Name: Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Naucz się automatycznej kwantyfikacji fluorescencji synaptycznej w C. elegans z rozdzielczością pojedynczych synaps. Ta metoda umożliwia szybką analizę setek synaps w jednej próbce z minimalnym zniekształceniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować A. Benham za pomoc w opracowaniu protokołu. Praca ta została sfinansowana z grantu NIH NS06747 przyznanego B. A. B.

1. Przygotowanie nicieni do obrazowania
Ten fragment protokołu opiera się na opublikowanych technikach hodowli C. elegans1,2 i jest przedstawiony na Rysunku 1.
<ol>
	<li>Hodować nicienie na płytkach agarowych NGM z wysoką zawartością peptonu (10 cm) zasiających bakterie E. coli szczepu NA22, aż będą bliskie zagłodzenia. W przypadku immunobarwienia jedna płytka pozwoli na uzyskanie wystarczającej liczby nicieni dla jednej indywidualnej barwienia, biorąc pod uwagę straty w procesie oraz rygorystyczne kryteria wyboru osobników do obrazowania (patrz Część 2).</li>
	<li>Zebrać nicienie, wlewając na płytkę kilka ml ddH2O, krótko mieszając okrężnie, a następnie przelewając ciecz do stożkowej probówki 15 ml (powtórzyć w razie potrzeby, aby przenieść większość nicieni do probówki). Odwirować w wirówce klinicznej przez 3 min przy 1000x g. Przemyć osad 1–3 razy ddH2O, aż nadsącz stanie się klarowny, aby usunąć pozostałe bakterie. Do usuwania nadsączu używać polipropylenowych pipet transferowych, ponieważ nicienie przyklejają się do szkła (od tego etapu kluczowe jest minimalizowanie czasu między krokami, aby uniknąć spadku żywotności jaj).</li>
	<li>Po ostatnim przemyciu resuspender osad z nicieniami w 5 ml alkalicznego roztworu podchlorynu w celu lizy nicieni i uwolnienia jaj. Delikatnie kołysać i badać probówki pod mikroskopem stereoskopowym mniej więcej raz na minutę. Gdy około 50% nicieni zostanie poddanych lizie (będą wyglądać na wygięte i rozbite), przerwać proces lizy, wypełniając probówkę do pełna buforem do jaj (Egg Buffer), kilkukrotnie odwracając i odwirowując przez 3 min przy 1000x g. Czas lizy nie może przekroczyć 5 min.</li>
	<li>Usunąć nadsącz pipetą transferową i przemyć osad 3 razy buforem do jaj (Egg Buffer).</li>
	<li>Aby oddzielić jaja od zanieczyszczeń, przeprowadzić ich flotację na poduszce 30% sacharozy w ddH2O: po ostatnim przemyciu z etapu 1.4 ostrożnie usunąć nadsącz i resuspender osad w 5 ml ddH20. Dodać 5 ml sterylnej 60% sacharozy w ddH2O i dobrze wymieszać. Wirować w wirówce klinicznej przez 6 min przy 1000x g. Jaja zbiorą się na menisku (będą miały mętny wygląd), natomiast zanieczyszczenia opadną na dno.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety transferowej odessać jaja w minimalnej objętości i przenieść na niezasiane płytki agarowe NGM. Wszelkie jaja przywierające do ścianek probówki można delikatnie spłukać i również przenieść. Jedna niezasiana płytka 10 cm na analizowany szczep jest wystarczająca.</li>
	<li>Inkubować niezasiane płytki z jajami przez noc (~16 h) w temperaturze 20 °C. Przez pierwsze kilka godzin pozostawić pokrywkę lekko uchyloną, aby płytka wyschła, a następnie szczelnie przykryć na noc.</li>
	<li>Po wykluciu przenieść larwy L1 do stożkowej probówki 15 ml z medium S Basal (dodać kilka ml S Basal na płytkę, wymieszać okrężnie i przelać do probówki). Odwirować w wirówce klinicznej (3 min, 1000x g), resuspender w minimalnej objętości S Basal i przenieść na płytki agarowe NGM 10 cm zasiaiane bakteriami NA22. Na tym etapie używać 2 płytek dla każdej pierwotnej płytki z etapu 1.1. Inkubować, aż nicienie osiągną pożądany wiek.</li>
	<li>Monitorować hodowle raz lub dwa razy dziennie. Jeśli pojawi się ryzyko zagłodzenia, przenieść je na świeże płytki NA22. W przypadku nicieni typu dzikiego N2 zagłodzeniu poprzedza utworzenie się linii lub fali nicieni przemieszczającej się przez płytkę, gdy zwierzęta masowo migrują z obszarów wyczerpanych z pożywienia. Po uformowaniu się takiej struktury pożywienie zostanie całkowicie zużyte w ciągu kilku godzin.</li>
	<li>Nicienie są teraz gotowe do immunobarwienia lub obrazowania na żywo. Optymalne jest utrwalanie i barwienie nicieni w zawiesinie, ponieważ pozwala to na łatwe obrazowanie dużych liczb nienaruszonych osobników. Procedury barwienia oparte na protokole Finneya i Ruvkuna3-6 są preferowane nad procedurami mrożenia i pękania (freeze-crack), ponieważ do obrazowania wymagana jest duża liczba nicieni.</li>
</ol>
2. Obrazowanie konfokalne
<ol>
