Name: Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej za pośrednictwem inwadopodiów w kontekstach jedno- i wielokomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej za pośrednictwem inwadopodiów w kontekstach jedno- i wielokomórkowych. Technika obejmuje przygotowanie powłok żelatynowych znakowanych fluorescencyjnie, hodowlę komórek, barwienie oraz kwantyfikację degradacji macierzy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z funduszy wieczystych West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Dziękujemy Susette Mueller (Georgetown University) oraz Laurze Kelley za wczesne rady i pomoc. Wyrażamy wdzięczność za możliwość korzystania z West Virginia University Microscopy Imaging Facility (wspieranej przez Mary Babb Randolph Cancer Center oraz granty NIH P20 RR16440, P30 RR032138 i P30 GM103488).

<ol><li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+at+the+leading+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Life at the leading edge.</a> Cell. 145, 1012-1022 (2011).</li>
<li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27ins%27+and+%27outs%27+of+podosomes+and+invadopodia%3A+characteristics%2C+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li>
<li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degrading+Devices%3A+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).</li>
<li>Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+degradation+of+fibronectin+at+sites+of+expression+of+the+transforming+gene+product+pp60src%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src.</a> Nature. 316, 156-158 (1985).</li>
<li>Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interactions+of+cortactin+and+membrane+type+1+matrix+metalloproteinase+at+invadopodia%3A+defining+the+stages+of+invadopodia+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function.</a> Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).</li>
<li>Ayala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+regulatory+inputs+converge+on+cortactin+to+control+invadopodia+biogenesis+and+extracellular+matrix+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation.</a> J. Cell Sci. , (2008).</li>
<li>Ammer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saracatinib+impairs+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+invasion+by+disrupting+invadopodia+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Sci.+Ther%22%5BJournal%5D)">Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function.</a> J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).</li>
<li>Seals, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+protein+Tks5%2FFish+is+required+for+podosome+formation+and+function%2C+and+for+the+protease-driven+invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells.</a> Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+invadopodium+formation%3A+the+role+of+the+N-WASP-Arp2%2F3+complex+pathway+and+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin.</a> J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).</li>
<li>Kopp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin+KIF1C+and+microtubule+plus+ends+regulate+podosome+dynamics+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).</li>
<li>Oser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+regulates+cofilin+and+N-WASp+activities+to+control+the+stages+of+invadopodium+assembly+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation.</a> J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Kelley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Src+requires+a+wild-type+counterpart+to+regulate+invadopodia+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation.</a> J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).</li>
<li>Chen, W. T., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+is+not+present+in+the+focal+adhesions+formed+between+normal+cultured+fibroblasts+and+their+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).</li>
<li>Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transformation-associated+protease%28s%29+that+degrade+fibronectin+at+cell+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites.</a> J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).</li>
<li>Bharti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src-dependent+phosphorylation+of+ASAP1+regulates+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes.</a> Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).</li>
<li>Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+engagement+of+ADAM12+induces+clusters+of+invadopodia+with+localized+ectodomain+shedding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity.</a> Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).</li>
<li>Scott, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).</li>
<li>Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+membrane+proteins+mediates+cellular+invasion+by+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells.</a> J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).</li>
<li>Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%3A+unique+methods+for+measurement+of+extracellular+matrix+degradation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro.</a> Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).</li>
<li>Baldassarre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+participates+in+focal+extracellular+matrix+degradation+by+invasive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells.</a> Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).</li>
<li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li>
<li>Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+degradation+assays+for+analyzing+local+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">ECM degradation assays for analyzing local cell invasion.</a> Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).</li>
<li>Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+microtubules%2C+and+vimentin+intermediate+filaments+cooperate+for+elongation+of+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia.</a> J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).</li>
<li>Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+is+an+essential+regulator+of+matrix+metalloproteinase+secretion+and+extracellular+matrix+degradation+in+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia.</a> Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase+signaling+pathway+mediated+by+p110alpha+regulates+invadopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation.</a> J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-bundling+protein+fascin+stabilizes+actin+in+invadopodia+and+potentiates+protrusive+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion.</a> Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+and+PIP5-kinase+Ialpha+are+required+for+invadopodia+formation+in+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells.</a> Cancer Sci. , (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Zdolność do wizualizacji komórek degradujących macierz pozakomórkową pomogła w odkryciu mechanizmów molekularnych wykorzystywanych we wczesnych etapach inwazji komórkowej. Metoda polegająca na powlekaniu szklanych szkiełek podstawkowych białkami pozakomórkowymi znakowanymi fluorescencyjnie w celu późniejszej analizy mikroskopowej, zapoczątkowana przez Wen-Tien Chen na początku lat 80. XX wieku4,14,15, stała się główną techniką oceny funkcji invadopodiów w szerokim zakresie typów komórek. Przedstawiony protokół...

