Name: Izolacja limfocytów T CD4 + z węzłów chłonnych myszy za pomocą oczyszczania Miltenyi MACS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:34:55.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę izolacji limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy przy użyciu zestawu Miltenyi MACS. Technika selekcji negatywnej zapewnia czystość komórek ≥96% dla badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Rebeccie Paquett za przygotowanie buforu MACS.

Prosimy o zapoznanie się z protokołem dołączonym do zestawu Miltenyi lub dostępnym online pod adresem <a href="http://www.miltenyibiotec.com/">http://www.miltenyibiotec.com/</a> i stosowanie się do niego.

<ol><li>Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+repertoire+scanning+is+promoted+by+dynamic+dendritic+cell+behavior+and+random+T+cell+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).</li>
<li>Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+IA+phosphoinositide+3-kinase+modulates+basal+lymphocyte+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node.</a> J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Izolacja komórek ze źródła pierwotnego jest niezbędnym etapem w wielu bardziej złożonych protokołach. Firma Miltenyi oferuje zestawy do izolacji komórek z kilku organizmów, w tym z ludzi, naczelnych niebędących ludźmi, szczurów oraz, jak opisano tutaj, myszy. Separacja komórek oparta na kuleczkach magnetycznych umożliwia zarówno selekcję pozytywną (lub usuwanie komórek), jak i selekcję negatywną. W niniejszym opracowaniu prezentujemy selekcję negatywną nienaruszonych lub naiwnych limfocytów T pomocniczych CD4+. Stosując ...

<table><tbody><tr><td>Bufor MACS</td><td>Odczynnik</td><td>None</td><td>None</td><td>Przygotować zgodnie z instrukcją firmy Miltenyi.</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji limfocytów T CD4+: Untouched Isolation</td><td>Odczynnik</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-860</td><td>Do użycia z systemem Miltenyi.</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td>Do przygotowania buforu MACS.</td></tr><tr><td>Corning 35 mm nienatłuszczana szalka hodowlana (Not TC-Treated)</td><td>Inne</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>Używana do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek.</td></tr><tr><td>Sito komórkowe 70 µm</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td>Używane do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek.</td></tr><tr><td>Strzykawka 6 mL</td><td>Narzędzie</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>8881516051</td><td>Używana do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek.</td></tr><tr><td>10x Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>14200-075</td><td>Do lizy RBC.</td></tr><tr><td>Woda sterylna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td>Do lizy RBC.</td></tr></tbody></table>

izolacja limfocytów t cd4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą miltenyi macs

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Izolacja komórek z pierwotnego źródła jest niezbędnym krokiem w wielu bardziej złożonych protokołach. Firma Miltenyi oferuje zestawy do izolacji komórek z kilku organizmów, w tym ludzi, naczelnych niebędących ludźmi, szczurów oraz, jak opisujemy tutaj, myszy. Separacja komórek oparta na kuleczkach magnetycznych pozwala na selekcję pozytywną (lub usunięcie konkretnych komórek), a także na selekcję negatywną. W niniejszym materiale demonstrujemy selekcję negatywną nienaruszonych lub naiwnych limfocytów T pomocniczych CD4+. Stosując ten standardowy protokół, zazwyczaj oczyszczamy komórki o czystości ≥ 96% dla frakcji CD4+/CD3+. Protokół ten jest stosowany w połączeniu z protokołem Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice opublikowanym w 7. wydaniu JoVE, w celu oczyszczania limfocytów T oraz innych typów komórek do transferu adopcyjnego na potrzeby obrazowania. Choć w tym filmie nie zaprezentowano analizy FACS, zdecydowanie zaleca się sprawdzenie ogólnej czystości wyizolowanych komórek przy użyciu odpowiednich przeciwciał za pomocą FACS. Ponadto demonstrujemy niejałową metodę izolacji limfocytów T. Jeśli do konkretnej aplikacji końcowej wymagane są komórki sterylne, należy przeprowadzić wszystkie zaprezentowane procedury w komorze do hodowli tkanek w standardowych warunkach sterylnych. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w Państwa własnych eksperymentach!

