Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Celem niniejszej procedury jest efektywna kwantyfikacja wymiarów i jasności punktowych sygnałów fluorescencyjnych w ziarnach. Dzięki temu możliwe jest przeanalizowanie dużych populacji obiektów. Statystycznie obrazowane są białka synaptyczne.

W niniejszej demonstracji pierwszym krokiem procedury jest wygenerowanie wysokiego zagęszczenia zsynchronizowanych kultur badanych ELEGANS. Następnie należy wykonać obrazy konfokalne znakowanych synaps, minimalizując zmienność między poszczególnymi obrazami. Punkty synaptyczne są automatycznie identyfikowane i odróżniane od fluorescencji tła.

Ostatnim krokiem jest zestawienie i zorganizowanie danych w celu przeprowadzenia wydajnej analizy końcowej. W rezultacie można precyzyjnie wykazać, w jaki sposób warunki eksperymentalne wpływają na rozmieszczenie białek synaptycznych lub dowolnych innych białek zlokalizowanych w punktach o wysokim kontraście. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza projekcji Zacka, jest zachowanie wszystkich danych, w tym objętości synaps, a zautomatyzowana identyfikacja umożliwia szybkie zgromadzenie setek próbek dla każdego badanego warunku.

Protokół ten wymaga gęstych kultur dorosłych nicieni C. elegans wyhodowanych na 10-centymetrowych płytkach z agarem NGM z dodatkiem peptydów i bakterii E. coli szczep NA 22; należy przygotować dokładnie jedną płytkę na każde zaplanowane barwienie immunologiczne. Rozpocznij od zebrania nicieni za pomocą kilku mililitrów wody. Przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i powtarzaj ten proces, aż do momentu zebrania większości nicieni.

Odwiruj nicienie i płucz osad wodą do trzech razy, aż nadsącz stanie się klarowny. Pozwala to na usunięcie pozostałości bakterii. Roztwory, które mogą zawierać nicienie lub jaja, należy zawsze przenosić za pomocą pipet plastikowych, ponieważ organizmy te mogą przywierać do szkła. Na tym etapie kluczowe jest sprawne przeprowadzenie pozostałych kroków, aby zapobiec utracie żywotności jaj.

Uwolnij jaja nicieni, poddając je ponownemu wyginaniu w 5 mL alkalicznego roztworu podchlorynu. Delikatnie kołysz probówkami i badaj je pod mikroskopem stereoskopowym mniej więcej raz na minutę. Kontynuuj proces przez pięć minut lub do momentu, gdy około połowa nicieni w probówce wyda się wygięta i pęknięta.

Napełnij probówkę do pełna buforem do jaj i odwróć ją kilka razy. Po odwirowaniu nicieni odessać i usunąć nadsącz. Następnie przemyć osad trzykrotnie buforem do jaj.

Po przemyciach Reese zawiesza osad w pięciu mililitrach wody, a następnie dodaje pięć mililitrów sterylnego 60% roztworu sacharozy w wodzie i dokładnie miesza. Po odwirowaniu zawiesiny jaja będą znajdować się na linii menisku i będą wyglądać na mętne.

Przenieś każdą kolekcję jaj do osobnej, nieposianej szalki z agarem NGM o średnicy 10 cm. Do wypłukania X na szalkę można użyć wody, jednak należy dążyć do zminimalizowania ilości przenoszonych cieczy. Inkubuj szalki przez noc w temperaturze 20 °C, przez pierwsze kilka godzin. Przewietrz szalki, pozostawiając przykrywki lekko uchylone, ale upewnij się, że są one całkowicie przykryte na noc.

Po wykluciu przenieść larwy w stadium L1 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej podłożem S basil. Zcentryfugować larwy L1 i zawiesić je ponownie w minimalnej objętości podłoża S basil. Następnie podzielić każdą kolekcję larw L1 na dwie 10-centymetrowe szalki z agarem NGM zaszczepione bakteriami NA 22.

Monitoruj kultury raz lub dwa razy dziennie. Jeśli istnieje ryzyko ich zagłodzenia, przenieś je na świeże płytki NA 22 przed wystąpieniem głodu; w przeciwnym razie linie typu N2 zaczną gromadzić się i przemieszczać wspólnie w formie fali, oddalając się od stref wyczerpania pożywienia na tych płytkach, a zapas pożywienia zostanie całkowicie wyczerpany w ciągu kilku godzin.

Gdy nicienie osiągną pożądany wiek, są gotowe do barwienia immunocytochemicznego lub obrazowania żywych organizmów w celu ich zamocowania. Do obrazowania konfokalnego należy użyć medium montażowego Antifade, aby dostosować ich gęstość do poziomu kilku stu nicieni na µL.

Z doświadczeniem gęstość tę można rozpoznać po mętności zawiesiny. W idealnym przypadku nicienie powinny być gęsto rozmieszczone na szkiełku mikroskopowym, ale nie powinny nadmiernie na siebie nachodzić. Na szkiełku przygotuj kroplę 2% aros w ESP basil, otaczając ją cienkim pierścieniem wazeliny.

Aby zapobiec odparowaniu podczas obrazowania, nanieś wazelinę za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml z odciętą igłą o rozmiarze 25 G. Następnie nanieś pipetą kilka µL zawiesiny nicieni na szkiełko nakrywkowe, używając końcówki pipety z odciętym końcem, aby uniknąć uszkodzeń mechanicznych nicieni, a następnie opuść podkład z agarozy na szkiełko nakrywkowe, rozkładając nicienie równomiernie na podkładzie pod mikroskopem. Interesujące synapsy powinny być zorientowane tak, aby były skierowane bezpośrednio w stronę obiektywu lub pod kątem nieprzekraczającym 45 stopni względem niego.

