Name: Izolacja i hodowla komórek grzebienia nerwowego z embrionalnej mysiej cewy nerwowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek grzebienia nerwowego z embrionalnej mysiej cewy nerwowej bez użycia FACS ani warstw karmicielskich. Protokół zapewnia około 96% czystość populacji komórek NC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Marcowi Wozniakowi za pomoc przy nagrywaniu wideo. Chcielibyśmy również podziękować Seanowi Morrisonowi z UT Southwestern za oryginalny protokół hodowli komórek NC szczura. Praca ta była wspierana przez Vanderbilt University Medical Center Academic Program Support oraz granty z NIH (HD36720 i HD036720-11S109) i AHA 11GRNT7690040 dla PAL, stypendia przeddoktoranckie z AHA (0615209B) i NIH (NS065604) dla NAM, a ERP otrzymał wsparcie z grantu szkoleniowego NIH T32HD007502.

1. Przygotowanie płytek
<ol>
 <li> Przez cały czas stosować technikę sterylną. </li>
 <li> Przygotować fibronektynę (FN), rozcieńczając 100 μL zapasu ludzkiej plazmowej FN do końcowej objętości 3,3 mL w buforze PBS Dulbecco (dPBS). Stężenie końcowe wynosi 30 μg/mL; roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień. </li>
 <li> Przykryć dno każdego dołka w sterylnej czterodołkowej płytce do hodowli tkankowych roztworem FN i pozostawić na 15 minut. Należy upewnić się, że cała powierzchnia jest pokryta. W tym czasie przygotować pożywki (kroki 2 i 3). </li>
 <li> Usunąć roztwór FN i pozwolić płytkom wyschnąć. Delikatnie wypłukać dołki 500 μL DMEM, usunąć DMEM i dodać 500 μL pożywki do samoodnowy (SR) (patrz poniżej). Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i zawartością 5 procent CO2. Czynność tę należy wykonać około godziny przed sekcją, aby płytki były suche przed użyciem. </li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki SR
<ol>
 <li>Do hodowli komórek grzebienia neuronalnego (NC) z obszaru błędnego i tułowia pochodzących z dziesięciu embrionów (około jednego miotu, w zależności od tła genetycznego linii myszy), przygotować 25 mL pożywki SR. Połączyć 12,5 mL DMEM z niską zawartością glukozy, 7,5 mL pożywki Neurobasal, 25 μL kwasu retinowego (stężenie końcowe 117 μM) oraz 25 μL 2-merkaptoetanolu (stężenie końcowe 50 mM). Dobrze wymieszać.</li>
 <li>Dodać 3,75 mL ekstraktu z embrionu kurczaka, 250 μL suplementu soli N2, 500 μL suplementu B27 oraz 250 μL penicyliny-streptomycyny (stężenie końcowe 1%). Przefiltrować pożywkę przez filtr 0,22 μm.</li>
 <li>Dodać 10 μL sterylnego IGF1 (stężenie końcowe 20 μg/mL) oraz 20 μL sterylnego bFGF (stężenie końcowe 20 μg/mL). Wymieszać poprzez odwracanie naczynia. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie medium piorącego
<ol>
 <li> Dla około 10 embrionów przygotować 50 mL medium piorącego. Połączyć 50 mg BSA z 35 mL DMEM z niską zawartością glukozy, 15 mL medium Neurobasal oraz 500 μL penicyliny-streptomycyny (stężenie końcowe 1%). Przefiltrować sterylnie za pomocą filtra 0,22 μm. </li>
</ol>
4. Przygotowanie kolagenazy/dispazy
<ol>
 <li>Dodaj 50 μL kolagenazy/dispazy o stężeniu 100 mg/mL do 5 mL dPBS. Wymieszaj dokładnie.</li>
 <li>Przefiltruj roztwór za pomocą strzykawki z filtrem 0,2 μm i dodaj 1,5 mL do każdej z trzech studzienek płytki dwunastodołkowej. Do pozostałych studzienek pipetuj około 1 mL medium do przemywania. Przechowuj całą płytkę na lodzie do momentu rozpoczęcia trawienia wypreparowanej tkanki.</li>
 <li>Odetnij końcówki filtrów do pipety p20 i p1000 za pomocą sterylnego ostrza żyletki. Cięcie wykonaj tuż poniżej ściętej krawędzi końcówki. Odetnice końcówki p1000 posłuży do przenoszenia całego zarodka, natomiast p20 do przenoszenia fragmentów wyizolowanej tkanki.</li>
</ol>
5. Izolowanie nerwowej rurki nerwowej z obszarów błędnych i tułowia z embrionów w 9,5 dpc
<ol>
 <li> W przypadku ciąż o określonym czasie, samice z czopem pochwawym są uznawane za 0,5 dpc w południe w dniu, w którym zaobserwowano czop. Eutanazuj samice i wyjmij macicę w 9,5 dpc. </li>
