Name: Izolacja limfocytów T CD4 + z węzłów chłonnych myszy za pomocą oczyszczania Miltenyi MACS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:34:55.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę izolacji limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy przy użyciu zestawu Miltenyi MACS. Technika selekcji negatywnej zapewnia czystość komórek ≥96% dla badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Rebeccie Paquett za przygotowanie buforu MACS.

Prosimy o zapoznanie się z protokołem dołączonym do zestawu Miltenyi lub dostępnym online pod adresem <a href="http://www.miltenyibiotec.com/">http://www.miltenyibiotec.com/</a> i stosowanie się do niego.

<ol><li>Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+repertoire+scanning+is+promoted+by+dynamic+dendritic+cell+behavior+and+random+T+cell+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).</li>
<li>Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+IA+phosphoinositide+3-kinase+modulates+basal+lymphocyte+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node.</a> J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Izolacja komórek ze źródła pierwotnego jest niezbędnym etapem w wielu bardziej złożonych protokołach. Firma Miltenyi oferuje zestawy do izolacji komórek z kilku organizmów, w tym z ludzi, naczelnych niebędących ludźmi, szczurów oraz, jak opisano tutaj, myszy. Separacja komórek oparta na kuleczkach magnetycznych umożliwia zarówno selekcję pozytywną (lub usuwanie komórek), jak i selekcję negatywną. W niniejszym opracowaniu prezentujemy selekcję negatywną nienaruszonych lub naiwnych limfocytów T pomocniczych CD4+. Stosując ...

<table><tbody><tr><td>Bufor MACS</td><td>Odczynnik</td><td>None</td><td>None</td><td>Przygotować zgodnie z instrukcją firmy Miltenyi.</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji limfocytów T CD4+: Untouched Isolation</td><td>Odczynnik</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-860</td><td>Do użycia z systemem Miltenyi.</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td>Do przygotowania buforu MACS.</td></tr><tr><td>Corning 35 mm nienatłuszczana szalka hodowlana (Not TC-Treated)</td><td>Inne</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>Używana do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek.</td></tr><tr><td>Sito komórkowe 70 µm</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td>Używane do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek.</td></tr><tr><td>Strzykawka 6 mL</td><td>Narzędzie</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>8881516051</td><td>Używana do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek.</td></tr><tr><td>10x Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>14200-075</td><td>Do lizy RBC.</td></tr><tr><td>Woda sterylna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td>Do lizy RBC.</td></tr></tbody></table>

izolacja limfocytów t cd4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą miltenyi macs

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Izolacja komórek z pierwotnego źródła jest niezbędnym krokiem w wielu bardziej złożonych protokołach. Firma Miltenyi oferuje zestawy do izolacji komórek z kilku organizmów, w tym ludzi, naczelnych niebędących ludźmi, szczurów oraz, jak opisujemy tutaj, myszy. Separacja komórek oparta na kuleczkach magnetycznych pozwala na selekcję pozytywną (lub usunięcie konkretnych komórek), a także na selekcję negatywną. W niniejszym materiale demonstrujemy selekcję negatywną nienaruszonych lub naiwnych limfocytów T pomocniczych CD4+. Stosując ten standardowy protokół, zazwyczaj oczyszczamy komórki o czystości ≥ 96% dla frakcji CD4+/CD3+. Protokół ten jest stosowany w połączeniu z protokołem Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice opublikowanym w 7. wydaniu JoVE, w celu oczyszczania limfocytów T oraz innych typów komórek do transferu adopcyjnego na potrzeby obrazowania. Choć w tym filmie nie zaprezentowano analizy FACS, zdecydowanie zaleca się sprawdzenie ogólnej czystości wyizolowanych komórek przy użyciu odpowiednich przeciwciał za pomocą FACS. Ponadto demonstrujemy niejałową metodę izolacji limfocytów T. Jeśli do konkretnej aplikacji końcowej wymagane są komórki sterylne, należy przeprowadzić wszystkie zaprezentowane procedury w komorze do hodowli tkanek w standardowych warunkach sterylnych. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w Państwa własnych eksperymentach!

