Name: Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Naucz się automatycznej kwantyfikacji fluorescencji synaptycznej w C. elegans z rozdzielczością pojedynczych synaps. Ta metoda umożliwia szybką analizę setek synaps w jednej próbce z minimalnym zniekształceniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować A. Benham za pomoc w opracowaniu protokołu. Praca ta została sfinansowana z grantu NIH NS06747 przyznanego B. A. B.

1. Przygotowanie nicieni do obrazowania
Ten fragment protokołu opiera się na opublikowanych technikach hodowli C. elegans1,2 i jest przedstawiony na Rysunku 1.
<ol>
	<li>Hodować nicienie na płytkach agarowych NGM z wysoką zawartością peptonu (10 cm) zasiających bakterie E. coli szczepu NA22, aż będą bliskie zagłodzenia. W przypadku immunobarwienia jedna płytka pozwoli na uzyskanie wystarczającej liczby nicieni dla jednej indywidualnej barwienia, biorąc pod uwagę straty w procesie oraz rygorystyczne kryteria wyboru osobników do obrazowania (patrz Część 2).</li>
	<li>Zebrać nicienie, wlewając na płytkę kilka ml ddH2O, krótko mieszając okrężnie, a następnie przelewając ciecz do stożkowej probówki 15 ml (powtórzyć w razie potrzeby, aby przenieść większość nicieni do probówki). Odwirować w wirówce klinicznej przez 3 min przy 1000x g. Przemyć osad 1–3 razy ddH2O, aż nadsącz stanie się klarowny, aby usunąć pozostałe bakterie. Do usuwania nadsączu używać polipropylenowych pipet transferowych, ponieważ nicienie przyklejają się do szkła (od tego etapu kluczowe jest minimalizowanie czasu między krokami, aby uniknąć spadku żywotności jaj).</li>
	<li>Po ostatnim przemyciu resuspender osad z nicieniami w 5 ml alkalicznego roztworu podchlorynu w celu lizy nicieni i uwolnienia jaj. Delikatnie kołysać i badać probówki pod mikroskopem stereoskopowym mniej więcej raz na minutę. Gdy około 50% nicieni zostanie poddanych lizie (będą wyglądać na wygięte i rozbite), przerwać proces lizy, wypełniając probówkę do pełna buforem do jaj (Egg Buffer), kilkukrotnie odwracając i odwirowując przez 3 min przy 1000x g. Czas lizy nie może przekroczyć 5 min.</li>
	<li>Usunąć nadsącz pipetą transferową i przemyć osad 3 razy buforem do jaj (Egg Buffer).</li>
	<li>Aby oddzielić jaja od zanieczyszczeń, przeprowadzić ich flotację na poduszce 30% sacharozy w ddH2O: po ostatnim przemyciu z etapu 1.4 ostrożnie usunąć nadsącz i resuspender osad w 5 ml ddH20. Dodać 5 ml sterylnej 60% sacharozy w ddH2O i dobrze wymieszać. Wirować w wirówce klinicznej przez 6 min przy 1000x g. Jaja zbiorą się na menisku (będą miały mętny wygląd), natomiast zanieczyszczenia opadną na dno.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety transferowej odessać jaja w minimalnej objętości i przenieść na niezasiane płytki agarowe NGM. Wszelkie jaja przywierające do ścianek probówki można delikatnie spłukać i również przenieść. Jedna niezasiana płytka 10 cm na analizowany szczep jest wystarczająca.</li>
	<li>Inkubować niezasiane płytki z jajami przez noc (~16 h) w temperaturze 20 °C. Przez pierwsze kilka godzin pozostawić pokrywkę lekko uchyloną, aby płytka wyschła, a następnie szczelnie przykryć na noc.</li>
	<li>Po wykluciu przenieść larwy L1 do stożkowej probówki 15 ml z medium S Basal (dodać kilka ml S Basal na płytkę, wymieszać okrężnie i przelać do probówki). Odwirować w wirówce klinicznej (3 min, 1000x g), resuspender w minimalnej objętości S Basal i przenieść na płytki agarowe NGM 10 cm zasiaiane bakteriami NA22. Na tym etapie używać 2 płytek dla każdej pierwotnej płytki z etapu 1.1. Inkubować, aż nicienie osiągną pożądany wiek.</li>
