Name: Elektroporacje in ovo zarodków kurcząt w stadium 10 HH (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:29:01.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Poznaj technikę elektroporacji in ovo zarodków kurcząt w stadium HH 10 do manipulacji genetycznej. Ta metoda umożliwia badanie ekspresji genów w rdzeniu kręgowym i analizę funkcji genów w rozwoju układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obsługa jaj
<ol>
<li>Jaja można przechowywać w temperaturze 13°C do jednego tygodnia przed inkubacją bez znaczącej utraty żywotności (w tym celu idealna jest mała chłodziarka do wina).</li>
<li>Przed inkubacją należy pozwolić jajom ogrzać się do temperatury pokojowej, a następnie umieścić je w nawilżanym inkubatorze do jaj kurzych ustawionym na 37.8°C (100°F).</li>
<li>Elektroporację embrionów przeprowadzamy zazwyczaj około 48 godzin od rozpoczęcia inkubacji, gdy embrion osiągnie 10. stadium według skali Hamburgera i Hamiltona.</li>
<li>Czas inkubacji może się różnić w zależności od pożądanego stadium Hamburgera i Hamiltona. Temperatura ma krytyczne znaczenie, a odchylenie od optymalnej temperatury inkubacji zmieni czas inkubacji i zmniejszy żywotność embrionów.</li>
<li>Podczas inkubacji jaja powinny być ułożone na boku, aby embrion był odpowiednio ustawiony do elektroporacji. Embrion unosi się na powierzchni żółtka; przed wykonaniem okienka pomocne jest zaznaczenie górnej części jaja ołówkiem, aby wiedzieć, gdzie należy wykonać nacięcie.</li>
</ol>
Przygotowanie
<ol>
<li>Podgrzać pożywkę Leibovitz L-15 do 37°C. Wyciągnąć szklane kapilary w formie igieł. Ustawić elektrody oraz mikromanipulator i podłączyć elektrody do generatora impulsów.</li>
</ol>
Okienkowanie
<ol>
<li>Za pomocą strzykawki z igłą o dużym przekroju przebij skorupkę na wąskim końcu jaja.</li>
<li>Kierując igłę ostrożnie w dół, aby nie uszkodzić żółtka, odessać około 5ml albuminy.</li>
<li>Zamknąć otwór małym kawałkiem taśmy.</li>
<li>Przykryć górną część jaja innym kawałkiem taśmy (około 4x4 cm).</li>
<li>Za pomocą zakrzywionych nożyczek, dbając o to, by nie uszkodzić zarodka, wyciąć otwór wystarczająco duży, aby stworzyć okno robocze.</li>
</ol>
Opcjonalnie: Aby zwizualizować rurkę neuralną, należy wstrzyknąć roztwór atramentu za pomocą igły 26G pod embrion (wprowadzić igłę pod embrion z zewnątrz pierścienia krwi). Atrament indyjski powinien być rozcieńczony w stosunku 1:5 w roztworze Hanksa lub porównywalnym sterylnym roztworze buforowym.
Iniekcja i elektroporacja
<ol>
<li>Za pomocą pęsety odłam końcówkę kapilary do pożądanej średnicy.</li>
<li>Używając pipety ustnej, napełnij kapilarę plazmidem z barwnikiem Fast Green.</li>
<li>Ustaw embrion głową w swoją stronę i wprowadź igłę do rurki neuralnej pod niewielkim kątem.</li>
<li>Wstrzyknij roztwór plazmidu do światła rurki neuralnej, aż barwnik wypełni całą przestrzeń.</li>
</ol>
Uwaga: Należy uważać, aby końcówka nie była szersza niż średnica rurki neuralnej. Zazwyczaj o osiągnięciu optymalnej wielkości końcówki można sądzić po tym, jak łatwo lub trudno jest zassać ciecz do kapilary. W przypadku wystąpienia dużego oporu otwór jest prawdopodobnie zbyt mały i końcówka powinna zostać ponownie odłamana wyżej. Jeśli opór jest niewielki lub nie występuje, otwór jest zbyt duży i należy użyć nowej igły.
<ol>
<li>Nanieś jedną do dwóch kropli sterylnego medium L-15 na embrion.</li>
<li>Natychmiast umieść elektrody po obu stronach embrionu, równolegle do cewy nerwowej, i podaj 5 impulsów o napięciu 10-24 V przez 50 ms w odstępach 1 s. Jeśli procedura przebiegła prawidłowo, w pobliżu elektrod pojawią się pęcherzyki powietrza.</li>
<li>Ostrożnie usuń elektrody, nanieś 5 kropli medium L-15 na embriony i zabezpiecz jajo taśmą. Upewnij się, że jajo jest szczelnie zamknięte, ponieważ wysychanie jest główną przyczyną utraty embrionów po elektroporacji.</li>
<li>Umieść jaja z powrotem w inkubatorze, stroną z okienkiem do góry, i inkubuj do momentu osiągnięcia pożądanego stadium H&amp;H.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół stanowi szczegółowy przewodnik krok po kroku po elektroporacji cewy nerwowej zarodków kurzych w stadium HH10. Oprócz prezentacji techniki, przedstawiono również wytyczne dotyczące przechowywania i obchodzenia się z jajami. Technika ta znajduje szerokie zastosowanie w analizach genetycznych, a łatwość i niski koszt przeprowadzania eksperymentów czynią ją dostępną dla wielu laboratoriów.