 <li> Oddziel deciduę od macicy, a następnie ostrożnie wyjmij zarodek z deciduy. Po nabyciu wprawy w tym protokole, izoluj od 3 do 4 zarodków w stadium 9,5 dpc jednocześnie w sterylnym dPBS. Stosuj technikę sterylną i wysterylizowane narzędzia do sekcji. Narzędzia można sterylizować w autoklawie, za pomocą sterylizacji termicznej lub poprzez inkubację w etanolu. </li>
 <li> W celu izolacji przednich grzebieni NC: używając igieł insulinowych, przetnij rurkę neuralną na wysokości środkowej placody słuchowej. Przetnij ponownie na tylnej krawędzi 4th somitu. Odetnij tkankę brzuszną względem rurki neuralnej, aby usunąć łuki gardłowe i serce. </li>
 <li> W celu izolacji NC tułowia: używając igieł insulinowych, usuń fragment rurki neuralnej między somitami 16-22 (lub do ostatniego somitu, jeśli zarodki są w wcześniejszym stadium rozwoju niż etap 22 somitów). </li>
 <li> Zachowaj worek żółtkowy oraz wszelkie pozostałe tkanki zarodkowe do genotypowania.</li>
</ol>
6. Usuwanie ektodermy nie neuronalnej i mezodermy
<ol>
 <li> Umieścić rurkę neuralną zawierającą segmenty w kolagenazie/dispazie w temperaturze pokojowej na 10 minut. Natychmiast przemyć w medium do mycia. </li>
 <li> Przenieść tkankę z powrotem do sterylnego dPBS. Używając sterylnych igieł insulinowych, delikatnie usunąć ektodermę pozaneuralną z tkanki i oddzielić somity od rurki neuralnej. Pozostałe części mezodermy z tkanki somitów można usunąć poprzez delikatne trituracje za pomocą przyciętej końcówki p20. Należy uważać, aby nie uszkodzić rurki neuralnej. Ściśle monitorować ten proces podczas trituracji. </li>
 <li> Poddać wyizolowaną rurkę neuralną drugiemu i trzeciemu 30-sekundowemu myciu w medium do mycia.</li>
 <li> Przemyć raz w medium SR i umieścić wyizolowaną rurkę neuralną w centrum wcześniej przygotowanej studni pokrytej FN (Krok 1.3). Nawilżyć komorę hipoksyczną za pomocą naczynia ze sterylną wodą. Umieścić naczynie w komorze hipoksycznej i przepłukać komorę mieszaniną gazów do uzyskania stężenia 3% O2 (użyć butli zawierającej mieszaninę 1% O2, 6% CO2, 93% N2). </li>
 <li> Zawsze obchodzić się z komorą niezwykle ostrożnie, aby upewnić się, że eksplanty nie zostaną poruszone i pozostaną w centrum studni. </li>
 <li> Inkubować w temperaturze 37 °C. Podsumowanie kroków 5-6 przedstawiono na Rysunku 1.</li>
</ol>
7. Usunięcie rurki neuralnej
<ol>
 <li> Po 24 godzinach inkubacji usuń rurkę neuronową, delikatnie oddzielając jej krawędź od migrujących komórek za pomocą sterylnej igły insulinowej. Wyjmij i odrzuć rurkę neuronową z pożywki, używając sterylnej pipety p20 zgodnie z opisem w kroku 6.2, a następnie wymień pożywkę na świeżą pożywkę SR (Rysunek 2). Czynność tę najłatwiej jest wykonać przy użyciu mikroskopu odwróconego. </li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C w warunkach hipoksji komórki NC migrują z rurki neuralnej, tworząc niemal czystą populację (Rysunek 3a). Czasami hodowle o mniej niż idealnych parametrach nie wykazują silnego odrostu. Na przykład możliwe jest, że po 24 godzinach rurka neuralna zawinie się w sobie, a komórki NC nie odmigrują z rurki neuralnej (Rysunek 3b). Sporadycznie zdarza się, że rurka neuralna nie przylega do płytek powlekanych fibronektyną. 
W naszym doświadczeniu nieoptymalna migracja NC lub problemy z przyleganiem rurki neuralnej mogą być niekorzystnie wpływane odpowiednio przez warunki normoksji lub stężenie fibronektyny. Aktywność enzymatyczna kolagenazy/dispazy różni się nieznacznie w zależności od partii i czas trawienia musi zostać odpowiednio dostosowany, jednak nie należy trawić tkanki dłużej niż przez piętnaście minut. Nadmierne trawienie tkanki zawierającej rurkę neuralną w kolagenazie/dispazie również doprowadzi do niedostatecznego wzrostu wypustek. Jeśli tkanka somytów nie daje się łatwo usunąć z rurki neuralnej po inkubacji w kolagenazie/dispazie, rurkę neuralną można inkubować dłużej niż dziesięć minut. Czasami rurka neuralna nie przylega do podłoża. W takim przypadku należy ponownie sprawdzić stężenie fibronektyny oraz warunki hipoksji.