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

Izolacja komórek z materiału źródłowego jest niezbędnym etapem w wielu bardziej złożonych protokołach. Firma Miltenyi oferuje zestawy do izolacji komórek z kilku...

To jest magnes Max MIDI. Widnieje na nim ostrzeżenie: uwaga, ekstremalnie silne pola magnetyczne. Cześć, nazywam się Melanie Matthew i pochodzę z laboratorium Mike'a Collinsa z Katedry Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine.Dzisiaj zaprezentujemy przygotowanie komórek T CD4+ za pomocą selekcji negatywnej z wykorzystaniem zestawów Milton Biotechnology. Mamy tutaj systemy MiniMax oraz MidiMax; magnesy MiniMax są stosowane do rozdzielania większych ilości materiału. Przez kolumnę pasującą do MiniMax można przepuścić do 10⁹ komórek, natomiast MidiMax służy do pracy z znacznie mniejszymi objętościami komórek.W zależności od tego, czy przeprowadzana jest separacja pozytywna czy negatywna, komórki należy znakować odpowiednim przeciwciałem. Są one sprzężone z koralikiem magnetycznym, który przyczepi się do magnesu. W przypadku selekcji negatywnej komórki, które są przedmiotem zainteresowania, przejdą przez kolumnę, a następnie można zebrać eluat, który będzie zawierał poszukiwane komórki.Powinienem wspomnieć, że techniki, które prezentuję dzisiejszego wieczoru, nie są sterylne. Dlatego, jeśli chcą Państwo wykorzystać te komórki do hodowli komórkowej, należy wszystko

isolation-cd4-t-cells-from-mouse-lymph-nodes-using-miltenyi-macs

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja komórek T CD4+ z węzłów chłonnych myszy za pomocą metody Miltenyi MACS

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Ten film opisuje wzbogacanie limfocytów T ze śledziony myszy poprzez selekcję negatywną za pomocą separatora magnetycznego. Technika ta polega na ukierunkowaniu na inne komórki w próbce w celu zubożenia za pomocą przeciwciał lub ligandów skierowanych przeciwko określonym antygenom powierzchniowym komórki.

Wzbogacanie limfocytów T: technika izolowania limfocytów T z mieszanej populacji komórek za pomocą separacji magnetycznej

Ten film demonstruje protokół izolacji opartej na znakowaniu magnetycznym populacji limfocytów T CD4+Vδ1+γδ o niskim stężeniu z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Wykorzystując kombinację przeciwciał anty-Vδ1 sprzężonych z FITC, magnetycznych mikrokulek anty-FITC i superparamagnetycznych kulek pokrytych przeciwciałem anty-CD4, limfocyty T CD4 + Vδ1 + można z powodzeniem oczyścić z populacji PBMC.

Selektywna izolacja limfocytów T CD4 + Vδ1 + γδ z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek dendrytycznych z mysich śledzion, poprzez magnetyczne sortowanie komórek, a następnie transfer adoptywny do naiwnych myszy. Model komórek dendrytycznych aktywowanych solą został wybrany, aby wyjaśnić krok po kroku procedury adoptywnej cytometrii transferowej i przepływowej.

Izolacja i transfer adoptywny komórek dendrytycznych prezentujących antygen traktowany wysoką solą

Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na odkrycie ruchomości limfocytów oraz oddziaływań komórkowych w obrębie węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz podczas odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy demonstrujemy adoptywny transfer limfocytów T, izolację węzłów chłonnych oraz obrazowanie ruchomości limfocytów T CD4+ w wypreparowanym węźle chłonnym.

Disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy

Poznaj metodę izolacji limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy przy użyciu zestawu Miltenyi MACS. Technika selekcji negatywnej zapewnia czystość komórek ≥96% dla badań immunologicznych.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

Przeglądaj więcej filmów