Name: Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej za pośrednictwem inwadopodiów w kontekstach jedno- i wielokomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej za pośrednictwem inwadopodiów w kontekstach jedno- i wielokomórkowych. Technika obejmuje przygotowanie powłok żelatynowych znakowanych fluorescencyjnie, hodowlę komórek, barwienie oraz kwantyfikację degradacji macierzy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była finansowana z funduszy wieczystych West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Dziękujemy Susette Mueller (Georgetown University) oraz Laurze Kelley za wczesne rady i pomoc. Wyrażamy wdzięczność za możliwość korzystania z West Virginia University Microscopy Imaging Facility (wspieranej przez Mary Babb Randolph Cancer Center oraz granty NIH P20 RR16440, P30 RR032138 i P30 GM103488).

<ol><li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+at+the+leading+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Life at the leading edge.</a> Cell. 145, 1012-1022 (2011).</li>
<li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27ins%27+and+%27outs%27+of+podosomes+and+invadopodia%3A+characteristics%2C+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li>
<li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degrading+Devices%3A+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).</li>
<li>Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+degradation+of+fibronectin+at+sites+of+expression+of+the+transforming+gene+product+pp60src%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src.</a> Nature. 316, 156-158 (1985).</li>
<li>Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interactions+of+cortactin+and+membrane+type+1+matrix+metalloproteinase+at+invadopodia%3A+defining+the+stages+of+invadopodia+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function.</a> Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).</li>
<li>Ayala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+regulatory+inputs+converge+on+cortactin+to+control+invadopodia+biogenesis+and+extracellular+matrix+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation.</a> J. Cell Sci. , (2008).</li>
<li>Ammer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saracatinib+impairs+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+invasion+by+disrupting+invadopodia+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Sci.+Ther%22%5BJournal%5D)">Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function.</a> J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).</li>
<li>Seals, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+protein+Tks5%2FFish+is+required+for+podosome+formation+and+function%2C+and+for+the+protease-driven+invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells.</a> Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+invadopodium+formation%3A+the+role+of+the+N-WASP-Arp2%2F3+complex+pathway+and+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin.</a> J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).</li>
<li>Kopp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin+KIF1C+and+microtubule+plus+ends+regulate+podosome+dynamics+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).</li>
<li>Oser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+regulates+cofilin+and+N-WASp+activities+to+control+the+stages+of+invadopodium+assembly+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation.</a> J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Kelley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Src+requires+a+wild-type+counterpart+to+regulate+invadopodia+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation.</a> J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).</li>
<li>Chen, W. T., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+is+not+present+in+the+focal+adhesions+formed+between+normal+cultured+fibroblasts+and+their+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).</li>
<li>Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transformation-associated+protease%28s%29+that+degrade+fibronectin+at+cell+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites.</a> J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).</li>
<li>Bharti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src-dependent+phosphorylation+of+ASAP1+regulates+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes.</a> Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).</li>
<li>Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+engagement+of+ADAM12+induces+clusters+of+invadopodia+with+localized+ectodomain+shedding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity.</a> Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).</li>
<li>Scott, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).</li>
<li>Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+membrane+proteins+mediates+cellular+invasion+by+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells.</a> J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).</li>
<li>Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%3A+unique+methods+for+measurement+of+extracellular+matrix+degradation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro.</a> Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).</li>
<li>Baldassarre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+participates+in+focal+extracellular+matrix+degradation+by+invasive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells.</a> Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).</li>
<li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li>
<li>Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+degradation+assays+for+analyzing+local+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">ECM degradation assays for analyzing local cell invasion.</a> Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).</li>
<li>Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+microtubules%2C+and+vimentin+intermediate+filaments+cooperate+for+elongation+of+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia.</a> J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).</li>
<li>Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+is+an+essential+regulator+of+matrix+metalloproteinase+secretion+and+extracellular+matrix+degradation+in+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia.</a> Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase+signaling+pathway+mediated+by+p110alpha+regulates+invadopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation.</a> J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-bundling+protein+fascin+stabilizes+actin+in+invadopodia+and+potentiates+protrusive+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion.</a> Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).</li>
<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+and+PIP5-kinase+Ialpha+are+required+for+invadopodia+formation+in+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells.</a> Cancer Sci. , (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Zdolność do wizualizacji komórek degradujących macierz pozakomórkową pomogła w odkryciu mechanizmów molekularnych wykorzystywanych we wczesnych etapach inwazji komórkowej. Metoda polegająca na powlekaniu szklanych szkiełek podstawkowych białkami pozakomórkowymi znakowanymi fluorescencyjnie w celu późniejszej analizy mikroskopowej, zapoczątkowana przez Wen-Tien Chen na początku lat 80. XX wieku4,14,15, stała się główną techniką oceny funkcji invadopodiów w szerokim zakresie typów komórek. Przedstawiony protokół...

