Name: Obrazowanie fluorescencyjne NADH izolowanych dwukomorowych pracujących serc królików (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Poznaj metodę obrazowania NADH w izolowanych sercach królików do badania metabolizmu mitochondrialnego w fizjologicznych warunkach. Technika umożliwia monitorowanie zmian redoks w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant z NIH (R01-HL095828 dla M. W. Kay).

1. Przygotowanie do badania
<ol>
	<li>Przygotować cztery litry zmodyfikowanego roztworu Krebsa-Henseleita 16 (w mM: 118 NaCl, 3,30 KCl, 2,00 CaCl2, 1,20 MgSO4, 24,0 NaHCO3, 1,20 KH2PO4, 10,0 glukozy, 2,00 pirogronianu sodu oraz 20,0 mg/L albuminy). Roztwór należy przygotować jak najkrócej przed rozpoczęciem eksperymentu. Wartość pH należy dostosować do 7,4 po filtracji sterylnej (rozmiar porów: 22 μm, Corning). Osmolalność roztworu powinna mieścić się w przedziale od 275 do 295 mOsm/kg.</li>
	<li>Wypłukać wszystkie probówki i komory systemu pracującego serca wodą oczyszczoną. Uruchomić pompy do czasu usunięcia całej wody z systemu.</li>
	<li>Zamontować filtry z membrany celulozowej (rozmiar porów: 5 μm, Advantec) w linii każdej z pomp perfuzyjnych (pompa perfuzyjna Langendorffa, pompa perfuzyjna lewej komory serca oraz pompa perfuzyjna prawej komory serca).</li>
	<li>Przeprowadzić kalibrację dwupunktową (0 i 60 mmHg) dla każdego czujnika ciśnienia.</li>
	<li>Włączyć łaźnie wodne. Podgrzewająca łaźnia wodna z cyrkulacją (Cole Palmer) służy do ogrzewania rurek z płaszczem wodnym i wymienników ciepła. Perfusat jest wstępnie ogrzewany w osobnej łaźni wodnej (Oakton Instruments). Obie łaźnie ustawia się tak, aby utrzymywały temperaturę roztworu 37 °C.</li>
	<li>Włączyć pompy w celu cyrkulacji perfusatu w obiegu zamkniętym. Perfusat przepływa przez mikrowłókniste natleniacze (hemofiltry) napowietrzane mieszaniną 95% O2 i 5% CO2 przy ciśnieniu 80 kPa. Natleniony perfusat przepływa następnie przez wymienniki ciepła w celu utrzymania temperatury 37 °C przed wprowadzeniem do kaniul serca.</li>
</ol>
2. Wycięcie serca
<ol>
	<li>Rozpocznij od ustawienia układu pracującego serca w trybie Langendorffa ze stałym ciśnieniem. Ustaw ciśnienie w bloku aorty w zakresie od 50 do 60 mmHg.</li>
	<li>Z narkozuj królika poprzez domięśniowy zastrzyk ketaminy (44 mg/Kg) i ksylazyny (10 mg/Kg). Po uspokojeniu zwierzęcia, pentobarbital (50 mg/Kg) oraz heparynę (2000 U) wstrzyknij dożylnie przez żyłę brzeżną ucha lub żyłę saphēnous boczną wewnątrz kończyny tylnej.</li>
	<li>Gdy królik stanie się całkowicie nieodpowiedni, co zostanie stwierdzone przez brak odruchu bólowego, szybko otwórz jamę klatki piersiowej, przetnij osierdzie, zaklemuj aortę, a następnie wycięte serce i płuca. Na tym etapie płuca powinny pozostać przytwierdzone do serca, aby ułatwić izolację żył płucnych.</li>
	<li>Wyizoluj aortę i przeprowadź kaniulację za pomocą kaniuli o średnicy 5 mm, podłączonej do strzykawki wypełnionej 60 mL perfuzatu i 200 jednostek heparyny. Przymocuj aortę do kaniuli jedwabną nicią chirurgiczną rozmiaru zero i powoli naciśnij tłok strzykawki, aby wypłukać krew z serca.</li>
</ol>
3. Kanulacja obu komór
<ol>
	<li>Podłącz serce do bloku aorty systemu pracującego serca. Zapobiegaj przedostawaniu się powietrza do aorty, co mogłoby spowodować zatorowość wieńcową. Najlepiej przymocować kaniulę do bloku aorty, zbliżając się do złącza aorty pod kątem ukośnym i pozwalając perfuzatowi delikatnie ściekać ze złącza do kaniuli podczas jej mocowania.</li>
	<li>Podczas perfuzji serca w trybie Langendorffa pod stałym ciśnieniem, usuń tłuszcz i tkankę łączną, a następnie zlokalizuj następujące naczynia: żyłę główną dolną i górną, żyłę azygos, tętnicę płucną oraz żyły płucne.</li>
	<li>Podwiąż żyłę główną górną. Przetnij tętnicę płucną tuż poniżej miejsca, w którym rozgałęzia się na prawą i lewą tętnicę płucną.</li>
	<li>Zgrupuj wszystkie pozostałe naczynia (żyły płucne) między sercem a płucami i podwiąż je wszystkie za pomocą jednego szwu. Usuń płuca.</li>
	<li>Wytnij mały otwór w narożniku uszka lewego przedsionka. Upewnij się, że LA jest wypełniony perfuzatem. Zakaniuluj LA, dbając o to, aby kaniula była całkowicie wypełniona perfuzatem podczas wprowadzania. Przyszyj kaniulę do uszka LA.</li>
	<li>Włącz pompę lewą (pompa nr 2), aby zapewnić przepływ do lewego przedsionka. Ustaw ciśnienie obciążenia wstępnego w zakresie 2 - 6 mmHg i reguluj je o ±2 mmHg, w zależności od rozszerzenia przedsionka.</li>
	<li>Przełącz serce w tryb pracującego serca, wyłączając pompę Langendorffa (pompa nr 1).</li>
	<li>Chwilowo obniż ciśnienie w aorcie do 10 mmHg, a następnie powoli zwiększaj je do zakresu od 80 do 100 mmHg. Pozwoli to zastawce aortalnej otworzyć się i funkcjonować tak, jak w normalnych warunkach fizjologicznych. Końcowe ciśnienie obciążenia następczego będzie zależeć od kurczliwości LV. Powinno zostać ustawione na wartość o około 20 mmHg niższą niż szczytowe ciśnienie w LV.</li>
	<li>Rzut serca w LV można określić, mierząc szybkość przepływu perfuzatu opuszczającego blok aorty (mL/min). Normalny rzut serca wynosi od 14,77 do 16,43 mL/min na 100 g masy ciała 17 i średnio 340 mL/min dla królika o masie 2,2 kg. Ciśnienie w aorcie powinno przypominać sygnał ciśnienia przedstawiony na Rysunku 1.</li>
