA

Przeglądaj więcej filmów