	<li>Monitorować hodowle raz lub dwa razy dziennie. Jeśli pojawi się ryzyko zagłodzenia, przenieść je na świeże płytki NA22. W przypadku nicieni typu dzikiego N2 zagłodzeniu poprzedza utworzenie się linii lub fali nicieni przemieszczającej się przez płytkę, gdy zwierzęta masowo migrują z obszarów wyczerpanych z pożywienia. Po uformowaniu się takiej struktury pożywienie zostanie całkowicie zużyte w ciągu kilku godzin.</li>
	<li>Nicienie są teraz gotowe do immunobarwienia lub obrazowania na żywo. Optymalne jest utrwalanie i barwienie nicieni w zawiesinie, ponieważ pozwala to na łatwe obrazowanie dużych liczb nienaruszonych osobników. Procedury barwienia oparte na protokole Finneya i Ruvkuna3-6 są preferowane nad procedurami mrożenia i pękania (freeze-crack), ponieważ do obrazowania wymagana jest duża liczba nicieni.</li>
</ol>
2. Obrazowanie konfokalne
<ol>
	<li>Zamocuj nicienie na szkiełkach do obrazowania konfokalnego. Dostosuj gęstość nicieni do poziomu kilku stu osobników na mikrolitr. Przygotuj podkład z 2% agarose w S-basal, otaczając go cienkim pierścieniem wazeliny, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania (nałożyć za pomocą strzykawki 3 ml z odciętą igłą 25 G). Pipetuj kilka mikrolitrów zawiesiny nicieni na szkiełko nakrywkę (w przypadku obrazowania żywych nicieni użyj środka znieczulającego), a następnie opuść podkład z agarose na szkiełko nakrywkę, rozkładając nicienie równomiernie na jego powierzchni.</li>
	<li>Wybierz nicienie do obrazowania. Wybierz osobniki, w których badane synapsy są skierowane w stronę obiektywu, z przesunięciem radialnym nie większym niż ±45° (gdzie 0° oznacza orientację bezpośrednio w stronę obiektywu). Przeprowadź tę ocenę szybko (w ciągu kilku sekund), aby uniknąć fotobielenia. Skala początkowych hodowli została zoptymalizowana tak, aby zapewnić wystarczającą liczbę nicieni spełniających te kryteria geometryczne.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie konfokalne preparatu. Najlepsze wyniki dają próbki względnie płaskie, które można objąć około 14 sekcjami o grubości 0.4 μm. Do szybkiego i dokładnego zbierania danych wystarczające są obrazy o wysokiej prędkości i niskiej rozdzielczości (512 x 512 pikseli). Unikaj nasycenia detektora zbyt silnym sygnałem, ponieważ spowoduje to niedoszacowanie sygnałów fluorescencyjnych.</li>
</ol>
3. Zautomatyzowana identyfikacja i analiza poszczególnych klastrów synaptycznych
<ol>
	<li>Otwórz pliki wyjściowe w formacie multi-TIF z mikroskopu konfokalnego, korzystając z oprogramowania Volocity 4.0 (lub nowszego) (PerkinElmer).</li>
	<li>Wytnij obszary obrazu, które nie zawierają interesującej struktury (Image -&gt; Extended Focus -&gt; Select area of interest using 'Freehand ROI' tool -&gt; Actions -&gt; Crop to Selection; Rycina 2A). Uwaga: funkcja Extended Focus generuje na ekranie komputera projekcję płaszczyzny z, aby ułatwić analizę, ale nie wpływa na podstawowe dane; to samo dotyczy ewentualnych korekt jasności i kontrastu).</li>
	<li>Zmierz długość analizowanego obszaru za pomocą narzędzia Line Tool. Długość linii zostanie obliczona i dodana do tabeli danych (Rycina 2B).</li>
