Konwersja testu ELISA wychwytującego do testu Luminex xMAP przy użyciu metody przesiewowej przeciwciał multipleksowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest konwersja wstępnie zoptymalizowanego testu Eliza dla cytokin TNF alfa na platformę Xap przy jednoczesnej ocenie alternatywnych par przeciwciał. Osiąga się to poprzez sprzężenie przeciwciała wychwytującego z zestawu ELIZA wraz z trzema innymi potencjalnymi przeciwciałami wychwytującymi do czterech różnych zestawów mikrosfer lub kulek po zmieszaniu ze sobą. Te cztery zestawy pozwalają na jednoczesne testowanie wszystkich czterech kandydatów z czterema oddzielnymi przeciwciałami wykrywającymi w celu określenia najlepszej pary przeciwciał.

Następnie konstruowane są dwa testy Xap z dwiema najbardziej optymalnymi parami przeciwciał. Wydajność testów jest następnie porównywana z oryginalną wydajnością testu EISA pod względem siły sygnału, zakresu dynamicznego i czułości. Wyniki pokazują, że podobne przeciwciała mogą działać bardzo różnie w tych samych warunkach i że kilka przeciwciał może być jednocześnie badanych przesiewowo za pomocą testu Luminex Xap, co pokazuje, że test ma zwiększoną czułość i zakres dynamiczny w porównaniu z EISA.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak EIS A, jest to, że testy immunologiczne oparte na xap pozwalają badaczowi testować wiele celów lub, jak w tym przypadku, testować wiele przeciwciał jednocześnie. Aby zidentyfikować najlepsze wykazane przeciwciało. Procedurę przeprowadzi Erica Lopez, naukowiec z Luminex Corporation.

Rozpocznij ten protokół od wyboru i przygotowania czterech przeciwciał wychwytujących i czterech przeciwciał wykrywających specyficznych dla ludzkiego TNF alfa, zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Należy również przygotować jedno przeciwciało potwierdzające specyficzne dla gatunku gospodarza przeciwciał wychwytujących. Doprowadź odczynniki w zestawie sprzęgającym przeciwciała do temperatury pokojowej.

Oznaczyć cztery probówki reakcyjne numerami regionów kulek wybranych dla reakcji sprzęgania. Przenieść zawartość czterech fiolek z mikrosferami mag plex do czterech znakowanych probówek reakcyjnych. Przemyć każdy z zestawów kulek dwukrotnie w 500 mikrolitrach buforu aktywacyjnego i aktywować każdy zestaw kulek roztworami siarczków ONHS i EDC, jak opisano w zestawie do sprzęgania przeciwciał.

Instrukcja obsługi Po 20-minutowej inkubacji na rotatorze powtórz poprzedni krok mycia z teraz aktywowanymi kulkami w sumie trzy razy z 500 mikrolitrami buforu aktywacyjnego. Do każdego prania przygotuj cztery oddzielne roztwory o pojemności 500 mikrolitrów. Każdy z nich zawiera 7,5 mikrograma buforu do inaktywacji przeciwciał wychwytujących.

Dodaj te cztery roztwory przeciwciał wychwytujących do odpowiednich probówek reakcyjnych. Natychmiast wymieszaj każdą probówkę i inkubuj przez dwie godziny na rotatorze. Powtórz etap mycia z teraz kilkoma kulkami w sumie trzy razy z 500 mikrolitrami buforu do płukania dołączonego do zestawu sprzęgającego przeciwciała.

Po ostatnim etapie płukania dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania do każdej probówki reakcyjnej, aby uzyskać końcowe stężenie 5 milionów kulek sprzężonych z przeciwciałami na mililitrowy wir, a następnie poddaj sonikę probówkom reakcyjnym, aby rozproszyć kulki. Policz liczbę kulek odzyskanych po reakcji sprzęgania za pomocą licznika komórek lub hemocytometru. Powrót do zdrowia po reakcji sprzęgania wynosi zwykle ponad 90%Potwierdź, że reakcja sprzęgania zakończyła się sukcesem, przygotowując roztwory testowe sprzężonych kulek dla każdego zestawu o końcowym stężeniu 100 kulek na mikrolitr w buforze testowym, przygotuj rozcieńczenie gatunków antys oznaczonych FICO.

Przeciwciało potwierdzające IgG w stężeniu czterech mikrogramów na mililitr w buforze testowym podajemy 50 mikrolitrów każdego roztworu testowego do czterech dołków 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem, co daje w sumie 16 dołków. Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu testowego do ośmiu studzienek w celu zmierzenia tła i 50 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała potwierdzającego do ośmiu pozostałych studzienek. Delikatnie wymieszać reakcje, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipetera wielokanałowego.

Przykryj płytkę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce do płytek. Umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytkowym na jedną do dwóch minut, aby wyciągnąć kulki z roztworu. Następnie usuń płyn, mocno odwracając płytkę znajdującą się na separatorze nad pojemnikiem na odpady.

Przemyć każdą studzienkę dwukrotnie, dodając 100 mikrolitrów buforu do oznaczania i usuwając SANE z płytki w podobny sposób. Za pomocą magnetycznego separatora płytkowego ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu testowego, delikatnie pipetując pięć razy w górę iw dół za pomocą pipetera wielokanałowego. Analizuj na instrumencie luminex xap, takim jak instrument magix.

Intensywność sygnału fluorescencyjnego tej reakcji jest wprost proporcjonalna do ilości białka na powierzchni kulek, zapewniając szybką ocenę względnej ilości białka sprzężonego z kulkami. Aby określić najskuteczniejszą parę przeciwciał w teście xap, przygotuj początkową mieszaninę wszystkich czterech zestawów kulek, dodając 10 mikrolitrów każdego z nich do 0,96 mililitra buforu testowego. Przygotować roztwory przeciwciał wykrywających, rozcieńczając każde przeciwciało do jednego mikrograma na mililitr w buforze do oznaczania.

Również bufor testowy. Przygotować wzorc białka alfa TNF w układach r i d przy 2000 pikogramach na mililitr i rozcieńczyć erynę Streptawidyny R FICO do ośmiu mikrogramów na mililitr. Dodać 50 mikrolitrów mieszaniny kulek sprzężonych z przeciwciałami do każdego z 16 dołków 96-dołkowej płytki CoStar z okrągłym dnem do testu przesiewowego.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu testowego do ośmiu z 16 studzienek, aby zmierzyć tło. Następnie odpipetuj 50 mikrolitrów wzorca alfa TNF do pozostałych ośmiu studzienek, aby zmierzyć odpowiedź. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, wytrząsając na wytrząsarce na płytce do oznaczania.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów każdego z czterech przeciwciał wykrywających do czterech studzienek, z których dwie są studzienkami tła, a dwie z nich są studzienkami odpowiedzi. Inkubować przez 30 minut w tych samych warunkach po dodaniu 50 mikrolitrów odczynnika SAPE do wszystkich studzienek. Inkubować ponownie przez 15 minut w tych samych warunkach.

Umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytowym na jedną minutę. Następnie usuń płyn, mocno odwracając płytkę znajdującą się na separatorze nad pojemnikiem na odpady. Odpipetować 100 mikrolitrów buforu testowego do każdej z 16 studzienek.

Następnie usuń płyn z kulek za pomocą separacji magnetycznej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu testowego do każdego z 16 dołków. Przeczytaj tabliczkę z przyrządem do wybierania magazynków Luminex, odwołując się do instrukcji obsługi, aby uzyskać prawidłowe działanie.

