Name: Nieprawidłowe fałdowanie białek Cykliczna amplifikacja prionów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj technikę PMCA do wzmacniania szczepów prionów in vitro przy użyciu mózgu chomika. Ta metoda umożliwia badanie konwersji prionów i barier gatunkowych w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować dr Vesper Fe Marie Ramos za krytyczną lekturę rękopisu. Praca ta była wspierana przez National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 oraz G20RR024001) oraz National Institute for Neurological Disorders and Stroke (2R01 NS052609).

1. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Użyj sonikatora Misonix 3000 lub Misonix 4000 (Farmingdale, NY) podłączonego do łaźni wodnej Thermo Electron Neslab EX-7 (Newington, NH) w celu utrzymania stałej temperatury 37 °C. Sonicuj próbki w cienkościennych paskach probówek PCR o pojemności 200 μl z wypukłymi zakrętkami marki Thermo Scientific (Waltham, MA).</li>
	<li>Nowy sonikator wymaga okresu "docierania" podczas ciągłej pracy9. Dwumiesięczny okres docierania składa się z cykli obejmujących 40-sekundowy impuls sonikacji i 10-minutową inkubację, przy poziomie amplitudy ustawionym na 10. Należy zaobserwować erozję na całej powierzchni tytanowego emitera do mikropłytek (Rysunek 1, panel B). Krążąca woda stanie się biała i mętna z powodu erozji tytanowego emitera do mikropłytek. Wymieniaj tę wodę codziennie.</li>
	<li>Amplifikacja PrPSc będzie różnić się w obrębie emitera do mikropłytek. Najlepszą wydajność amplifikacji PrPSc można uzyskać w promieniu 5 cm od centrum emitera do mikropłytek (patrz Rysunek 1, panel C).</li>
	<li>Jedna runda PMCA składa się ze 144 cykli. Każdy cykl obejmuje 5 s sonikacji i 10 min inkubacji. Przełoży się to w przybliżeniu na 24 h na jedną rundę PMCA.</li>
	<li>Moc sonikacji wyświetlana na panelu sterowania sonikatora zmienia się w zależności od liczby probówek PCR znajdujących się w statywie sonikatora oraz temperatury wody krążącej z łaźni wodnej. Upewnij się, że woda ma temperaturę 37 °C i nie wypełniaj więcej niż 30% statywu na probówki sonikatora (Rysunek 1, panel C). Rozmieść probówki PCR w obrębie emitera do mikropłytek. Pozostaw przynajmniej jeden pusty rząd między paskami probówek PCR i nie łącz więcej niż czterech probówek w jednym pasku (Rysunek 1, panel C).</li>
	<li>Intensywność sonikacji jest krytyczna dla udanej amplifikacji szczepu prionów. Podczas sonikacji dostosuj amplitudę tak, aby moc wyjściowa mieściła się w zakresie 155 ~ 170 watów. W naszym laboratorium poziom mocy jest ustawiony odpowiednio na sześć dla Misonix 3000 i siedem dla Misonix 4000.</li>
	<li>W łaźni wodnej stosuj wodę destylowaną, aby zapobiec osadzaniu się kamienia. Wymieniaj tę wodę co tydzień. Podczas cykli inkubacji i sonikacji wewnątrz pokrywy emitera do mikropłytek pojawi się kondensacja wody. Aby uniknąć kondensacji, przymocuj małą akwariową matę grzejną do górnej części obudowy sonikatora, jak pokazano na Rysunku 1, panel A.