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

Izolacja komórek z materiału źródłowego jest niezbędnym etapem w wielu bardziej złożonych protokołach. Firma Miltenyi oferuje zestawy do izolacji komórek z kilku...

To jest magnes Max MIDI. Widnieje na nim ostrzeżenie: uwaga, ekstremalnie silne pola magnetyczne. Cześć, nazywam się Melanie Matthew i pochodzę z laboratorium Mike'a Collinsa z Katedry Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine.Dzisiaj zaprezentujemy przygotowanie komórek T CD4+ za pomocą selekcji negatywnej z wykorzystaniem zestawów Milton Biotechnology. Mamy tutaj systemy MiniMax oraz MidiMax; magnesy MiniMax są stosowane do rozdzielania większych ilości materiału. Przez kolumnę pasującą do MiniMax można przepuścić do 10⁹ komórek, natomiast MidiMax służy do pracy z znacznie mniejszymi objętościami komórek.W zależności od tego, czy przeprowadzana jest separacja pozytywna czy negatywna, komórki należy znakować odpowiednim przeciwciałem. Są one sprzężone z koralikiem magnetycznym, który przyczepi się do magnesu. W przypadku selekcji negatywnej komórki, które są przedmiotem zainteresowania, przejdą przez kolumnę, a następnie można zebrać eluat, który będzie zawierał poszukiwane komórki.Powinienem wspomnieć, że techniki, które prezentuję dzisiejszego wieczoru, nie są sterylne. Dlatego, jeśli chcą Państwo wykorzystać te komórki do hodowli komórkowej, należy wszystko przeprowadzić w dygestorium do hodowli tkanek, używając sterylnych narzędzi. Zatem, mimo że prezentuję przygotowanie dla limfocytów T CD4+, wiele z tych technik ma zastosowanie przy oczyszczaniu innych typów komórek z wykorzystaniem zestawów Miltenyi Biotec.Dobrze, usunęłam węzły chłonne z myszy; szczegółowy sposób postępowania w tym zakresie przedstawiam w siódmym wydaniu JoVE: przygotowanie węzłów chłonnych do obrazowania dwufotonowego. Teraz rozdrobię węzły chłonne do postaci zawiesiny pojedynczych komórek wewnątrz sitka komórkowego o oczkach 70 µm. Dobrze, teraz rozdrobię węzły chłonne do zawiesiny pojedynczych komórek, używając tłoka strzykawki o pojemności 6 mL.Węzły chłonne znajdują się w medium RPMI wewnątrz filtra; ważne jest, aby przygotować prawidłową zawiesinę pojedynczych komórek. Używamy filtra, aby mieć pewność, że w próbce nie ma aglomeratów komórkowych. Po zakończeniu rozcierania wyjmę filtr z medium, a następnie wykorzystam materiał, który przeszedł przez sito, tworząc zawiesinę pojedynczych komórek.Podczas rozcierania należy upewnić się, że tkanka została rozbita w możliwie największym stopniu. Z tej zawiesiny pojedynczych komórek będziemy oczyszczać limfocyty T CD4+. Dobrze, rozcieranie tkanki zostało zakończone i widać, że większość węzłów chłonnych została całkowicie rozdrobniona.Pozostały nam tutaj niewielkie fragmenty tłuszczu oraz rodzaj otoczki węzła chłonnego z niewielką ilością tkanki łącznej, które posklejały się z wszystkich sześciu węzłów chłonnych. Teraz usuwam sitko do komórek. Widać tutaj, że medium jest bardzo mętne.Jest ona wypełniona zawiesiną pojedynczych komórek, aby zapewnić uzyskanie maksymalnej liczby komórek z filtra, gdyż część z nich może się do niego przykleić. Przemywam ją kilkoma ml pożywki, a następnie pipetuję całą pożywkę do probówki Falcon 15 ml i wiruję, aby uzyskać osad komórek do późniejszej puryfikacji. Oto moja zawiesina pojedynczych komórek, odwirowana i osadzona przy 300 G przez 10 minut.Jeśli przypuszczają Państwo, że w zawiesinie pojedynczych komórek pojawi się duża populacja martwych komórek, warto zastosować zestaw do usuwania martwych komórek firmy Miltenyi Biotec. Po odwirowaniu osadu zlewam pożywkę i przeprowadzam lizę erytrocytów, a następnie policzę komórki i zastosuję zestaw do negatywnej selekcji limfocytów T CD4+ w odniesieniu do tych konkretnych komórek. Dobrze, teraz przystępuję do lizy RBC.Przeprowadzimy lizę erytrocytów, które zostały odwirowane wraz z limfocytami, poprzez obniżenie osmolarności roztworu – najpierw dodając wodę, a następnie przywracając stężenie do roztworu 1x poprzez dodanie 10x DPBS. Limfocyty są bardziej odporne na zmiany osmolarności niż erytrocyty, jednak nadal musimy pracować