Obrazowanie fluorescencyjne NADH izolowanych dwukomorowych pracujących serc królików

Ogólnym celem tej procedury jest badanie metabolizmu. Stosując obrazowanie NADH w pracującym preparacie serca, osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie serca królika. Drugim krokiem procedury jest pomyślna kaniulacja wszystkich czterech komór serca w celu uzyskania działającego modelu serca.

Ostatnim krokiem jest skonfigurowanie sprzętu do obrazowania i zbieranie danych NADH w różnym tempie. Ostatecznie wyniki mogą pokazać zmiany metaboliczne w sercu poprzez obrazowanie fluorescencyjnego NADH. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak lanor retro profusion, jest to, że serce działa w swoim stanie fizjologicznym z przepływem w normalnym kierunku i z sercem zapewniającym własne ciśnienie do perfuzji wieńcowej.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu elektrofizjologii i mechanizmów śmiertelnych arytmii. Odbywa się to poprzez dostarczenie modelu fizjologicznego do badania związku między metabolizmem przepływu wieńcowego a aktywnością elektryczną. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy kaniulacji naczyń krwionośnych i komory serca są trudne do nauczenia.

Niewłaściwa technika może uszkodzić serce i zagrozić reszcie eksperymentu. Przed przeprowadzeniem eksperymentu należy przepłukać wszystkie rurki w komorach pracującego układu serca oczyszczoną wodą, a następnie usunąć wodę z systemu, uruchamiając pompy. Dodaj filtry membranowe z celulozy zgodnie z pompą perfuzyjną LOR, pompą perfuzyjną lewego serca i pompą perfuzyjną prawego serca.

Po dodaniu perfusu ósemkowego do systemu należy przeprowadzić dwupunktową kalibrację dla każdego czujnika ciśnienia. Włączyć podgrzewaną łaźnię wodną obiegową, która ogrzewa rurki z płaszczem wodnym i wymienniki ciepła Włączyć łaźnię wodną. Służy do podgrzewania PERFUSE ósemka.

Włącz pompy, które cyrkulują PERFUSE eight w zamkniętej pętli, włącz zbiornik cyrkulacyjny, aby natlenić Perfuse. Po ósme, upewnij się, że natleniacz z mikrofibry lub filtry hemo dostarczają 95% tlenu do perfuzyjnej ósemki o mocy 80 kilopaskalów. Na koniec upewnij się, że wymienniki ciepła utrzymują temperaturę krążącego perfufu.

Osiem w temperaturze 37 stopni Celsjusza rozpocznij wycięcie serca, najpierw ustawiając pracujący układ serca na działanie pod stałym ciśnieniem. Tryb LRF. Ustaw ciśnienie bloku aorty między 50 a 60 po uspokojeniu królika.

Wstrzyknąć pentobarbital i heparynę do żyły ucha brzeżnego lub żyły odpiszczelowej bocznej po wewnętrznej stronie kończyny tylnej. Gdy królik nie ma odruchu bólowego, szybko otwórz klatkę piersiową. Przeciąć osierdzie, zacisnąć aortę i wyciąć serce i płuca.

Płuca są połączone, aby ułatwić izolację żył płucnych. Następnie napełnij strzykawkę 60 mililitrami na F osiem i 200 jednostkami heparyny. Załóż pięciomilimetrową kaniulę i kaniuluj aortę.

Przymocuj aortę do kaniuli za pomocą jedwabnych szwów w rozmiarze zero. Następnie powoli wciśnij strzykawkę, aby wypłukać krew przez serce. Skonfiguruj działający układ serca, najpierw łącząc serce z blokiem aorty.

Podejdź do łącznika pod kątem i pozwól, aby Perfuse eight delikatnie kapał ze złącza do kaniuli, gdy jest on podłączony. Zapobiega to przedostawaniu się powietrza do aorty, zapobiegając w ten sposób zatorowości wieńcowej, podczas gdy serce jest perfundowane pod stałym ciśnieniem. Tryb L endorf.

Usuń tłuszcz i tkankę łączną i zlokalizuj następujące naczynia. Żyła dolna i górna cva, żyła aose, tętnica płucna i żyły płucne. Następnie podwiązaj żyłę górną cva.

Przetnij tętnicę płucną tuż poniżej miejsca, w którym rozgałęzia się na prawą i lewą tętnicę płucną. Pozostałe naczynia to żyły płucne. Zgrupuj je między sercem a płucami i podwiąż je wszystkie za pomocą jednego szwu.

Ma to kluczowe znaczenie z dwóch powodów. Po pierwsze, zawiązanie naczyń połączonych z płucami zapewni brak wycieku po zakończeniu kaniulacji. Po drugie, ważne jest, aby wyizolować obie VNA cavas furl późniejszą kaniulację.

Teraz usuń płuca. Wytnij odpowiedniej wielkości otwór w rogu lewego uszka przedsionka i upewnij się, że jest wypełniony obfitą ósemką. Następnie kaniuluj wyrostek, podczas gdy kaniula jest całkowicie wypełniona perfuzją ósemkową.

Następnie, trzymając tkankę, przyszyj kaniulę do wyrostka. Tkanka uszka lewego przedsionka jest niezwykle delikatna i łatwo ulega rozerwaniu. Dlatego ważne jest, aby kaniulować lewe przedsionek za pierwszym razem, w przeciwnym razie może to nie być możliwe.

Włącz pompę numer dwa, aby zapewnić przepływ do lewego przedsionka. Ustaw napięcie wstępne między dwoma a sześcioma torami przez cały czas trwania eksperymentu. Może być konieczna regulacja ciśnienia.

Utrzymuj go w odległości dwóch milimetrów od docelowego ciśnienia. Teraz przełącz serce w tryb pracy serca, wyłączając na chwilę pompę numer jeden, pompę langora. Zmniejsz ciśnienie w aortze, aby dążyć do toru, a następnie powoli zwiększaj je do zakresu od 80 do 100 torów.

Dzięki temu zastawka aortalna otwiera się i funkcjonuje tak, jak w normalnych warunkach fizjologicznych. Ustaw końcowe ciśnienie obciążenia następczego na wartość około 20. Rozerwać ciśnienie LV poniżej szczytowego za pomocą kaniuli podłączonej bezpośrednio do systemu.

Kanuleguj prawemu przedsionkowi przez żyłę dolną CVA i zszyj kaniulę do żyły. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Włącz pompę numer trzy, pompę po prawej stronie, aby zapewnić przepływ do prawego przedsionka.

Ustaw ciśnienie na około trzy tor. Na koniec należy kanulować prawą komorę, nie dopuszczając do przedostania się powietrza i zszyć kaniulę do tętnicy płucnej. Na tym kończy się kaniulacja dwukomorowa.

Teraz przejdź do akwizycji sygnału. Ostrożnie wprowadzić cewnik przetwornika ciśnienia do aorty za pomocą kaniuli aorty. Delikatnie przesuń go obok zastawki aortalnej i do lv.

Sygnał ciśnienia LV pojawi się zgodnie z oczekiwaniami, gdy końcówka cewnika zostanie prawidłowo umieszczona. Następnie delikatnie dociśnij elektrodę potencjału czynnościowego monofazowego do nasierdzia komory. Niewielki artefakt ruchu w sygnale elektrody jest normalny.

Następnie umieść bipolarną elektrodę bodźcową na prawym przedsionku, aby przyspieszyć pracę serca zgodnie z eksperymentalną pozycją projektową. I ustaw ostrość kamerę CCD na obszarze zainteresowania serca. Do kamery powinien być podłączony filtr emisyjny.

Aby przejść fluorescencję NADH, wyłącz światła otoczenia, aby równomiernie oświetlić nasierdzie źródłem światła UV na stacji roboczej, do której podłączona jest kamera. Aby ustawić oprogramowanie tak, aby pobierało obrazy z prędkością dwóch klatek na sekundę. Następnie wybierz tryb aktualizacji na żywo, aby monitorować średnią intensywność pikseli w obszarze zainteresowania.

Jeśli obfitość była odpowiednia, poziomy NADH reprezentowane przez fluorescencję powinny być niskie i stabilne na powierzchni nasierdzia. Teraz uruchom eksperyment po jego zakończeniu. Usuń serce.

Opróżnij PERFUSE eight oraz rurki i komory systemu z oczyszczoną wodą. Okresowo płukać system roztworem TM błony śluzowej lub rozcieńczonym roztworem nadtlenku wodoru, stosując opisany protokół. Serca wklejano w cyklach o długości od 200 do 400 uderzeń na minutę.

Rozkurczowe LVP wynosiło zwykle od zera do 10 tor, minimalne rozkurczowe ciśnienie w aorcie wynosiło około 60 Tor, szczytowe skurczowe LVP zależy od ciśnienia wypełnienia i kurczliwości, a optymalnie powinno wynosić od 60 do 80. Tor maksymalne ciśnienie w aorcie i maksymalny LVP powinny ściśle odpowiadać monofazowemu potencjałowi czynnościowemu Potencjały typowe dla serca królika mają szybką fazę depolaryzacji i charakterystyczną fazę repolaryzacji. Potencjały czynnościowe były łatwo rejestrowane z preparatów, ale zwykle występował niewielki artefakt ruchowy podczas rozkurczu.

Średnie fluorescencyjne wartości NADH z obszaru zainteresowania w czerwonej ramce mierzono w celu monitorowania zmian w mitochondrialnym stanie redoks podczas trzech cykli stymulacji o długości psychozy 300, 200 i 150 milisekund, gdy tempo stymulacji było bliskie rytmowi zatokowemu. Wyjściowy poziom NADH był względnie stały w miarę skracania długości cyklu. Poniżej 300 milisekund podstawowy poziom NADH wzrastał z największym wzrostem po 150 milisekundach, sygnał oscyluje ze skurczem, a częstotliwość oscylacji odpowiada częstości akcji serca.

Amplituda tych oscylacji była zawsze mniejsza niż jakiekolwiek trendy w dłuższej skali czasowej spowodowane niedokrwieniem lub niedotlenieniem. Obrazowanie fluorescencyjne NADH o wysokiej rozdzielczości całej przedniej powierzchni z prędkością 200 uderzeń na minutę było stałe i jednorodne przestrzennie przy 400 uderzeniach na minutę. Poziomy NADH znacznie wzrosły w całym nasierdziu.

Zaobserwowano znaczną niejednorodność przestrzenną, przy czym największe wzrosty wystąpiły w obrębie obszarów przegrody RV i LV po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w mniej niż 45 minut, jeśli zostanie wykonana poprawnie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do aorty lub lewego przedsionka Zgodnie z tą procedurą.

Dodatkowe metody, takie jak ładowanie serca barwnikiem wrażliwym na napięcie, można wykorzystać do odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak powiązanie aktywności elektrycznej i metabolicznej na powierzchni serca podczas patologicznych scenariuszy, takich jak miejscowe niedokrwienie Po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się fizjologią serca do badania metabolizmu serca i zaburzeń przewodzenia w stanach patologicznych przy użyciu bardziej fizjologicznie istotnego modelu.