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Creighton i są zgodne z Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Przed pobraniem tkanek zwierzę musi zostać poddane znieczuleniu i perfuzji transkardialnej za pomocą lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z dodatkiem 5 mM EDTA o pH 7,4, aby usunąć krew z mózgu i uniknąć hamowania reakcji PMCA przez krew7. Tkanki zwierzęce należy pobierać szybko, stosując technikę aseptyczną, używając osobnych narzędzi do sekcji dla każdego szczepu prionów. Po sekcji tkankę umieszcza się w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, zamraża gwałtownie na suchem lodzie i przechowuje w temperaturze -80 °C do momentu homogenizacji.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór podłoża PMCA (PrPC), należy zhomogenizować niezakażony mózg chomika (UN BH) do uzyskania 10% roztworu masy/objętości (w/v) w lodowatym buforze konwersyjnym (patrz część 3), używając homogenizatora tkanek Tenbroeck. Podczas homogenizacji należy uważać, aby do homogenizatora nie dostało się powietrze, co zapobiegnie nadmiernemu pienieniu się roztworu. Roztwór należy oczyścić poprzez wirowanie przy 500 x g przez 30 s, a następnie podzielić supernatant na alykwoy w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór nasion PMCA (PrPSc), należy zhomogenizować materiał zakaźny (mózg, śledzionę, węzły chłonne, inne tkanki lub zanieczyszczoną glebę) do uzyskania 10% roztworu w/v w lodowatej wodzie, a następnie podzielić roztwór na alykwoy w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 0,6 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie buforu konwersyjnego
<ol>
	<li>Odważyć 0,5093 g Triton X-100 do kolby miarowej o pojemności 50 ml (wynikiem jest końcowe stężenie 1% Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH; Steinheim, Niemcy).</li>
	<li>Dodać jedną tabletkę inhibitora proteaz Complete Protease Inhibitor Tablet (Roche Diagnostics GmbH; Mannheim, Niemcy).</li>
	<li>Dodać 0,0931 g EDTA (zaowocuje to końcowym stężeniem 5 mM EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc.; Phillipsburg, NJ).</li>
	<li>Dostosować pH do 7,4 za pomocą 1N NaOH.</li>
	<li>Dopełnić objętość do 50 ml za pomocą soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) (Mediatech Inc.; Manassas, VA).</li>
	<li>Przefiltrować roztwór przez membranę nitrocelulozową o porach 0,45 μm za pomocą aparatu do filtracji próżniowej. Bufor konwersyjny można przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż przez miesiąc.</li>
</ol>
4. Amplifikacja szczepów prionów z wykorzystaniem PMCA
<ol>
	<li>Rozcieńczyć zarodniki PMCA w podłożu PMCA w stosunku 1:20 (tj. zmieszać 5 μl zarodników PMCA i 95 μl podłoża PMCA) w probówce PCR. Pobrać i przechowywać alikwot 15 μl w temperaturze -80 °C jako kontrolę niepoddaną sonikacji; kontrola ta zostanie wykorzystana do ilościowego określenia amplifikacji PrPSc poprzez trawienie proteinazą K (PK), a następnie analizę Western blot (WB). Dodatkową kontrolę niepoddaną sonikacji można uzyskać, umieszczając drugi alikwot 15 μl w temperaturze 37 °C przez cały czas trwania reakcji PMCA. W celach statystycznych wymagane jest minimum trzech powtórzeń.</li>
	<li>Pozostałą część próbki (70 μl) poddać jednej rundzie PMCA, zgodnie z Rysunkiem 1, Panel A. Wstrząsać probówki co 5 h, aby uniknąć kondensacji wody na wypukłej zakrętce probówki PCR.</li>
	<li>Probówki z próbkami należy odwirować i delikatnie wymieszać w wibratorze (vortex), dbając o to, aby roztwór nie dostał się do wypukłej zakrętki, przed otwarciem po każdej procedurze, aby zapewnić homogeniczność i uniknąć potencjalnej kontaminacji.</li>
