Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

To jest magnes Max MIDI. Widnieje na nim ostrzeżenie: uwaga, bardzo silne pola magnetyczne. Cześć, jestem Melanie Matthew z laboratorium Mike'a Collinsa z Katedry Fizjologii i Biofizyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine.

Dzisiaj zaprezentujemy przygotowanie CD4-dodatnich limfocytów T metodą selekcji negatywnej przy użyciu zestawów firmy Miltenyi Biotec. Mamy tutaj urządzenia MiniMac i MicroMac; magnesy MiniMac służą do separacji większych ilości materiału. Przez kolumnę pasującą do urządzenia MiniMac można przepuścić do 10⁹ komórek, natomiast urządzenia MicroMac są przeznaczone do znacznie mniejszych objętości komórek.

Zależnie od tego, czy przeprowadzana jest separacja pozytywnna czy negatywna, komórki należy znakować odpowiednim przeciwciałem. Przeciwciała te są sprzężone z koralikami magnetycznymi, które wiążą się z magnesem. W przypadku selekcji negatywnej komórki docelowe przepływają przez kolumnę, a następnie można zebrać eluat, który będzie zawierał poszukiwane komórki.

Powinienem zaznaczyć, że techniki, które prezentuję dzisiejszego wieczoru, nie są sterylne. Jeśli zatem chcą Państwo wykorzystać te komórki do hodowli komórkowej, wszystkie czynności należy wykonywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy użyciu sterylnych narzędzi. Mimo że prezentuję przygotowanie komórek T CD4+, wiele z tych technik można zastosować przy oczyszczaniu innych typów komórek z wykorzystaniem zestawów biotechnologicznych Miltenyi.

Po usunięciu węzłów chłonnych z myszy – co szczegółowo demonstruję w siódmym odcinku JoVE pt. „Przygotowanie węzłów chłonnych do obrazowania dwufotonowego” – przystąpię do rozcierania ich w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek przy użyciu sitka komórkowego o oczkach 70 µm. Teraz roztrę węzły chłonne na zawiesinę pojedynczych komórek, używając tłoka strzykawki o objętości 6 mL.

Węzły chłonne znajdują się w pożywce RPMI wewnątrz sitka; ważne jest przygotowanie odpowiedniej zawiesiny pojedynczych komórek. Używamy sitka, aby upewnić się, że w próbce nie ma żadnych agregatów komórkowych. Po zakończeniu rozcierania wyjmę sitko z pożywki, a następnie wykorzystam materiał, który przeszedł przez sito, tworząc zawiesinę pojedynczych komórek.

Podczas rozcierania należy upewnić się, że tkanka została rozbita w jak największym stopniu. Z tej zawiesiny pojedynczych komórek będziemy oczyszczać limfocyty T CD4+.

Mamy tutaj wciąż kilka małych fragmentów tkanki tłuszczowej oraz coś w rodzaju otoczki węzła chłonnego z niewielką ilością tkanki łącznej, które zbiły się razem ze wszystkich sześciu węzłów chłonnych. Teraz usuwam sitko do komórek. Jak widać, medium jest bardzo mętne.

Jest ona pełna komórek z zawiesiny pojedynczych komórek, aby zapewnić uzyskanie maksymalnej liczby komórek z filtra, gdyż część z nich przylgnie do niego. Przemywam go kilkoma ml pożywki, a następnie przenoszę całą pożywkę pipetą do probówki Falcon 15 ml i wiruję, aby uzyskać pellet komórek do późniejszej puryfikacji. Oto moja zawiesina pojedynczych komórek, odwirowana i zebrana w pellet przy 300 G przez 10 minut.

Jeśli przewidujesz wysoką populację martwych komórek w swojej zawiesinie pojedynczych komórek, warto zastosować zestaw do usuwania martwych komórek firmy Miltenyi Biotec. Teraz, gdy mam już osad, odleję medium i przeprowadzę lizę erytrocytów, a następnie policzę komórki i zastosuję zestaw do negatywnej selekcji limfocytów T CD4+ w odniesieniu do tych konkretnych komórek. Dobrze, teraz przeprowadzę lizę RBC.

Przeprowadzimy lizę erytrocytów, które zostały osadzone w granulacie wraz z limfocytami, poprzez zmniejszenie osmolarności roztworu – najpierw dodając wodę, a następnie przywracając stężenie do poziomu 1x poprzez dodanie 10X-DBPS. Limfocyty są bardziej odporne na zmiany osmolarności niż erytrocyty, jednak wciąż musimy pracować szybko, aby nie doprowadzić do lizy limfocytów, czego chcemy uniknąć. Elementem szybkiej pracy jest przygotowanie przez mnie objętości potrzebnych do lizy jeszcze przed faktycznym dodaniem wody do układu.