	<li>Zamocuj nicienie na szkiełkach do obrazowania konfokalnego. Dostosuj gęstość nicieni do poziomu kilku stu osobników na mikrolitr. Przygotuj podkład z 2% agarose w S-basal, otaczając go cienkim pierścieniem wazeliny, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania (nałożyć za pomocą strzykawki 3 ml z odciętą igłą 25 G). Pipetuj kilka mikrolitrów zawiesiny nicieni na szkiełko nakrywkę (w przypadku obrazowania żywych nicieni użyj środka znieczulającego), a następnie opuść podkład z agarose na szkiełko nakrywkę, rozkładając nicienie równomiernie na jego powierzchni.</li>
	<li>Wybierz nicienie do obrazowania. Wybierz osobniki, w których badane synapsy są skierowane w stronę obiektywu, z przesunięciem radialnym nie większym niż ±45° (gdzie 0° oznacza orientację bezpośrednio w stronę obiektywu). Przeprowadź tę ocenę szybko (w ciągu kilku sekund), aby uniknąć fotobielenia. Skala początkowych hodowli została zoptymalizowana tak, aby zapewnić wystarczającą liczbę nicieni spełniających te kryteria geometryczne.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie konfokalne preparatu. Najlepsze wyniki dają próbki względnie płaskie, które można objąć około 14 sekcjami o grubości 0.4 μm. Do szybkiego i dokładnego zbierania danych wystarczające są obrazy o wysokiej prędkości i niskiej rozdzielczości (512 x 512 pikseli). Unikaj nasycenia detektora zbyt silnym sygnałem, ponieważ spowoduje to niedoszacowanie sygnałów fluorescencyjnych.</li>
</ol>
3. Zautomatyzowana identyfikacja i analiza poszczególnych klastrów synaptycznych
<ol>
	<li>Otwórz pliki wyjściowe w formacie multi-TIF z mikroskopu konfokalnego, korzystając z oprogramowania Volocity 4.0 (lub nowszego) (PerkinElmer).</li>
	<li>Wytnij obszary obrazu, które nie zawierają interesującej struktury (Image -&gt; Extended Focus -&gt; Select area of interest using 'Freehand ROI' tool -&gt; Actions -&gt; Crop to Selection; Rycina 2A). Uwaga: funkcja Extended Focus generuje na ekranie komputera projekcję płaszczyzny z, aby ułatwić analizę, ale nie wpływa na podstawowe dane; to samo dotyczy ewentualnych korekt jasności i kontrastu).</li>
	<li>Zmierz długość analizowanego obszaru za pomocą narzędzia Line Tool. Długość linii zostanie obliczona i dodana do tabeli danych (Rycina 2B).</li>
	<li>Zidentyfikuj obiekty, korzystając z filtra „Objects by Intensity” (tryb Measurements). Określ próg w taki sposób, aby podświetlone zostały klastry synaptyczne, a nie synaptyczne tło (Rycina 2C). Zastosowanie niezależnego markera synaptycznego znakowanego innym kolorem może pomóc jednoznacznie zidentyfikować synapsy. Typowe synapsy obejmują od kilku do kilkuset wokseli. Ustaw próg raz, korzystając z próbki kontrolnej, a następnie stosuj go do wszystkich kolejnych próbek. Oddzielne wyznaczanie progu dla każdej próbki jest niedopuszczalne, ponieważ wprowadza ryzyko błędu eksperymentatora. Obiekty są wybierane i tabulowane automatycznie (Rycina 2D).</li>
	<li>Uporządkuj i wyeksportuj dane. Usuń obiekty o rozmiarze 2 wokseli lub mniejszych, ponieważ są to zazwyczaj drobinki tła. Można je wyeliminować poprzez dalsze filtrowanie lub podczas późniejszej analizy. Aby ułatwić ich usunięcie na dalszych etapach, ponownie posortuj plik danych według „object size”, tak aby zostały zgrupowane. Eksportuj dane w formacie CSV, który można otworzyć w programie Microsoft Excel lub innych programach arkuszy kalkulacyjnych. Każdy obraz generuje jeden plik wyjściowy.</li>
	<li>Jeśli oprogramowanie Volocity jest niedostępne, można zastosować alternatywne metody analizy projekcji płaszczyzn Z danych konfokalnych (np. ref. 7 lub analiza ręczna w programie ImageJ), choć wiąże się to z utratą informacji trójwymiarowych (patrz Discussion).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przedstawiona metoda ilościowa powinna pozwalać na rozróżnianie populacji klastrów o różnej jasności i różnych objętościach. Reprezentatywne obrazy oraz odpowiadające im dane ilościowe przedstawione na Rysunku 3 demonstrują przykłady różnicowania na podstawie tych parametrów. Co do zasady wyniki powinny być zgodne z tym, co jest widoczne gołym okiem. W przypadku immunobarwienia receptorów GABA UNC-49 w brzusznych sznurach nerwowych C. elegans, wszystkie zwierzęta zazwyczaj wydawały się bardzo podobne pod względem wielkości i stopnia dojrzałości, a całkowite wartości fluorescencji synaptycznej dla grupy pięciu osobników (znormalizowane do długości analizowanego sznura nerwowego) wykazały błąd