Wybierz parę przeciwciał, która spełnia żądaną siłę sygnału. Po wybraniu najlepszego do wychwycenia przeciwciała, rozcieńczyć 100 mikrolitrów tego przeciwciała sprzężonego z biczem do 10 mililitrów z buforem testowym. Dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonych kulek do 78 dołków dwóch okrągłodennych 96-dołkowych płytek CoStar.

Każda płytka zostanie wykorzystana do oceny działania innego przeciwciała wykrywającego. Następnie przygotuj 12-punktową krzywą standardową zaczynającą się od 8 000 pikogramów na mililitr i kończącą na czterech pikogramach na mililitr. Z systemami badawczo-rozwojowymi.

Wzorzec TNF Alpha dodaje sześć 50-mikrolitrowych powtórzeń każdego rozcieńczenia do każdej z płytek oraz sześć studzienek z 50 mikrolitrami buforu testowego każdy jako tło, co daje w sumie 78 dołków na płytkę. Inkubować płytki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem, wytrząsając na wytrząsarce do płytek testowych. Następnie dodaj 50 mikrolitrów przeciwciała pierwszego wykrywania do wszystkich 78 dołków pierwszej płytki.

Powtórzyć te czynności dla drugiego przeciwciała wykrywającego na drugiej płytce. Inkubować płytki przez 30 minut w tych samych warunkach. Następnie dodaj 50 mikrolitrów odczynnika SAPE do wszystkich dołków każdej płytki.

Po potrząsaniu dwiema płytkami przez 15 minut, chronionymi przed światłem, umieść płytki na magnetycznych separatorach płytowych na jedną minutę. Usuń płyn, mocno odwracając płytkę, gdy znajduje się na separatorze nad pojemnikiem na odpady. Następnie odpipetuj 100 mikrolitrów buforu testowego do każdego z 78 dołków na płytkach przed usunięciem cieczy z kulek magnetycznych.

Po dodaniu stu mikrolitrów buforu testowego do kulek w każdym z 78 dołków na płytkach, przeanalizuj płytki na przyrządzie do wybierania mag, odnosząc się do instrukcji obsługi, aby zapewnić prawidłowe działanie. Postępując zgodnie z instrukcjami dołączonymi do systemów r i d, człowiek TNF Alpha T NF SF jeden zestaw DUO ELI A kit. Zmierz odpowiedź wygenerowaną przez normę dostarczoną z zestawem do badań i rozwoju.

Powtórzyć test ELI A jeszcze trzy razy, zastępując przeciwciała wychwytywane i wykrywające w systemach badań i d przeciwciałami innych dostawców. Dla uproszczenia sparuj przeciwciała według dostawcy, oceń każdą parę niezależnie, zgodnie z wymogami formatu EISA z każdym z trzech standardów białka TNF Alfa. Testy Luminex Xap przeprowadzono jako multipleks w celu oceny wszystkich czterech przeciwciał wychwytujących jako mieszaniny poprzez połączenie czterech zestawów przeciwciał TNF alfa sprzężonych z mikrosferami Mag PLX, przeciwciała wychwytywane oceniano indywidualnie dla każdego z czterech biotynylowanych przeciwciał wykrywających, tak aby można było jednocześnie określić interakcję jednego przeciwciała wykrywającego z każdym z czterech przeciwciał wychwytujących.

Wyniki wykazały, że para przeciwciał z zestawu DUO systemów r i d działała najlepiej z uzyskaną odpowiedzią na poziomie 6 183 mediany intensywności fluorescencji lub jednostek MFI. Zaobserwowano również, że przeciwciała wykrywające z Millipore i ABAM zapewniły rozsądną odpowiedź w teście XAP, gdy w połączeniu z przeciwciałami wychwytującymi w systemach RD, przeciwciała wychwytujące z Millipore, ACAM i Novus wytworzyły mniej pożądaną odpowiedź w teście XAP. Do porównania czterech par przeciwciał w formacie EISA wykorzystano protokół zestawu DUO systemów r i d.