	<li>Zakaniuluj RA poprzez żyłę główną dolną. Upewnij się, że zarówno RA, jak i kaniula są całkowicie wypełnione perfuzatem, i wprowadź kaniulę, zapobiegając tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Przyszyj kaniulę do żyły.</li>
	<li>Włącz pompę prawą (pompa nr 3), aby zapewnić przepływ do prawego przedsionka. Ustaw ciśnienie na około 3 mmHg.</li>
	<li>Upewnij się, że RV jest wypełniony perfuzatem, a następnie zakaniuluj tętnicę płucną. Upewnij się, że kaniula jest całkowicie wypełniona perfuzatem podczas wprowadzania, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Przyszyj kaniulę do tętnicy płucnej.</li>
</ol>
4. Pozyskiwanie sygnałów: ciśnienia, jednofazowe potencjały czynnościowe i fNADH
<ol>
	<li>Po zakończeniu kaniulacji obu komór, ostrożnie wprowadź cewnik przetwornika ciśnienia (Millar) do aorty poprzez kaniulę aortalną. Delikatnie przesuń go poza zastawkę aortalną do lewej komory (LV). Monitoruj sygnał ciśnienia w LV, aby zapewnić prawidłowe rozmieszczenie końcówki cewnika. Przykład ciśnienia w LV przedstawiono na Rysunku 1.</li>
	<li>Delikatnie dociśnij elektrodę do pomiaru jednofazowego potencjału czynnościowego do epikardium komory. Monitoruj sygnał, aby uzyskać odpowiednie pomiary potencjału czynnościowego. Lekki artefakt ruchowy w sygnale jest zjawiskiem normalnym.</li>
	<li>Umieść bipolarną elektrodę stymulującą w prawym przedsionku w celu stymulacji serca. W naszym protokole serca były stymulowane przy długościach cyklu od 300 do 150 msec, co odpowiada odpowiednio 200 i 400 bpm.</li>
	<li>Zmierz temperaturę powierzchni epikardialnej LV. Jeśli badanie wymaga utrzymania temperatury 37 °C, umieść serce w komorze z płaszczem wodnym lub zanurz serce w kąpieli z podgrzanym superfuzatem, aby utrzymać stałą temperaturę w całym sercu.</li>
	<li>Ustaw kamerę CCD (Andor iXon DV860, 128x128 pikseli) i ustaw ostrość obiektywu tak, aby uzyskać odpowiednie pole widzenia. Kamera jest podłączona do stacji roboczej, a obrazy są pozyskiwane z częstotliwością 2 fps przy użyciu oprogramowania Andor SOLIS.</li>
	<li>Włącz lampę rtęciową przed rozpoczęciem obrazowania. Światło jest kierowane przez filtr wzbudzenia (350±25 nm, Chroma Technology) i do światłowodowego przewodnika światła (Horiba Jobin Yvon model 1950-1M), aby oświetlić powierzchnię serca. Tłumienie światła UV w przewodniku światła jest niewielkie. Oświetlenie UV może być również zapewnione za pomocą wysokomocnego systemu LED składającego się z reflektorów LED (Mightex PLS-0365-030-S) i jednostki sterującej (Mightex SLC-SA04-US).</li>
	<li>Wyłącz światło w pomieszczeniu i zminimalizuj wszelkie oświetlenie otoczenia. Skieruj tuleje przewodnika światła (lub reflektory LED) na serce, aby uzyskać równomierne oświetlenie epikardium. Emitowana fluorescencja NADH (fNADH) przechodzi przez filtr emisyjny (460±20 nm Chroma Technology) i jest rejestrowana przez kamerę CCD.</li>
	<li>Monitoruj zmiany fNADH w czasie, wybierając obszar zainteresowania (ROI) za pomocą oprogramowania do obrazowania. Wybierz tryb aktualizacji na żywo, aby monitorować średnią intensywność pikseli w obrębie obszaru zainteresowania.</li>
	<li>Serce powinno funkcjonować w trybie pracy obu komór, aby generować odpowiednie ciśnienia. Poziomy fNADH powinny być niskie i stabilne na powierzchni epikardialnej, co potwierdza odpowiednią perfuzję wieńcową. Na tym etapie badania należy wdrożyć konkretny protokół eksperymentalny w celu zweryfikowania hipotezy.</li>
	<li>Po zakończeniu badania wyjmij serce z systemu i odlej cały perfuzat. Przepłucz przewody i komory systemu wodą oczyszczoną. W ramach rutynowej konserwacji system należy okresowo płukać roztworem Mucasol lub rozcieńczonym roztworem nadtlenku wodoru, w zależności od potrzeb.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie obrazów fNADH w trybie off-line
<ol>
	<li>Jednym ze sposobów porównywania zbiorów danych NADH (fNADH(i,j,t)) pomiędzy eksperymentami jest normalizacja każdego obrazu fluorescencji przy użyciu obrazu referencyjnego (fNADH(i,j,t0)) z danego zbioru9, zgodnie z poniższym równaniem. Inną metodą normalizacji fluorescencji NADH jest umieszczenie w polu widzenia małego kawałka szkła uranylowego przed rozpoczęciem eksperymentu9, 18, 19. Szkło uranylowe wykazuje fluorescencję (450 - 550 nm) po naświetleniu światłem UV, co dostarcza sygnału, który może służyć jako stabilny punkt odniesienia.</li>
</ol>
<img alt="Wzór na zmianę stężenia NADH; wyrażenie matematyczne; analiza biochemiczna; równanie badawcze." src="/files/ftp_upload/4115/4115eq1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Równanie 1">
6. Reprezentatywne wyniki
Widoki przedni i podstawny preparatu pracującego serca królika z zachowaniem funkcji obu komór przedstawiono na Ryc. 1. Ciśnienie w lewej komorze mierzono poprzez wprowadzenie cewnika z przetwornikiem ciśnienia (Millar SPR-407) poza zastawkę aortalną do lewej komory. Ciśnienia w aorcie, tętnicy płucnej oraz w lewej komorze (LVP) przedstawiono na Ryc. 1C. Rozkurczowe LVP zazwyczaj mieści się w przedziale od 0 do 10 mmHg. Minimalne rozkurczowe ciśnienie w aorcie wynosi około 60 mmHg. Szczytowe skurczowe LVP zależy od ciśnienia napełniania (obciążenia wstępnego lub ciśnienia w lewym przedsionku) oraz kurczliwości i optymalnie powinno wynosić od 80 do 100 mmHg. Maksymalne ciśnienie w aorcie oraz maksymalne LVP powinny być do siebie zbliżone, co pokazano na Ryc. 1C.