standardowy wynoszący około 10% średniej 4. Mutacje genetyczne oraz inne zabiegi eksperymentalne (np. ekspozycja na leki) mogą zmieniać nie tylko wartości objętości i intensywności oraz rozkłady częstotliwości klastrów synaptycznych, ale potencjalnie także przebieg czasowy rozwoju i synchronizację osobników, co prowadzi do większej zmienności. Niemniej jednak wyniki ilościowe powinny zawsze odzwierciedlać to, co można ocenić wizualnie; w przeciwnym razie analiza obrazów i obiektów zidentyfikowanych przez program Volocity powinna ujawnić, gdzie wystąpił błąd i zasugerować działania naprawcze, takie jak ponowne ustalenie progu (re-thresholding) lub usunięcie obiektów artefaktowych.
<img alt="Schemat doświadczenia dotyczącego cyklu życiowego C. elegans: hodowla, zbieranie jaj, wzrost, przygotowanie do mikroskopii." src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przygotowanie synchronicznych kultur C. elegans. Synchroniczne kultury uzyskuje się za pomocą tej procedury, ponieważ rozwój C. elegans zatrzymuje się na stadium larwalnym L1 w przypadku braku pożywienia i zostaje wznowiony po jego podaniu.
<img alt="Schemat analizy sznura nerwowego; kroki obejmują wybór, ustawienie progu, pomiar długości i tabulację danych." src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Ilościowe oznaczenie punktów synaptycznych.
<ol class="ualpha">
	<li>Zbędne obszary obrazu są przycinane w celu zmniejszenia rozmiaru plików i zwiększenia specyficzności. Lewy panel pokazuje obraz początkowy, środkowy panel wybrany obszar, a prawy panel obraz po przycięciu. Sygnał czerwony to immunofluorescencja receptora GABA UNC-49, sygnał zielony to synaptobrevina-GFP (marker presynaptyczny) ekspresowana w presynaptycznych neuronach GABA 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.</li>
	<li>Rysowana jest linia o długości analizowanego segmentu sznura nerwowego, a jego długość jest automatycznie zapisywana w tabeli wyników. Informacja ta jest niezbędna do normalizacji danych synaptycznych ze względu na długość analizowanego sznura nerwowego, która może różnić się kilkukrotnie, jeśli nicienie ulegną fragmentacji podczas barwienia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.</li>
	<li>Stosowany jest próg (threshold), aby zidentyfikować poszczególne skupiska synaptyczne. Lewy panel pokazuje obraz przed progowaniem; przykłady różnych poziomów progowania przedstawiono na oddzielnych panelach (pominięto sygnał zielony). Każdy zidentyfikowany obiekt jest przedstawiony na obrazie jako kolorowy obszar. Zwróć uwagę na zgodność między wizualnie widocznymi skupiskami synaptycznymi w najbardziej lewym panelu a kolorowymi obszarami w panelu najbardziej prawym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.</li>
	<li>Każdy zidentyfikowany obiekt jest wymieniony oddzielnie w tabeli wyników. Można wybierać poszczególne obiekty, które w razie potrzeby są podświetlane na obrazie w celu inspekcji. Należy zauważyć, że tabela zawiera informacje dla kanałów czerwonego („rhodamine”) i zielonego („EGFP”); informacje z kanału zielonego mogą być mylące, ponieważ obiekty zostały zidentyfikowane ściśle na podstawie fluorescencji czerwonej. Analizę tę można przeprowadzić również na obrazach jednobarwnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.</li>
</ol>
<img alt="Porównanie fluorescencji neuronalnej; traktowanie muscimolem; wykres słupkowy, wykresy skumulowane; analiza synaptyczna." src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywne wyniki. Reprezentatywne mikrofotografie osobników dzikiego typu C. elegans barwionych pod kątem receptorów GABA UNC-49 przed (A) i po (B) traktowaniu muscimolem, agonistą receptora GABA, który powoduje downregulation receptorów po długotrwałej ekspozycji. Panele przedstawiają przycięte obrazy przed (lewo) i po (prawo) progowaniu oraz usunięciu małych plamek tła. (C) Wykresy ilościowych parametrów synaptycznych dla okazów przedstawionych na (A) i (B): całkowita fluorescencja znormalizowana do długości sznura nerwowego (lewo) oraz histogramy skumulowanego prawdopodobieństwa zawartości fluorescencji pojedynczych synaps (środek) i objętości synaps (prawo), wykazujące statystycznie istotną redukcję zawartości i objętości synaptycznej wywołaną ekspozycją na agonistę (n = 60 synaps dla grupy nietraktowanej, n = 115 synaps dla grupy traktowanej muscimolem; p &lt; 0.001, test Kołmogorowa-Smirnowa <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html</a>).

<ol><li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li>
<li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li>
<li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li>
<li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li>
<li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent%2C+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li>
<li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2%2B+entry+into+the+nerve+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Metoda zaprezentowana w niniejszej pracy została opracowana w celu uzyskania ilościowych danych wieloparametrycznych dla dużych populacji synaps u C. elegans, przy jednoczesnym maksymalizowaniu spójności w obrębie grup badawczych. Do realizacji tych celów przyczyniają się trzy cechy. Po pierwsze, barwienie immunocytochemiczne przeprowadza się na synchronizowanych populacjach nicieni, aby upewnić się, że wszystkie zwierzęta są w tym samym wieku. Krok ten jest kluczowy, ponieważ rozwojowa regulacja poziomów ekspre...

<table><tbody><tr><td>Volocity v4.0 lub nowsza</td><td>PerkinElmer/Improvision</td><td></td><td>W celu uzyskania dostępu do tego oprogramowania należy skontaktować się z lokalną jednostką obrazowania (imaging core facility). Oprogramowanie demonstracyjne jest dostępne na stronie internetowej firmy PerkinElmer. Metoda ta wymaga jedynie modułu Quantitation oprogramowania Volocity.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;span class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Bufor do jaj&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;NaCl&lt;br/&gt; KCl&lt;br/&gt; CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; HEPES&lt;br/&gt; (Dostosować pH do 7,3)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;118 mM&lt;br/&gt; 48 mM&lt;br/&gt; 2 mM&lt;br/&gt; 2 mM&lt;br/&gt; 24 mM&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Podchloryn alkaliczny (na 5 ml)&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Świeży wybielacz domowy (butelkę należy wyrzucić 30 dni po otwarciu)&lt;br/&gt; 10 N NaOH&lt;br/&gt; ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1,0 ml 0,25 ml&lt;br/&gt; 3,75 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;span class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Roztwory.&lt;/span&gt;</td></tr></tbody></table>

automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u c. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Siła synaptyczna odnosi się do amplitudy odpowiedzi postsynaptycznych na zdarzenia uwalniania neuroprzekaźnika z terminala presynaptycznego i ma istotny wpływ na ogólną funkcję obwodów neuronalnych. Siła synaptyczna zależy w sposób krytyczny od liczby receptorów neuroprzekaźników zgromadzonych w miejscach synaptycznych na błonie postsynaptycznej. Poziomy receptorów są ustalane w procesie rozwoju i mogą być zmieniane poprzez transport receptorów między pulami zlokalizowanymi na powierzchni, podsynaptycznymi a wewnątrzkomórkowymi, co stanowi istotny mechanizm plastyczności synaptycznej i neuromodulacji. Rygorystyczne metody ilościowego oznaczania liczby receptorów neuroprzekaźników zlokalizowanych w synapsach są niezbędne do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Mikroskopia fluorescencyjna jest optymalnym podejściem, ponieważ zachowuje informacje przestrzenne, umożliwiając odróżnienie pul synaptycznych od niesynaptycznych oraz rozróżnienie populacji receptorów zlokalizowanych w różnych typach synaps. Genetyczny organizm modelowy Caenorhabditis elegans jest szczególnie odpowiedni do tych badań ze względu na niewielki rozmiar i względną prostotę jego układu nerwowego, jego przezroczystość oraz dostępność potężnych technik genetycznych, które pozwalają na badanie naturalnych synaps w nienaruszonych zwierzętach.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę ilościowego oznaczania fluorescencyjnie znakowanych synaptycznych receptorów neurotransmiterów u C. elegans. Jej kluczową cechą jest zautomatyzowana identyfikacja i analiza pojedynczych synaps w trzech wymiarach w plikach wynikowych z konfokalnego mikroskopu wielopłaszczyznowego, z tabulacją pozycji, objętości, intensywności fluorescencji oraz całkowitej fluorescencji dla każdej synapsy. Podejście to posiada dwie główne zalety w stosunku do ręcznej analizy projekcji płaszczyzn z niżu (z-plane) danych konfokalnych. Po pierwsze, ponieważ uwzględniona jest każda płaszczyzna zestawu danych konfokalnych, żadne dane nie giną w wyniku projekcji z-plane, która zazwyczaj opiera się na średnich lub maksymalnych wartościach intensywności pikseli. Po drugie, identyfikacja synaps jest zautomatyzowana, lecz może być nadzorowana przez eksperymentatora w trakcie analizy danych, co pozwala na szybką i dokładną ekstrakcję danych z dużej liczby synaps. Z jednej próbki można łatwo uzyskać od setek do tysięcy synaps, co pozwala na stworzenie dużych zestawów danych w celu maksymalizacji mocy statystycznej. Omówiono również kwestie przygotowania C. elegans do analizy oraz przeprowadzenia obrazowania konfokalnego w celu zminimalizowania zmienności między zwierzętami w grupach badawczych. Choć metoda ta została opracowana do analizy receptorów postsynaptycznych u C. elegans, jest ona ogólnie użyteczna dla każdego rodzaju białka zlokalizowanego w synapsach, a w rzeczywistości dla każdego sygnału fluorescencji zlokalizowanego w postaci dyskretnych klastrów, punktów lub organelli.
Procedurę wykonuje się w trzech etapach: 1) przygotowanie próbek, 2) obrazowanie konfokalne oraz 3) analiza obrazów. Etapy 1 i 2 są specyficzne dla C. elegans, natomiast etap 3 ma zastosowanie ogólne do każdego punktowego sygnału fluorescencji w mikrografiach konfokalnych.

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Siła synaptyczna odnosi się do amplitudy odpowiedzi postsynaptycznych na zdarzenia uwalniania neurotransmitera z terminala presynaptycznego i ma istotny wpływ na ogólny...

Celem niniejszej procedury jest efektywna kwantyfikacja wymiarów i jasności punktowych sygnałów fluorescencyjnych w ziarnach. Dzięki temu możliwe jest przeanalizowanie dużych populacji obiektów. Statystycznie obrazowane są białka synaptyczne.W niniejszej demonstracji pierwszym krokiem procedury jest wygenerowanie wysokiego zagęszczenia zsynchronizowanych kultur badanych ELEGANS. Następnie należy wykonać obrazy konfokalne znakowanych synaps, minimalizując zmienność między poszczególnymi obrazami. Punkty synaptyczne są automatycznie identyfikowane i odróżniane od fluorescencji tła.Ostatnim krokiem jest zestawienie i zorganizowanie danych w celu przeprowadzenia wydajnej analizy końcowej. W rezultacie można precyzyjnie wykazać, w jaki sposób warunki eksperymentalne wpływają na rozmieszczenie białek synaptycznych lub dowolnych innych białek zlokalizowanych w punktach o wysokim kontraście. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza projekcji Zacka, jest zachowanie wszystkich danych, w tym objętości synaps, a zautomatyzowana identyfikacja umożliwia szybkie zgromadzenie setek próbek dla każdego badanego warunku.Protokół ten wymaga gęstych kultur dor

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zautomatyzowane ilościowe określenie fluorescencji synaptycznej w C. elegans

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Źródło: Pigazzini, M. L., et. al. Charakterystyka struktur amyloidowych w starzeniu się C. Elegans Korzystanie z obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. exp. (2020). Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) do oceny agregacji białek polyQ w neuronach C. elegans, porównując robaki kontrolne i robaki z niedoborem białka opiekuńczego. Zwiększona agregacja u robaków z niedoborem białka opiekuńczego sprzyja przenoszeniu energii między...

Obrazowanie czasu życia fluorescencji agregacji białka PolyQ w neuronach Caenorhabditis elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Produkty translacyjne związane z powtarzalnością, niezależne, są wyłaniającymi się cechami patogennymi kilku powtarzających się chorób opartych na ekspansji. Celem opisanego protokołu jest ocena toksyczności spowodowanej przez te peptydy przy użyciu testów behawioralnych i komórkowych w systemie modelowym C. elegans.

Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans

Ten protokół opisuje podejścia do wykrywania i ilościowego oznaczania dużych zagregowań i/lub organelli (~4 μm) wytwarzanych przez komórki C. elegans w postaci egzoferów związanych z błoną. Opisujemy szczepy, warunki wzrostu, kryteria punktacji, czas i rozważania mikroskopowe potrzebne do ułatwienia sekcji tego mechanizmu wydalania gruzu.

Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Naucz się automatycznej kwantyfikacji fluorescencji synaptycznej w C. elegans z rozdzielczością pojedynczych synaps. Ta metoda umożliwia szybką analizę setek synaps w jednej próbce z minimalnym zniekształceniem.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów