Name: Konwersja testu ELISA wychwytującego do testu Luminex xMAP przy użyciu metody przesiewowej przeciwciał multipleksowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Poznaj konwersję testu ELISA do platformy Luminex xMAP przy użyciu metody przesiewowej przeciwciał multipleksowych. Technika ta umożliwia jednoczesne testowanie wielu par przeciwciał dla cytokiny TNF Alpha, zwiększając czułość i zakres dynamiczny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez Luminex Corporation.

<ol><li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li>
<li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li>
<li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+gene+expression+signature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput gene expression signature analysis.</a> Genome Biol. 7, 61(2006).</li>
<li>VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+extract+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+from+Schirmer+strips+and+analyze+using+Luminex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex.</a> Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).</li>
<li>Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+reverse+transcription+PCR+Luminex+assay+for+detection+and+quantitation+of+viral+agents+of+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis.</a> J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).</li>
<li>de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+multiplex+immunoassay+performance+in+human+plasma+and+synovial+fluid+following+removal+of+interfering+heterophilic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).</li>
<li>Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+xMAP+and+ELISA+cytokine+profiles%3B+development+and+validation+for+immunotoxicological+studies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Roum.+Arch.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro.</a> Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li>
<li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li>
<li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA%3A+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li>
<li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li>
<li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li>
</ol>

Praca ta została wykonana w Luminex Corporation przy użyciu sprzętu wyprodukowanego przez Luminex Corporation.
Firmy R&amp;D Systems oraz EMD Millipore są strategicznymi partnerami Luminex Corporation i posiadają licencję na opracowywanie oraz komercjalizację testów multipleksowych opartych na technologii xMAP.

Konwersja testu ELISA na platformę Luminex xMAP może być tak prosta, jak zastąpienie streptawidyny z peroksydazą chrzanową (SA-HRP) w typowym zestawie ELISA streptawidyną z fikoerytryną (SA-PE) i optymalizacja parametrów wydajności. Dla osób pragnących stworzyć immunoassay xMAP od podstaw, można to osiągnąć za pomocą prostego protokołu, który umożliwia również szybką, multipleksową ocenę par przeciwciał. Odczynniki do testu xMAP zostały łatwo przygotowane przy użyciu zestawu xMAP Antibody Coupling w celu sprzężenia wybranych przeciwciał wychwytujących z mikrosfer MagPlex o niskim stężeniu. Zastosowanie mikrosfer o niskim stężeniu obniża koszty opracowania testu, zapewniając jednocześnie taką samą wydajność, jak w przypadku mikrosfer o wyższym stężeniu. Czas wymagany do przygotowania sprzężonych mikrosfer MagPlex wynosi około 3 godzin, co jest znacznie szybsze niż 22 - 24 godziny wymagane do pokrycia dołków płytki ELISA, a następnie ich obróbki. Wydajność testu xMAP jest również wyższa niż w przypadku ELISA pod względem granicy wykrywalności (&lt;4 pg/mL vs. &gt;31 pg/mL) oraz zakresu dynamicznego (&lt;4 pg/mL do &gt;8000 pg/mL vs. 16 pg/mL do 1000 pg/mL). Czytniki płytek mają ograniczony zakres OD, wynoszący 3 lub 4 OD, co ogranicza górną granicę zakresu dynamicznego testu.
Bez wątpienia nie wszystkie przeciwciała będą działać w formacie ELISA, a nie wszystkie przeciwciała, które dobrze sprawdzają się w teście ELISA, można łatwo przenieść do formatu testu xMAP. Jednakże, ponieważ testy xMAP mogą być wykonywane w trybie multipleksowym (tj. jednocześnie), możliwe jest jednoczesne ocenienie kilku kombinacji przeciwciał wychwytujących i detekcyjnych w celu zidentyfikowania najlepszej pary do zastosowania w analizie. Proces ten pozwala zaoszczędzić znaczną ilość czasu i odczynników w porównaniu z procedurą opracowywania testu ELISA, która ogranicza się do oceny jednej pary na raz. W przypadku gdy dwie lub więcej par przeciwciał wykażą równoważną skuteczność, można rozważyć inne parametry testu, aby określić odpowiedniość danej pary (np. dostępność, koszt itp.).
Oprócz poprawy wydajności i elastyczności analizy xMAP, możliwe są również znaczne oszczędności kosztów. Zalecana ilość przeciwciał potrzebna do pokrycia jednej studzienki płytki ELISA wynosi 400ng, podczas gdy ilość wymagana dla kulek użytych w jednej studnience analizy xMAP to około 7,5 ng. Zatem ilość przeciwciał potrzebna do jednej studzienki ELISA pozwoli na uzyskanie ponad 50 wyników testów, jeśli zostanie wykorzystana w analizie xMAP. W zastosowaniach obejmujących cenne próbki xMAP ma również znaczącą przewagę. Objętość próbki zalecana dla metody ELISA to 100 μL, podczas gdy objętość wymagana dla analizy xMAP może być o połowę mniejsza lub jeszcze niższa.
Podsumowując, konwersja testu ELISA na platformę Luminex xMAP jest prosta, wydajna i ekonomiczna, a jednocześnie pozwala na opracowanie testu o szerszym zakresie dynamicznym i wyższej czułości.