Jednofazowe potencjały czynnościowe (MAPs) z szybką fazą depolaryzacji i fazą repolaryzacji, typowe dla serca królika, przedstawiono na Rysunku 1D. MAPs można rejestrować stosunkowo łatwo z kurczącego się serca, jednak zazwyczaj występują w nich niewielkie artefakty ruchowe podczas rozkurczu, co pokazano na Rysunku 1D. MAPs są przydatne do potwierdzenia pomyślnego sprzężenia serca (wychwytu) podczas stymulacji i mogą być również wykorzystywane do pomiaru lokalnych zmian elektrofizjologicznych spowodowanych niedokrwieniem lub innymi ostrymi zaburzeniami. EKG można również zmierzyć poprzez zanurzenie serca w kąpieli z ciepłego superfuzatu i umieszczenie elektrod w kąpieli po lewej i prawej stronie serca. Trzecią, obojętną elektrodę umieszcza się w kąpieli, z dala od serca, lub mocuje do aorty. EKG dostarczy informacji na temat globalnego procesu pobudzenia i repolaryzacji, co jest przydatne do oceny ogólnej funkcji elektrycznej oraz wykrywania obecności niedokrwienia.
Obrazowanie fNADH ujawnia zmiany w stanie redoks mitochondriów w sercu, co może być wykorzystane do pomiaru czasowo-przestrzennego postępu obszarów niedokrwiennych lub niedotlenionych. W niniejszym badaniu mierzono fNADH w obrębie osierdzia, aby monitorować zmiany stanu redoks podczas stymulacji trzema częstotliwościami przy długościach cyklu (CL) wynoszących 300, 200 i 150 msec. Średnie wartości fNADH z wyznaczonego obszaru zainteresowania (czerwona ramka, Rysunek 2) wykazują, że bazowe poziomy fNADH rosną wraz ze skróceniem długości cyklu. Gdy częstotliwość stymulacji jest zbliżona do rytmu zatokowego (CL=300 msec), bazowy poziom fNADH pozostaje stosunkowo stały. Wraz ze skróceniem długości cyklu poniżej 300 msec, bazowe poziomy fNADH wzrastają, przy czym największy wzrost odnotowano dla najkrótszego CL (150 msec). Obrazowanie fNADH o wysokiej rozdzielczości całej powierzchni przedniej przy 200 i 400 bpm przedstawiono na Rysunku 3. Poziomy fNADH przy 200 bpm były stałe i jednorodne przestrzennie. Przy 400 bpm poziomy fNADH znacznie wzrosły w całym osierdziu. Zaobserwowano istotną heterogeniczność przestrzenną, a największe wzrosty wystąpiły w obszarach przegrody RV i LV.
Sygnał fNADH oscyluje wraz ze skurczem (artefakt ruchu), a częstotliwość oscylacji odpowiada częstotliwości akcji serca (Rysunek 2). W przypadku kaniulacji dwujamyzowej podstawie serca przytrzymuje 4 kaniule, co zapobiega kołysaniu się serca podczas skurczu. W związku z tym amplituda oscylacji jest zawsze mniejsza niż trendy fNADH w dłuższych skalach czasowych (5-10 sec), które są wywoływane przez niedokrwienie lub hipoksję.
<img alt="Układ do pomiaru ciśnienia w sercu wraz z wykresami ciśnień komorowych, aorty i tętnicy płucnej." src="/files/ftp_upload/4115/4115fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Typowe wartości ciśnień i monofazowe potencjały czynnościowe z izolowanego, pracującego serca królika z obiema komorami. A. Widok podstawny serca z zaznaczonymi czterema kaniulami: 1, aortą; 2, tętnicą płucną; 3, lewym przedsionkiem; oraz 4, prawym przedsionkiem. B. Widok przedni serca z zaznaczoną lewą komorą (LV) i prawą komorą (RV). C. Reprezentatywne wartości ciśnień. Góra: ciśnienie w lewej komorze (linia ciągła) i ciśnienie w aorcie (linia przerywana). Dół: ciśnienie w tętnicy płucnej. D. Reprezentatywne monofazowe potencjały czynnościowe. Sygnał jest zsynchronizowany z ciśnieniami przedstawionymi w panelu C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4115/4115fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię</a>.
<img alt="Obrazowanie serca z analizą NADH wykazujące efekty częstotliwości stymulacji; wykres zmiany fluorescencji NADH." src="/files/ftp_upload/4115/4115fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Obrazowanie fNADH wyizolowanego, pracującego serca królika z obiema komorami. Góra: Przedstawiono schemat pola widzenia (po lewej) oraz trzy obrazy fNADH. Na każdym obrazie zaznaczono odpowiadającą mu długość cyklu stymulacji (CL). Obszar zainteresowania dla sygnału fNADH w dolnym panelu został zaznaczony czerwoną ramką. Końcówka elektrody do potencjału czynnościowego monofazowego jest widoczna po prawej stronie obszaru zainteresowania. Epikardium było oświetlane za pomocą lampy rtęciowej i światłowodu, jak pokazano na Rycynie 5. Oświetlona została tylko powierzchnia epikardialna otaczająca obszar zainteresowania. Dół: Średnie fNADH dla obszaru zainteresowania zaznaczonego czerwoną ramką w górnym panelu. Średnie fNADH wzrasta wraz ze skróceniem długości cyklu.
<img alt="Obrazy ultrasonograficzne serca przy 200 bpm i 400 bpm z oznaczeniami RV, LV, tkanki tłuszczowej i MAP." src="/files/ftp_upload/4115/4115fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Obrazy fNADH całej powierzchni przedniej izolowanego, pracującego dwukomorowego serca królika. Serce było stymulowane z poziomu RA przy 200 bpm i 400 bpm. Obrazowanie fNADH (2 fps, 128x128 pikseli przy rozdzielczości 0,4 mm) przeprowadzano podczas oświetlania całego przedniego epikardium za pomocą dwóch wysokiej mocy diod LED (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensywności, max 50 mW).