<table><tbody><tr><td>żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>skóra wieprzowa</td></tr><tr><td> sacharoza</td><td>Fisher</td><td>BP220</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe 12 mm</td><td>Fisher</td><td>50-121-5159</td><td></td></tr><tr><td>płytki 24-dołkowe</td><td>Fisher</td><td>08-772-1</td><td>BD Falcon</td></tr><tr><td>kwas azotowy</td><td>Ricca</td><td>R5326000</td><td>roztwór 20%</td></tr><tr><td>poli-L-lizyna</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19320-B</td><td>roztwór 0,1%</td></tr><tr><td>glutaraldehyd</td><td>Sigma</td><td>G7526</td><td>roztwór 8%</td></tr><tr><td>żelatyna sprzężona z Oregon Green 488</td><td>Invitrogen</td><td>G-13186</td><td></td></tr><tr><td>borowodorek sodu</td><td>Sigma</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>rodamina-falloidyna</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-kortaktyna (klon 4F11)</td><td>Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-FLAG</td><td>Millipore</td><td>MAB3118</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop konfokalny LSM 510</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie ImageJ</td><td>Domena publiczna</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.macbiophotonics.ca/imagej/&quot; target=&quot;_blank">http://www.macbiophotonics.ca/imagej/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>oprogramowanie AutoQuant X2.2</td><td>Media Cybernetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Inwazja komórkowa do tkanek lokalnych jest procesem istotnym w rozwoju i homeostazie. Nieprawidłowo regulowana inwazja i następujący po niej ruch komórek są charakterystyczne dla wielu procesów patologicznych, w tym stanów zapalnych, chorób sercowo-naczyniowych oraz przerzutów komórek nowotworowych1. Ogniskowa degradacja proteolityczna składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w błonie podstawnej nabłonka lub śródbłonka jest krytycznym krokiem w inicjowaniu inwazji komórkowej. W przypadku komórek nowotworowych szeroko zakrojone analizy in vitro wykazały, że degradacja ECM odbywa się za pośrednictwem brzusznych, bogatych w aktynę struktur wypukłych błony komórkowej, nazywanych invadopodiami2,3. Invadopodia tworzą się w bezpośrednim sąsiedztwie ECM, gdzie modulują jej rozkład poprzez działanie metaloproteinaz macierzy (MMPs). Zdolność komórek nowotworowych do tworzenia invadopodiów koreluje bezpośrednio ze zdolnością do inwazji do lokalnego zrębu oraz powiązanych z nim komponentów naczyniowych3.
Wizualizacja degradacji ECM przez komórki za pośrednictwem invadopodiów, przeprowadzana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z wykorzystaniem znakowanych barwnikiem białek macierzy naniesionych na szklane szkiełka coverglass, stała się najpowszechniejszą techniką oceny stopnia proteolizy macierzy oraz inwazyjnego potencjału komórek4,5. W niniejszej pracy opisujemy wersję standardowej metody wytwarzania fluorescencyjnie znakowanych szkiełek coverglass z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie koniugatu żelatyny Oregon Green-488. Metoda ta jest łatwo skalowalna, co pozwala na szybkie przygotowanie dużej liczby powlekanych szkiełek. Przedstawiamy niektóre z częstych artefaktów mikroskopowych, które często pojawiają się podczas tej procedury, oraz sposób ich unikania. Na koniec opisujemy znormalizowane metody z wykorzystaniem powszechnie dostępnego oprogramowania komputerowego, umożliwiające ilościową ocenę degradacji znakowanej macierzy żelatynowej pośredniczonej przez pojedyncze komórki oraz przez całe populacje komórkowe. Opisane procedury zapewniają możliwość dokładnego i powtarzalnego monitorowania aktywności invadopodiów i mogą służyć jako platforma do oceny skuteczności modulacji ekspresji białek lub testowania związków przeciwinwazyjnych w kontekście degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej w układach pojedynczych i wielokomórkowych.