szybko, aby nie doprowadzić do lizy limfocytów, czego chcemy uniknąć. Elementem szybkiego działania jest przygotowanie odpowiednich objętości odczynników potrzebnych do lizy jeszcze przed dodaniem wody do układu.Chcę móc dodać mój 10 X-D-B-P-S kilka sekund po dodaniu wody, aby upewnić się, że nie dojdzie do lizy limfocytów, a jedynie do lizy erytrocytów. Pobieram więc 900 µL wody – to prawie jeden mililitr – oraz 100 µL 10 X-D-B-P-S.Przygotowałem obie probówki. Do buforu do lizy dodaję wodę, czekam kilka sekund, być może lekko wstrząsam probówką, a następnie dodaję 10 X-D-B-P-S i ponownie lekko wstrząsam probówkę. Jeśli lizujesz dużą ilość erytrocytów, zauważysz powstanie dużej, amorficznej masy składającej się z rozbitych błon komórkowych.Mamy tutaj niewielką ilość materiału i można zauważyć, że są to w niewielkiej mierze uszkodzone błony komórkowe. Zatem po przeprowadzeniu lizy, na wypadek ewentualnych błędów podczas pipetowania, zazwyczaj dodaję do komórek kilka ml pożywki, aby upewnić się, że osmolarność jest prawidłowa i aby nie doprowadzić do dalszej lizy. Dobrze, teraz mam limfocyty w zawiesinie pojedynczych komórek.Ponownie, po przeprowadzeniu lizy erytrocytów, odwiruję komórki w celu ich osadzenia. Przed tym etapem policzę je za pomocą komory licznikowej (hemocytometru), aby określić ilość przeciwciał niezbędną do zastosowania zestawu do selekcji negatywnej komórek T CD4+. Teraz odwiruję komórki w buforze MACS; można zauważyć, że po przeprowadzeniu lizy erytrocytów osad jest znacznie bielszy.Następnie przeprowadzę selekcję negatywną w celu wyizolowania limfocytów T CD4+. Odleję całą pożywkę oraz bufor MACS, w którym wirowano komórki. Następnie przeprowadzę znakowanie przy użyciu koktajlu przeciwciał biotynylowanych, co stanowi pierwszy krok w selekcji negatywnej limfocytów T CD4+.Następnie inkubuję w lodówce przez 10 minut. Dobrze, wstępna inkubacja komórek została zakończona. Teraz dodam antybiotyk do mikrokulek i ponownie umieszczę je w lodówce na 15 minut.W przypadku tej konkretnej separacji komórek używamy kolumny LS firmy Miltenyi Biotech. Umieścimy ją na uchwycie magnetycznym i przygotujemy kolumnę, przepuszczając przez nią 3 mL buforu MACS. Otworzymy kolumnę i umieścimy ją tak, aby wypustki były skierowane do wnętrza magnesu. Teraz dodam bufor MACS do kolumny; należy zauważyć, że przemieszcza się on w dół kolumny LS i zaczyna wyciekać u dołu. Nie należy obawiać się całkowitego wyschnięcia kolumny.Napięcie powierzchniowe cieczy zapobiegnie jej całkowitemu wyschnięciu do momentu dodania komórek. Przed dodaniem komórek ważne jest, aby bufor Max został całkowicie wchłonięty przez kolumnę. Zatem po 15-minutowej inkubacji z naszymi magnetycznymi kuleczkami biotynowymi, które naniesiono na komórki w buforze Max, odleję bufor i ponownie zawieszę komórki w ilości buforu odpowiedniej dla liczby komórek.W związku z tym należy sprawdzić protokół dla zestawu Mini, aby go zweryfikować. Następnie naniosę je na kolumnę, którą przed chwilą przelaliśmy buforem MAX. Teraz dodamy zawiesinę komórkową do kolumny.Ponieważ jest to kolumna do selekcji negatywnej, zbierzemy komórki, które przepłynęły przez kolumnę, a w tym przypadku powinny to być wszystkie limfocyty T CD4+. Teraz przemyję kolumnę 12 ml buforu MAC, ponownie zbierając eluat, który powinien zawierać wyłącznie limfocyty T CD4+. Następnie odwiruję limfocyty T CD4+, resuspenduję je, a potem oznaczuję odpowiednim barwnikiem, którego będę używać do obrazowania białka tau.Pobiorę również niewielką próbkę oczyszczonych komórek, oznaczę je przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD4, a następnie poddam analizie FACS, aby upewnić się, że otrzymałem czystą populację limfocytów T CD4-dodatnich. Oto widok komórek, które właśnie odwirowaliśmy. Powinna to być populacja czystych limfocytów T CD3- i CD4-dodatnich.Właśnie zaprezentowałem proces selekcji negatywnej dla limfocytów T CD4+. Używając zestawu firmy Miltenyi Biotec, dokonamy adoptywnego transferu tych komórek do myszy, którą wykorzystamy w jednym z naszych własnych eksperymentów T-cell photon machine. Powodzenia w Państwa własnych badaniach.

