Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Ta standardowa technika pozwala na przygotowanie szkiełek nakrywek pokrytych żelatyną znakowaną fluorescencyjnie, które nadają się do ilościowych analiz degradacji macierzy przez inwazyjne podie. Po pokryciu szkiełek nakrywek żelatyną znakowaną fluorescencyjnie, należy wysiać komórki i inkubować je w celu przeprowadzenia degradacji macierzy. Następnie należy utrwalić i zabarwić fluorescencyjnie komórki pod kątem białek markerowych inwazyjnych podiów, pozyskać obrazy i ilościowo ocenić degradację macierzy.

Typowe wyniki pozwalają na ilościowe określenie różnic w degradacji macierzy zapośredniczonej przez podia pomiędzy komórkami poddanymi różnym manipulacjom w obrębie wybranych genów lub leczeniu czynnikami farmakologicznymi. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ przygotowanie szkiełek podstawkowych pokrytych żelatyną o jednorodnej fluorescencji jest trudne do osiągnięcia ze względu na nierównomierne pokrycie fluorescencyjną żelatyną lub niewłaściwą obsługę szkiełek pokrytych żelatyną. Procedurę zaprezentują adiunkt Karen Martin, pracownik postdoktorski Mandy Ammer oraz doktoranci Elise Walk, Karen Hayes i Steve Markwell.

Aby przygotować nieoznakowany roztwór zapasowy 5% żelatyny i sacharozy, połączyć żelatynę i sacharozę w PBS i rozpuścić całkowicie w temperaturze 37 °C. Następnie przechowywać w temperaturze 4 °C. Przejść do czyszczenia szklanych szkiełeczek przykrywek.

Umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdej studzience 24-dołkowej plastikowej płytki do hodowli tkanek, dodaj do każdej studzience 500 µL 20% kwasu azotowego i inkubuj przez 30 minut. Po usunięciu roztworu kwasu azotowego przemyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie wodą dejonizowaną. Następnie wykonaj powlekanie.

Na każde szkiełko nakładamy 500 µL poli-L-lizyny w stężeniu 50 µg/mL i inkubujemy przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór poli-L-lizyny usuwamy, a następnie płuczemy szkiełka trzykrotnie w PBS. Powlekanie poli-L-lizyną ułatwia równomierne pokrycie i wiązanie nakładanej żelatyny znakowanej. Płytki 24-dołkowe umieszczamy na lodzie i do każdego dołka dodajemy 500 µL świeżo przygotowanego 0,5% glutaraldehydu.

Następnie inkubuj płytki na lodzie przez 15 minut. Przeprowadź trzy przemycia zimnym PBS, a następnie odessaj wszystkie pozostałości PBS przed powlekaniem żelatyną. W międzyczasie, podczas inkubacji z glutaraldehydem, przygotuj roztwór żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488.

Zgodnie z protokołem producenta, podgrzać odczynnik oraz nieoznaczony roztwór zapasu 5%żelatyny z sacharozą do 37 °C. Następnie 500 µl oznakowanej żelatyny rozcieńczyć w czterech ml nieoznaczonej żelatyny z sacharozą. Nanieść 100 µl rozcieńczonej mieszaniny żelatyny 4 88 na każde szkiełko nakrywkowe.

Użycie odpowiedniej ilości żelatyny do pokrycia szkiełka nakrywki bez konieczności ręcznego rozprowadzania. Ważne jest, aby podczas procedury pokrywania utrzymać rozcieńczoną mieszaninę żelatyny 4 88 w temperaturze 37 °C, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu. Ponadto od tego etapu należy przechowywać szkiełka nakrywki w ciemności tak często, jak to możliwe, aby uniknąć potencjalnego fotoblaknięcia.

Po pokryciu wszystkich szkiełek nakrywek w jednej płytce, należy trzymać płytkę pod kątem i usunąć nadmiar żelatyny z każdej studniki za pomocą aspiracji próżniowej. Następnie inkubować pokryte szkiełka nakrywki w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przemyciu szkiełek nakrywek PBS dodać 500 µL boranu sodu, boranu sodu.

Wodorzek wykazuje właściwości musujące, a na powierzchni i wokół każdego szkiełka nakrywkowego pojawią się małe pęcherzyki; inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby zredukować i dezaktywować pozostałości glutaraldehydu. Usuń roztwór borowodorku sodu za pomocą aspiracji próżniowej, wykonując szybki ruch zamiatania wokół krawędzi każdej studni; należy uważać, aby nie wciągnąć żadnych pływających szkiełek nakrywkowych, które mogły oddzielić się od dna płytki do hodowli tkanek podczas obróbki borowodorkiem sodu. Po trzech przemyciach w PBS inkubuj szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Stosując technikę sterylną, przenieś szkiełka nakrywkowe z płytkami do laminarnego dygestorium klasy II do hodowli komórek B i wypłucz szkiełka trzy razy sterylnym PBS, używając sterylnej igły i pęsety. Ostrożnie przenieś szkiełka nakrywkowe do pustego dołka nowej płytki 24-dołkowej i zrównoważ szkiełka nakrywkowe w pożywce hodowlanej dla konkretnego typu komórek poddawanych badaniu.

Następnie, po odpowiednim czasie inkubacji, wysiej komórki bezpośrednio na szkiełka nakrywkowe. Przygotuj próbki do obrazowania immunofluorescencyjnego w celu ich zamontowania. Na szkiełko przedmiotowe nanieś kroplę środka Prolong Gold Antifade lub podobnego odczynnika, a następnie ostrożnie umieść odwrócone szkiełko nakrywkowe i wykonaj zdjęcia do analizy.

Niniejsza analiza dostarcza znormalizowanej powierzchni degradacji macierzy w stosunku do powierzchni komórek lub liczby komórek. Jest ona przydatna do analizy całych mikroskopowych pól widzenia, w których znajduje się wiele komórek poddanych wspólnemu działaniu czynników wzrostu irna lub czynników terapeutycznych. Do tej analizy wykorzystuje się obrazy zebrane przy mniejszym powiększeniu, wystarczającym do efektywnego gromadzenia informacji o populacjach komórek.

Otwórz obraz w programie ImageJ. Sprawdź informacje o skali i wybierz pomiary. Wybierz opcje obszaru (area) oraz ograniczenia progu (limit to threshold). Oblicz powierzchnię degradacji, korzystając z obrazu fluorescencyjnej żelatyny; skoryguj obraz pod kątem nierównomiernego oświetlenia żelatyny poprzez odjęcie progu tła, a następnie ustaw górną i dolną wartość intensywności pikseli.

W kolejnych obrazach użyj przycisku „set” w oknie progu (threshold), aby ustawić ten sam próg dla wszystkich obrazów, co stanowi obiektywny sposób wyboru obszaru degradacji. Użyj funkcji „analyze particles”, aby zmierzyć próg w obszarach degradacji macierzy.

Wybierz rozmiar cząstek większy od zera, aby usunąć szum z zaznaczenia. Włącz opcję wyświetlania konturów, aby zidentyfikować obszary zainteresowania. Następnie zaznacz opcje wyświetlania wyników oraz podsumowania, aby pokazać pomiary, jeśli na rysunku zostały precyzyjnie obrysowane wszystkie obszary degradacji.

Skopiuj pomiar całkowitej powierzchni do arkusza kalkulacyjnego; jeśli wybrano inne obiekty, takie jak zanieczyszczenia, zarejestruj jedynie powierzchnie odpowiednich obszarów zainteresowania. Następnie, aby obliczyć powierzchnię komórki, otwórz foid i wykonaj progowanie obrazu barwionego, aby ustawić górne i dolne wartości intensywności pikseli w taki sposób, by w kolejnych obrazach zaznaczono krawędzie komórek. Użyj przycisku set w oknie progowania, aby ustawić ten sam próg dla wszystkich obrazów.

Jako obiektywny sposób wyboru obszaru komórek, należy użyć funkcji analizy cząstek (analyze particles), aby zmierzyć próg powierzchni komórek. Wybierz rozmiar cząstek większy od zera, aby usunąć szum z zaznaczenia.

Wyświetl kontury, aby zidentyfikować obszary do analizy, sprawdź wyniki wyświetlania i podsumuj, aby pokazać pomiary powierzchni. Nie zaznaczaj. Uwzględnij otwory, jeśli występują przestrzenie między komórkami a klastrem.

Teraz wybierz odpowiednią metodę. Skopiuj wyniki powierzchni dla odpowiednich obszarów zainteresowania do arkusza kalkulacyjnego i oblicz powierzchnię degradacji żelatyny w stosunku do całkowitej powierzchni komórek. Alternatywnym podejściem jest normalizacja powierzchni degradacji do liczby komórek, określonej poprzez zliczenie jąder zabarwionych DAPI.

Jest to istotne w przypadku, gdy manipulacje zmieniają średnią powierzchnię komórki. W tej metodzie należy użyć wtyczki nucleus counter do automatycznego liczenia jąder. Dostosuj opcje, aby zoptymalizować proces dla swoich obrazów. Jeśli jądra znacznie na siebie nachodzą, automatyczne liczenie może nie zapewnić dokładnego zestawienia w tym przypadku.

Ręczne liczenie może zostać ułatwione dzięki zastosowaniu wtyczki do liczenia komórek, jeśli zostanie ono przeprowadzone prawidłowo. Szkiełka podstawowe są równomiernie pokryte żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488. Podczas powlekania i przetwarzania szkiełek pokrytych żelatyną mogą wystąpić liczne artefakty.