	<li>W przypadku seryjnego PMCA (sPMCA) dla szczepów o krótkim okresie inkubacji (tj. HY TME, HaCWD lub 263K), rozcieńczyć materiał poddany sonikacji w stosunku 1:20, przenosząc 5 μl zsonikowanej próbki z pierwszej rundy do 95 μl świeżego, niezarażonego homogenatu mózgowego (Rysunek 2, Panel B).</li>
	<li>W przypadku sPMCA dla szczepów o długim okresie inkubacji (tj. DY TME, 139H, 22CH, 22AH lub ME7H), rozcieńczyć materiał poddany sonikacji w stosunku 1:1, przenosząc 50 μl zsonikowanej próbki z pierwszej rundy do 50 μl świeżego, niezarażonego homogenatu mózgowego (Rysunek 2, Panel B).</li>
	<li>Pobrać dwa alikwoty po 15 μl z wcześniej rozcieńczonej zsonikowanej mieszaniny (z kroków 4.4 lub 4.5) i przechowywać jeden z nich w temperaturze -80 °C, a drugi w 37 °C (roztwory kontrolne niepoddane sonikacji dla drugiej rundy PMCA). Pozostałą część poddać drugiej rundzie PMCA.</li>
	<li>Procedurę tę można powtarzać w nieskończoność. W naszym laboratorium przeprowadziliśmy do piętnastu rund PMCA, przy czym właściwości szczepu pozostały niezmienione.</li>
	<li>Próbki poddać trawieniu PK. Dla typowego WB zmieszać 5 μl PK w stężeniu 80 μg/ml z 5 μl próbki (roztwór ten będzie miał końcowe stężenie PK 40 μg/ml) i inkubować w 37 °C przez jedną godzinę. Dodać 10 μl buforu do ładowania żelu. Gotować ten roztwór przez 10 min. Pozostawić roztwór do ostygnięcia i nałożyć 10 μl na żel.</li>
	<li>Aby obliczyć skuteczność amplifikacji, przeprowadzić analizę WB próbek poddanych trawieniu PK w celu oszacowania ilości amplifikowanego PrPSc, porównując je albo z kontrolami niepoddanymi sonikacji20,21 (Rysunek 2, Panel C), albo ze znanymi ilościami rekombinowanego PrP niepoddanego trawieniu PK.</li>
</ol>
5. Unikanie kontaminacji krzyżowej
Należy podjąć krytyczne środki w celu zminimalizowania kontaminacji krzyżowej oraz występowania wyników fałszywie dodatnich wynikających z tworzenia się produktów odpornych na proteazy de novo.
<ol>
	<li>Do pobierania próbek dla każdego szczepu prionów należy używać oddzielnego zestawu narzędzi do sekcji (np. pęset, szczypiec, nożyczek).</li>
	<li>Przed homogenizacją niezinfekowanych mózgów, które będą służyć jako podłoże PMCA, należy przetrzeć pipety 1% roztworem wybielacza. Statyw do probówek PCR sonikatora, homogenizatory tkanek oraz statywy do przechowywania probówek PCR należy moczyć w 1% roztworze wybielacza przez 10 min, a następnie dokładnie wypłukać wodą destylowaną.</li>
	<li>Obszar roboczy należy wyłożyć nową matą chłonną Versi-Dry Lab Soaker za każdym razem, gdy homogenizowana jest nowa próbka, przygotowywany jest nowy eksperyment PMCA lub podczas rozdzielania alikwotów pomiędzy rundami sPMCA.</li>
	<li>Należy zmieniać rękawiczki na nowe przy każdym kontakcie z nowymi próbkami (zwłaszcza podczas przenoszenia alikwotów pomiędzy rundami sPMCA).</li>
	<li>W każdym cyklu PMCA należy stosować krótkie serie sonikacji. Cykle składające się z 5 s sonikacji połączonej z 10 min inkubacji są wystarczające do amplifikacji prionów bez generowania PrPSc de novo 1,20,21,23,24. Jak wykazano w innych laboratoriach, wydłużenie czasu sonikacji, zwiększenie amplitudy sonikacji oraz zwiększenie liczby cykli PMCA zwiększa prawdopodobieństwo powstania PrPSc de novo2.</li>
</ol>