isolation-cd4-t-cells-from-mouse-lymph-nodes-using-miltenyi-macs

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja komórek T CD4+ z węzłów chłonnych myszy za pomocą metody Miltenyi MACS

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Ten film opisuje wzbogacanie limfocytów T ze śledziony myszy poprzez selekcję negatywną za pomocą separatora magnetycznego. Technika ta polega na ukierunkowaniu na inne komórki w próbce w celu zubożenia za pomocą przeciwciał lub ligandów skierowanych przeciwko określonym antygenom powierzchniowym komórki.

Wzbogacanie limfocytów T: technika izolowania limfocytów T z mieszanej populacji komórek za pomocą separacji magnetycznej

Ten film demonstruje protokół izolacji opartej na znakowaniu magnetycznym populacji limfocytów T CD4+Vδ1+γδ o niskim stężeniu z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Wykorzystując kombinację przeciwciał anty-Vδ1 sprzężonych z FITC, magnetycznych mikrokulek anty-FITC i superparamagnetycznych kulek pokrytych przeciwciałem anty-CD4, limfocyty T CD4 + Vδ1 + można z powodzeniem oczyścić z populacji PBMC.

Selektywna izolacja limfocytów T CD4 + Vδ1 + γδ z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek dendrytycznych z mysich śledzion, poprzez magnetyczne sortowanie komórek, a następnie transfer adoptywny do naiwnych myszy. Model komórek dendrytycznych aktywowanych solą został wybrany, aby wyjaśnić krok po kroku procedury adoptywnej cytometrii transferowej i przepływowej.

Izolacja i transfer adoptywny komórek dendrytycznych prezentujących antygen traktowany wysoką solą

Ten protokół zapewnia in vitro strategię współhodowli do badania wpływu komórek T regulatorowych na proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych.

In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na odkrycie ruchomości limfocytów oraz oddziaływań komórkowych w obrębie węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz podczas odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy demonstrujemy adoptywny transfer limfocytów T, izolację węzłów chłonnych oraz obrazowanie ruchomości limfocytów T CD4+ w wypreparowanym węźle chłonnym.

Disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy

Poznaj metodę izolacji limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy przy użyciu zestawu Miltenyi MACS. Technika selekcji negatywnej zapewnia czystość komórek ≥96% dla badań immunologicznych.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

Przeglądaj więcej filmów