Protokół systemów badawczo-rozwojowych został użyty ze wszystkimi parami przeciwciał, ponieważ odzwierciedla typowe protokoły EIA powszechnie stosowane obecnie i jest analogiczny do protokołów stosowanych w technologii xap. Testy EISA wykazały, że para przeciwciał z układów r i d ponownie dała najlepsze wyniki. Para przeciwciał z Acam nie wywołała żadnej odpowiedzi, a pary przeciwciał z Millipore i Novas dały skromną odpowiedź w celu oceny wszelkich zmian w reaktywności przeciwciał.

W przypadku standardu wszystkie cztery pary przeciwciał zostały przetestowane z trzema różnymi wzorcami rekombinowanego białka TNF alfa od trzech różnych dostawców. Dane pokazują, że rekombinowane wzorce białka TNF alfa od trzech dostawców dały równoważne wyniki. Białko TNF alfa z systemów badawczo-rozwojowych wykorzystano do wygenerowania krzywych standardowych za pomocą testów ELSA i XAP.

Podczas gdy test ELI A został wykonany z parą przeciwciał systemu r i d, testy xap wykorzystywały przeciwciało wychwytujące systemu r i d oraz przeciwciało wykrywające z systemów r i d lub Millipore. Białko TNF alfa z układów badawczo-rozwojowych rozcieńczono w celu uzyskania zakresu stężeń od 8 000 do czterech pikogramów na mililitr. Para przeciwciał z systemów r i d dała oczekiwany wynik w teście Xap z odpowiedzią większą niż 20 000 MFI, jak pokazano.

Gdy przeciwciało detekcyjne firmy Millipore zostało użyte z testem Xap zamiast przeciwciała wykrywającego systemy r i d, odpowiedź wynosiła około 30% odpowiedzi uzyskanej za pomocą przeciwciała wykrywającego z systemów RD. Zielona linia na tym wykresie reprezentuje standardową krzywą ELA, która miała zalecany przez producenta zakres alfa TNF od 16 do 1000 pikogramów na mililitr. Ze względu na limit spektrofotometru nie było możliwe zwiększenie zasięgu testu Eliza.

Co więcej, zakres dynamiki i czułość obu metod jest lepiej zilustrowany, gdy są wykreślone w skali logarytmicznej. Można zauważyć wyraźne rozróżnienie między nachyleniem odpowiedzi EISA a odpowiedziami z testów xap, co dodatkowo wskazuje na bardziej ograniczoną zdolność wykrywania TNF alfa za pomocą EL iza zarówno przy wyższych, jak i niższych stężeniach. Granice wykrywalności lub LOD dla dwóch funkcjonalnych testów TNF alpha xap zostały przybliżone poprzez zidentyfikowanie najniższego stężenia TNF alfa z obserwowanym poziomem odpowiedzi większym niż tło, plus trzykrotność jego odchylenia standardowego lub SD od sześciu powtórzeń.

W tym miejscu można zaobserwować, że przy użyciu pary systemów r i d najniższe stężenie TNF alfa na poziomie 3,91 pikogramów na mililitr wywołało odpowiedź 66 MFI, czyli większą niż odpowiedź dla tła plus trzy spotkania SD. To kryterium. Gdy przeciwciało wykrywające milipory było używane z przeciwciałem wychwytywającym systemy r i d, granica wykrywalności wynosiła mniej niż 7,81 pikogramów na mililitr.

W tym przypadku drugie najniższe stężenie TNF alfa wytworzyło akceptowalną odpowiedź 17 MFI większą niż odpowiedź najniższego stężenia TNF alfa plus trzykrotność jego odchylenia standardowego. Podobnie, granica wykrywalności dla zestawu systemów badawczo-rozwojowych Eliza została oszacowana na od 63 do 31 pikogramów na mililitr. Po tej procedurze można wykonać inne kroki, takie jak testowanie, różne matryce próbek lub stężenia przeciwciał w reporterze, w celu dalszej optymalizacji testu xap.