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Inwazja komórkowa do tkanek lokalnych jest procesem istotnym w rozwoju i homeostazie. Zaburzenia regulacji inwazji i następującego po niej ruchu komórek prowadzą do...

Ta standardowa technika pozwala na przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną znakowaną fluorescencyjnie, które nadają się do ilościowych analiz degradacji macierzy przez inwazyjne podia. Po pokryciu szkiełek nakrywkowych żelatyną znakowaną fluorescencyjnie, należy wysiać komórki i inkubować je w celu degradacji macierzy. Następnie komórki należy utrwalić i zabarwić fluorescencyjnie pod kątem białek markerowych inwazyjnych podiów, a następnie pozyskać obrazy i ilościowo ocenić degradację macierzy.Typowe wyniki pozwalają na ilościowe określenie różnic w degradacji macierzy pośredniczonej przez podia pomiędzy komórkami poddanymi zróżnicowanej manipulacji wybranymi genami lub traktowaniu środkami farmakologicznymi. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną z jednorodną fluorescencją jest trudne do osiągnięcia ze względu na nierównomierne pokrycie fluorescencyjną żelatyną lub niewłaściwe obchodzenie się z szkiełkami pokrytymi żelatyną. Procedurę zaprezentują adiunkt Karen Martin, pracownik postdoktorski Mandy Ammer oraz doktoranci Elise Walk, Karen Hayes i Steve Markwell.Aby przygotować nieoznakowany roztwór zapasowy 5% żelatyny i sacharozy, połączyć żelatynę i sacharozę w PBS i rozpuścić całkowicie w temperaturze 37 °C. Następnie przechowywać w temperaturze 4 °C. Przystąpić do czyszczenia szklanych szkiełek nakrywkowych.Do każdego dołka plastikowej 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek włóż pojedynczy szkiełko nakrywkę, dodaj 500 µL 20% kwasu azotowego i inkubuj przez 30 minut. Po usunięciu roztworu kwasu azotowego przemyj szkiełka nakrywki trzykrotnie wodą dejonizowaną. Następnie przeprowadź powlekanie.Na każde szkiełko nakraplamy 500 µL roztworu poli-L-lizyny o stężeniu 50 µg/mL i inkubujemy przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór poli-L-lizyny należy usunąć, a szkiełka przemyć trzykrotnie PBS. Powlekanie poli-L-lizyną ułatwia równomierne pokrycie i wiązanie nakładanej żelatyny znakowanej. Płytki 24-dołkowe należy umieścić w lodzie, a następnie do każdego dołka dodać 500 µL świeżo przygotowanego 0,5% glutaraldehydu.Następnie inkubuj płytki na lodzie przez 15 minut. Przeprowadź trzy przemycia zimnym PBS, a następnie odessij wszystkie pozostałości PBS przed powleczeniem żelatyną. W międzyczasie, podczas inkubacji z glutaraldehydem, przygotuj roztwór żelatyny koniugowanej z Oregon Green 488.Zgodnie z protokołem producenta, należy podgrzać ten roztwór oraz nieznakowany 5% roztwór stokowy żelatyny z sacharozą do 37 °C. Następnie należy rozcieńczyć 500 µL znakowanej żelatyny w czterech mL nieznakowanej żelatyny z sacharozą, naniosząc 100 µL tak rozcieńczonej mieszaniny żelatyny 4 88 na każde szkiełko nakrywkowe.Należy użyć odpowiedniej ilości żelatyny, aby pokryć szkiełko nakrywkowe bez konieczności ręcznego rozprowadzania. Ważne jest, aby podczas procedury powlekania utrzymywać rozcieńczoną mieszankinę żelatyny 4 88 w temperaturze 37°C, aby zapobiec przedwczesnemu stężeniu. Ponadto, od