<table><tbody><tr><td>Zestaw ELISA Human TNF-&amp;alpha;/TNFSF1A DuoSet</td><td>R D Systems</td><td>DY210</td><td>Zawiera przeciwciała monoklonalne i poliklonalne sprzężone z biotyną oraz rekombinowany standard białka TNF-&amp;alpha;</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne przeciw TNF-&amp;alpha;</td><td>Abcam</td><td>Ab18696</td><td>Przeciwciało chwytające, klon CH8820</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne przeciw TNF-&amp;alpha;</td><td>Abcam</td><td>Ab16166</td><td>Przeciwciało detekcyjne sprzężone z biotyną, klon AS1</td></tr><tr><td>Białko TNF alfa</td><td>Abcam</td><td>Ab9642</td><td>Rekombinowany standard białka TNF-&amp;alpha;</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne przeciw TNF-&amp;alpha;</td><td>Novus</td><td>NBP1-50115</td><td>Przeciwciało chwytające, klon 4H31</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne przeciw TNF-&amp;alpha;</td><td>Novus</td><td>NB100-78162</td><td>Przeciwciało detekcyjne sprzężone z biotyną, klon MAb11</td></tr><tr><td>Białko TNF alfa</td><td>Novus</td><td>NBC1-18460</td><td>Rekombinowany standard białka TNF-&amp;alpha;</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne przeciw TNF-&amp;alpha;</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1141</td><td>Przeciwciało chwytające, klon 3C7.2</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne przeciw TNF-&amp;alpha;</td><td>EMD Millipore</td><td>654250</td><td>Królicze poliklonalne przeciwciało detekcyjne</td></tr><tr><td>Streptawidyna-Fyk&amp;#8211;erytryna</td><td>Moss</td><td>SAPE-001</td><td>Fluorescencyjny odczyn raportujący do analizy Luminex xMAP</td></tr><tr><td>MAGPIX z oprogramowaniem xPONENT</td><td>Luminex Corporation</td><td>MAGPIX-XPONENT</td><td>Urządzenie Luminex</td></tr><tr><td>Zestaw do sprzęgania przeciwciał xMAP (AbC)</td><td>Luminex Corporation</td><td>40-50016</td><td>Zawiera odczyn EDC, odczyn Sulfo-NHS, bufor aktywacyjny, bufor do mycia, probówki reakcyjne 1,5 mL i pipety jednorazowe</td></tr><tr><td>Mikrosfery MagPlex, niskie stężenie</td><td>Luminex Corporation</td><td>MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID</td><td>Kulek o niskim stężeniu (@ 2,5 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; kulek/mL)</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI-21335</td><td>Zestaw do biotynylacji niemodyfikowanych przeciwciał detekcyjnych</td></tr><tr><td>Czytnik Tecan Infinite F200</td><td>Tecan</td><td></td><td>Czytnik płytek ELISA</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3688</td><td>1% PBS-BSA, bufor do analizy</td></tr><tr><td>Kompaktowa myjka ultradźwiękowa One-Pint, 115 VAC</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-08849-00</td><td>Zapewnia efektywną częstotliwość pracy 55 kHz</td></tr><tr><td>Magnetyczny separator do probówek</td><td>Luminex Corporation</td><td>CN-0288-01</td><td>Do separacji magnetycznej pojedynczej probówki 1,5 mL w etapach mycia podczas sprzęgania</td></tr><tr><td>Magnetyczny separator do płytek</td><td>Luminex Corporation</td><td>CN-0269-01</td><td>Do separacji magnetycznej płytek 96-dołkowych w etapach mycia podczas analizy</td></tr></tbody></table>

konwersja testu elisa typu capture na test luminex xmap z wykorzystaniem metody wielipleksowego przesiewania przeciwciał