Chcę dodać 10 X-D-B-P-S kilka sekund po dodaniu wody, aby mieć pewność, że nie dojdzie do lizy limfocytów, a jedynie do lizy erytrocytów. Pobieram zatem 900 µL wody – czyli prawie 1 mL – oraz 100 µL 10 X-D-B-P-S.

Mam obie probówki przygotowane do użycia. Do buforu do lizy dodaję wodę, czekam kilka sekund, być może lekko wstrząsam probówką, a następnie dodaję 10 X-D-B-P-S i ponownie delikatnie potrząsam probówką. Jeśli lizujesz dużą liczbę erytrocytów, zauważysz powstanie dużej, amorficznej masy z rozbitych błon komórkowych.

Mamy tutaj niewielką ilość i widać, że są to fragmenty przerwanych błon komórkowych. Po przeprowadzeniu lizy, na wypadek ewentualnych błędów podczas pipetowania, dodaję do komórek kilka ml pożywki, aby upewnić się, że osmolarność jest prawidłowa i aby nie doprowadzić do dalszej lizy. Dobrze, teraz mam limfocyty w zawiesinie pojedynczych komórek.

Ponownie przeprowadziłem lizę erytrocytów i zamierzam teraz odwirować komórki, aby uzyskać osad. Przed tym etapem policzę je za pomocą hemocytometru, aby określić ilość przeciwciał niezbędną do zastosowania zestawu do negatywnej selekcji limfocytów T CD4+. Dobrze, teraz wiruję komórki w buforze MAC i można zauważyć, że po przeprowadzeniu lizy erytrocytów osad jest znacznie bielszy.

Następnie przeprowadzę selekcję negatywną w celu wyizolowania limfocytów T CD4+. Odleję całe medium oraz bufor MACS, w którym zwirowano komórki. Następnie przeprowadzę znakowanie za pomocą koktajlu przeciwciał biotynylowanych, co stanowi pierwszy krok w selekcji negatywnej limfocytów T CD4+.

Następnie inkubuję próbkę w lodówce przez 10 minut. Dobrze, wstępna inkubacja komórek została zakończona. Teraz dodam antybiotyk do mikrokulek i ponownie umieszczę je w lodówce na 15 minut.

W przypadku tej konkretnej separacji komórek używamy kolumny LS firmy Miltenyi Biotec. Umieścimy ją w uchwycie magnetycznym i przygotujemy kolumnę, przepuszczając przez nią 3 mL buforu MACS. Otwieramy kolumnę i umieszczamy ją tak, aby wypustki były skierowane do wewnątrz magnesu. Teraz dodaję bufor MACS do kolumny; powinno być widać, jak przepływa przez kolumnę LS i zaczyna kapać na dole. Nie należy obawiać się całkowitego przepływu cieczy przez kolumnę.

Napięcie powierzchniowe cieczy zapobiegnie wysychaniu kolumny do momentu dodania komórek. Przed dodaniem komórek ważne jest, aby bufor MAX całkowicie przesiąkł przez kolumnę. Po 15-minutowej inkubacji komórek z buforem MAX i magnetycznymi kuleczkami biotynylowymi, odleję bufor i zawieszę komórki w ilości buforu odpowiedniej dla liczby komórek.

W związku z tym należy sprawdzić protokół Mini Tiny w tym zakresie. Następnie przeniosę je na kolumnę, którą przed chwilą przepłukaliśmy buforem max. Teraz dodamy zawiesinę komórkową do kolumny.

Ponieważ jest to kolumna do selekcji negatywnej, będziemy zbierać komórki, które przeszły przez kolumnę – w tym przypadku powinny to być wszystkie limfocyty T CD4+. Teraz przepłukam kolumnę 12 ml buforu MACS, ponownie zbierając eluat, który powinien zawierać wyłącznie limfocyty T CD4+. Następnie odwiruję limfocyty T CD4+, resuspenduję je, a potem oznaczę odpowiednim barwnikiem, którego użyję do obrazowania białka tau.

Pobiorę również niewielką próbkę oczyszczonych komórek, aby oznakować je przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD4, a następnie poddam je analizie FACS, aby upewnić się, że uzyskałem czystą populację limfocytów T CD4-dodatnich. Oto widok komórek, które właśnie odwirowaliśmy. Powinna to być populacja czystych limfocytów T CD3- i CD4-dodatnich.

Właśnie zaprezentowałem proces selekcji negatywnej limfocytów T CD4+. Wykorzystując zestaw firmy Miltenyi Biotec, dokonamy adoptywnego transferu tych komórek do myszy, która zostanie wykorzystana w jednym z naszych eksperymentów T-cell photon machine. Powodzenia w Państwa własnych badaniach.