Ekstrakty jądrowe na małą skalę do funkcjonalnych testów maszyn do ekspresji genów
June 27th, 2012
Opisano protokół przygotowania solidnych, małych ekstraktów jądrowych HeLa. Protokół ten jest cenny w przypadku testów, które wymagają użycia małych populacji komórek, takich jak komórki leczone lekami lub RNAi. Metoda ta powinna mieć zastosowanie do szerokiej gamy testów ekspresji genów i innych typów komórek, w tym komórek pacjenta.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest oznaczenie ekspresji genów przy użyciu funkcjonalnych maszyn jądrowych wyekstrahowanych z komórek. Osiąga się to poprzez pierwsze zebranie w pęcznieniu komórek hela. Następnie komórki są splecione przez downing, a następnie odwirowane w celu osadzenia jąder w trzecim etapie.
Jądra są ekstrahowane, zagęszczane i dializowane w celu uzyskania rozpuszczalnych i funkcjonalnych mechanizmów ekspresji genów. Ostatecznie funkcjonalność ekstraktów jądrowych można ocenić na podstawie ich aktywności transkrypcji i splicingu, ocenianych za pomocą sprzężonej polimerazy RNA z systemem transkrypcji i splicingu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przygotowanie ekstraktu z jąder masowych, jest to, że dzięki tej technice do przygotowania ekstraktu jąder można użyć niewielkiej ilości komórek.
Zacznij od posiewu komórek hela na trzech 150-milimetrowych płytkach z pożywką DMEM uzupełnioną FBS i antybiotykami, hoduj kultury w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2, aż komórki osiągną płynność 90%Co, w tym momencie odessaj pożywkę z kultur komórkowych HELOC i umyj je raz 13 mililitrami temperatury pokojowej. PBS na płytkę, a następnie aspirować. PBS stoi każdą płytką na boku przez kilka sekund i zasysa resztę PBS.
Następnie użyj podnośnika komórek, aby zeskrobać komórki do dolnej krawędzi każdej płytki, a następnie wciągnij komórki do 1,5-mililitrowej rurki einor. Na koniec granuluj komórki w mikro fuge przez pięć minut w temperaturze sto razy G i w czterech stopniach Celsjusza. Teraz odessać PBS z osadu komórkowego i oszacować objętość upakowanych komórek lub PCV, patrząc na gradację na probówce.
Następnie dodać do osadu komórkowego dwukrotność objętości buforu hipotonicznego niż PCV. Delikatnie potrząśnij tubką, aby ponownie zawiesić. Komórki delikatnie pipetują zawiesinę komórek w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby w razie potrzeby usunąć skupiska komórek.
Następnie osadzaj komórki w tych samych warunkach wirowania, co poprzednio. Po odwirowaniu ostrożnie odessać hipotoniczną warstwę buforową. Komórki zaczną pęcznieć, a objętość komórek wzrośnie do około 750 do 1000 mikrolitrów.
Dodaj nowy bufor hipotoniczny do końcowej objętości 1,5 mililitra i ponownie zawieś komórki w buforze. Znów. Na koniec inkubuj ponownie zawieszone, spuchnięte komórki na lodzie przez 10 minut, podczas gdy komórki się schładzają. Wypłucz homogenizator puchowy buforem hipotonicznym, a następnie umieść go na lodzie wraz z komórkami.
Następnie za pomocą delikatnej wycieraczki roboczej, takiej jak chusteczka Kim, wysusz tłuczek. Użyj przedłużonej końcówki mikropipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby usunąć bufor z dołków. Teraz użyj pipety, aby przenieść schłodzone, spuchnięte komórki do puchu w dół.
Jest najtrudniejszą częścią tej procedury, aby wejść pomyślnie Sprawdź pod kątem lizy. Po każdym upadku pod mikroskopem powoli przesuń ciasny tłuczek puchów pięć razy w górę iw dół, aby usunąć z komórek, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Następnie przenieś pięciomikrolitrową Eloqua zawiesiny komórek lys do probówki einor i dodaj 10 mikrolitrów błękitu trianowego i 15 mikrolitrów jednego XPBS.
Dodaj roztwór komórkowy do szkiełka i zbadaj komórki pod mikroskopem świetlnym pod kątem lizy, jądra komórek lys staną się niebieskie po trzech uncjach. Nie ma wystarczającej ilości lizy, ponieważ widoczne są liczne żywe komórki. Po pięciu uncjach jest wystarczająca ilość lizy.
Na koniec przenieś komórki lys do wstępnie schłodzonej probówki einor i wiruj zawiesinę komórek przez pięć minut w mikro fuge w temperaturze 1500 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Następnie ostrożnie przenieś super natin do nowej tuby, nie naruszając przy tym granulki. Teraz oszacuj objętość jądra plamy lub PNV, patrząc na gradację na rurce.
Napełnij końcówkę mikropipety buforem o niskiej zawartości soli w połowie PNV. Następnie włóż końcówkę mikropipety do jąder na dnie probówki einor. Powoli wstrzykując bufor do jąder, delikatnie mieszając.
Delikatnie przesuń rurkę, aby upewnić się, że granulka jest całkowicie zawieszona. Następnie dodaj bufor o wysokiej zawartości soli w połowie PNV i szybko wymieszaj jeden raz, odwracając probówkę. Obracaj rurkę przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Na koniec wiruj jądra w mikro fuge przez 15 minut w temperaturze 18 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Zacznij od przeniesienia 500 mikrolitrów supernatantu do schłodzonych mikrokontorów. Odwiruj ekstrakt jądrowy o wysokiej zawartości soli przez 15 minut w temperaturze 14 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza po odwirowaniu, odwróć mini racon i umieść go w nowej, pojedynczej probówce EOR.
Po wirowaniu przez dwie minuty w temperaturze 1000 razy G i czterech stopniach Celsjusza, ekstrakt jądrowy o wysokiej zawartości soli zostanie skoncentrowany do około 115 mikrolitrów. Teraz przenieś 45 mikrolitrów podwielokrotności ekstraktu jądrowego o wysokiej zawartości soli do mini dializ SLI. Upewnij się, że spód szkiełka znajduje się z dnem pływaka.
Następnie umieścić SLI w 500 mililitrach schłodzonego buforu do dializy. Na koniec mieszaj porcje przez jedną do dwóch godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ekstrakt jądrowy po dializie będzie wyglądał na mętny. Ten rysunek przedstawia reprezentatywne dane porównujące sprzężoną polimerazę RNA, dwie reakcje transkrypcji i krojenia w ekstrakcie jądrowym na małą skalę z ekstraktem jądrowym na dużą skalę.
Gdy konstrukt A-C-M-V-D-N-A inkubowano w ekstraktach masowych lub na małą skalę, podobne poziomy powstającego pre mRNA zostały zsyntetyzowane w ciągu pięciu minut po dodaniu alfa i maniny w celu zablokowania dalszej transkrypcji, półprodukty splicingu i produkty splicingu gromadziły się w czasie z podobną kinetyką w obu typach ekstraktów. Te reprezentatywne wyniki potwierdzają, że wydajność systemu transkrypcji i splicingu sprzężonej polimerazy RNA jest podobna w ekstraktach jądrowych masowych i małoskalowych. Aby zademonstrować użyteczność ekstraktu na małą skalę, przygotowano ekstrakty metodą z komórek hela potraktowanych inhibitorem splicingu E 7 1 0 7 lub ujemnym związkiem kontrolnym Platy analy F, a następnie przeprowadzono sprzężoną polimerazę RNA dwa transkrypcje i test splicingu, jak wykazano na tym rysunku, transkrypcja przez polimerazę RNA dwa występowała skutecznie w ekstraktach przygotowanych zarówno z plaid F, jak i E 7 1 0 7 poddanych działaniu Komórek.
W przeciwieństwie do tego, splicing występował normalnie w ekstrakcie przygotowanym z komórek poddanych działaniu analizy F, ale został zniesiony w komórkach poddanych działaniu E 7 1 0 7. Dane te dostarczają dowodów na słuszność koncepcji wykorzystania ekstraktów jądrowych na małą skalę do specjalnej obróbki komórek w małej skali. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w mniej niż pięć godzin.
Overview
Ten artykuł opisuje protokół przygotowywania wytrzymałych, małoskalowych ekstraktów jądrowych komórek HeLa, który jest cenny dla testów wymagających małych populacji komórek. Metoda jest stosowalna do różnych testów ekspresji genów i innych typów komórek, w tym komórek pacjentów.
Kluczowe Elementy Badań
Dziedzina nauki
- Biologia komórkowa
- Ekspresja genów
- Biochemia
Wprowadzenie
- Komórki HeLa są powszechnie wykorzystywane w badaniach do badania procesów komórkowych.
- Ekstraкты jądrowe są niezbędne do zrozumienia mechanizmów ekspresji genów.
- Tradycyjne metody często wymagają dużych populacji komórek, co ogranicza ich zastosowanie.
- Ten protokół umożliwia wykorzystanie małych ilości komórek, zwiększając wszechstronność.
Cel badania
- Opracowanie metody przygotowywania małoskalowych ekstraktów jądrowych z komórek HeLa.
- Umożliwienie testów ekspresji genów przy ograniczonej liczbie komórek.
- Ocena funkcjonalności ekstraktów jądrowych w aktywnościach transkrypcji i splicingowania.
Wykorzystane metody
- Zbiór i obrzęk komórek HeLa.
- Centrifugacja w celu wytrącenia jąder i ekstrakcja solna.
- Dializa ekstraktów jądrowych w celu uzyskania rozpuszczalnych składników.
- Ocena aktywności transkrypcji i splicingowania przy użyciu sprzężonego systemu RNA polimerazy.
Główne wyniki
- Małoskalowe ekstraкты jądrowe wykazują podobną wydajność transkrypcji i splicingowania w porównaniu z ekstraktami masowymi.
- Testy funkcjonalne potwierdzają użyteczność metody małoskalowej.
- Wyniki demonstrują zastosowanie metody do komórek leczonych inhibitorami.
- Dane potwierdzają skuteczność protokołu w różnych badaniach ekspresji genów.
Wnioski
- Przygotowanie małoskalowych ekstraktów jądrowych jest wydajne i wszechstronne.
- Metodę tę można zastosować do różnych testów wymagających ograniczonej liczby komórek.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten protokół do różnorodnych badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Small-scale nuclear extract preparation enables functional gene expression assays from limited cell populations, supporting rapid evaluation of cellular responses to diverse treatments. This capability is critical for biopharma teams working with scarce patient samples, engineered cell lines, or drug-exposed populations where bulk extraction is impractical. The method enhances predictive confidence in early discovery and mechanistic de-risking by allowing direct assessment of transcription and splicing machinery under relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression pathways in cells exposed to drugs, RNAi, or DNA-damaging agents.
- Supports mechanistic de-risking by directly measuring transcription and splicing activity post-treatment.
- Facilitates functional target validation using minimal cell input, including rare or patient-derived samples.
Screening & Assay Development
- Provides validated nuclear extracts for quantitative transcription and splicing assays.
- Improves assay reproducibility and standardization across small-scale experiments.
- Enables rapid screening of compound effects on gene expression machinery.
Translational & Preclinical Research
- Allows functional assessment of gene expression in disease-relevant or patient-derived cells.
- Supports translational biomarker studies by enabling mechanistic assays with limited clinical material.
- Bridges discovery and preclinical validation by maintaining assay continuity across cell types and treatments.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional gene expression assays from early target validation through translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring transcription and splicing outputs after specific cellular perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready nuclear extracts for reproducible, quantitative evaluation of compound or genetic interventions.
- Analytics: Provides direct readouts of transcription and splicing efficiency, enabling robust comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates continuity from in vitro discovery to preclinical studies using limited or patient-derived samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable workflow for functional nuclear extract preparation across diverse cell types and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes extract preparation for reproducibility and scalability in small-scale settings.
- Strategic Value: Enables rapid go/no-go decisions and efficient resource allocation by supporting functional assays with minimal material.
- Portfolio Impact: Improves risk-adjusted prioritization by allowing functional validation in rare or limited cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell handling, nuclear extraction, and functional gene expression assays.
- Needs access to centrifugation, dialysis, and quantitative assay infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible extract quality and assay outputs.
- Adaptable to various cell types, but optimization may be needed for non-HeLa systems.
- Limited by the minimum cell number required for detectable transcription and splicing activity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Growing and Harvesting HeLa Cells for Nuclear Extraction
1:56
Swell HeLa Cells in Hypotonic Buffer
3:00
Lyse Cells using a Dounce Homogenizer
4:27
Salt-extract the Nuclei
5:15
Concentrate and Dialyze the Nuclear Extract
6:16
Results: Small-scale Nuclear Extract Technique for Functional Assays of Gene Expression Machineries
7:51
Conclusion