Podczas gdy warunki normoksji mogą być stosowane do hodowli komórek grzebienia neuronalnego (NC) typu dzikiego, warunki hipoksji dokładniej odwzorowują środowisko in vivo29,30. W naszym doświadczeniu warunki hipoksji stały się krytyczne podczas hodowli zmutowanych NC. Na przykład, gdy zmutowane NC Foxd3 były hodowane w warunkach normoksji, NC tułowia wykazywały znacznie zredukowany wzrost komórek w porównaniu z grupą kontrolną. Ta różnica w rozmiarze wzrostu została zniesiona, gdy eksplanty hodowano w warunkach hipoksji (Rysunek 4). Ponadto, gdy eksplanty rurki neuralnej typu dzikiego hodowano w normoksji, liczba komórek pozytywnych pod kątem kaspazy była większa niż w przypadku podobnych eksplantów hodowanych w hipoksji (dane nie przedstawiono). Dzięki utrzymaniu wszystkich hodowli NC w hipoksji można łatwiej porównać dynamikę hodowli kontrolnych i zmutowanych.
<img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig1.jpg" alt="Schemat preparatyki rurki neuralnej; kolagenaza, etapy płukania; konfiguracja samoodnowienia; proces hodowli komórkowej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ogólny schemat izolacji NC. A) Wycięcie obszarów zainteresowania z zarodka. B) Trawienie rurki neuralnej w kolagenazie/dispazie przez dziesięć minut (nie przekraczać piętnastu minut). C) Płukanie w medium do płukania. D) Wycięcie ektodermy pozaneuralnej i mezodermy. E-F) Dwukrotne płukanie w medium do płukania. G) Wysiew na medium do samoodnowienia. Inkubacja w 37 °C w warunkach hipoksji 3% O2.
<img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig2.jpg" alt="Etapy rozwoju NT na obrazach mikroskopowych; struktura komórkowa, wzrost, zmiany morfologiczne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Etapowe usuwanie cewy nerwowej z eksplantu. Cewę nerwową należy usunąć po 24-48 godzinach, aby zapobiec kontaminacji komórkami innymi niż NC. A) Zauważ granicę między cewą nerwową a wypustką NC (linia ciągła). B) Przetnij wzdłuż krawędzi cewy nerwowej za pomocą igły insulinowej. C) Usuń cewę nerwową i wymień pożywkę na świeżą pożywkę do samoodnowy. Linia przerywana wskazuje zasięg wypustki. Skrót: NT, cewka nerwowa.
<img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig3.jpg" alt="Mikroskopowy obraz tkanki nerwowej, schemat klastra komórek, analiza neurorozwoju, wyniki eksperymentu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przykłady reprezentatywnych wyników. A) Typowy wzrost eksplantu po 24 godzinach inkubacji w pożywce do samoodnawiania w warunkach hipoksji (linia przerywana wskazuje zasięg wzrostu). B) Powiększony widok wzrostu NC po 48 godzinach hodowli. C) Mniej optymalna hodowla z niską wydajnością wzrostu. Próbki A i C były hodowane w tych samych warunkach. Obrazy demonstrują naturalny zakres stabilności hodowli. Może on być uwarunkowany wydajnością izolacji cewy nerwowej, stężeniem FN, warunkami hipoksji oraz czasem trawienia kolagenazą/dispazą. 
<img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig4.jpg" alt="Równowaga statyczna; porównanie wzrostu komórek w warunkach normoksji i hipoksji; obrazy z mikroskopii; mutant Foxd3." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Analizy in vitro kultur eksplantów grzebieni neuralnych (NC) w warunkach normoksji i hipoksji. Kontrolne komórki NC (typ dziki) migrowały z eksplantów rurki neuralnej po 48 godzinach w warunkach hodowli normoksycznej. W przeciwieństwie do nich, mutanty Foxd3 NC wykazywały znacznie ograniczony wzrost komórek w normoksji (czerwone obrysy wyznaczają krawędzie wzrostu NC). Gdy analogiczne eksplanty hodowano w warunkach hipoksji, eksplanty mutantów Foxd3 NC rosły w stopniu porównywalnym do kontroli, co umożliwiło dalsze analizy. Należy zauważyć, że zachowanie to korelowało z zachowaniem mutantów Foxd3 NC in vivo.

<ol><li>Le Douarin, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLe+Douarin%2C+N+%22The+neural+crest%22">The neural crest</a>. , 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).</li>
<li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+migration%3A+patterns%2C+phases+and+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Developmental biology. 344, 566-568 (2010).</li>
<li>Saint-Jeannet, J. -P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaint-Jeannet%2C+J-P+%22Neural+crest+induction+and+differentiation%22">Neural crest induction and differentiation</a>. , Springer Science+Business Media, Landes Bioscience/Eurekah.com. (2006).</li>
<li>Plank, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+and+timing+of+arrival+of+murine+neural+crest+on+pancreatic+beta+cell+development+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation.</a> Developmental biology. 349, 321-330 (2011).</li>
<li>Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+neural+crest+regulate+beta-cell+mass+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas.</a> Development. 135, 2151-2160 (2008).</li>
<li>Freem, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intrinsic+innervation+of+the+lung+is+derived+from+neural+crest+cells+as+shown+by+optical+projection+tomography+in+Wnt1-Cre%3BYFP+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice.</a> J. Anat. 217, 651-664 (2010).</li>
<li>Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+approach+to+the+problem+of+neural+crest+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A clonal approach to the problem of neural crest determination.</a> Developmental biology. 46, 262-280 (1975).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+quail+neural+crest+cells%3A+they+are+pluripotent+and+differentiate+in+vitro+in+the+absence+of+noncrest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells.</a> Developmental biology. 80, 96-106 (1980).</li>
<li>Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+precursors+for+neural+and+mesectodermal+derivatives+in+the+cephalic+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest.</a> Development. 112, 301-305 (1991).</li>
<li>White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+cells+undergo+cell-intrinsic+developmental+changes+in+sensitivity+to+instructive+differentiation+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals.</a> Neuron. 29, 57-71 (2001).</li>
<li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification%2C+isolation+by+flow+cytometry%2C+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+avian+neural+crest%3A+migration+and+maturation+of+mixed+neural+crest+clones+injected+into+host+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos.</a> J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
<li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li>
<li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skin-derived+precursors+%28SKPs%29+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).</li>
<li>Chung, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+property+of+postmigratory+cranial+neural+crest+cells+and+their+utility+in+alveolar+bone+regeneration+and+tooth+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development.</a> Stem Cells. 27, 866-877 (2009).</li>
<li>Biernaskie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKPs+derive+from+hair+follicle+precursors+and+exhibit+properties+of+adult+dermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).</li>
<li>Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P0+and+PMP22+mark+a+multipotent+neural+crest-derived+cell+type+that+displays+community+effects+in+response+to+TGF-beta+family+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors.</a> Development. , 126-3781 (1999).</li>
<li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+and+isolation+of+enteric+nervous+system+progenitors+using+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2.</a> Stem Cells. 29, 128-140 (2011).</li>
<li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+in+reduced+levels+of+oxygen+promotes+clonogenic+sympathoadrenal+differentiation+by+isolated+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells.</a> J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).</li>
<li>Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+clonal+analysis+of+mouse+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">In vitro clonal analysis of mouse neural crest development.</a> Developmental biology. 157, 517-525 (1993).</li>
<li>Etchevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+chick%2C+mouse+or+human+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells.</a> Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).</li>
<li>Mundell, N. A., Labosky, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+cell+multipotency+requires+Foxd3+to+maintain+neural+potential+and+repress+mesenchymal+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates.</a> Development. 138, 641-652 (2011).</li>
<li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2%2Fsemaphorin+3F+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development. 133, 99-106 (2006).</li>
<li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+2%2Fsemaphorin+3F+signaling+is+essential+for+cranial+neural+crest+migration+and+trigeminal+ganglion+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation.</a> Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).</li>
<li>Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrins+and+N-cadherin+coordinate+to+control+the+pattern+of+sympathetic+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia.</a> Development. 133, 4839-4847 (2006).</li>
<li>Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin%2Fneuropilin+signaling+influences+the+positioning+of+migratory+neural+crest+cells+within+the+hindbrain+region+of+the+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick.</a> Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).</li>
<li>Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+signaling+guides+neural+crest+cells+to+coordinate+pathway+choice+with+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).</li>
<li>Simon, M. C., Keith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxygen+availability+in+embryonic+development+and+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).</li>
<li>Ivanovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+or+in+situ+normoxia%3A+The+stem+cell+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm.</a> J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Aby zapewnić sukces tego podejścia, należy zwrócić szczególną uwagę na stopień rozwoju zarodka. Liczenie somytów we wczesnych zarodkach myszy jest kluczowe zarówno dla dopasowania stadium rozwoju zarodków w obrębie jednego miotu, jak i dla wyznaczenia prawidłowych obszarów rurki nerwowej do izolacji. Różnica jednego lub dwóch somytów między zarodkami mieści się w dopuszczalnym zakresie czasu rozwoju, w zależności od wymaganej rozdzielczości prowadzonego eksperymentu. Zarodek w wieku od 9 do 9,5 dpc będzie miał od 17 do 2...

<table><tbody><tr><td>DMEM (niska zawartość glukozy)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Neurobasal</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912-10G</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>IGF1</td><td>BD Biosciences</td><td>354037</td><td>Przechowywać w alikwotach 50 &amp;#x03BC;g/mL</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td>Przechowywać w alikwotach 25 &amp;#x03BC;g/mL</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>Przechowywać w alikwotach 1mg/mL</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Rozpuścić w etanolu, przygotować alikwoty 35 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>2-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5637</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Filtry Steriflip 0,22 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Filtry 0,20 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki (do filtracji)</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>Płytki czterodołkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza/Dyspaza</td><td>Roche Group</td><td>269 638</td><td>Aktywność różni się w zależności od partii. Przechowywać w alikwotach 100 mg/mL.</td></tr><tr><td>Igły insulinowe (rozmiar 29 &amp;frac12; G)</td><td>BD Biosciences</td><td>309306</td><td></td></tr><tr><td>Komora hipoksyczna</td><td>Billups-Rothenberg, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizator tlenu</td><td>Billups-Rothenberg, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceta nr 5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Do usuwania macicy i błony decidualnej.</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla komórek grzebienia neuronalnego z zarodkowej rurki nerwowej myszy

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Zarodkowa grzebień neuronalny (NC) jest multipotentną populacją prekursorową, która powstaje w grzbietowej części rurki nerwowej, przechodzi przejście epitelialno-mezenchymalne (EMT) i migruje przez cały embrion, dając początek różnym typom komórek 1-3. NC posiada również wyjątkową zdolność wpływania na różnicowanie i dojrzewanie organów docelowych4-6. Po wyizolowaniu in vitro, prekursory NC ulegają samoodnawianiu, migrują i różnicują się w różne typy tkanek, w tym w neurony, glej, komórki mięśni gładkich, chrząstkę i kość.
Wielopotencjalność NC została po raz pierwszy opisana na przykładach eksplantów rurki nerwowej ptaków7-9. Izolacja komórek NC in vitro ułatwia badanie dynamiki NC, w tym proliferacji, migracji i wielopotencjalności. Dalsze prace w systemach ptasich i szczurzych wykazały, że eksplantowane komórki NC zachowują swój potencjał NC po ponownym przeszczepieniu do embrionu10-13. Ponieważ te wrodzone właściwości komórkowe są zachowane w eksplantowanych progenitorach NC, test z eksplantem rurki nerwowej stanowi atrakcyjną opcję badania NC in vitro.
Aby lepiej zrozumieć naturę ssaczych NC, zastosowano wiele metod izolacji populacji NC. Progenitory pochodzące z NC mogą być hodowane z lokalizacji pomigracyjnych zarówno w embrionie, jak i u osobników dorosłych, w celu zbadania dynamiki pomigracyjnych progenitorów NC11,14-20; jednak izolacja progenitorów NC w momencie ich emigracji z rurki neuralnej zapewnia optymalne zachowanie potencjału komórek NC oraz ich właściwości migracyjnych13,21,22. Niektóre protokoły wykorzystują fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) w celu wyizolowania populacji NC wzbogaconej o konkretne progenitory11,13,14,17. Jednak w przypadku rozpoczynania pracy z embrionami we wczesnym stadium, trudno jest uzyskać za pomocą FACS liczbę komórek wystarczającą do analiz, co komplikuje izolację wczesnych populacji NC z pojedynczych embrionów. W niniejszej pracy opisujemy podejście, które nie opiera się na FACS i pozwala uzyskać populację NC o czystości około 96%, w oparciu o aktywowany przez Wnt1-Cre reporter linii komórkowej23.
Metoda przedstawiona w niniejszej pracy została zaadaptowana z protokołów zoptymalizowanych dla hodowli komórek NC szczura11,13. Zaletą tego protokołu w porównaniu z wcześniejszymi metodami jest to, że 1) komórki nie są hodowane na warstwie karmionej, 2) do uzyskania względnie czystej populacji NC nie jest wymagana metoda FACS, 3) izolowane są premigracyjne komórki NC oraz 4) wyniki są łatwe do ilościowego określenia. Ponadto protokół ten może być wykorzystany do izolacji NC z dowolnego mutantowego modelu mysiego, co ułatwia badanie charakterystyki NC przy różnych manipulacjach genetycznych. Ograniczeniem tego podejścia jest usunięcie NC z kontekstu zarodka, co jak wiadomo wpływa na przeżywalność, migrację i różnicowanie NC2,24-28.

Izolacja embrionalnej grzebieni neuralnej z rurki neuralnej umożliwia zastosowanie metod in vitro do badania migracji, samoodnawiania oraz multipotencji grzebieni neuralnej.

Izolacja i hodowla komórek grzebienia neuronalnego z zarodkowej rurki nerwowej myszy

Zarodkowa grzebień neuronalny (NC) to multipotentna populacja progenitorów, która powstaje w grzbietowej części rurki neuralnej, przechodzi przejście z nabłonka w...

Zarezerwuj trzy godziny na przeprowadzenie tego protokołu. Po nabyciu doświadczenia realizacja protokołu powinna zająć od półtorej do dwóch godzin, w zależności od liczby poddanych sekcji embrionów. Protokół ten opisuje sposób pobrania embrionu z 9,5 dnia po zapłodnieniu, przeciętego na poziomie środkowej blaszki ucha i czwartego somitu, w celu wyizolowania tkanki zawierającej nerwową rurkę błędną. Cięcie.W 16. i 22. godzinie izolowane będzie tkanki zawierające rurkę neuralną tułowia. Grzbietowe komórki grzebienia neuralnego migrują z rurki neuralnej obszaru błędnego. Podczas gdy komórki grzebienia neuralnego tułowia migrują z rurki neuralnej tułowia, wypreparowana tkanka zostanie poddana trawieniu enzymatycznemu w roztworze kolagenazy, przemyta, a nie-neuralna epiderm i mezoderm zostaną usunięte drogą dyssekcji.Wyizolowana rurka kostna zostanie przemyta jeszcze dwukrotnie, a następnie wysiana w medium do samoodnawiania. Jestem Elise Graph z Laboratorium Bosky na Uniwersytecie Vanderbilt. Dzisiaj zaprezentuję, jak izolować grzebień neuronalny z rurki kostnej w hodowli eksplantacyjnej.Technika ta pozwoli na badanie charakterystyki grzebienia neuronalnego in vitro. Zacznijmy. W pierw

isolation-culture-neural-crest-cells-from-embryonic-murine-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolacja i hodowlania komórek grzebienia nerwowego z zarodkowej mysiej rury nerwowej

W tym filmie opisano metodę izolacji neuroprekursorów z rozwijającej się kory zarodków myszy. Przedstawiono procedurę usuwania zarodków z macicy, wycinania tkanki korowej oraz trawienia wyizolowanej kory mózgu.

Hodowla prekursorów neuronalnych komórek macierzystych myszy

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę izolacji mysich komórek macierzystych grzebienia neuronalnego naskórka (EPI-NCSC). Technika ta polega na mikrodysekcji mieszków włosów wibrysów, izolacji wybrzuszenia (bulge) i umieszczeniu go w hodowli tkankowej. EPI-NCSC zaczynają emigrować z eksplantów wybrzuszenia na podłoże w ciągu 3 - 4 dni.

Hodowle mysich macierzystych komórek grzebienia neuronalnego naskórka (EPI-NCSC)

Do hodowli komórek macierzystych grzebienia neuronalnego (NCSC) in vitro wymagane jest specjalne medium (NCSCM). Niezbędnym składnikiem NCSCM jest ekstrakt z embrionu kurczaka (CEE). Opisujemy tutaj precyzyjne techniki pozwalające na uzyskanie maksymalnej ilości czystego i wysokiej jakości CEE, w tym szczegóły dotyczące procesów izolacji, maceracji, wirowania oraz filtracji.

Wytwarzanie ekstraktu z zarodka kurczaka do hodowli mysich komórek macierzystych grzebienia neuronalnego

Niniejszy artykuł przedstawia wiarygodny protokół izolacji i hodowli komórek macierzystych grzebienia neuronalnego z ludzkich mieszków włosowych.

Izolacja i hodowla komórek macierzystych grzebienia neuronalnego z ludzkich mieszków włosowych

Ten film ilustruje technikę izolowania fałdów nerwowych czaszki od śródmózgowia zarodków piskląt. Przedstawiono szczegółowy proces rozwarstwiania fałdów nerwowych, ich rozmieszczenia i mocowania na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, a następnie obserwację migracji komórek grzebienia nerwowego z fałdów nerwowych.

Izolowanie fałdów nerwowych czaszki od zarodka kurcząt w celu hodowli komórek grzebienia nerwowego

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę komórek grzebienia nerwowego czaszki z modeli mysich, głównie do badania migracji komórek. Opisujemy stosowane techniki obrazowania na żywo oraz analizę zmian prędkości i kształtu komórek.

Sekcja, hodowla i analiza pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki od myszy w celu zbadania delaminacji i migracji komórek grzebienia nerwowego

Ten wszechstronny protokół opisuje izolację premigrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) poprzez wycięcie fałdów nerwowych czaszki z zarodków piskląt. Po posiewie i inkubacji migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych, co pozwala na ocenę morfologii i migracji komórek w uproszczonym środowisku 2D.

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Ten protokół przedstawia eksperyment migracji in vitro odpowiedni do analizy funkcjonalnej cząsteczek biorących udział w migracji in vivo komórek grzebienia nerwowego do bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej.

In vitro Badanie wpływu bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej na migrację komórek grzebienia nerwowego

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) protokół różnicowania in vitro, generujący neurosfery o powtarzalnych rozmiarach do produkcji komórek grzebienia nerwowego czaszki z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Pokazujemy, że ta metodologia zmniejsza zmienność w porównaniu z poprzednimi protokołami i jak można ją wykorzystać do testu multipleksowego do badania rozwoju komórek grzebienia nerwowego czaszki.

Komórki grzebienia nerwowego czaszki Trójwymiarowy protokół różnicowania in vitro do testu multipleksowego

Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek grzebienia nerwowego z embrionalnej mysiej cewy nerwowej bez użycia FACS ani warstw karmicielskich. Protokół zapewnia około 96% czystość populacji komórek NC.

Izolacja i hodowla komórek grzebienia neuronalnego z zarodkowej rurki nerwowej myszy

Przeglądaj więcej filmów