<ol><li>Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strain-encoded+relationship+between+PrP+replication%2C+stability+and+processing+in+neurons+is+predictive+of+the+incubation+period+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease.</a> PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).</li>
<li>Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+infectious+prions+in+vitro+produces+a+new+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype.</a> PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+physical+properties+of+the+prion+protein+from+two+strains+of+the+transmissible+mink+encephalopathy+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent.</a> J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+PrP+properties+suggest+the+molecular+basis+of+strain+variation+in+transmissible+mink+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy.</a> J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+biologically+distinct+strains+of+transmissible+mink+encephalopathy+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters.</a> J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).</li>
<li>Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+species+barrier+by+PrP%28Sc%29+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134, 757-768 (2008).</li>
<li>Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+propagation+of+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cell-free propagation of prion strains.</a> EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).</li>
<li>Caughey, B., Raymond, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scrapie-associated+form+of+PrP+is+made+from+a+cell+surface+precursor+that+is+both+protease-+and+phospholipase-sensitive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive.</a> J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).</li>
<li>Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+native+prions+from+minimal+components+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formation of native prions from minimal components in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+between+different+scrapie+agents+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Competition between different scrapie agents in mice.</a> Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).</li>
<li>Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+prions+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious prions in urine.</a> FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).</li>
<li>Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high+fidelity+prion+amplification+within+and+across+prion+species+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers.</a> PLoS Pathog. 4, e1000139(2008).</li>
<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+distribution+of+transmissible+mink+encephalopathy+virus+in+mink+inoculated+subcutaneously%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously.</a> J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).</li>
<li>Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+of+protease-resistant+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation of protease-resistant prion protein.</a> Nature. 370, 471-474 (1994).</li>
<li>Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-species+amplification+of+PrP%28CWD%29+and+correlation+with+rigid+loop+170N%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N.</a> Virology. 387, 3235-3240 (2009).</li>
<li>Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of scrapie prions.</a> J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).</li>
<li>Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protease-resistant+cervid+prion+protein+in+water+from+a+CWD-endemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area.</a> Prion. 3, 171-183 (2009).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216, 136-144 (1982).</li>
<li>Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+pathological+prion+protein+by+cyclic+amplification+of+protein+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.</a> Nature. 411, 810-813 (2001).</li>
<li>Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+treatment+of+soil-bound+prions+effectively+inhibits+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).</li>
<li>Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+efficiency+of+soil-bound+prions+varies+with+soil+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Schutt, C. R., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+interference+with+multiple+prion+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Prion interference with multiple prion isolates.</a> Prion. 2, 61-63 (2008).</li>
<li>Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infecting+prion+strains+compete+for+a+limiting+cellular+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource.</a> Journal of. 84, 5706-5714 (2010).</li>
<li>Shikiya, R. A., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+high+titer+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of high titer prions.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genuine+prion+infectivity+by+serial+PMCA%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+microbiology%22%5BJournal%5D)">Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA.</a> Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Wyzwania związane z amplifikacją zakaźnych białek prionowych to długie okresy inkubacji oraz koszty eksperymentów in vivo. Technika PMCA jest kosztowo efektywnym sposobem amplifikacji zakaźnych prionu. Kilka laboratoriów potwierdziło zdolność PMCA do dokładnej amplifikacji szczepów prionów in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24.
Choroby prionowe mogą być przenoszone między gatunkami. Bessen i Marsh skutecznie zaszczepili chomiki zapaleniem mózgu norków, co doprowadziło do po...