	<li>Zidentyfikuj obiekty, korzystając z filtra „Objects by Intensity” (tryb Measurements). Określ próg w taki sposób, aby podświetlone zostały klastry synaptyczne, a nie synaptyczne tło (Rycina 2C). Zastosowanie niezależnego markera synaptycznego znakowanego innym kolorem może pomóc jednoznacznie zidentyfikować synapsy. Typowe synapsy obejmują od kilku do kilkuset wokseli. Ustaw próg raz, korzystając z próbki kontrolnej, a następnie stosuj go do wszystkich kolejnych próbek. Oddzielne wyznaczanie progu dla każdej próbki jest niedopuszczalne, ponieważ wprowadza ryzyko błędu eksperymentatora. Obiekty są wybierane i tabulowane automatycznie (Rycina 2D).</li>
	<li>Uporządkuj i wyeksportuj dane. Usuń obiekty o rozmiarze 2 wokseli lub mniejszych, ponieważ są to zazwyczaj drobinki tła. Można je wyeliminować poprzez dalsze filtrowanie lub podczas późniejszej analizy. Aby ułatwić ich usunięcie na dalszych etapach, ponownie posortuj plik danych według „object size”, tak aby zostały zgrupowane. Eksportuj dane w formacie CSV, który można otworzyć w programie Microsoft Excel lub innych programach arkuszy kalkulacyjnych. Każdy obraz generuje jeden plik wyjściowy.</li>
	<li>Jeśli oprogramowanie Volocity jest niedostępne, można zastosować alternatywne metody analizy projekcji płaszczyzn Z danych konfokalnych (np. ref. 7 lub analiza ręczna w programie ImageJ), choć wiąże się to z utratą informacji trójwymiarowych (patrz Discussion).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przedstawiona metoda ilościowa powinna pozwalać na rozróżnianie populacji klastrów o różnej jasności i różnych objętościach. Reprezentatywne obrazy oraz odpowiadające im dane ilościowe przedstawione na Rysunku 3 demonstrują przykłady różnicowania na podstawie tych parametrów. Co do zasady wyniki powinny być zgodne z tym, co jest widoczne gołym okiem. W przypadku immunobarwienia receptorów GABA UNC-49 w brzusznych sznurach nerwowych C. elegans, wszystkie zwierzęta zazwyczaj wydawały się bardzo podobne pod względem wielkości i stopnia dojrzałości, a całkowite wartości fluorescencji synaptycznej dla grupy pięciu osobników (znormalizowane do długości analizowanego sznura nerwowego) wykazały błąd standardowy wynoszący około 10% średniej 4. Mutacje genetyczne oraz inne zabiegi eksperymentalne (np. ekspozycja na leki) mogą zmieniać nie tylko wartości objętości i intensywności oraz rozkłady częstotliwości klastrów synaptycznych, ale potencjalnie także przebieg czasowy rozwoju i synchronizację osobników, co prowadzi do większej zmienności. Niemniej jednak wyniki ilościowe powinny zawsze odzwierciedlać to, co można ocenić wizualnie; w przeciwnym razie analiza obrazów i obiektów zidentyfikowanych przez program Volocity powinna ujawnić, gdzie wystąpił błąd i zasugerować działania naprawcze, takie jak ponowne ustalenie progu (re-thresholding) lub usunięcie obiektów artefaktowych.
<img alt="Schemat doświadczenia dotyczącego cyklu życiowego C. elegans: hodowla, zbieranie jaj, wzrost, przygotowanie do mikroskopii." src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przygotowanie synchronicznych kultur C. elegans. Synchroniczne kultury uzyskuje się za pomocą tej procedury, ponieważ rozwój C. elegans zatrzymuje się na stadium larwalnym L1 w przypadku braku pożywienia i zostaje wznowiony po jego podaniu.
<img alt="Schemat analizy sznura nerwowego; kroki obejmują wybór, ustawienie progu, pomiar długości i tabulację danych." src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Ilościowe oznaczenie punktów synaptycznych.