<table><tbody><tr><td>żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>skóra wieprzowa</td></tr><tr><td> sacharoza</td><td>Fisher</td><td>BP220</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe 12 mm</td><td>Fisher</td><td>50-121-5159</td><td></td></tr><tr><td>płytki 24-dołkowe</td><td>Fisher</td><td>08-772-1</td><td>BD Falcon</td></tr><tr><td>kwas azotowy</td><td>Ricca</td><td>R5326000</td><td>roztwór 20%</td></tr><tr><td>poli-L-lizyna</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19320-B</td><td>roztwór 0,1%</td></tr><tr><td>glutaraldehyd</td><td>Sigma</td><td>G7526</td><td>roztwór 8%</td></tr><tr><td>żelatyna sprzężona z Oregon Green 488</td><td>Invitrogen</td><td>G-13186</td><td></td></tr><tr><td>borowodorek sodu</td><td>Sigma</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>rodamina-falloidyna</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-kortaktyna (klon 4F11)</td><td>Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-FLAG</td><td>Millipore</td><td>MAB3118</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop konfokalny LSM 510</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie ImageJ</td><td>Domena publiczna</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.macbiophotonics.ca/imagej/&quot; target=&quot;_blank">http://www.macbiophotonics.ca/imagej/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>oprogramowanie AutoQuant X2.2</td><td>Media Cybernetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Inwazja komórkowa do tkanek lokalnych jest procesem istotnym w rozwoju i homeostazie. Nieprawidłowo regulowana inwazja i następujący po niej ruch komórek są charakterystyczne dla wielu procesów patologicznych, w tym stanów zapalnych, chorób sercowo-naczyniowych oraz przerzutów komórek nowotworowych1. Ogniskowa degradacja proteolityczna składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w błonie podstawnej nabłonka lub śródbłonka jest krytycznym krokiem w inicjowaniu inwazji komórkowej. W przypadku komórek nowotworowych szeroko zakrojone analizy in vitro wykazały, że degradacja ECM odbywa się za pośrednictwem brzusznych, bogatych w aktynę struktur wypukłych błony komórkowej, nazywanych invadopodiami2,3. Invadopodia tworzą się w bezpośrednim sąsiedztwie ECM, gdzie modulują jej rozkład poprzez działanie metaloproteinaz macierzy (MMPs). Zdolność komórek nowotworowych do tworzenia invadopodiów koreluje bezpośrednio ze zdolnością do inwazji do lokalnego zrębu oraz powiązanych z nim komponentów naczyniowych3.
Wizualizacja degradacji ECM przez komórki za pośrednictwem invadopodiów, przeprowadzana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z wykorzystaniem znakowanych barwnikiem białek macierzy naniesionych na szklane szkiełka coverglass, stała się najpowszechniejszą techniką oceny stopnia proteolizy macierzy oraz inwazyjnego potencjału komórek4,5. W niniejszej pracy opisujemy wersję standardowej metody wytwarzania fluorescencyjnie znakowanych szkiełek coverglass z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie koniugatu żelatyny Oregon Green-488. Metoda ta jest łatwo skalowalna, co pozwala na szybkie przygotowanie dużej liczby powlekanych szkiełek. Przedstawiamy niektóre z częstych artefaktów mikroskopowych, które często pojawiają się podczas tej procedury, oraz sposób ich unikania. Na koniec opisujemy znormalizowane metody z wykorzystaniem powszechnie dostępnego oprogramowania komputerowego, umożliwiające ilościową ocenę degradacji znakowanej macierzy żelatynowej pośredniczonej przez pojedyncze komórki oraz przez całe populacje komórkowe. Opisane procedury zapewniają możliwość dokładnego i powtarzalnego monitorowania aktywności invadopodiów i mogą służyć jako platforma do oceny skuteczności modulacji ekspresji białek lub testowania związków przeciwinwazyjnych w kontekście degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej w układach pojedynczych i wielokomórkowych.

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Inwazja komórkowa do tkanek lokalnych jest procesem istotnym w rozwoju i homeostazie. Zaburzenia regulacji inwazji i następującego po niej ruchu komórek prowadzą do...

Ta standardowa technika pozwala na przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną znakowaną fluorescencyjnie, które nadają się do ilościowych analiz degradacji macierzy przez inwazyjne podia. Po pokryciu szkiełek nakrywkowych żelatyną znakowaną fluorescencyjnie, należy wysiać komórki i inkubować je w celu degradacji macierzy. Następnie komórki należy utrwalić i zabarwić fluorescencyjnie pod kątem białek markerowych inwazyjnych podiów, a następnie pozyskać obrazy i ilościowo ocenić degradację macierzy.Typowe wyniki pozwalają na ilościowe określenie różnic w degradacji macierzy pośredniczonej przez podia pomiędzy komórkami poddanymi zróżnicowanej manipulacji wybranymi genami lub traktowaniu środkami farmakologicznymi. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych żelatyną z jednorodną fluorescencją jest trudne do osiągnięcia ze względu na nierównomierne pokrycie fluorescencyjną żelatyną lub niewłaściwe obchodzenie się z szkiełkami pokrytymi żelatyną. Procedurę zaprezentują adiunkt Karen Martin, pracownik postdoktorski Mandy Ammer oraz doktoranci Elise Walk, Karen Hayes i Steve Markwell.Aby przygotować nieoznakowany roztw

quantitative-measurement-invadopodia-mediated-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowe pomiaru proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej pośredniczonej przez inwadopodie w kontekście pojedynczych i wielokomorkowych

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Ten film opisuje technikę wykorzystania natywnej matrycy do badania inwazji komórek nowotworowych. Technika zastosowana w tym teście zapewnia możliwość oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych w warunkach 3D bez konieczności stosowania syntetycznej lub obcej matrycy.

Test inwazji komórek nowotworowych: natywna metoda 3D oparta na macierzy in vitro do oceny interakcji komórek nabłonkowo-mezenchymalnych

Ten film prezentuje ilościową mikroskopię poklatkową do oceny zależnej od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej rozprzestrzeniania się Listeria monocytogenes przez komórki śródbłonka. Bardziej miękki hydrożel ułatwia szybsze rozprzestrzenianie się bakterii przez komórki śródbłonka w porównaniu ze sztywniejszymi odpowiednikami, co podkreśla wpływ sztywności matrycy na rozprzestrzenianie się bakterii.

Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny rozsiewu bakterii zależnego od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej

Mikroreologia śledząca cząstki może być wykorzystana do nieniszczącego ilościowego i przestrzennego mapowania zmian właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D nowotworów.

Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Mechaniczna sztywność w mikrośrodowisku guza odgrywa kluczową rolę w napędzaniu złośliwych zachowań poprzez zwiększanie aktywności inwadopodii i kurczliwości aktomiozyny. Za pomocą żeli poliakrylamidowych (PAA), testy inwadopodiów i siły trakcyjnej można wykorzystać do badania właściwości inwazyjnych i kurczliwych komórek rakowych w odpowiedzi na sztywność matrycy.

Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół do ciągłego ilościowego oznaczania procesów adhezji i deadhezji komórek z wysoką rozdzielczością czasową w sposób nieinwazyjny poprzez impedancję substratu komórkowego i analizy obrazowania żywych komórek. Podejścia te ujawniają dynamikę procesów adhezji/deadhezji komórek wyzwalanych przez modyfikację matrycy i ich czasowy związek ze zdarzeniami sygnalizacyjnymi zależnymi od adhezji.

Wykorzystanie impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w adhezji komórkowej i deadhezji wywołanych modyfikacją matrycy

Ten protokół opisuje, jak przygotować mieszaną matrycę 2D, składającą się z żelatyny i kolagenu I, oraz wtyczkę 3D kolagenu I do badania liniowych inwadosomów. Protokoły te pozwalają na badanie liniowego tworzenia inwadosomu, aktywności degradacji macierzy oraz zdolności inwazji komórek pierwotnych i linii komórek rakowych.

Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

Wiele genów o podwyższonej regulacji stymuluje migrację i inwazję komórek nowotworowych, co prowadzi do złych rokowań. Określenie, które geny regulują migrację i inwazję komórek nowotworowych, ma kluczowe znaczenie. Protokół ten przedstawia metodę badania wpływu zwiększonej ekspresji genu na migrację i inwazję komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym.

Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Poznaj metodę ilościowej analizy proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej za pośrednictwem inwadopodiów w kontekstach jedno- i wielokomórkowych. Technika obejmuje przygotowanie powłok żelatynowych znakowanych fluorescencyjnie, hodowlę komórek, barwienie oraz kwantyfikację degradacji macierzy.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Przeglądaj więcej filmów