tego etapu wzwyż należy przechowywać szkiełka nakrywkowe w ciemności tak często, jak to możliwe, aby uniknąć potencjalnego fotoblaknięcia.Po pokryciu wszystkich szkiełek nakrywkowych w jednej płytce, należy trzymać płytkę pod kątem i usunąć nadmiar żelatyny z każdej studni za pomocą aspiracji próżniowej. Następnie inkubować pokryte szkiełka nakrywkowe w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przemyciu szkiełek nakrywkowych PBS dodać 500 µL borohydreku sodu.W wyniku reakcji z borowodorkiem wydziela się gaz i wokół każdego szkiełka nakrywkowego pojawią się małe pęcherzyki; inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby zredukować i dezaktywować resztkowy glutaraldehyd. Usuń roztwór borowodorku sodu poprzez aspirację próżniową, wykonując szybkie ruchy zamiatające wokół krawędzi każdej studzienki. Należy uważać, aby nie odessać pływających szkiełek nakrywkowych, które mogły oddzielić się od dna płytki do hodowli tkankowej podczas obróbki borowodorkiem sodu. Po trzech przemyciach w PBS inkubuj szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Stosując technikę sterylną, przenieś szkiełka nakrywkowe zawierające płytki do komory z laminarnym przepływem powietrza typu II przeznaczonej do hodowli komórek B, a następnie przemyj szkiełka nakrywkowe trzy razy sterylnym PBS za pomocą sterylnej igły i pęsety. Ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe do pustej studni nowej płytki 24-dołkowej i doprowadź szkiełka nakrywkowe do równowagi z pożywką hodowlaną dla konkretnego typu analizowanych komórek.Następnie, po odpowiednim czasie inkubacji, wysiej komórki bezpośrednio na szkiełka nakrywki. Przystąp do obróbki próbek w celu obrazowania immunofluorescencyjnego, aby zamontować preparaty. Nanieś kroplę Prolong Gold Antifade lub podobnego odczynnika na szkiełko przedmiotowe, ostrożnie umieść na nim odwróconą nakrywkę i wykonaj zdjęcia do analizy.Analiza ta dostarcza znormalizowaną powierzchnię degradacji macierzy w stosunku do powierzchni komórek lub ich liczby. Jest ona przydatna do analizy całych mikroskopowych pól widzenia, w których znajduje się wiele komórek poddanych wspólnej obróbce czynnikami wzrostu irna lub środkami terapeutycznymi. Do tej analizy wykorzystuje się obrazy zebrane przy niższym powiększeniu, wystarczającym do efektywnego gromadzenia informacji o populacjach komórek.Otwórz obraz w programie ImageJ. Sprawdź informacje o skali i wybierz pomiary. Wybierz opcje obszaru (area) oraz limitu progu (limit to threshold). Oblicz obszar degradacji, korzystając z obrazu fluorescencyjnej żelatyny; skoryguj nierównomierne oświetlenie żelatyny poprzez odjęcie progu tła z obrazu służącego do ustawienia górnych i dolnych wartości intensywności pikseli.W kolejnych obrazach należy użyć przycisku „set” w oknie progowania, aby ustawić ten sam próg dla wszystkich obrazów, co stanowi obiektywny sposób wyboru obszaru degradacji. Następnie należy użyć funkcji „analyze particles”, aby zmierzyć wartość progu w obszarach degradacji macierzy.Wybierz rozmiar cząsteczki większy od zera, aby usunąć szum z zaznaczenia. Włącz wyświetlanie konturów, aby zidentyfikować obszary zainteresowania. Następnie zaznacz opcje wyświetlania wyników oraz podsumowania, aby