<ol class="ualpha">
	<li>Zbędne obszary obrazu są przycinane w celu zmniejszenia rozmiaru plików i zwiększenia specyficzności. Lewy panel pokazuje obraz początkowy, środkowy panel wybrany obszar, a prawy panel obraz po przycięciu. Sygnał czerwony to immunofluorescencja receptora GABA UNC-49, sygnał zielony to synaptobrevina-GFP (marker presynaptyczny) ekspresowana w presynaptycznych neuronach GABA 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.</li>
	<li>Rysowana jest linia o długości analizowanego segmentu sznura nerwowego, a jego długość jest automatycznie zapisywana w tabeli wyników. Informacja ta jest niezbędna do normalizacji danych synaptycznych ze względu na długość analizowanego sznura nerwowego, która może różnić się kilkukrotnie, jeśli nicienie ulegną fragmentacji podczas barwienia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.</li>
	<li>Stosowany jest próg (threshold), aby zidentyfikować poszczególne skupiska synaptyczne. Lewy panel pokazuje obraz przed progowaniem; przykłady różnych poziomów progowania przedstawiono na oddzielnych panelach (pominięto sygnał zielony). Każdy zidentyfikowany obiekt jest przedstawiony na obrazie jako kolorowy obszar. Zwróć uwagę na zgodność między wizualnie widocznymi skupiskami synaptycznymi w najbardziej lewym panelu a kolorowymi obszarami w panelu najbardziej prawym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.</li>
	<li>Każdy zidentyfikowany obiekt jest wymieniony oddzielnie w tabeli wyników. Można wybierać poszczególne obiekty, które w razie potrzeby są podświetlane na obrazie w celu inspekcji. Należy zauważyć, że tabela zawiera informacje dla kanałów czerwonego („rhodamine”) i zielonego („EGFP”); informacje z kanału zielonego mogą być mylące, ponieważ obiekty zostały zidentyfikowane ściśle na podstawie fluorescencji czerwonej. Analizę tę można przeprowadzić również na obrazach jednobarwnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.</li>
</ol>
<img alt="Porównanie fluorescencji neuronalnej; traktowanie muscimolem; wykres słupkowy, wykresy skumulowane; analiza synaptyczna." src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywne wyniki. Reprezentatywne mikrofotografie osobników dzikiego typu C. elegans barwionych pod kątem receptorów GABA UNC-49 przed (A) i po (B) traktowaniu muscimolem, agonistą receptora GABA, który powoduje downregulation receptorów po długotrwałej ekspozycji. Panele przedstawiają przycięte obrazy przed (lewo) i po (prawo) progowaniu oraz usunięciu małych plamek tła. (C) Wykresy ilościowych parametrów synaptycznych dla okazów przedstawionych na (A) i (B): całkowita fluorescencja znormalizowana do długości sznura nerwowego (lewo) oraz histogramy skumulowanego prawdopodobieństwa zawartości fluorescencji pojedynczych synaps (środek) i objętości synaps (prawo), wykazujące statystycznie istotną redukcję zawartości i objętości synaptycznej wywołaną ekspozycją na agonistę (n = 60 synaps dla grupy nietraktowanej, n = 115 synaps dla grupy traktowanej muscimolem; p &lt; 0.001, test Kołmogorowa-Smirnowa <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html</a>).

<ol><li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li>
<li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li>
<li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li>
<li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li>
<li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li>
<li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li>
<li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent%2C+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li>
<li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2%2B+entry+into+the+nerve+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Metoda zaprezentowana w niniejszej pracy została opracowana w celu uzyskania ilościowych danych wieloparametrycznych dla dużych populacji synaps u C. elegans, przy jednoczesnym maksymalizowaniu spójności w obrębie grup badawczych. Do realizacji tych celów przyczyniają się trzy cechy. Po pierwsze, barwienie immunocytochemiczne przeprowadza się na synchronizowanych populacjach nicieni, aby upewnić się, że wszystkie zwierzęta są w tym samym wieku. Krok ten jest kluczowy, ponieważ rozwojowa regulacja poziomów ekspre...