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Test immunoenzymatyczny (ELISA) od dawna stanowi główne narzędzie do wykrywania interesujących analitytów w próbkach biologicznych, zarówno w badaniach nad naukami o życiu, jak i w diagnostyce klinicznej. Metoda ELISA posiada jednak pewne ograniczenia. Zazwyczaj jest ona przeprowadzana w mikropłytce 96-dołkowej, a dołki są pokryte przeciwciałem wychwytującym, co wymaga stosunkowo dużej ilości próbki w celu wychwycenia interesującego antygenu. Duża powierzchnia dołków oraz hydrofobowe wiązanie przeciwciała wychwytującego mogą również prowadzić do niespecyficznego wiązania i zwiększenia tła. Ponadto większość testów ELISA opiera się na enzymatycznej amplifikacji sygnału w celu uzyskania odpowiedniej czułości. Taka amplifikacja nie zawsze jest liniowa, co może prowadzić do zafałszowania wyników.
W ciągu ostatnich 15 lat pojawiła się nowa technologia, która oferuje zalety testu ELISA, a jednocześnie umożliwia wyższą przepustowość, większą elastyczność, zmniejszenie objętości próbki oraz niższe koszty, przy zachowaniu podobnego schematu postępowania 1, 2. Technologia Luminex xMAP to platforma macierzy mikrocząsteczek (kuleczek), umożliwiająca przeprowadzanie analiz monopleksowych i multipleksowych, które mogą być stosowane zarówno w aplikacjach białkowych, jak i kwasów nukleinowych 3-5. Kuleczki mają przeciwciało wychwytujące unieruchomione kowalencyjnie na mniejszej powierzchni, co w porównaniu z testem ELISA wymaga mniejszej ilości przeciwciała wychwytującego i mniejszych objętości próbek, a wiązanie nieswoiste jest znacznie zredukowane. Mniejsze objętości próbek są istotne podczas pracy z próbkami o ograniczonej ilości, takimi jak płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn stawowy itp. 6. Multipleksowanie analizy dodatkowo zmniejsza wymagania dotyczące objętości próbki, umożliwiając uzyskanie wielu wyników z jednej próbki.
Ostatnie ulepszenia wprowadzone przez firmę Luminex obejmują: nowy system MAGPIX, będący mniejszym, tańszym i łatwiejszym w obsłudze analizatorem; magnetyczne mikrosfery MagPlex o niskim stężeniu (Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres), które eliminują potrzebę stosowania kosztownych płytek filtrujących i są dostępne w stężeniu roboczym lepiej dostosowanym do opracowywania testów oraz zastosowań o niskiej przepustowości; oraz zestaw xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, który zawiera protokół, odczynniki i materiały eksploatacyjne niezbędne do sprzęgania kulek z wybranym przeciwciałem wychwytującym. (Szczegółową listę zawartości zestawu można znaleźć w sekcji Materiały).
W niniejszym eksperymencie przenosimy zoptymalizowany test ELISA dla cytokiny TNF-alpha na platformę xMAP i porównujemy wydajność obu metod 7-11. TNF-alpha jest biomarkerem stosowanym w pomiarze odpowiedzi zapalnych u pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi.
Proces rozpoczynamy od sprzężenia czterech kandydackich przeciwciał wychwytujących z czterema różnymi zestawami lub regionami mikrokürełek. Po wymieszaniu te cztery zestawy umożliwiają jednoczesne testowanie wszystkich czterech kandydatów przy użyciu czterech oddzielnych przeciwciał detekcyjnych w celu wyłonienia najlepszej pary przeciwciał, co pozwala zaoszczędzić odczynniki, próbki i czas. Następnie konstruuje się dwa testy xMAP z wykorzystaniem dwóch najbardziej optymalnych par przeciwciał i porównuje ich wydajność z oryginalnym testem ELISA pod kątem siły sygnału, zakresu dynamicznego i czułości.