pokazać pomiary, jeżeli na rysunku zostały dokładnie obrysowane wszystkie obszary degradacji.Skopiuj pomiar całkowitej powierzchni do arkusza kalkulacyjnego; jeśli zaznaczono inne obiekty, takie jak zanieczyszczenia, zapisz jedynie powierzchnie odpowiednich obszarów zainteresowania. Następnie, aby obliczyć powierzchnię komórek, otwórz plik i obraz z barwieniem, a następnie wykonaj progowanie obrazu, aby ustawić górną i dolną wartość intensywności pikseli w taki sposób, aby na kolejnych obrazach zaznaczone zostały krawędzie komórek. Użyj przycisku set w oknie progowania, aby ustawić ten sam próg dla wszystkich obrazów.Jako obiektywny sposób wyboru obszaru komórek należy użyć funkcji analyze particles, aby zmierzyć próg powierzchni komórek. Wybierz rozmiar cząstki większy od zera, aby usunąć szum z zaznaczonego obszaru.Wyświetl obrysy, aby zidentyfikować obszary do analizy, sprawdź wyniki wyświetlania i podsumuj, aby pokazać pomiary powierzchni. Nie zaznaczaj. Uwzględnij otwory, jeśli występują przestrzenie między komórkami a klastrem.Teraz dokonaj wyboru. Skopiuj wyniki powierzchni dla odpowiednich obszarów zainteresowania do arkusza kalkulacyjnego i oblicz powierzchnię degradacji żelatyny w stosunku do całkowitej powierzchni komórek. Alternatywnym podejściem jest normalizacja powierzchni degradacji do liczby komórek, określonej poprzez zliczenie jąder barwionych DAPI.Jest to istotne, jeśli manipulacje zmieniają średnią powierzchnię komórek. W tym podejściu należy użyć wtyczki nucleus counter do automatycznego zliczania jąder. Dostosuj opcje, aby zoptymalizować je pod kątem swoich obrazów. Jeśli jądra w znacznym stopniu na siebie nachodzą, automatyczne zliczanie może nie zapewnić dokładnej numeracji w takim przypadku.Przy prawidłowym wykonaniu, ręczne liczenie można ułatwić za pomocą wtyczki do liczenia komórek. Szkiełka podstawowe są równomiernie pokryte żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488. Podczas pokrywania i przetwarzania szkiełek pokrytych żelatyną mogą wystąpić liczne artefakty.Na przykład nierównomierne pokrycie wynika z niewłaściwego zakrycia szkiełka podstawowego podczas procesu powlekania z powodu słabego wymieszania, ręcznego rozprowadzania lub częściowego zestalenia mieszaniny żelatyny. Zarysowania wskazują na usunięcie powlekłej matrycy poprzez nacięcia igłami lub pęsetą podczas manipulacji. Wyschnięcie powierzchni szkiełka podstawowego podczas długotrwałego przechowywania może skutkować wyglądem przypominającym brukowanie. Ten obszar odzwierciedla fotowyblaknięcie fluorescencyjnej powierzchni żelatyny podczas obrazowania w wyniku długotrwałej lub wysokointensywnej ekspozycji na światło.Zwróć uwagę, że odpowiednio przygotowane szkiełko nakrywki wykazuje jednorodną fluorescencję podczas obserwacji mikroskopowej. Cienkie macierze otrzymywane w wyniku tej procedury stanowią czułe narzędzie do oceny zdolności komórek do degradowania ECM. Na przykład.Obrazy te przedstawiają aktywność degradacji macierzy podium w procesie inwazji komórki raka głowy i szyi OSC 19. Komórki zasiano na szkiełkach nakrywkowych z żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488, a następnie obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, co przedstawiono na obrazach 2D i 3D. Komórki OSC 19 wysiane na szkiełkach z żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488a zostały znakowane rodaminą sprzężoną z Phalloidiną oraz przeciwciałami przeciwko kortaktynie, wizualizowanymi za pomocą wtórnego przeciwciała ANOR 647 i pseudo kolorowanymi na zielono w obszarach inwazji.Podia są widoczne na scalonym obrazie jako ogniskowe koncentracje cytoplazmatyczne aktyny F i kortyny, które nakładają się na obszary przejaśnienia żelatyny. Wizualizacja przedstawia, w jaki sposób wnikające podia penetrują podobjętość ECMA; stworzono ją, aby ukazać krawędź wewnątrz komórki, w której obecne są wnikające podia. Widok krawędzi grzbietowej demonstruje wnikające podia wstawione w znajdującą się poniżej żelatynę.Widok krawędzi brzusznej ukazuje wypukłości w podia Veda oraz obszary degradacji żelatyny pod szkiełkiem podstawowym, gdzie regiony czerwone występują w obrębie zielonej matrycy. Obrazy te przedstawiają niektóre z kluczowych etapów kwantyfikacji znormalizowanej degradacji matrycy żelatynowej przez komórki w obrębie całego obrazu mikroskopowego. Wszystkie obrazy fluorescencyjne zostały przekonwertowane na skalę szarości, aby lepiej zobrazować czerwone progi odcięcia oraz oznaczenia obszarów zainteresowania.Ten obraz żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488 pokazuje ciemne obszary, w których nastąpiła degradacja. Dzięki progowaniu obrazu żelatyny wyróżniono obszary degradacji, z których wybrano interesujące regiony w celu pomiaru powierzchni degradacji. Obraz ten przedstawia rumine, foid oraz barwienie f-aktyny zgodnie z oczekiwaniami.Próg na obrazie aktyny uwidacznia całkowity obszar komórki, z którego wybierane są obszary komórkowe do pomiaru. Podobnie technikę tę można zastosować do badania obrazów jąder komórkowych barwionych DAPI. Ten panel przedstawia wybrane kroki zaangażowane w kwantyfikację degradacji fluorescencyjnej żelatyny przez poszczególne komórki w obrębie mieszanej populacji komórkowej.Ta prosta kwantyfikacja dotyczy pojedynczej przetransfekowanej komórki OSC 19 nadprodukującej rekombinantową kortaktynę połączoną z epitopem flag. Należy zauważyć, że degradacja macierzy przez komórki przetransfekowane może być analizowana również w mieszanej populacji komórek przetransfekowanych i nieprzetransfekowanych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o kilku kwestiach.Najpierw należy upewnić się, że fluorescencyjne markery komórkowe nie pokrywają się z kolorem fluorescencyjnej żelatyny. Podczas gromadzenia obrazów ważne jest wybieranie pól na podstawie obecności komórek. Nie należy celowo wyszukiwać obszarów degradacji, ponieważ może to wprowadzić błąd do danych ze względu na zmienność między liniami komórkowymi i odpowiedzi na różne czynniki terapeutyczne.Czynniki takie jak liczba próbek, czas degradacji oraz dobór białek do znakowania immunofluorescencyjnego powinny zostać zoptymalizowane pod kątem konkretnego eksperymentu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat przygotowania szkiełek podstawowych równomiernie pokrytych fluorescencyjną żelatyną w badaniach degradacji pośredniczonej przez beta-podia, a także metod ilościowego oznaczania degradacji macierzy.