<table><tbody><tr><td>Inkubator do jaj kurzych</td><td></td><td></td><td>nawilżany, ustawiony na 37.80&amp;#x00B0;C (100F). </td></tr><tr><td>Generator impulsów</td><td>Genetronics</td><td>BTX T820</td><td>Generator fali prostokątnej lub porównywalny</td></tr><tr><td>Elektrody</td><td></td><td></td><td>użyte elektrody wykonano z drutu platynowego o średnicy 0.25 mm; miały one długość 5 mm i były rozmieszczone w odstępach 1 mm</td></tr><tr><td>Kable połączeniowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop sekcyjny</td><td></td><td></td><td>z dużą odległością roboczą</td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td></td><td></td><td>oraz wyciągacz kapilar lub komercyjne igły szklane</td></tr><tr><td>Pożywka Leibovitz&amp;rsquo;s L-15</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jaja kurze</td><td></td><td></td><td>zapłodnione</td></tr><tr><td>Nożyczki zakrzywione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła o dużym przekroju</td><td></td><td></td><td>16-18G</td></tr><tr><td>Pipeta ustna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tusz indyjski</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa/strzykawka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazmidowe DNA</td><td></td><td></td><td>&amp;#8805; 1&amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;l w sterylnym buforze TE lub 1X PBS zawierającym 0.05% barwnika Fast Green</td></tr></tbody></table>

elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według hh

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Duże rozmiary oraz rozwój zewnętrzny zarodka kurczaka sprawiły, że od dawna jest on cennym narzędziem w badaniach nad biologią rozwoju. Wraz z pojawieniem się technik biologii molekularnej, kurczak stał się użytecznym systemem do badania regulacji i funkcji genów. Poprzez elektroporację konstruktów DNA lub RNA do rozwijającego się zarodka kurczaka, możliwe jest wywołanie ekspresji genów lub ich wyciszenie w celu analizy funkcji genów in vivo. Podobnie, konstrukty reporterowe mogą być wykorzystywane do mapowania losów komórek lub badania domniemanych elementów regulacyjnych genów. W porównaniu do analogicznych eksperymentów u myszy, elektroporacja u kurcząt ma zalety takie jak szybkość, łatwość wykonania i niski koszt. Niniejszy film demonstruje najpierw, jak wykonać okno w skorupce jaja w celu manipulacji zarodkiem. Następnie zarodek jest wizualizowany za pomocą wstrzykniętego pod niego rozcieńczonego roztworu tuszu indyjskiego. Szklana igła i pipeta służą do wstrzyknięcia DNA oraz barwnika Fast Green do rozwijającej się cewy nerwowej, a następnie elektrody platynowe są umieszczane równolegle do zarodka i za pomocą generatora impulsów podawane są krótkie impulsy elektryczne. Na koniec jajo jest uszczelniane taśmą i umieszczane z powrotem w inkubatorze w celu dalszego rozwoju. Ponadto film przedstawia prawidłowe przechowywanie i obchodzenie się z jajami oraz omawia możliwe przyczyny utraty zarodków po elektroporacji.