<ol><li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+am+uberlebenden+saugethierherzen+%5Binvestigations+on+the+surviving+mammalian+heart%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Gesante+Physiol%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart].</a> Arch. Gesante Physiol. 61, 291-332 Forthcoming.</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to langendorff---still viable in the new millennium.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).</li>
<li>Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pressure+development+on+oxygen+consumption+by+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart.</a> Am. J. Physiol. 212, 804-814 (1967).</li>
<li>Feng, H. Z., Jin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+cardiac+troponin+T+variants+reduces+heart+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Coexistence of cardiac troponin T variants reduces heart efficiency.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H97-H105 (2010).</li>
<li>Clemens, M. G., Forrester, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+adenosine+triphosphate+in+the+coronary+sinus+effluent+from+isolated+working+rat+heart+in+response+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Appearance of adenosine triphosphate in the coronary sinus effluent from isolated working rat heart in response to hypoxia.</a> J. Physiol. 312, 143-158 (1981).</li>
<li>Cole, M. A., Murray, A. J., Cochlin, L. E., Heather, L. C., McAleese, S., Knight, N. S., Sutton, E., Jamil, A. A., Parassol, N., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+fat+diet+increases+mitochondrial+fatty+acid+oxidation+and+uncoupling+to+decrease+efficiency+in+rat+heart.+Basic+Res%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A high fat diet increases mitochondrial fatty acid oxidation and uncoupling to decrease efficiency in rat heart. Basic Res.</a> Basic Res. Cardiol. 106, 447-457 (2011).</li>
<li>Demmy, T. L., Curtis, J. J., Kao, R., Schmaltz, R. A., Walls, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Load-insensitive+measurements+from+an+isolated+perfused+biventricular+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Load-insensitive measurements from an isolated perfused biventricular working rat heart.</a> J. Biomed. Sci. 4, 111-119 (1997).</li>
<li>Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+biventricular+working+rat+heart+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Isolated biventricular working rat heart preparation.</a> Ann. Thorac. Surg. 54, 915-920 (1992).</li>
<li>Kay, M., Swift, L., Martell, B., Arutunyan, A., Sarvazyan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locations+of+ectopic+beats+coincide+with+spatial+gradients+of+NADH+in+a+regional+model+of+low-flow+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Locations of ectopic beats coincide with spatial gradients of NADH in a regional model of low-flow reperfusion.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2400-2405 (2008).</li>
<li>Swift, L., Martell, B., Khatri, V., Arutunyan, A., Sarvazyan, N., Kay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+regional+hypoperfusion+in+langendorff+heart+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Meas%22%5BJournal%5D)">Controlled regional hypoperfusion in langendorff heart preparations.</a> Physiol. Meas. 29, 269-279 (2008).</li>
<li>High resolution contrast ultrasound and NADH fluorescence imaging of myocardial perfusion in excised rat hearts. Kay, M. W., Swift, L. M., Sangave, A., Zderic, V. 30th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, , 1-4 (2008).</li>
<li>Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridine+nucleotide+as+an+indicator+of+the+oxygen+requirements+for+energy-linked+functions+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pyridine nucleotide as an indicator of the oxygen requirements for energy-linked functions of mitochondria.</a> Circ. Res. 38, I31-I38 (1976).</li>
<li>Mayevsky, A., Rogatsky, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+in+vivo+evaluated+by+NADH+fluorescence%3A+From+animal+models+to+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: From animal models to human studies.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, C615-C640 (2007).</li>
<li>Barlow, C. H., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+areas+in+perfused+rat+hearts%3A+Measurement+by+NADH+fluorescence+photography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ischemic areas in perfused rat hearts: Measurement by NADH fluorescence photography.</a> Science. 193, 909-910 (1976).</li>
<li>Mayevsky, A., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation-reduction+states+of+NADH+in+vivo%3A+From+animals+to+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Oxidation-reduction states of NADH in vivo: From animals to clinical use.</a> Mitochondrion. 7, 330-339 (2007).</li>
<li>Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+electrophysiological+variables+in+blood-perfused+and+buffer-perfused%2C+isolated%2C+working+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart.</a> Am. J. Physiol. 271, H784-H789 (1996).</li>
<li>Ôta, K., Peaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactation+in+the+rabbit%3A+Mammary+blood+flow+and+cardiac+output%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lactation in the rabbit: Mammary blood flow and cardiac output.</a> Experimental Physiology. 64, 225-238 (1979).</li>
<li>Ashruf, J. F., Ince, C., Bruining, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+ischemia+in+hypertrophic+langendorff-perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regional ischemia in hypertrophic langendorff-perfused rat hearts.</a> Am. J. Physiol. 277, H1532-H1539 (1999).</li>
<li>Ashruf, J. F., Coremans, J. M., Bruining, H. A., Ince, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+cardiac+work+is+associated+with+decrease+of+mitochondrial+NADH%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increase of cardiac work is associated with decrease of mitochondrial NADH.</a> Am. J. Physiol. 269, 856-862 (1995).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ. Res. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Rogers, J. M., Walcott, G. P., Gladden, J. D., Melnick, S. B., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoramic+optical+mapping+reveals+continuous+epicardial+reentry+during+ventricular+fibrillation+in+the+isolated+swine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Panoramic optical mapping reveals continuous epicardial reentry during ventricular fibrillation in the isolated swine heart.</a> Biophys. J. 92, 1090-1095 (2007).</li>
<li>Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+panoramic+imaging+of+cardiac+arrhythmias+in+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart.</a> J. Biomed. Opt. 12, 044019(2007).</li>
<li>Chinchoy, E., Soule, C. L., Houlton, A. J., Gallagher, W. J., Hjelle, M. A., Laske, T. G., Morissette, J., Iaizzo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+four-chamber+working+swine+heart+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Isolated four-chamber working swine heart model.</a> Ann. Thorac. Surg. 70, 1607-1614 (2000).</li>
<li>Hill, A. J., Laske, T. G., Coles, J. A., Sigg, D. C., Skadsberg, N. D., Vincent, S. A., Soule, C. L., Gallagher, W. J., Iaizzo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of human hearts.</a> Ann. Thorac. Surg. 79, 168-177 (2005).</li>
<li>Schenkman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+performance+as+a+function+of+intracellular+oxygen+tension+in+buffer-perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).</li>
<li>Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardioprotection+by+nifedipine+in+isolated+working+hearts%3A+A+comparative+study+on+three+different+types+of+experimental+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).</li>
<li>Khatib, S. Y., Boyett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+glyburide+%28glibenclamide%29+on+myocardial+function+in+langendorff+perfused+rabbit+heart+and+on+myocardial+contractility+and+slow+calcium+current+in+guinea-pig+single+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes.</a> Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).</li>
<li>Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+albumin+on+the+electrophysiologic+stability+of+isolated+perfused+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).</li>
<li>Combs, C. A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+imaging+of+dehydrogenase+activity+within+living+cells+using+enzyme-dependent+fluorescence+recovery+after+photobleaching+%28ED-FRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP).</a> Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).</li>