<table><tbody><tr><td>Volocity v4.0 lub nowsza</td><td>PerkinElmer/Improvision</td><td></td><td>W celu uzyskania dostępu do tego oprogramowania należy skontaktować się z lokalną jednostką obrazowania (imaging core facility). Oprogramowanie demonstracyjne jest dostępne na stronie internetowej firmy PerkinElmer. Metoda ta wymaga jedynie modułu Quantitation oprogramowania Volocity.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;span class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Bufor do jaj&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;NaCl&lt;br/&gt; KCl&lt;br/&gt; CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; HEPES&lt;br/&gt; (Dostosować pH do 7,3)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;118 mM&lt;br/&gt; 48 mM&lt;br/&gt; 2 mM&lt;br/&gt; 2 mM&lt;br/&gt; 24 mM&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Podchloryn alkaliczny (na 5 ml)&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Świeży wybielacz domowy (butelkę należy wyrzucić 30 dni po otwarciu)&lt;br/&gt; 10 N NaOH&lt;br/&gt; ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1,0 ml 0,25 ml&lt;br/&gt; 3,75 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;span class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Roztwory.&lt;/span&gt;</td></tr></tbody></table>

automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u c. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Siła synaptyczna odnosi się do amplitudy odpowiedzi postsynaptycznych na zdarzenia uwalniania neuroprzekaźnika z terminala presynaptycznego i ma istotny wpływ na ogólną funkcję obwodów neuronalnych. Siła synaptyczna zależy w sposób krytyczny od liczby receptorów neuroprzekaźników zgromadzonych w miejscach synaptycznych na błonie postsynaptycznej. Poziomy receptorów są ustalane w procesie rozwoju i mogą być zmieniane poprzez transport receptorów między pulami zlokalizowanymi na powierzchni, podsynaptycznymi a wewnątrzkomórkowymi, co stanowi istotny mechanizm plastyczności synaptycznej i neuromodulacji. Rygorystyczne metody ilościowego oznaczania liczby receptorów neuroprzekaźników zlokalizowanych w synapsach są niezbędne do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Mikroskopia fluorescencyjna jest optymalnym podejściem, ponieważ zachowuje informacje przestrzenne, umożliwiając odróżnienie pul synaptycznych od niesynaptycznych oraz rozróżnienie populacji receptorów zlokalizowanych w różnych typach synaps. Genetyczny organizm modelowy Caenorhabditis elegans jest szczególnie odpowiedni do tych badań ze względu na niewielki rozmiar i względną prostotę jego układu nerwowego, jego przezroczystość oraz dostępność potężnych technik genetycznych, które pozwalają na badanie naturalnych synaps w nienaruszonych zwierzętach.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę ilościowego oznaczania fluorescencyjnie znakowanych synaptycznych receptorów neurotransmiterów u C. elegans. Jej kluczową cechą jest zautomatyzowana identyfikacja i analiza pojedynczych synaps w trzech wymiarach w plikach wynikowych z konfokalnego mikroskopu wielopłaszczyznowego, z tabulacją pozycji, objętości, intensywności fluorescencji oraz całkowitej fluorescencji dla każdej synapsy. Podejście to posiada dwie główne zalety w stosunku do ręcznej analizy projekcji płaszczyzn z niżu (z-plane) danych konfokalnych. Po pierwsze, ponieważ uwzględniona jest każda płaszczyzna zestawu danych konfokalnych, żadne dane nie giną w wyniku projekcji z-plane, która zazwyczaj opiera się na średnich lub maksymalnych wartościach intensywności pikseli. Po drugie, identyfikacja synaps jest zautomatyzowana, lecz może być nadzorowana przez eksperymentatora w trakcie analizy danych, co pozwala na szybką i dokładną ekstrakcję danych z dużej liczby synaps. Z jednej próbki można łatwo uzyskać od setek do tysięcy synaps, co pozwala na stworzenie dużych zestawów danych w celu maksymalizacji mocy statystycznej. Omówiono również kwestie przygotowania C. elegans do analizy oraz przeprowadzenia obrazowania konfokalnego w celu zminimalizowania zmienności między zwierzętami w grupach badawczych. Choć metoda ta została opracowana do analizy receptorów postsynaptycznych u C. elegans, jest ona ogólnie użyteczna dla każdego rodzaju białka zlokalizowanego w synapsach, a w rzeczywistości dla każdego sygnału fluorescencji zlokalizowanego w postaci dyskretnych klastrów, punktów lub organelli.
Procedurę wykonuje się w trzech etapach: 1) przygotowanie próbek, 2) obrazowanie konfokalne oraz 3) analiza obrazów. Etapy 1 i 2 są specyficzne dla C. elegans, natomiast etap 3 ma zastosowanie ogólne do każdego punktowego sygnału fluorescencji w mikrografiach konfokalnych.

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Siła synaptyczna odnosi się do amplitudy odpowiedzi postsynaptycznych na zdarzenia uwalniania neurotransmitera z terminala presynaptycznego i ma istotny wpływ na ogólny...