<table><tbody><tr><td>Misonix 3000</td><td>Misonix</td><td>S-3000</td><td></td></tr><tr><td>Misonix 4000</td><td>Misonix</td><td>S-4000</td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz tkanek Tenbr&amp;#8211;ck</td><td>Kontes</td><td>885000-0007</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna Neslab EX-7</td><td>Thermo Electron</td><td>Neslab EX-7</td><td></td></tr><tr><td>Strefy probówek PCR 0,2 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0451</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny inhibitor proteaz</td><td>Roche</td><td>11 697 498 001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-00</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Mallinckrodt Baker Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki laboratoryjne Versi-Dry</td><td>Fisher Scientific</td><td>14 206 28</td><td></td></tr><tr><td>Grzałka Repti Therm</td><td>Zoo Med Laboratories, Inc.</td><td>RH-4</td><td></td></tr></tbody></table>

cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek prionów

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Priony są czynnikami zakaźnymi, które wywołują nieuchronnie śmiertelne zaraźliwe encefalopatie gąbczaste (TSE) u zwierząt i ludzi9,18. Białko prionowe występuje w dwóch odrębnych izoformach: niezakaźnym białku kodowanym przez organizm gospodarza (PrPC) oraz białku zakaźnemu (PrPSc), które jest nieprawidłowo sfałdowaną izoformą PrPC 8.
Jednym z wyzwań związanych z pracą z agentami prionowymi jest długi okres inkubacji przed wystąpieniem objawów klinicznych po inokulacji gospodarza13. Tradycyjnie wymuszało to przeprowadzanie długotrwałych i kosztownych badań bioanalitycznych na zwierzętach. Ponadto właściwości biochemiczne i biofizyczne PrPSc są słabo scharakteryzowane ze względu na ich nietypową konformację i stany agregacji.
PrPSc może inicjować konwersję PrPC do PrPSc in vitro14. PMCA jest techniką in vitro, która wykorzystuje tę zdolność, stosując cykle sonikacji i inkubacji w celu produkcji dużych ilości PrPSc w przyspieszonym tempie, z układu zawierającego nadmiar PrPC i śladowe ilości zarodnika PrPSc19. Technika ta okazała się skuteczna w odtwarzaniu swoistości gatunkowej i szczepowej konwersji PrPC do PrPSc, emulowaniu interferencji szczepów prionów oraz amplifikacji bardzo niskich poziomów PrPSc z zakażonych tkanek, płynów i próbek środowiskowych6,7,16,23.
Niniejsza praca szczegółowo opisuje protokół PMCA, w tym zalecenia dotyczące minimalizacji kontaminacji, generowania spójnych wyników oraz ich kwantyfikacji. Omówiono również kilka zastosowań PMCA, w tym generowanie i charakterystykę zakaźnych szczepów prionów, interferencję szczepów prionów oraz detekcję prionów w środowisku.

Cykliczna amplifikacja błędnie sfałdowanych białek (PMCA) jest stosowana do amplifikacji PrPSc in vitro7, 12, 14, 19, 24. Pomyślną amplifikację PrPSc wykazuje wzrost intensywności prążka na analizach Western blot dla białka prionowego odpornego na PK (migrującego w zakresie od 19 do 30 kDa dla szczepów prionowych pochodzących od chomika), co przedstawiono na Rysunku 3. Wzrost intensywności tego prążka po PMCA wskazuje na amplifikację materiału PrPSc od...

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek (PMCA) jest testem in vitro służącym do badania konwersji prionów oraz barier szczepowych i gatunkowych. Może być również wykorzystywana jako test detekcji prionów.

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek prionów

Priony to czynniki zakaźne wywołujące nieuchronnie śmiertelną transmisyjną encefalopatię gąbczastą (TSE) u zwierząt i ludzi9,18. Białko prionowe...

Celem niniejszej procedury jest skuteczna amplifikacja in vitro szczepów PreOn zaadaptowanych do chomika. Osiąga się to poprzez wstępną homogenizację niezinfekowanego mózgu chomika, który służy jako substrat, a następnie przygotowanie zainfekowanej tkanki jako materiału posiewnego. Drugim krokiem jest wymieszanie substratu i materiału posiewnego w probówkach do PCR, a następnie przeprowadzenie cyklicznej amplifikacji błędnego zwijania białek (PMCA) poprzez cykle sonikacji i inkubacji.Następnie materiał amplifikowany rozcieńcza się świeżym substratem i poddaje seryjnej amplifikacji in vitro, a następnie przeprowadza procedurę PMCA. Na koniec próbki trawioną się proteinazą K, a następnie analizuje metodą western blot. Ostatecznie wzrost intensywności prążka w analizie western blot może służyć do określenia stopnia amplifikacji in vitro szczepu prionów.Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny PreOn, takie jak: jakie są istotne kofaktory zaangażowane w amplifikację PreOn? Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności jedynie z drobnymi, lecz ważnymi szczegółami technicznymi, a także z unikaniem zanieczyszczeń krzyżowych próbek. Przed homogenizacją należy przetrzeć pipety 1% roztworem wybielacza, a także nasączyć wybielaczem statywy do probówek PCR stosowane w sonikatorze, homogenizatory tkankowe oraz statywy do przechowywania probówek PCR.Po 10 minutach dokładnie wypłucz każdy element sprzętu wodą destylowaną, a następnie przykryj obszar roboczy nowym ręcznikiem chłonnym Verly dry lab Soaker. Następnie użyj homogenizatora tkankowego o pojemności 10 ml oraz świeżo przygotowanego, lodowatego buforu konwersyjnego, aby zhomogenizować niezakażony mózg chomika do uzyskania 10% roztworu masa/objętość. Użyj roztworu substratu PMCA, a następnie przelej homogenat do 15 ml probówek stożkowych i oczyść zhomogenizowany roztwór poprzez wirowanie przy 500 ×g przez 30 sekund.Następnie, uważając, aby nie pobrać frakcji z dużego osadu, przenieść otrzymany nadsącz do probówek mikrocentryfugalnych o pojemności 1,5 ml. Aby przygotować roztwór ziarna PMCA, zhomogenizować pobrany materiał zakaźny do stężenia 10% w/v w sposób przedstawiony powyżej, lecz stosując fosforanowy roztwór soli buforowej DPBS zamiast buforu konwersyjnego, a następnie rozdzielić roztwór do probówek mikrocentryfugalnych o pojemności 0,6 ml. Przed rozpoczęciem procedury amplifikacji wyłożyć obszar roboczy nowym, suchym podkładem laboratoryjnym, odmierzyć substrat PMCA do pasków probówek PCR o cienkich ściankach o pojemności 200 µL i rozcieńczyć w nich ziarno PMCA w stosunku 1:20; przygotować łącznie cztery powtórzenia w probówkach oznaczonych kolorem czerwonym.Do niebieskich probówek PCR należy przenieść dwie powtórki aliquotów o objętości 15 µL z każdej próbki, aby służyły jako nieuwięźne kontrolki przechowywane w -80 °C. Do kolejnych probówek PCR należy przenieść dodatkowe dwie powtórki aliquotów o objętości 15 µL z każdej próbki w celu przechowywania ich w 37 °C jako dodatkowe kontrolki nieuwięźne. Następnie nieuwięźne kontrolki -80 °C należy umieścić w zamrażarce w temperaturze -80 °C, a pozostałe kontrolki nieuwięźne w inkubatorze w temperaturze 37 °C na czas trwania reakcji PMCA.Teraz rozpocznij pierwszą rundę amplifikacji PMCA, umieszczając pasek probówek PCR zawierający pozostałe 70 µL każdej próbki w sonikatorze podłączonym do cyrkulacyjnej kąpieli wodnej ustawionej na stałą temperaturę 37 °C. Jako kontrolę negatywną w celu sprawdzenia wystąpienia zanieczyszczeń krzyżowych można dołączyć probówkę PCR zawierającą wyłącznie podłoże PMCA. Wypełnij nie więcej niż 30% pojemności uchwytu sonikatora, rozkładając probówki PCR w obrębie tuby sonikacyjnej. Zachowaj co najmniej jeden pusty rząd między paskami probówek PCR i nie łącz więcej niż czterech probówek w jednym pasku.Amplifikacja P-R-P-S-C różni się w obrębie tuby mikroplate. Najlepszą wydajność amplifikacji P-R-P-S-C uzyskuje się w promieniu pięciu centymetrów od centrum tuby mikroplate. Jedna runda PMCA składa się ze 144 cykli, z których każdy obejmuje pięć sekund sonikacji i 10 minut inkubacji, co zajmuje około 24 godzin na rundę PMCA; podczas sonikacji należy dostosować amplitudę tak, aby moc wyjściowa mieściła się w zakresie od 155 do 170 W.Umieść matę grzewczą do akwariów na pokrywie sonikatora, aby zapobiec kondensacji wody, która mogłaby doprowadzić do zanieczyszczenia krzyżowego próbek. Wstrząsaj probówkami co pięć godzin, aby uniknąć skraplania się wody na wypukłych zakrętkach probówek do PCR po zakończeniu cyklu. Wyjmij pasek probówek z urządzenia i odwiruj próbki.Następnie delikatnie wymieszaj probówki na wortexie, trzymając zakrętkę tak, aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas ich otwierania, co pozwoli dodatkowo zminimalizować ryzyko kontaminacji. Unikaj dotykania krawędzi probówki i kładź zakrętkę na czystym ręczniku papierowym Kimwipe. Następnie, w przypadku seryjnego PMCA szczepu PreOn, przenieś 5 µL zsonikowanej próbki do 95 µL świeżego podłoża PMCA.Do każdej próbki używaj nowych rękawiczek. Następnie pobierz dwie alikwoty po 15 µL z każdej z sonikowanych próbek; jedną alikwotę przechowuj w temperaturze -80 °C, a drugą w 37 °C. W przypadku roztworów kontrolnych niepoddanych sonikacji przeznacz pozostałe części do drugiej rundy PMCA, zgodnie z przedstawioną procedurą.Krok ten można powtarzać dowolną liczbę razy. W celu sprawdzenia wystąpienia zanieczyszczeń krzyżowych można dołączyć probówkę PCR zawierającą wyłącznie substrat PMCA z niezinfekowanego mózgu. Po sonikacji próbek przez pożądaną liczbę cykli, należy zmieszać 5 µL proteinazy K o stężeniu 18 µg/mL z 5 µL sonikowanej próbki, kontrolą -80 °C oraz kontrolą 37 °C w osobnych probówkach PCR, a następnie inkubować próbki w celu trawienia w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Następnie do trawionej próbki należy dodać 10 µL buforu do ładowania żelu i gotować roztwór przez 10 minut. Po ostygnięciu 10 µL mieszaniny próbki z buforem do ładowania nanosi się na żel do Western blotu. Aby określić ilość namnożonego P-R-P-S-C, należy porównać ilość próbki trawionej proteinazą K w analizie Western blot z kontrolami nietrawionymi lub z znanymi ilościami proteinazy.K: niestrawiony rekombinowany. P-R-P-C-P-M-C-A jest stosowany do amplifikacji P-R-P-S-C in vitro. Pomyślną amplifikację białka PreOn zaadaptowanego do chomika, CWD chomika i TME typu „drowsy” można zaobserwować w tej analizie Western blot, porównując intensywność prążków przed i po PMCA. Trawienie P-R-P-S-C proteinazą K, a następnie analiza Western blot, wykazuje prążek górny, środkowy i dolny, odpowiadadające odpowiednio diglikozylowanemu, monoglikozylowanemu i nieglikozylowanemu białku prionowemu. Niektóre szczepy PreOn można rozróżnić na podstawie ich mobilności elektroforetycznej.Na przykład, różnica w migracji między szczepami CWD chomika i TME drowsy PreOn wynosi dwa kilodaltony. Ta wysokowierna amplifikacja jest widoczna poprzez podobną migrację elektroforetyczną szczepu CWD chomika amplifikowanego metodą PMCA w porównaniu do odpowiadającego mu nasiona CWD chomika, a także w przypadku szczepu TME drowsy w porównaniu do jego nasiona TME drowsy. Jeśli nie dojdzie do kontaminacji krzyżowej ani do tworzenia się PrPSc de novo, próbki kontrolne PMCA OFM w analizie Western blot powinny pozostać czyste po trawieniu proteinazą K.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o oczyszczeniu każdego elementu sprzętu przed użyciem nowej próbki, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej.

protein-misfolding-cyclic-amplification-of-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wzmacnianie cykliczne nieprawidłowego fałdowania białka prionów

SDD-AGE jest użyteczną techniką wykrywania i charakteryzacji polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Przedstawiamy tutaj adaptację, która sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań na szeroką skalę.

Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

W niniejszej pracy opisujemy protokół oczyszczania wysoce aktywnego białka Hsp104, heksamerycznego białka AAA+ z drożdży, które sprzęga hydrolizę ATP z disagregacją białek. Schemat ten wykorzystuje konstrukt z oznakowaniem His6 do oczyszczania powinowactwa z E. coli, a następnie chromatografię wymiany anionowej, usunięcie znacznika His6 za pomocą proteazy TEV oraz chromatografię wykluczania cząsteczkowego.

Oczyszczanie Hsp104, białkowej dysagregazy

Inkubuj z enzymem proteolitycznym w celu trawienia normalnych prionów, pozostawiając nienaruszone odporne agregaty.

Wykrywanie nieprawidłowo sfałdowanych agregatów białkowych prionów w tkance mózgowej myszy za pomocą Western Blotting

Ten film opisuje test degradacji dla nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą leczenia cykloheksymidem wraz z frakcjonowaniem detergentem. Metoda ta pomaga w badaniu dynamiki nieprawidłowo sfałdowanych białek i odkrywaniu dogłębnych mechanizmów obrotu białkami.

Test degradacji białek podatnych na nieprawidłowe fałdowanie: technika monitorowania nieprawidłowo sfałdowanej degradacji białek przy użyciu obróbki cykloheksymidem i frakcjonowania detergentem

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Tutaj prezentujemy protokół opisujący prostą, szybką i efektywną technikę wzmacniania prionów, metodę konwersji indukowanej wstrząsami w czasie rzeczywistym (RT-QuIC).

Test konwersji wywołany wstrząsem w czasie rzeczywistym do wykrywania prionów CWD w materiale kałowym

Coraz więcej dowodów potwierdza tezę, że patogenne agregaty białkowe związane z chorobami neurodegeneracyjnymi rozprzestrzeniają się między komórkami z właściwościami podobnymi do prionów. W tym miejscu opisano metodę, która umożliwia wizualizację rozprzestrzeniania się między komórkami agregatów podobnych do prionów w organizmie modelowym Drosophila melanogaster.

Monitorowanie transmisji między komórkami priopodobnych agregatów białkowych u Drosophila melanogaster

Padlinożercy mają potencjał do przenoszenia zakaźnych prionów gąbczastej encefalopatii w swoim kale do obszarów wolnych od chorób.  Szczegółowo opisujemy metody stosowane do określenia, czy priony trzęsawki przystosowane do myszy pozostają zakaźne po przejściu przez przewód pokarmowy wron amerykańskich (Corvus brachyrhynchos), powszechnego konsumenta martwych zwierząt.

Procedury identyfikacji zakaźnych prionów po przejściu przez układ pokarmowy gatunku ptaków

Poznaj technikę PMCA do wzmacniania szczepów prionów in vitro przy użyciu mózgu chomika. Ta metoda umożliwia badanie konwersji prionów i barier gatunkowych w neurobiologii.

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek prionów

Przeglądaj więcej filmów