quantitative-measurement-invadopodia-mediated-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowe pomiaru proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej pośredniczonej przez inwadopodie w kontekście pojedynczych i wielokomorkowych

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Ten film opisuje technikę wykorzystania natywnej matrycy do badania inwazji komórek nowotworowych. Technika zastosowana w tym teście zapewnia możliwość oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych w warunkach 3D bez konieczności stosowania syntetycznej lub obcej matrycy.

Test inwazji komórek nowotworowych: natywna metoda 3D oparta na macierzy in vitro do oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych

Ten film prezentuje ilościową mikroskopię poklatkową do oceny zależnej od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej rozprzestrzeniania się Listeria monocytogenes przez komórki śródbłonka. Bardziej miękki hydrożel ułatwia szybsze rozprzestrzenianie się bakterii przez komórki śródbłonka w porównaniu ze sztywniejszymi odpowiednikami, co podkreśla wpływ sztywności matrycy na rozprzestrzenianie się bakterii.

Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny rozsiewu bakterii zależnego od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej

Mikroreologia śledząca cząstki może być wykorzystana do nieniszczącego ilościowego i przestrzennego mapowania zmian właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D nowotworów.

Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Mechaniczna sztywność w mikrośrodowisku guza odgrywa kluczową rolę w napędzaniu złośliwych zachowań poprzez zwiększanie aktywności inwadopodii i kurczliwości aktomiozyny. Za pomocą żeli poliakrylamidowych (PAA), testy inwadopodiów i siły trakcyjnej można wykorzystać do badania właściwości inwazyjnych i kurczliwych komórek rakowych w odpowiedzi na sztywność matrycy.

Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół do ciągłego ilościowego oznaczania procesów adhezji i deadhezji komórek z wysoką rozdzielczością czasową w sposób nieinwazyjny poprzez impedancję substratu komórkowego i analizy obrazowania żywych komórek. Podejścia te ujawniają dynamikę procesów adhezji/deadhezji komórek wyzwalanych przez modyfikację matrycy i ich czasowy związek ze zdarzeniami sygnalizacyjnymi zależnymi od adhezji.

Wykorzystanie impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w adhezji komórkowej i deadhezji wywołanych modyfikacją matrycy

Ten protokół opisuje, jak przygotować mieszaną matrycę 2D, składającą się z żelatyny i kolagenu I, oraz wtyczkę 3D kolagenu I do badania liniowych inwadosomów. Protokoły te pozwalają na badanie liniowego tworzenia inwadosomu, aktywności degradacji macierzy oraz zdolności inwazji komórek pierwotnych i linii komórek rakowych.

Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

Test inwazji komórkowej in vitro służy do pomiaru potencjału przerzutów raka poprzez ilościowe określenie potencjału komórkowego do inwazji i migracji za pomocą wkładek do hodowli komórkowych zawierających matrycę białkową. Komórki są zmuszane do migracji przez matrycę białkową i porowatą błonę w kierunku chemoatraktantu, a następnie określane ilościowo za pomocą mikroskopii świetlnej.

Zastosowanie mysich komórek nowotworowych sutka w teście inwazji in vitro jako miary zachowania komórek onkogennych

Wiele genów o podwyższonej regulacji stymuluje migrację i inwazję komórek nowotworowych, co prowadzi do złych rokowań. Określenie, które geny regulują migrację i inwazję komórek nowotworowych, ma kluczowe znaczenie. Protokół ten przedstawia metodę badania wpływu zwiększonej ekspresji genu na migrację i inwazję komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym.

Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Poznaj metodę ilościowej analizy proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej za pośrednictwem inwadopodiów w kontekstach jedno- i wielokomórkowych. Technika obejmuje przygotowanie powłok żelatynowych znakowanych fluorescencyjnie, hodowlę komórek, barwienie oraz kwantyfikację degradacji macierzy.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Przeglądaj więcej filmów