Test ELISA można łatwo przekształcić w analizę Luminex xMAP, a dzięki zaletom multipleksowania można jednocześnie przesiewowo badać kilka przeciwciał w celu zidentyfikowania optymalnej pary przeciwciał, co prowadzi do zwiększenia czułości i zakresu dynamicznego przy jednoczesnym obniżeniu kosztów analizy.

Konwersja testu ELISA typu capture na test Luminex xMAP z wykorzystaniem metody wielipleksowego przesiewania przeciwciał

Test immunoenzymatyczny (ELISA) od dawna stanowi główne narzędzie do wykrywania interesujących analitytów w próbkach biologicznych, zarówno w naukach o życiu...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przeniesienie uprzednio zoptymalizowanego testu ELISA dla cytokiny TNF Alpha na platformę Xap przy jednoczesnej ocenie alternatywnych par przeciwciał. Zostaje to osiągnięte poprzez sprzężenie przeciwciała wychwytującego z zestawu ELISA, wraz z trzema innymi kandydackimi przeciwciałami wychwytującymi, z czterema różnymi zestawami mikrosfer lub kulek po ich wymieszaniu. Te cztery zestawy umożliwiają jednoczesne przetestowanie wszystkich czterech kandydatów z czterema oddzielnymi przeciwciałami detekcyjnymi w celu wyłonienia najlepszej pary przeciwciał.Kolejne dwa testy Xap zostają opracowane z wykorzystaniem dwóch najbardziej optymalnych par przeciwciał. Następnie wydajność tych testów jest porównywana z wydajnością oryginalnego testu EISA pod kątem siły sygnału, zakresu dynamicznego i czułości. Wyniki pokazują, że podobne przeciwciała mogą działać bardzo różnie w tych samych warunkach oraz że kilka przeciwciał można przesiewać jednocześnie za pomocą testu Luminex Xap, co wykazuje, że test ten charakteryzuje się zwiększoną czułością i szerszym zakresem dynamicznym w porównaniu do EISA.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak EIS A, jest to, że immunoanalizy oparte na xap pozwalają badaczowi na testowanie wielu celów lub, jak w tym przypadku, jednoczesne testowanie wielu przeciwciał, aby zidentyfikować przeciwciało o najlepszych parametrach. Procedurę zaprezentuje Erica Lopez, naukowiec współpracujący w Luminex Corporation.Protokół należy rozpocząć od wyboru i przygotowania czterech przeciwciał wychwytujących oraz czterech przeciwciał detekcyjnych specyficznych dla ludzkiego TNF alpha, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Należy również przygotować jedno przeciwciało potwierdzające specyficzne dla gatunku gospodarza przeciwciał wychwytujących. Odczynniki z zestawu do sprzęgania przeciwciał należy doprowadzić do temperatury pokojowej.Oznacz cztery probówki reakcyjne numerami obszarów koralików wybranych do reakcji sprzęgania. Przenieś zawartość czterech fiolek mikrosfer mag plex do czterech oznaczonych probówek reakcyjnych. Przemyj każdy z zestawów koralików dwukrotnie w 500 µL buforu aktywacyjnego, a następnie aktywuj każdy zestaw koralików roztworami sulf ONHS i EDC zgodnie z opisem w zestawie do sprzęgania przeciwciał.Instrukcja obsługi: po 20 minutowej inkubacji na rotatorze powtórz poprzedni etap płukania z obecnie aktywowanymi kuleczkami łącznie trzy razy, używając 500 µL buforu aktywacyjnego. Dla każdego płukania przygotuj cztery oddzielne roztwory o objętości 500 µL, z których każdy zawiera 7,5 µg przeciwciała wychwytującego w buforze inaktywacyjnym.Dodaj te cztery roztwory przeciwciał wychwytujących do odpowiednich probówek reakcyjnych. Natychmiast wymieszaj każdą probówkę w wirówce typu vortex i inkubuj przez dwie godziny na rotatorze. Powtórz etap płukania obecnie sprzężonych kulek łącznie trzy razy, używając 500 µL buforu do płukania dołączonego do zestawu do sprzęgania przeciwciał.Po