Celem niniejszej procedury jest efektywna kwantyfikacja wymiarów i jasności punktowych sygnałów fluorescencyjnych w ziarnach. Dzięki temu możliwe jest przeanalizowanie dużych populacji obiektów. Statystycznie obrazowane są białka synaptyczne.W niniejszej demonstracji pierwszym krokiem procedury jest wygenerowanie wysokiego zagęszczenia zsynchronizowanych kultur badanych ELEGANS. Następnie należy wykonać obrazy konfokalne znakowanych synaps, minimalizując zmienność między poszczególnymi obrazami. Punkty synaptyczne są automatycznie identyfikowane i odróżniane od fluorescencji tła.Ostatnim krokiem jest zestawienie i zorganizowanie danych w celu przeprowadzenia wydajnej analizy końcowej. W rezultacie można precyzyjnie wykazać, w jaki sposób warunki eksperymentalne wpływają na rozmieszczenie białek synaptycznych lub dowolnych innych białek zlokalizowanych w punktach o wysokim kontraście. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza projekcji Zacka, jest zachowanie wszystkich danych, w tym objętości synaps, a zautomatyzowana identyfikacja umożliwia szybkie zgromadzenie setek próbek dla każdego badanego warunku.Protokół ten wymaga gęstych kultur dorosłych nicieni C. elegans wyhodowanych na 10-centymetrowych płytkach z agarem NGM z dodatkiem peptydów i bakterii E. coli szczep NA 22; należy przygotować dokładnie jedną płytkę na każde zaplanowane barwienie immunologiczne. Rozpocznij od zebrania nicieni za pomocą kilku mililitrów wody. Przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i powtarzaj ten proces, aż do momentu zebrania większości nicieni.Odwiruj nicienie i płucz osad wodą do trzech razy, aż nadsącz stanie się klarowny. Pozwala to na usunięcie pozostałości bakterii. Roztwory, które mogą zawierać nicienie lub jaja, należy zawsze przenosić za pomocą pipet plastikowych, ponieważ organizmy te mogą przywierać do szkła. Na tym etapie kluczowe jest sprawne przeprowadzenie pozostałych kroków, aby zapobiec utracie żywotności jaj.Uwolnij jaja nicieni, poddając je ponownemu wyginaniu w 5 mL alkalicznego roztworu podchlorynu. Delikatnie kołysz probówkami i badaj je pod mikroskopem stereoskopowym mniej więcej raz na minutę. Kontynuuj proces przez pięć minut lub do momentu, gdy około połowa nicieni w probówce wyda się wygięta i pęknięta.Napełnij probówkę do pełna buforem do jaj i odwróć ją kilka razy. Po odwirowaniu nicieni odessać i usunąć nadsącz. Następnie przemyć osad trzykrotnie buforem do jaj.Po przemyciach Reese zawiesza osad w pięciu mililitrach wody, a następnie dodaje pięć mililitrów sterylnego 60% roztworu sacharozy w wodzie i dokładnie miesza. Po odwirowaniu zawiesiny jaja będą znajdować się na linii menisku i będą wyglądać na mętne.Przenieś każdą kolekcję jaj do osobnej, nieposianej szalki z agarem NGM o średnicy 10 cm. Do wypłukania X na szalkę można użyć wody, jednak należy dążyć do zminimalizowania ilości przenoszonych cieczy. Inkubuj szalki przez noc w temperaturze 20 °C, przez pierwsze kilka godzin. Przewietrz szalki, pozostawiając przykrywki lekko uchylone, ale upewnij się, że są one całkowicie przykryte na noc.Po wykluciu przenieść larwy w stadium L1 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej podłożem S basil. Zcentryfugować larwy L1 i zawiesić je ponownie w minimalnej objętości podłoża S basil. Następnie podzielić każdą kolekcję larw L1 na dwie 10-centymetrowe szalki z agarem NGM zaszczepione bakteriami NA 22.Monitoruj kultury raz lub dwa razy dziennie. Jeśli istnieje ryzyko ich zagłodzenia, przenieś je na świeże płytki NA 22 przed wystąpieniem głodu; w przeciwnym razie linie typu N2 zaczną gromadzić się i przemieszczać wspólnie w formie fali, oddalając się od stref wyczerpania pożywienia na tych płytkach, a zapas pożywienia zostanie całkowicie wyczerpany w ciągu kilku godzin.Gdy nicienie osiągną pożądany wiek, są gotowe do barwienia immunocytochemicznego lub obrazowania żywych organizmów w celu ich