Na przykład nierównomierna powłoka wynika z niewłaściwego pokrycia szkiełka podstawowego podczas procesu powlekania, spowodowanego słabym mieszaniem, ręcznym rozprowadzaniem lub częściowym zestaleniem się mieszaniny żelatynowej. Zarysowania wskazują na usunięcie powleczonej matrycy poprzez nacięcie igłami lub pęsetą podczas manipulacji. Wysychanie powierzchni szkiełka podczas długotrwałego przechowywania może prowadzić do powstania wyglądu przypominającego bruk. Ten obszar odzwierciedla fotowybielanie fluorescencyjnej powierzchni żelatyny podczas obrazowania w wyniku przedłużonej lub wysokiej intensywności ekspozycji na światło.

Zauważmy, że odpowiednio przygotowane szkiełko nakrywki wykazuje jednorodną fluorescencję podczas obserwacji mikroskopowych. Cienkie macierze otrzymane w wyniku tej procedury stanowią czuły sposób oceny zdolności komórek do degradacji ECM. Na przykład.

Obrazy te przedstawiają aktywność degradacji macierzy podium w procesie inwazji komórki raka głowy i szyi OSC 19. Komórki wysiano na szkiełku nakrywkowym z żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488, a następnie obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, co przedstawiono na obrazach 2D i 3D. Komórki OSC 19 wysiane na szkiełkach z żelatyną sprzężoną z Oregon Green 488 znakowano sprzężonym z rodominą Phin oraz przeciwciałami anty-cortactin, wizualizowanymi za pomocą wtórnego przeciwciała ANOR 647; obszary inwazji zaznaczono kolorem zielonym.

Na scalonym obrazie widoczne są podia w postaci ogniskowych stężeń cytoplazmatycznych aktyny F i kortyny, które pokrywają się z obszarami przejaśnień żelatyny. Wizualizacja przedstawia sposób, w jaki wnikające podia penetrują podobjętość ECMA; utworzono ją, aby ukazać przekrój wewnątrz komórki, w którym obecne są wnikające podia. Widok krawędzi grzbietowej demonstruje wnikające podia wstawione w znajdującą się poniżej żelatynę.

Widok krawędzi brzusznej ukazuje wypustki w podia Veda oraz obszary degradacji żelatyny pod szkiełkiem nakrywnym, gdzie regiony czerwone występują w obrębie zielonej macierzy. Obrazy te przedstawiają niektóre z kluczowych etapów kwantyfikacji znormalizowanej degradacji macierzy żelatynowej przez komórki w obrębie całego obrazu mikroskopowego. Wszystkie obrazy fluorescencyjne zostały przekonwertowane na skalę szarości, aby lepiej zobrazować progowanie czerwieni oraz oznaczenia obszarów zainteresowania.

Ten obraz żelatyny sprzężonej z Oregon Green 488 pokazuje ciemne obszary, w których nastąpiła degradacja. Dzięki progowaniu obrazu żelatyny wyróżniono obszary degradacji, z których wybrano interesujące regiony w celu pomiaru powierzchni degradacji. Obraz ten przedstawia rumine, foid oraz barwienie aktyny F zgodnie z oczekiwaniami.

Próg na obrazie aktyny wyróżnia całkowity obszar komórki, z którego wybierane są obszary komórek do pomiaru. Podobnie technikę tę można zastosować do badania obrazów jąder komórkowych barwionych DAPI. Ten panel przedstawia wybrane etapy kwantyfikacji fluorescencyjnej degradacji żelatyny przez poszczególne komórki w mieszanej populacji komórkowej.

Ta prosta kwantyfikacja przedstawia pojedynczą transfektowaną komórkę OSC 19 nadekspresującą rekombinowany kort-aktynę połączoną z epitopem FLAG. Zwróć uwagę, że degradacja macierzy przez komórki transfektowane może być analizowana również w mieszanej populacji komórek transfektowanych i nietransfektowanych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o kilku kwestiach.

Najpierw upewnij się, że fluorescencyjne markery komórkowe nie nakładają się na kolor fluorescencyjnej żelatyny. Podczas pozyskiwania obrazów ważne jest wybieranie pól na podstawie obecności komórek. Nie należy celowo wyszukiwać obszarów degradacji, ponieważ może to zniekształcić dane ze względu na zmienność między liniami komórkowymi oraz różnice w odpowiedziach na poszczególne środki terapeutyczne.

Czynniki takie jak czas degradacji w zależności od liczby miejsc w płytce oraz dobór białek do znakowania immunofluorescencyjnego powinny zostać zoptymalizowane pod kątem konkretnego eksperymentu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat sposobu przygotowania szkiełek podstawowych równomiernie pokrytych fluorescencyjną żelatyną w testach degradacji pośredniczonej przez beta podie, a także metod ilościowego oznaczania degradacji macierzy.