ostatnim etapie płukania, do każdej probówki z reakcją należy dodać 500 µL buforu do płukania, aby uzyskać końcowe stężenie zapasu 5 milionów kulek sprzężonych z przeciwciałami na mL, wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie poddać probówki sonikacji w celu rozproszenia kulek. Liczbę kulek odzyskanych po reakcji sprzęgania należy policzyć za pomocą licznika komórek lub hemocytometru. Odzyskiwanie z reakcji sprzęgania zazwyczaj przekracza 90%. Aby potwierdzić pomyślny przebieg reakcji sprzęgania, należy przygotować roztwory testowe zapasów sprzężonych kulek dla każdego zestawu o końcowym stężeniu 100 kulek na µL w buforze do analizy, a następnie przygotować rozcieńczenia przeciwciał FICO znakowanych przeciwko odpowiednim gatunkom.Przeciwciało potwierdzające IgG w stężeniu 4 µg/mL w buforze do analizy. Nanieś 50 µL każdego roztworu testowego do czterech studzienek okrągłodnnej płytki 96-dołkowej, co łącznie daje 16 studzienek. Następnie dodaj 50 µL buforu do analizy do ośmiu studzienek w celu pomiaru tła oraz 50 µL rozcieńczonego przeciwciała potwierdzającego do ośmiu pozostałych studzienek. Delikatnie wymieszaj reakcje, pipetując w górę i w dół kilka razy za pomocą pipety wielokanałowej.Przykryć płytkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce do płytek. Umieścić płytkę na magnetycznym separatorze do płytek na jedną do dwóch minut, aby wyciągnąć koraliki z roztworu. Następnie usunąć ciecz, gwałtownie odwracając płytkę nad pojemnikiem na odpady, podczas gdy znajduje się ona na separatorze.Przemyj każdą studzienkę dwukrotnie, dodając 100 µL buforu do analizy, a następnie usuwając SANE z płytki w analogiczny sposób. Używając magnetycznego separatora do płytek, resuspenduj kuleczki w 100 µL buforu do analizy, delikatnie pipetując w górę i w dół pięć razy za pomocą pipety wielokanałowej. Przeprowadź analizę na urządzeniu Luminex xAP, takim jak instrument Magix.Intensywność sygnału fluorescencyjnego tej reakcji jest wprost proporcjonalna do ilości białka na powierzchni kulek, co umożliwia szybką ocenę względnej ilości białka sprzężonego z kulkami. Aby wyznaczyć najskuteczniejszą parę przeciwciał w teście xap, przygotować początkową mieszaninę wszystkich czterech zestawów kulek, dodając 10 µL każdego z nich do 0,96 mL buforu do testu. Przygotować roztwory przeciwciał detekcyjnych, rozcieńczając każde przeciwciało do stężenia 1 µg/mL w buforze do testu.Jest to również bufor do analizy. Przygotować standard białka TNF alpha firmy R&amp;D Systems w stężeniu 2000 picograms per milliliter oraz rozcieńczyć Streptawidynę R FICOerynę do stężenia eight micrograms per milliliter. Do każdego z 16 dołków okrągłodنnej płytki 96-dołkowej CoStar przeznaczonej do analizy przesiewowej dodać 50 microliters mieszaniny kulek sprzężonych z przeciwciałem.Następnie do ośmiu z 16 dołków dodaje się 50 µL buforu do analizy w celu pomiaru tła. Dalej do pozostałych ośmiu dołków pipetuje się 50 µL standardu TNF alpha w celu pomiaru odpowiedzi. Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem i wytrząsając na wytrząsarce do płytek analitycznych.Następnie do czterech dołków dodaje się po 50 µL każdego z czterech przeciwciał detekcyjnych, przy czym dwa dołki stanowią kontrolę tła, a dwa pozostałe są dołkami odpowiedzi. Inkubuje się przez 30 minut w tych samych warunkach, a następnie do wszystkich dołków dodaje się 50 µL odczynnika SAPE. Ponownie inkubuje się przez 15 minut w tych samych warunkach.Umieść płytkę na magnetycznym separatorze płytek na jedną minutę. Następnie usuń ciecz, energicznie odwracając płytkę nad pojemnikiem na odpady, podczas gdy