<li>Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28Semi-%29quantitative+analysis+of+reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+images+of+blood-perfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">(Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart.</a> Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).</li>
<li>Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+substrate+on+mitochondrial+NADH%2C+cytosolic+redox+state%2C+and+phosphorylated+compounds+in+isolated+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts.</a> Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).</li>
<li>Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+dual+camera+systems+for+multimodal+imaging+of+cardiac+electrophysiology+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med.+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism.</a> Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Izolowane serce poddane perfuzji w układzie Langendorffa pozostaje kluczowym narzędziem w badaniach fizjologii serca2. Jest ono szczególnie użyteczne w badaniach nad arytmiami serca, zwłaszcza w tych wykorzystujących obrazowanie fluorescencyjne potencjału błonowego20. Zaletą jest możliwość obserwacji całego epikardium izolowanego serca21, 22. Kolejną zaletą jest fakt, że w przeciwieństwie do krwi, perfuzja klarownym krystaloidalnym roztworem buforowym nie zakłóca sygnałów fluorescencyjnych. Ograniczeniem jest to, że technika Langendorffa nie nadaje się do badań metabolizmu serca, które często wymagają, aby serce wykonywało pracę w warunkach fizjologicznego obciążenia wstępnego i następczego.
Aby zwiększyć przydatność izolowanych preparatów serca w badaniach metabolicznych, Neely wprowadził modyfikacje w technice Langendorffa w celu ustanowienia odpowiedniego obciążenia wstępnego i następczego lewej komory (LV)3. Model ten, znany jako model pracującego izolowanego serca z lewą komorą, był szeroko stosowany do badania wydajności i metabolizmu LV4-6. Model pracującego serca z LV jest lepszy od modelu Langendorffa w ocenach funkcjonalnych, jednak nie zapewnia on właściwego obciążenia prawej komory (RV). Demmy et al. po raz pierwszy opisali model biventrykularny (LV i RV) jako modyfikację modelu pracującego serca z LV7, 8. Stwierdzili oni, że objętość wyrzutowa, rzut serca oraz rozwój ciśnienia uległy poprawie w sercach przekształconych z trybu pracy LV na tryb pracy biventrykularny8. Prawidłowo obciążona RV poprawia również funkcję przegrody, zmniejszając nieprawidłowe gradienty ciśnienia w obrębie przegrody. Wykazano, że pracujące serca biventrykularne utrzymują rzut aortalny, przepływ płucny, średnie ciśnienie aortalne, średnie ciśnienie płucne, częstotliwość akcji serca oraz poziomy ATP mięśnia sercowego i fosfokreatyny przez okres do 3 godzin8. W badaniach nad pracującym sercem biventrykularnym zazwyczaj wykorzystuje się serca małych zwierząt, takich jak szczury i króliki, ponieważ rzut serca i wymagana objętość perfuzatu są znacznie mniejsze niż w przypadku serc większych zwierząt. Niemniej jednak badania nad pracującym sercem biventrykularnym prowadzono również z wykorzystaniem serc świń, psów, a nawet ludzi23, 24.
Zapotrzebowanie metaboliczne izolowanych serc w trybie pracy dwukomorowej jest znacznie wyższe niż w przypadku perfuzji Langendorffa. Istotne jest, aby roztwór perfuzyjny dostarczał wystarczającą ilość tlenu i substratów metabolicznych do podtrzymania funkcji serca w trybie dwukomorowym. Standardowe krystaloidalne roztwory buforowe, takie jak Krebs-Henseleit16, 17, 25 lub Tyrodes26, 27, charakteryzują się rozpuszczalnością tlenu do 5,6 mg/L. Gdy roztwory te są napowietrzane karbogenem (mieszaniną gazów 95% O2 i 5% CO2) i zawierają odpowiedni substrat metaboliczny (glukozę, dekstrozę i/lub pirogronian sodu), są one odpowiednie dla serc pracujących w trybie dwukomorowym z prawidłową częstotliwością rytmu zatokowego (około 180 bpm dla królika).
Zapotrzebowanie metaboliczne wzrasta przy szybkich rytmach, a ilość tlenu rozpuszczonego w standardowych perfuzatach może być niewystarczająca do pełnego wsparcia pracującego serca dwukomorowego kurczącego się z wysoką częstotliwością. W preparatach pracującego serca stosowano krystaloidalne roztwory buforowe zawierające erytrocyty lub zmieszane z pełną krwią, aby zapewnić odpowiednią dostępność tlenu. Wcześniejsze badania wykazały, że dodanie erytrocytów do roztworu Krebsa-Henseleita poprawiło funkcję pracującego serca podczas rygorystycznych protokołów stymulacji oraz zmniejszyło częstotliwość występowania migotania komór16. Ograniczeniem w stosowaniu erytrocytów lub mieszanin pełnej krwi jest fakt, że hemoglobina zakłóca długości fal świetlnych wykorzystywanych w obrazowaniu fluorescencyjnym13. Do roztworów perfuzyjnych można również dodawać inne substraty, takie jak albumina, aby przedłużyć żywotność serca i zmniejszyć obrzęki28.
Podczas obrazowania fluorescencyjnego natężenie światła wzbudzenia powinno być wysokie, a rozkład światła jednolity. Osiągnięcie jednolitego oświetlenia nie zawsze jest łatwe ze względu na krzywiznę powierzchni epikardium. W naszych badaniach obrazujemy fNADH, filtrując światło (350±25 nm) z lampy rtęciowej. Do kierowania światłem UV na powierzchnię epikardium używa się rozgałęzionego światłowodowego prowadnika światła. Jednorodne oświetlenie można uzyskać poprzez odpowiednie rozmieszczenie dwóch tulejek wyjściowych. Można również zastosować źródła światła UV LED, co zaprezentowaliśmy na Rysunku 3. Źródła LED są stosunkowo tanie, dzięki czemu do systemu obrazowania można włączyć wiele takich źródeł. Diody LED mogą być również włączane i wyłączane z wysoką częstotliwością w celu synchronizacji światła wzbudzenia z akwizycją obrazu.
Należy zminimalizować fotobleaching NADH29 poprzez skrócenie czasu oświetlania tkanki. Można to osiągnąć, cyklicznie włączając i wyłączając oświetlenie za pomocą migawki elektronicznej i lampy lub korzystając z systemu oświetlenia LED z kontrolerem. Jeśli oświetlenie zostanie zsynchronizowane z cyklem pracy serca, akwizycję obrazów fNADH można ograniczyć do rozkurczu, co zredukuje artefakty ruchowe w sygnałach fluorescencji. Jednym ze sposobów realizacji tego celu byłoby wyzwalanie oświetlenia i akwizycji obrazów za pomocą sygnału ciśnienia, np. ciśnienia w LV.
W naszych badaniach zaobserwowaliśmy, że zmiany fNADH na jednostkę czasu mogą być ponad 5X wyższe przy 400 bpm niż przy 200 bpm. Wskazuje to, że szybkie rytmy podnoszą stan redoks serca. Kwestia tego, czy jest to spowodowane hipoksją, czy też niezdolnością miocytów do wystarczająco szybkiego utleniania NADH do NAD+, aby uniknąć akumulacji NADH, pozostaje wciąż nieodpowiedziana.
Wydajność preparatu pracującego serca dwukomorowego zależy od wielu czynników. Jednym z najważniejszych jest ustawienie odpowiedniego obciążenia wstępnego i następczego, aby odwzorować badane warunki fizjologiczne. W szczególności obciążenie następcze LV (ciśnienie aortalne) musi zostać dostosowane tak, aby reprezentowało ciśnienie systemowe. Jeśli będzie ono zbyt wysokie, LV nie będzie w stanie pokonać tego ciśnienia, co doprowadzi do cofania się krwi. Z kolei zbyt niskie ciśnienie niekorzystnie wpłynie na perfuzję wieńcową. Ciśnienie obciążenia wstępnego LV (ciśnienie w lewym przedsionku) powinno być również dostosowane tak, aby zapewnić objętość końcowodorozkurczową odpowiednią dla protokołu eksperymentalnego.
Obrazowanie fNADH w żywych tkankach jest ugruntowaną metodą obrazowania fluorescencyjnego13. Jej zastosowanie w tkance serca zostało zilustrowane przez Barlowa i Chance'a, którzy zgłosili wyraźne podwyższenie poziomu fNADH w obrębie tkanki regionalnie niedokrwionej po podwiązaniu naczynia wieńcowego14. Ich obrazy fNADH zostały zarejestrowane na kliszy za pomocą kamery oscyloskopowej Fairchild oraz fotografii z lampą błyskową UV. Coremans et al. rozwinęli tę koncepcję, wykorzystując stosunek fluorescencji NADH do odbicia UV w celu pomiaru stanu metabolicznego osierdzia w perfundowanych krwią sercach szczurów w modelu Langendorffa30. Do obrazowania wykorzystano wideofluorymetr, a dane zarejestrowano za pomocą rejestratora wideo. Później Scholz et al. użyli spektrografu i matrycy fotodiod do pomiaru średniego poziomu fNADH z dużego obszaru LV. Podejście to ograniczyło wpływ heterogeniczności fluorescencji osierdzia oraz lokalnych zmienności w ukrwieniu, ujawniając jednocześnie makroskopowe zmiany fNADH związane z pracą serca31. Metoda ta jest podobna do obliczania średnich poziomów fNADH dla obszaru zainteresowania we wszystkich klatkach zestawu danych obrazowania fNADH, co zilustrowano na Rysunku 2. Jak przedstawiliśmy w niniejszym artykule, współczesna technologia oferuje szybkie kamery CCD oraz cyfrowo sterowane, wysokoenergetyczne reflektory UV. Technologie te umożliwiają badanie dynamiki czasowo-przestrzennej fNADH i metabolizmu serca z wielu nowych perspektyw. Stosunkowo niski koszt optyki i źródła światła sprawia, że obrazowanie fNADH jest użytecznym dodatkiem do konwencjonalnych systemów optycznego mapowania serca.9, 32

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>C77-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-233</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>423-316</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158968-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie fluorescencyjne nadh w izolowanych, pracujących sercach królika z obiema komorami

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

Od czasu wprowadzenia tej metody przez Langendorffa1, izolowane perfundowane serce pozostaje kluczowym narzędziem w badaniach fizjologii serca2. Nie nadaje się ono jednak w pełni do badań metabolizmu serca, które wymagają, aby serce wykonywało pracę w warunkach fizjologicznego obciążenia wstępnego (preload) i następczego (afterload). Neely wprowadził modyfikacje techniki Langendorffa w celu ustanowienia odpowiedniego obciążenia wstępnego i następczego lewej komory (LV)3. Model ten jest znany jako model pracującego izolowanego serca z lewą komorą i był szeroko stosowany do badania wydajności oraz metabolizmu LV4-6. Model ten nie zapewnia jednak właściwego obciążenia prawej komory (RV). Demmy et al. jako pierwsi opisali model biventrykularny jako modyfikację modelu pracującego serca z LV7, 8. Stwierdzili oni, że objętość wyrzutowa, rzut serca oraz generowanie ciśnienia uległy poprawie w sercach przekształconych z trybu pracującej LV na tryb pracujący biventrykularny8. Prawidłowo obciążona RV zmniejsza również nieprawidłowe gradienty ciśnień w obrębie przegrody, co poprawia funkcję przegrody międzykomorowej. Wykazano, że pracujące serca biventrykularne utrzymują rzut aortalny, przepływ płucny, średnie ciśnienie w aorcie, częstość akcji serca oraz poziomy ATP w mięśniu sercowym przez okres do 3 godzin8.
Podczas badania efektów metabolicznych uszkodzenia mięśnia sercowego, takich jak niedokrwienie, często konieczna jest identyfikacja lokalizacji dotkniętej tkanki. Można to osiągnąć poprzez obrazowanie fluorescencji NADH (zredukowanej formy nikotynamidoadeninodynukleotydu)9-11, koenzymu występującego w dużych ilościach w mitochondriach. Fluorescencja NADH (fNADH) wykazuje niemal liniową odwrotną zależność od lokalnego stężenia tlenu12 i stanowi miarę stanu redoks mitochondriów13. Obrazowanie fNADH w warunkach hipoksji i niedokrwienia jest wykorzystywane jako metoda bezbarwnikowa do identyfikacji obszarów niedotlenionych14, 15 oraz do monitorowania postępu warunków hipoksycznych w czasie10.
Celem opracowanej metody jest monitorowanie stanu redoks mitochondriów w pracujących sercach dwukomorowych podczas protokołów zmieniających tempo metabolizmu miocytów, indukujących hipoksję lub łączących oba te czynniki. Serca królików rasy nowozelandzkiej zostały podłączone do systemu pracującego serca dwukomorowego (Hugo Sachs Elektronik) i perfundowane zmodyfikowanym roztworem Krebsa-Henseleit16 w temperaturze 37 °C. Rejestrowano ciśnienie w aorcie, LV, tętnicy płucnej oraz w lewym i prawym przedsionku. Aktywność elektryczną mierzono za pomocą elektrody do jednofazowego potencjału czynnościowego. W celu obrazowania fNADH światło z lampy rtęciowej było filtrowane (350±25 nm) i wykorzystywane do oświetlania epikardium. Emitowane światło było filtrowane (460±20 nm) i rejestrowane za pomocą kamery CCD. Przedstawiono zmiany poziomu fNADH w epikardium pracujących serc dwukomorowych przy różnych częstotliwościach stymulacji. Połączenie modelu serca z obrazowaniem fNADH stanowi nowe i wartościowe narzędzie eksperymentalne do badania ostrych patologii serca w kontekście realistycznych warunków fizjologicznych.

Celem jest monitorowanie stanu redoks mitochondriów w izolowanych sercach w kontekście fizjologicznych ciśnień obciążenia wstępnego i następczego. Przedstawiono biventrykularny model pracującego serca królika. Do monitorowania stanu redoks mitochondriów w tkance epikardialnej wykorzystano obrazowanie fluorescencyjne NADH o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.

Obrazowanie fluorescencyjne NADH w izolowanych, pracujących sercach królika z obiema komorami

Od czasu wprowadzenia tej metody przez Langendorffa1, izolowane perfuzowane serce pozostaje istotnym narzędziem w badaniach nad fizjologią układu krążenia2. Nie nadaje się ono jednak do...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie metabolizmu. Wykorzystując obrazowanie NADH w preparacie pracującego serca, cel ten realizuje się poprzez wstępne wyizolowanie serca królika. Drugim krokiem procedury jest prawidłowe zakanulowanie wszystkich czterech jam serca w celu uzyskania modelu pracującego serca.Ostatnim krokiem jest przygotowanie sprzętu obrazującego i zbieranie danych dotyczących NADH przy różnych częstotliwościach stymulacji. W rezultacie obrazowanie fluorescencyjne NADH pozwala na wykazanie zmian metabolicznych w sercu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak perfuzja retrogradowa, jest fakt, że serce pracuje w stanie fizjologicznym, z przepływem w naturalnym kierunku i przy własnym ciśnieniu zapewniającym perfuzję wieńcową.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu elektrofizjologii oraz mechanizmów śmiertelnych arytmii. Odbywa się to poprzez zapewnienie modelu fizjologicznego do badania związku między metabolizmem przepływu wieńcowego a aktywnością elektryczną. Wizualna prezentacja tej metody jest istotna, ponieważ etapy kaniulacji naczyń i jam serca są trudne do opanowania.Nieprawidłowa technika może uszkodzić serce i zagrozić dalszemu przebiegowi eksperymentu. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wypłukać wszystkie probówki w komorach pracującego układu serca wodą oczyszczoną, a następnie usunąć wodę z układu poprzez uruchomienie pomp. W liniach pompy perfuzyjnej LOR, pompy perfuzyjnej lewej komory serca oraz pompy perfuzyjnej prawej komory serca należy zastosować filtry z membrany celulozowej.Po dodaniu systemu PERFUSE eight do układu, przeprowadź kalibrację dwupunktową dla każdego czujnika ciśnienia. Włącz podgrzewaną łaźnię wodną z cyrkulacją, która ogrzewa rurki z płaszczem wodnym oraz wymienniki ciepła. Włącz łaźnię wodną używaną do podgrzewania systemu PERFUSE eight.Włącz pompy krążące PERFUSE eight w obiegu zamkniętym, włącz zbiornik cyrkulacyjny w celu natlenienia Perfuse Eight i upewnij się, że natleniacz z mikrowłókien lub filtry hemo dostarczają 95% tlenu do perfuse eight pod ciśnieniem 80 kilopascals. Na koniec upewnij się, że wymienniki ciepła utrzymują temperaturę krążącego perfuse.Przy 37 °C rozpoczynij wycinanie serca, ustawiając najpierw system pracy serca w trybie stałego ciśnienia (tryb LRF). Po podaniu królikowi środka uspokajającego ustaw ciśnienie bloku aorty w zakresie od 50 do 60.Wstrzyknąć pentobarbital i heparynę do żyły brzegowej ucha lub żyły saphenous bocznej na wewnętrznej stronie kończyny tylnej. Gdy u królika ustąpi odruch bólowy, szybko otworzyć jamę klatki piersiowej. Przeciąć osierdzie, zacisnąć aortę i wyciąć serce oraz płuca.Płuca pozostawia się przytwierdzone, aby ułatwić izolację żył płucnych. Następnie należy napełnić strzykawkę 60 mililitrami PBS oraz 200 jednostkami heparyny. Należy przymocować kaniulę o średnicy pięciu milimetrów i przeprowadzić kaniulację aorty.Przymocuj aortę do kaniuli za pomocą jedwabnych szwów rozmiaru zero. Następnie powoli naciśnij tłok strzykawki, aby wypłukać krew przez serce. Przygotuj system pracującego serca, podłączając najpierw serce do bloku aorty.Zbliż się do złącza pod kątem i pozwól, aby Perfuse eight powoli ściekał ze złącza do kaniuli, gdy ta jest podłączona. Zapobiega to przedostawaniu się powietrza do aorty, co przeciwdziała powstawaniu zatorów wieńcowych podczas perfuzji serca w trybie stałego ciśnienia (tryb Langendorfa).Usuń tłuszcz i tkankę łączną, a następnie zlokalizuj następujące naczynia: żyłę główną dolną i górną, żyłę aortyczną, tętnicę płucną oraz żyły płucne. Następnie podwiąż żyłę główną górną.Przetnij tętnicę płucną tuż poniżej miejsca jej rozgałęzienia na prawą i lewą tętnicę płucną. Pozostałe naczynia to żyły płucne. Zbierz je w wiązkę między sercem a płucami i podwiąż wszystkie jednym szwem.Jest to krytyczne z dwóch powodów. Po pierwsze, podwiązanie naczyń połączonych z płucami zapewni brak wycieków po zakończeniu kanulacji. Po drugie, ważne jest odizolowanie obu żył głównych VNA przed późniejszą kanulacją.Następnie usuń płuca. W narożniku uszka lewego przedsionka wytnij otwór o odpowiedniej wielkości i upewnij się, że jest on wypełniony roztworem perfuse eight. Następnie wprowadź kaniulę do uszka, dbając o to, aby kaniula była całkowicie wypełniona roztworem perfuse eight.Następnie, przytrzymując tkankę, przyszyj kaniulę do wyrostka. Tkanka wyrostka lewego przedsionka jest niezwykle delikatna i może łatwo ulec rozerwaniu. Dlatego ważne jest, aby kaniulacja lewego przedsionka powiodła się za pierwszym razem, w przeciwnym razie może okazać się ona niemożliwa.Włącz pompę numer dwa, aby zapewnić przepływ do lewego przedsionka. Ustaw obciążenie wstępne (preload) w zakresie od 2 do 6 tor przez cały czas trwania eksperymentu. Może być konieczne skorygowanie ciśnienia.Utrzymaj wartość w granicach dwóch milimetrów od ciśnienia docelowego. Teraz przełącz serce w tryb pracy, wyłączając na chwilę pompę numer jeden, pompę płucną. Obniż ciśnienie aorty do 10 mmHg, a następnie powoli zwiększ je do zakresu od 80 do 100 mmHg.Pozwala to na otwarcie zastawki aortalnej i jej funkcjonowanie w sposób odpowiadający normalnym warunkom fizjologicznym. Za pomocą kaniuli podłączonej bezpośrednio do układu ustaw końcowe ciśnienie obciążenia następczego na wartość wynoszącą około 20 Tore mniej niż maksymalne ciśnienie w LV.Wprowadź kaniulę do prawego przedsionka przez dolną żyłę główną i przyszyj kaniulę do żyły. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza. Włącz pompę numer trzy, pompę prawostronną, aby zapewnić przepływ do prawego przedsionka.Ustaw ciśnienie na około trzy tor. Na koniec wprowadź kaniulę do prawej komory, nie dopuszczając do przedostania się powietrza, a następnie przyszyj kaniulę do tętnicy płucnej. Tym samym zakończono kaniulację dwukomorową.Przejdź teraz do akwizycji sygnału. Ostrożnie wprowadź cewnik przetwornika ciśnienia do aorty za pomocą kaniuli aortalnej. Delikatnie przesuń go poza zastawkę aortalną do lv.Sygnał ciśnienia w LV pojawi się zgodnie z oczekiwaniami, gdy końcówka cewnika zostanie prawidłowo ustawiona. Następnie delikatnie dociśnij elektrodę do pomiaru jednofazowego potencjału czynnościowego do epikardium komory. Lekki artefakt ruchowy w sygnale z elektrody jest zjawiskiem normalnym.Następnie umieść bipolarną elektrodę stymulującą w prawym przedsionku, aby stymulować serce zgodnie z pozycją przewidzianą w planie eksperymentalnym. Następnie ustaw ostrość kamery CCD na obszarze zainteresowania serca. Do kamery powinien być przymocowany filtr emisyjny.Aby zarejestrować fluorescencję NADH, należy wyłączyć światło zewnętrzne, aby równomiernie oświetlić epikardium źródłem światła UV w stacji roboczej, do której przymocowana jest kamera. Należy ustawić oprogramowanie tak, aby rejestrowało obrazy z częstotliwością dwóch klatek na sekundę. Następnie należy wybrać tryb aktualizacji na żywo, aby monitorować średnią intensywność pikseli w obrębie wybranego obszaru zainteresowania.Jeśli perfuzja była odpowiednia, poziomy NADH reprezentowane przez fluorescencję powinny być niskie i stabilne na powierzchni epikardium. Po zakończeniu eksperymentu należy usunąć serce.Opróżnij PERFUSE eight oraz przewody i komory systemu z wody oczyszczonej. Okresowo płucz system roztworem TM do błon śluzowych lub rozcieńczonym roztworem nadtlenku wodoru zgodnie z opisanym protokołem. Serca były stymulowane przy długościach cyklu od 200 do 400 uderzeń na minutę.Rozkurczowe LVP wynosiło zazwyczaj od 0 do 10 Tor, natomiast minimalne rozkurczowe ciśnienie aortalne wynosiło około 60 Tor. Szczytowe skurczowe LVP zależy od ciśnienia napełniania oraz kurczliwości i optymalnie powinno mieścić się w zakresie od 60 do 80 Tor. Maksymalne ciśnienie aortalne i maksymalne LVP powinny być ze sobą ściśle zgodne. Monofazowe potencjały czynnościowe typowe dla serca królika charakteryzują się szybką fazą depolaryzacji oraz charakterystyczną fazą repolaryzacji. Potencjały czynnościowe były łatwo rejestrowane z preparatów, lecz zazwyczaj występował w nich niewielki artefakt ruchowy podczas rozkurczu.Średnie wartości fluorescencji NADH z obszaru zainteresowania zaznaczonego czerwonym prostokątem były mierzone w celu monitorowania zmian stanu redoks mitochondriów podczas trzech cykli stymulacji przy długościach cyklu wynoszących odpowiednio 300, 200 i 150 ms, gdy częstość stymulacji była zbliżona do rytmu zatokowego. Poziom bazowy NADH pozostawał stosunkowo stały przy skracaniu długości cyklu. Poniżej 300 ms poziomy bazowe NADH wzrosły, przy czym największy wzrost odnotowano przy 150 ms; sygnał oscyluje w rytm skurczów, a częstotliwość tych oscylacji odpowiada częstotliwości pracy serca.Amplituda tych oscylacji była zawsze mniejsza niż trendy w dłuższych skalach czasowych wywołane niedokrwieniem lub hipoksją. Wysokorozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne NADH całej powierzchni przedniej przy 200 uderzeniach na minutę było stałe i przestrzennie jednorodne przy 400 uderzeniach na minutę. Poziomy NADH wzrosły znacząco w całym epikardium.Zaobserwowano znaczną heterogeniczność przestrzenną, przy czym największe wzrosty wystąpiły w obszarach przegrodowych RV i LV. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w czasie krótszym niż 45 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procesu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zapobieganiu przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do aorty lub lewego przedsionka po zakończeniu procedury.Dodatkowe metody, takie jak obciążenie serca barwnikiem wrażliwym na napięcie, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na kolejne pytania, np. dotyczące powiązania aktywności elektrycznej i metabolicznej na powierzchni serca w scenariuszach patologicznych, takich jak lokalne niedokrwienie po jego wystąpieniu. Technika ta utorowała drogę badaczom fizjologii serca do studiowania metabolizmu serca i zaburzeń przewodzenia w warunkach patologicznych z wykorzystaniem modelu bardziej istotnego fizjologicznie.

nadh-fluorescence-imaging-isolated-biventricular-working-rabbit

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Fluorescencyjne wizerunki NADH izolowanych dwukomorowych pracujących serc królików

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Niniejszy artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania oraz podwójnej modalności obrazowania (napięciowego i wapniowego).

Multiparametryczne mapowanie optyczne serca królika perfundowanego metodą Langendorffa

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Izolowane modele pracującego serca mogą być używane do pomiaru wpływu warunków obciążenia, tętna i leków na wydajność mięśnia sercowego i zużycie tlenu. Opisano metody przygotowania modelu pracy lewego serca gryzonia, który pozwala na badanie wydolności skurczowej i rozkurczowej oraz zużycia tlenu w różnych warunkach.

Model pracującego serca gryzoni do badania wydajności mięśnia sercowego i zużycia tlenu

W sercu, zdarzenia molekularne koordynują funkcję elektryczną i kurczliwą narządu. Zaprezentowany tu zestaw technik mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego umożliwia rejestrację zmiennych komórkowych w nienaruszonych sercach. Identyfikacja mechanizmów definiujących czynność serca ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak serce działa w sytuacjach patologicznych.

Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach

Ten protokół opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków myszy za pomocą optycznego systemu mapowania o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, w tym podwójne zapisy napięcia membranowego i Ca2+ przejściowego pod zaprogramowaną stymulacją przez specjalistyczny cewnik elektrodowy.

Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości

Nowatorskie strategie terapeutyczne w medycynie regeneracyjnej serca wymagają obszernych i szczegółowych badań na dużych przedklinicznych modelach zwierzęcych, zanim będą mogły być rozważane do zastosowania u ludzi. W tym miejscu demonstrujemy technikę przezskórnego wstrzykiwania domięśniowego do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii kontrastowej u królików, która jest cenna dla hipotezy testującej skuteczność takich nowatorskich terapii.

Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

Tutaj przedstawiamy metodę użycia wewnątrzkomorowego cewnika optycznego w perfundowanych sercach do wykonywania spektroskopii absorbancji przez ścianę serca. Uzyskane dane dostarczają solidnych informacji na temat napięcia tlenu w tkankach, a także wykorzystania substratu i potencjału błonowego jednocześnie z pomiarami wydolności serca w tym wszechobecnym preparacie.

Wewnątrzsercowy cewnik świetlny do bocznego zapłonu do monitorowania metabolizmu komórkowego za pomocą przezściennej spektroskopii absorpcji perfundowanych serc ssaków

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Celem tego badania było ustalenie metody badania dynamiki serca za pomocą translacyjnego modelu zwierzęcego. Opisane podejście eksperymentalne obejmuje optokardiografię podwójnej emisji w połączeniu z badaniem elektrofizjologicznym w celu oceny aktywności elektrycznej w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Obecne badanie demonstruje wysoce powtarzalny model zwierzęcy ostrego regionalnego niedokrwienia mięśnia sercowego i uszkodzenia reperfuzyjnego u królików przy użyciu mini-torakotomii lewej dla przypadków przeżycia lub sternotomii linii środkowej dla przypadków nieprzeżytych.

Model uszkodzenia niedokrwiennego i reperfuzyjnego u królików

Poznaj metodę obrazowania NADH w izolowanych sercach królików do badania metabolizmu mitochondrialnego w fizjologicznych warunkach. Technika umożliwia monitorowanie zmian redoks w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie fluorescencyjne NADH w izolowanych, pracujących sercach królika z obiema komorami

Przeglądaj więcej filmów