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

Duży rozmiar oraz rozwój zewnętrzny zarodka kurczego sprawiły, że od dawna jest on cennym narzędziem w badaniach nad biologią rozwoju. Wraz z pojawieniem się...

Kurczęta stanowią dobry system modelowy, ponieważ embriony są bardzo podatne na manipulacje, a ich duży rozmiar sprawia, że praca z nimi jest znacznie łatwiejsza niż w przypadku innych embrionów. Eksperymenty z elektroporacją kurcząt pozwalają również na przesiewanie dużej liczby genów w krótkim czasie. Cześć, jestem Marissa Blank.Jestem doktorantką w laboratorium Kathy Millon na Katedrze Genetyki Ludzkiej na Uniwersytecie w Chicago. Dzisiaj opowiem Państwu o tym, jak przeprowadzić elektroporację in ovo u kurczaka; będziemy elektroporować embriony kurczęce w stadium 10 według Hamiltona, co odpowiada około dwóm dniom rozwoju embrionalnego. Procedura ta jest rutynowo wykonywana w naszym laboratorium, a zazwyczaj badamy wpływ nadekspresji lub wyciszenia genów w rdzeniu kręgowym, ponieważ interesują nas geny zaangażowane w rozwój ośrodkowego układu nerwowego.Technika elektroporacji in ovo, którą zaprezentuję dzisiaj, składa się z kilku etapów. Pierwszym krokiem będzie wykonanie okna w skorupce jaja. Drugim krokiem będzie właściwa iniekcja DNA do światła cewy nerwowej.Trzecim krokiem będzie wykorzystanie pola elektrycznego do wprowadzenia DNA do jednej strony cewy nerwowej. Następnie po

in-ovo-electroporations-of-hh-stage-10-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Elektroporacja in ovo zarodków kurczaka w stadium HH 10

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Opisano metodę transferu genów do embrionów kurcz uklutych na późniejszych etapach inkubacji (starszych niż stadium Hamburgera i Hamiltona (HH) 22). Metoda ta eliminuje wady elektroporacji in ovo stosowanej u starszych embrionów kurczych i stanowi przydatną technikę badania funkcji i regulacji genów na późniejszych etapach rozwoju.

Transfer genów do starszych zarodków kur w metodzie elektroporacji ex ovo

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Jak sieci neuronowe są tworzone w embrionalnym mózgu, jest fundamentalnym pytaniem w neurobiologii rozwojowej. Połączyliśmy technikę elektroporacji z nowatorskimi narzędziami genetycznymi, takimi jak plazmidy Cre/Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac w tyłomózgowiu ptaków, aby oznaczyć interneurony grzbietowe i śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne na różnych etapach rozwoju.

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Narząd słuchowy pośredniczy w słyszeniu. W niniejszej pracy przedstawiono zmodyfikowaną metodę mikroelektroporacji in ovo zoptymalizowaną do badania proliferacji i różnicowania słuchowych komórek progenitorowych w rozwijającym się narządzie słuchowym kurcząt.

Transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Opisujemy elektroporację informacyjnego RNA (mRNA) jako metodę, która pozwala na szybką i efektywną ekspresję wielu białek w systemie modelowym zarodka przepiórki. Metoda ta może być stosowana do fluorescencyjnego znakowania komórek i rejestrowania ich ruchów in vivo za pomocą mikroskopii poklatkowej wkrótce po elektroporacji.

Szybka i wydajna ekspresja wielu białek w zarodkach ptaków za pomocą elektroporacji mRNA

Niniejszy film demonstruje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów Drosophila w stadium środkowej gastruli. Widoki żywych kultur przedstawiają komórki 1 godzinę po wysianiu oraz zróżnicowane neurony po 2 dniach wzrostu w zdefiniowanym medium opartym na wodorowęglanach. Neurony te są elektrycznie pobudliwe i tworzą połączenia synaptyczne.

Przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium środkowej gastruli

Poznaj technikę elektroporacji in ovo zarodków kurcząt w stadium HH 10 do manipulacji genetycznej. Ta metoda umożliwia badanie ekspresji genów w rdzeniu kręgowym i analizę funkcji genów w rozwoju układu nerwowego.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

Przeglądaj więcej filmów