zamocowania. Do obrazowania konfokalnego należy użyć medium montażowego Antifade, aby dostosować ich gęstość do poziomu kilku stu nicieni na µL.Z doświadczeniem gęstość tę można rozpoznać po mętności zawiesiny. W idealnym przypadku nicienie powinny być gęsto rozmieszczone na szkiełku mikroskopowym, ale nie powinny nadmiernie na siebie nachodzić. Na szkiełku przygotuj kroplę 2% aros w ESP basil, otaczając ją cienkim pierścieniem wazeliny.Aby zapobiec odparowaniu podczas obrazowania, nanieś wazelinę za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml z odciętą igłą o rozmiarze 25 G. Następnie nanieś pipetą kilka µL zawiesiny nicieni na szkiełko nakrywkowe, używając końcówki pipety z odciętym końcem, aby uniknąć uszkodzeń mechanicznych nicieni, a następnie opuść podkład z agarozy na szkiełko nakrywkowe, rozkładając nicienie równomiernie na podkładzie pod mikroskopem. Interesujące synapsy powinny być zorientowane tak, aby były skierowane bezpośrednio w stronę obiektywu lub pod kątem nieprzekraczającym 45 stopni względem niego.Poświęć na to kilka sekund, aby uniknąć fotowybielania. Kultura i warunki powinny zapewnić wystarczającą liczbę nicieni, aby spełnić to rygorystyczne kryterium, przedstawione tutaj jako idealna orientacja, w której sznur brzuszny jest skierowany bezpośrednio w stronę obiektywu. Kolejny osobnik zostałby odrzucony, ponieważ jego sznur brzuszny jest skierowany w stronę przeciwną do obiektywu.Zauważmy, że w tym preparacie sznur grzbietowy skierowany w stronę obiektywu daje obraz o ostrzejszym skupieniu. Oto kolejny przykład, który zostałby odrzucony, ponieważ sznury grzbietowy i brzuszny znajdują się na krawędziach organizmu. W takim przypadku światło wzbudzenia i emisji musi przejść przez większą ilość tkanki nicienia, co prowadziłoby do zniekształceń obrazu.Głównym wyzwaniem jest zminimalizowanie zmienności w obrębie grup badawczych; synchronizacja wieku oraz wybór nicieni, w których interesująca nas struktura jest skierowana bezpośrednio w stronę obiektywu, mogą w tym znacznie pomóc. Rozpoczęcie pracy z dużymi kulturami zwiększa wybór osobników, co pozwala na uzyskanie maksymalnej spójności. Aby uzyskać najlepsze wyniki obrazowania, należy wybierać próbki stosunkowo płaskie, które można objąć stosem składającym się z 14 lub mniejszej liczby obrazów.Przekroje o grubości 0,4 µm. Do szybkiego i dokładnego zbierania danych wystarczające są obrazy o wysokiej prędkości i niskiej rozdzielczości. Należy unikać nasycania detektora nadmierną siłą sygnału, ponieważ spowoduje to niedoszacowanie sygnałów fluorescencji.W niniejszym pokazie wykorzystano komercyjny pakiet oprogramowania velocity w wersji co najmniej 4.0. Wiele alternatywnych programów powoduje utratę informacji trójwymiarowych. Po otwarciu plików wyjściowych w formacie multi tiff z mikroskopu konfokalnego należy wybrać opcję image, następnie extended focus, a potem freehand.Następnie za pomocą ROI wycina się obszary obrazu, które nie zawierają analizowanej struktury. Wykorzystując aktywowane narzędzie, funkcja extended focus zapewnia projekcję w płaszczyźnie Z, co ułatwia zaznaczanie ROI. Nie wpływa to na dane źródłowe.Podobnie, korekty jasności i kontrastu nie wpływają na dane podstawowe. Zakończ przycinanie, wybierając opcję działań i przytnij do zaznaczenia. Następnie zmierz długość analizowanego obszaru.Po użyciu narzędzia linii jej długość zostanie obliczona i dodana do tabeli danych. Teraz należy zidentyfikować obiekty, korzystając z filtra obiektów według intensywności w trybie pomiarów. Włączenie niezależnego markera synaptycznego oznaczonego unikalnym kolorem może pomóc w jednoznacznym zidentyfikowaniu synaps; należy określić próg w taki sposób, aby podświetlone zostały klastry synaptyczne, a nie niesynaptyczne tło.Należy wykonać tę czynność tylko raz, używając próbki kontrolnej, a następnie zastosować ją do wszystkich kolejnych próbek; progowanie każdej próbki osobno