Poświęć na to kilka sekund, aby uniknąć fotowybielania. Kultura i warunki powinny zapewnić wystarczającą liczbę nicieni, aby spełnić to rygorystyczne kryterium, przedstawione tutaj jako idealna orientacja, w której sznur brzuszny jest skierowany bezpośrednio w stronę obiektywu. Kolejny osobnik zostałby odrzucony, ponieważ jego sznur brzuszny jest skierowany w stronę przeciwną do obiektywu.

Zauważmy, że w tym preparacie sznur grzbietowy skierowany w stronę obiektywu daje obraz o ostrzejszym skupieniu. Oto kolejny przykład, który zostałby odrzucony, ponieważ sznury grzbietowy i brzuszny znajdują się na krawędziach organizmu. W takim przypadku światło wzbudzenia i emisji musi przejść przez większą ilość tkanki nicienia, co prowadziłoby do zniekształceń obrazu.

Głównym wyzwaniem jest zminimalizowanie zmienności w obrębie grup badawczych; synchronizacja wieku oraz wybór nicieni, w których interesująca nas struktura jest skierowana bezpośrednio w stronę obiektywu, mogą w tym znacznie pomóc. Rozpoczęcie pracy z dużymi kulturami zwiększa wybór osobników, co pozwala na uzyskanie maksymalnej spójności. Aby uzyskać najlepsze wyniki obrazowania, należy wybierać próbki stosunkowo płaskie, które można objąć stosem składającym się z 14 lub mniejszej liczby obrazów.

Przekroje o grubości 0,4 µm. Do szybkiego i dokładnego zbierania danych wystarczające są obrazy o wysokiej prędkości i niskiej rozdzielczości. Należy unikać nasycania detektora nadmierną siłą sygnału, ponieważ spowoduje to niedoszacowanie sygnałów fluorescencji.

W niniejszym pokazie wykorzystano komercyjny pakiet oprogramowania velocity w wersji co najmniej 4.0. Wiele alternatywnych programów powoduje utratę informacji trójwymiarowych. Po otwarciu plików wyjściowych w formacie multi tiff z mikroskopu konfokalnego należy wybrać opcję image, następnie extended focus, a potem freehand.

Następnie za pomocą ROI wycina się obszary obrazu, które nie zawierają analizowanej struktury. Wykorzystując aktywowane narzędzie, funkcja extended focus zapewnia projekcję w płaszczyźnie Z, co ułatwia zaznaczanie ROI. Nie wpływa to na dane źródłowe.

Podobnie, korekty jasności i kontrastu nie wpływają na dane podstawowe. Zakończ przycinanie, wybierając opcję działań i przytnij do zaznaczenia. Następnie zmierz długość analizowanego obszaru.

Po użyciu narzędzia linii jej długość zostanie obliczona i dodana do tabeli danych. Teraz należy zidentyfikować obiekty, korzystając z filtra obiektów według intensywności w trybie pomiarów. Włączenie niezależnego markera synaptycznego oznaczonego unikalnym kolorem może pomóc w jednoznacznym zidentyfikowaniu synaps; należy określić próg w taki sposób, aby podświetlone zostały klastry synaptyczne, a nie niesynaptyczne tło.

Należy wykonać tę czynność tylko raz, używając próbki kontrolnej, a następnie zastosować ją do wszystkich kolejnych próbek; progowanie każdej próbki osobno jest niedopuszczalne, ponieważ wprowadza ryzyko błędu eksperymentatora. Obiekty są wybierane i tabulowane automatycznie. Typowe synapsy obejmują od kilku do kilkuset wokseli; przed eksportem danych należy je posortować według rozmiaru obiektu.

Ułatwia to późniejsze usuwanie obiektów o wielkości dwóch lub mniej wokseli, które zazwyczaj są jedynie artefaktami tła. Następnie należy wyeksportować dane w formacie CSV, który można otworzyć w dowolnym programie do arkuszy kalkulacyjnych. Każdy obraz generuje jeden plik wyjściowy do sortowania i eksportu; mikrografie sznura nerwowego brzusznego CL gans, na których wykazano 49 receptorów GABA, zostały przygotowane zgodnie z opisanym protokołem.

Wszystkie zwierzęta wydawały się bardzo podobne pod względem wielkości i stopnia dojrzałości. Całkowite wartości fluorescencji synaptycznej dla pięciu nicieni zostały znormalizowane względem długości analizowanego sznura nerwowego. Dane te wykazały wartości błędu standardowego wynoszące około 10% średniej.

Obraz po lewej stronie jest surowy, bez zastosowania progu odcięcia oraz usuwania tła i artefaktów. Synapsy potraktowano mus carmalem, agonistą receptora GABA, który powoduje downregulację receptorów po długiej ekspozycji. Całkowitą fluorescencję zmierzono i znormalizowano do skumulowanego prawdopodobieństwa długości sznura nerwowego.

Obliczono histogramy zawartości fluorescencji poszczególnych synaps. Analogicznie obliczono objętość synaps. Pomiary te wykazują, że ekspozycja na agonistę znacząco redukuje zawartość oraz objętość synaptyczną.

Ogólnie wyniki ilościowe powinny zawsze odzwierciedlać to, co można ocenić wizualnie. W przeciwnym razie analiza obrazów oraz obiektów zidentyfikowanych na podstawie prędkości powinna wskazać miejsce wystąpienia błędu i zasugerować działania korygujące, takie jak progowanie lub usuwanie artefaktów podczas wykonywania tej procedury. Kluczowe jest wybieranie nicieni do obrazowania na podstawie ich orientacji geometrycznej, a nie subiektywnej oceny jakości obrazu; jeśli to możliwe, wysoce zaleca się stosowanie ślepej oceny.