znajduje się ona na separatorze. Pipetuj 100 µL buforu do analizy do każdej z 16 studni.Następnie usuń ciecz z kulek za pomocą separacji magnetycznej. Dalej, dodaj 100 µL buforu do analizy do każdego z 16 dołków. Odczytaj płytkę za pomocą instrumentu Luminex mag picks, korzystając z instrukcji obsługi w celu zapewnienia prawidłowego działania.Wybierz parę przeciwciał, która zapewnia pożądaną siłę sygnału. Po wybraniu najlepszego przeciwciała wychwytującego, rozcieńcz 100 µl zapasu kulek sprzężonych z tym przeciwciałem do objętości 10 mL buforem do analizy. Dodaj 50 µL rozcieńczonych kulek do 78 studzienek dwóch płytek 96-dołkowych CoStar z okrągłym dnem.Każda płytka zostanie wykorzystana do oceny wydajności innego przeciwciała detekcyjnego. Następnie należy przygotować 12-punktową krzywą wzorcową, rozpoczynając od 8 000 pg/mL i kończąc na 4 pg/mL, zgodnie z procedurą firmy R&amp;D Systems.Standard TNF Alpha: do każdej z płytek dodaj sześć powtórzeń po 50 µL każdego rozcieńczenia oraz sześć studzienek zawierających po 50 µL buforu do analizy jako tło, co daje łącznie 78 studzienek na płytkę. Inkubuj płytki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem i wytrząsając na wytrząsarce do płytek analitycznych. Następnie do wszystkich 78 studzienek pierwszej płytki dodaj 50 µL pierwszego przeciwciała detekcyjnego.Powtórz procedurę dla drugiego przeciwciała detekcyjnego na drugiej płytce. Inkubuj płytki przez 30 minut w tych samych warunkach. Następnie dodaj 50 µL odczynnika SAPE do wszystkich dołków każdej płytki.Po potrząsaniu obiema płytkami przez 15 minut w warunkach ochrony przed światłem, należy umieścić płytki na magnetycznych separatorach płytek na jedną minutę. Usuń ciecz, energicznie odwracając płytkę znajdującą się na separatorze nad pojemnikiem na odpady. Następnie pipetuj 100 µL buforu do testu do każdej z 78 studni na płytkach, zanim ciecz z kulek magnetycznych zostanie usunięta.Po dodaniu 100 µL buforu do testu do kulek w każdym z 78 dołków na płytkach, przeanalizuj płytki na urządzeniu MagPicks, korzystając z instrukcji obsługi w celu zapewnienia prawidłowego działania. Postępuj zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu ELISA Duo TNF-α/TNFSF1a dla ludzi firmy R&amp;D Systems. Zmierz odpowiedź wygenerowaną przez standard dostarczony w zestawie R&amp;D.Powtórz test ELISA jeszcze trzy razy, zastępując przeciwciała wychwytujące i detekcyjne firmy r and d systems przeciwciałami innych dostawców. Dla uproszczenia sparuj przeciwciała według dostawcy i oceń każdą parę niezależnie, zgodnie z formatem EISA, przy użyciu każdego z trzech standardów białka TNF Alpha. Testy Luminex Xap przeprowadzono w trybie multipleksowym, aby ocenić wszystkie cztery przeciwciała wychwytujące jako mieszaninę poprzez połączenie czterech zestawów przeciwciał TNF alpha sprzężonych z mikrosferami Mag PLX; przeciwciała wychwytujące oceniano indywidualnie z każdym z czterech biotynylowanych przeciwciał detekcyjnych, tak aby interakcję jednego przeciwciała detekcyjnego z każdym z czterech przeciwciał wychwytujących można było określić jednocześnie.Wyniki wskazały, że para przeciwciał z zestawu DUO firmy R&amp;D Systems wykazała najlepszą wydajność, dając odpowiedź na poziomie 6 183 jednostek średniej intensywności fluorescencji (MFI). Zaobserwowano również, że przeciwciała detekcyjne od Millipore i ABAM zapewniały zadowalającą odpowiedź w teście XAP w połączeniu z przeciwciałem wychwytującym R&amp;D Systems; natomiast przeciwciała wychwytujące od Millipore, ACAM i Novus dawały mniej korzystną odpowiedź w teście XAP. W celu porównania czterech par przeciwciał w formacie EISA zastosowano protokół z zestawu DUO firmy R&amp;D Systems.W odniesieniu do wszystkich par przeciwciał zastosowano protokół firmy r and d systems, ponieważ odzwierciedla on typowe protokoły EIA powszechnie stosowane obecnie i jest analogiczny do protokołów wykorzystywanych w technologii xap. Testy EISA wykazały, że para przeciwciał z firmy r and d systems ponownie przyniosła najlepsze wyniki. Para przeciwciał z firmy Acam nie wywołała żadnej odpowiedzi, natomiast pary przeciwciał z firm Millipore i Novas wykazały umiarkowane odpowiedzi, co pozwoliło ocenić wszelkie różnice w reaktywności przeciwciał.W przypadku standardu, wszystkie cztery pary przeciwciał przetestowano z użyciem trzech różnych standardów rekombinowanego białka TNF alpha pochodzących od trzech różnych dostawców. Dane wykazują, że standardy rekombinowanego białka TNF alpha od trzech dostawców dały równoważne wyniki. Białko TNF alpha od r and d systems zostało wykorzystane do wygenerowania krzywych wzorcowych w testach ELSA i XAP.Podczas gdy test ELI A przeprowadzono z użyciem pary przeciwciał firmy R&amp;D Systems, w testach Xap wykorzystano przeciwciało chwytające firmy R&amp;D Systems oraz przeciwciało detekcyjne pochodzące albo z R&amp;D Systems, albo z Millipore. Białko TNF alpha firmy R&amp;D Systems rozcieńczono tak, aby uzyskać zakres stężeń od 8 000 do zaledwie 4 pg/mL. Para przeciwciał z R&amp;D Systems w teście Xap dała oczekiwany wynik z odpowiedzią przekraczającą 20 000 MFI, jak pokazano.Gdy w teście Xap zamiast przeciwciała detekcyjnego firmy R&amp;D Systems zastosowano przeciwciało detekcyjne firmy Millipore, odpowiedź wyniosła około 30% odpowiedzi uzyskanej przy użyciu przeciwciała detekcyjnego z R&amp;D Systems. Zielona linia na tym wykresie reprezentuje krzywą wzorcową testu ELISA, dla którego zalecany przez producenta zakres TNF alpha wynosił od 16 do 1000 pg/mL. Ze względu na ograniczenia spektrofotometru nie było możliwe zwiększenie zakresu testu ELISA.Ponadto zakres dynamiczny i czułość obu metod są lepiej widoczne po przedstawieniu ich w skali logarytmicznej. Wyraźna różnica między nachyleniem krzywej odpowiedzi EISA a odpowiedziami z testów xap wskazuje na bardziej ograniczoną zdolność wykrywania TNF alpha w teście EL iza zarówno przy wyższych, jak i niższych stężeniach. Granice wykrywalności lub LOD dla dwóch funkcjonalnych testów xap TNF alpha zostały przybliżone poprzez zidentyfikowanie najniższego stężenia TNF alpha z poziomem odpowiedzi wyższym niż tło, powiększonym o trzykrotność odchylenia standardowego lub SD z sześciu powtórzeń.Można zauważyć, że przy zastosowaniu pary od R&amp;D Systems najniższe stężenie TNF alpha wynoszące 3,91 picograms per milliliter wywołało odpowiedź na poziomie 66 MFI, co jest wartością wyższą niż odpowiedź dla tła powiększonego o trzy SD, spełniając tym samym to kryterium. Gdy przeciwciało detekcyjne firmy Millipore zostało użyte wraz z przeciwciałem wychwytującym od R&amp;D Systems, granica wykrywalności była niższa niż 7,81 picograms per milliliter.W tym przypadku druga najniższa stężenie TNF alpha wygenerowała akceptowalną odpowiedź na poziomie 17 MFI, co było wartością większą niż odpowiedź dla najniższego stężenia TNF alpha powiększona o trzykrotność jego odchylenia standardowego. Podobnie, granicę wykrywalności dla zestawu r and d systems duo set Eliza oszacowano na wartość między 63 a 31 picograms per milliliter. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić kolejne kroki, takie jak testowanie różnych macierzy próbek lub stężeń przeciwciała w reporterze, w celu dalszej optymalizacji testu xap.

conversion-capture-elisa-to-luminex-xmap-assay-using-multiplex

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Konwersja testu Capture ELISA na test Luminex xMAP z wykorzystaniem metody wielokrotnego przesiewowego badania przeciwciał

Wykorzystując technologię mikrosfer xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy wielowiązkowy fluorometryczny test immunoenzymatyczny (MFIA) do nadzoru serologicznego różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to zawiesinowa macierz mikrosfer, w której antygen, kontrola tkankowa lub immunoglobuliny są kowalencyjnie powiązane z kolorowo kodowanymi mikrosferami polistyrenowymi. Omówiono metodę testową MFIA oraz różne zagadnienia związane z rozwiązywaniem problemów.

Metodyka przeprowadzania i rozwiązywanie problemów w multipleksowym fluorometrycznym immunoprzebiegu

Film prezentuje implementację technologii chipów snap do wielowarstwowych testów immunologicznych bez reaktywności krzyżowej. Prosta czynność polegająca na zatrzaśnięciu dwóch szkiełek mikromacierzy, z których każdy zawiera inne odczynniki, zapewnia transfer odczynnika bez zanieczyszczenia krzyżowego i pomaga w wykrywaniu wielu białek za pomocą testu immunologicznego typu sandwich.

Technologia Snap Chip do wielowarstwowego testu immunologicznego bez reaktywności krzyżowej

Ten film demonstruje multipleksowane ilościowe wykrywanie bakterii za pomocą karboksylowanych magnetycznych mikrosfer polistyrenowych barwionych w różne zestawy. Procedura obejmuje tworzenie kompleksów perełkowo-bakteryjnych, separację magnetyczną i analizę opartą na przepływie, umożliwiając precyzyjne i jednoczesne oznaczanie ilościowe wielu bakterii w tym samym dołku reakcyjnym.

Multipleksowa ilościowa detekcja bakterii przy użyciu mikrosfer magnetycznych znakowanych barwnikiem

Pomiar biomarkerów w złożonych próbkach biologicznych coraz częściej pomaga w podejmowaniu decyzji klinicznych. Opisujemy wysoce czułą metodę jednoczesnego pomiaru białka C wiążącego miozynę sercową, kinazy kreatynowej MB i troponiny sercowej I w próbkach surowicy od osób z zawałem mięśnia sercowego i zdrowych osób z grupy kontrolnej.

Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

W obecnym klimacie ograniczonych zasobów, pojawiają się nowe technologie, które pozwalają badaczom prowadzić badania taniej, szybciej i z większą precyzją. W tym miejscu opisujemy rozwój multipleksowego testu immunologicznego na bazie przeciwciał ślinowych na bazie kulek do pomiaru narażenia ludzi na wiele patogenów środowiskowych jednocześnie.

Opracowanie testu immunologicznego Multiplex opartego na przeciwciałach ślinowych do pomiaru narażenia ludzi na patogeny środowiskowe

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Modelujemy prosty multipleksowany test ECL, który łączy ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Test jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu innych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i autoimmunologicznego zespołu wielogruczołowego 1.

Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Zgodnie z pilną potrzebą badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i choroby koronawirusowej 2019, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 6-Plex do jednoczesnego wykrywania wszystkich czterech autoprzeciwciał wysp trzustkowych, autoprzeciwciał transglutaminazy tkankowej oraz przeciwciał przeciwko domenie wiążącej receptor koronawirusa 2 zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej.

Wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19

Trzykanałowy system analizy przepływu fluorescencji z podwójnym reporterem został wykorzystany do opracowania multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie ocenia próbki surowicy pod kątem IgG i IgM wywołanych przez wiele antygenów różnych gatunków Borrelia, które powodują boreliozę z Lyme w Europie i Ameryce Północnej.

Jednoczesne wykrywanie różnych klas przeciwciał w multipleksowanym teście serologicznym

Poznaj konwersję testu ELISA do platformy Luminex xMAP przy użyciu metody przesiewowej przeciwciał multipleksowych. Technika ta umożliwia jednoczesne testowanie wielu par przeciwciał dla cytokiny TNF Alpha, zwiększając czułość i zakres dynamiczny.

Konwersja testu ELISA typu capture na test Luminex xMAP z wykorzystaniem metody wielipleksowego przesiewania przeciwciał

Przeglądaj więcej filmów