jest niedopuszczalne, ponieważ wprowadza ryzyko błędu eksperymentatora. Obiekty są wybierane i tabulowane automatycznie. Typowe synapsy obejmują od kilku do kilkuset wokseli; przed eksportem danych należy je posortować według rozmiaru obiektu.Ułatwia to późniejsze usuwanie obiektów o wielkości dwóch lub mniej wokseli, które zazwyczaj są jedynie artefaktami tła. Następnie należy wyeksportować dane w formacie CSV, który można otworzyć w dowolnym programie do arkuszy kalkulacyjnych. Każdy obraz generuje jeden plik wyjściowy do sortowania i eksportu; mikrografie sznura nerwowego brzusznego CL gans, na których wykazano 49 receptorów GABA, zostały przygotowane zgodnie z opisanym protokołem.Wszystkie zwierzęta wydawały się bardzo podobne pod względem wielkości i stopnia dojrzałości. Całkowite wartości fluorescencji synaptycznej dla pięciu nicieni zostały znormalizowane względem długości analizowanego sznura nerwowego. Dane te wykazały wartości błędu standardowego wynoszące około 10% średniej.Obraz po lewej stronie jest surowy, bez zastosowania progu odcięcia oraz usuwania tła i artefaktów. Synapsy potraktowano mus carmalem, agonistą receptora GABA, który powoduje downregulację receptorów po długiej ekspozycji. Całkowitą fluorescencję zmierzono i znormalizowano do skumulowanego prawdopodobieństwa długości sznura nerwowego.Obliczono histogramy zawartości fluorescencji poszczególnych synaps. Analogicznie obliczono objętość synaps. Pomiary te wykazują, że ekspozycja na agonistę znacząco redukuje zawartość oraz objętość synaptyczną.Ogólnie wyniki ilościowe powinny zawsze odzwierciedlać to, co można ocenić wizualnie. W przeciwnym razie analiza obrazów oraz obiektów zidentyfikowanych na podstawie prędkości powinna wskazać miejsce wystąpienia błędu i zasugerować działania korygujące, takie jak progowanie lub usuwanie artefaktów podczas wykonywania tej procedury. Kluczowe jest wybieranie nicieni do obrazowania na podstawie ich orientacji geometrycznej, a nie subiektywnej oceny jakości obrazu; jeśli to możliwe, wysoce zaleca się stosowanie ślepej oceny.

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zautomatyzowane ilościowe określenie fluorescencji synaptycznej w C. elegans

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Źródło: Pigazzini, M. L., et. al. Charakterystyka struktur amyloidowych w starzeniu się C. Elegans Korzystanie z obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. exp. (2020). Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) do oceny agregacji białek polyQ w neuronach C. elegans, porównując robaki kontrolne i robaki z niedoborem białka opiekuńczego. Zwiększona agregacja u robaków z niedoborem białka opiekuńczego sprzyja przenoszeniu energii między...

Obrazowanie czasu życia fluorescencji agregacji białka PolyQ w neuronach Caenorhabditis elegans

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Produkty translacyjne związane z powtarzalnością, niezależne, są wyłaniającymi się cechami patogennymi kilku powtarzających się chorób opartych na ekspansji. Celem opisanego protokołu jest ocena toksyczności spowodowanej przez te peptydy przy użyciu testów behawioralnych i komórkowych w systemie modelowym C. elegans.

Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans

Ten protokół opisuje podejścia do wykrywania i ilościowego oznaczania dużych zagregowań i/lub organelli (~4 μm) wytwarzanych przez komórki C. elegans w postaci egzoferów związanych z błoną. Opisujemy szczepy, warunki wzrostu, kryteria punktacji, czas i rozważania mikroskopowe potrzebne do ułatwienia sekcji tego mechanizmu wydalania gruzu.

Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Naucz się automatycznej kwantyfikacji fluorescencji synaptycznej w C. elegans z rozdzielczością pojedynczych synaps. Ta metoda umożliwia szybką analizę setek synaps w jednej próbce z minimalnym zniekształceniem.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów