Name: Ekstrakty jądrowe na małą skalę do funkcjonalnych testów maszyn do ekspresji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę przygotowania małoskalowych ekstraktów jądrowych z komórek HeLa do testów ekspresji genów. Technika ta umożliwia badania transkrypcji i splicing z użyciem ograniczonych populacji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu oraz H. Cheng za pomocne dyskusje. Komórki HeLa otrzymano z National Cell Culture Center (Minneapolis, MN). Dziękujemy również firmie Eisai Co., Ltd za dostarczenie związku E7107 oraz Nikon Imaging Center w Harvard Medical School za pomoc w zakresie mikroskopii świetlnej. Praca ta była finansowana z grantu NIH GM043375 dla RR i EGF oraz stypendium NRSA dla JLH.

1. Hodowla komórek HeLa do ekstrakcji jądrowej
<ol>
 <li>Wysiać komórki HeLa na trzy płytki 150 mm w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny. Hodować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 aż do osiągnięcia 90% konfluencji komórek.</li>
</ol>
Wskazówka: Przesiej komórki z płyty konfluencyjnej w stosunku 1:10 i zbierz je 3 dni po przesiewaniu.
Wskazówka – Można wyhodować dodatkową płytkę na wypadek, gdyby trzy płytki nie zapewniły wystarczającej liczby komórek (na przykład, jeśli konfluencja komórek jest mniejsza niż 90%).
2. Przygotowanie i schłodzenie roztworów ekstraktu jądrowego
<ol>
 <li>Przygotować świeże roztwory zgodnie z opisem w Tabeli 2.</li>
 <li>Przenieść 10 ml buforu hipotonicznego do probówki Falcon 15 ml. Przenieść 1 ml buforu o wysokim zasoleniu oraz 1 ml buforu o niskim zasoleniu do probótek Eppendorf 1,5 ml. Schłodzić bufory na lodzie. Bezpośrednio przed użyciem dodać do każdego buforu odpowiednie objętości PMSF oraz DTT (patrz Tabela 1).</li>
</ol>
3. Zbieranie komórek HeLa do ekstrakcji jądrowej
<ol>
 <li>Odssać pożywkę z komórek i przepłukać komórki raz 13 ml 1X PBS o temperaturze pokojowej na płytkę.</li>
 <li>Odssać PBS użyty do płukania.</li>
</ol>
Wskazówka: Odessaj jak najwięcej PBS, najpierw wykonując aspirację, następnie stawiając płytkę pionowo, odczekując kilka sekund i odsysając resztę płynu.
<ol start="3">
 <li>Używając zgarniacza do komórek (cell lifter), zgarnij komórki do dolnej krawędzi płytek, a następnie przenieś je do probówki Eppendorf. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza. Zawartość z 3 płytek powinna zmieścić się w jednej probówce Eppendorf o pojemności 1.5 ml.</li>
</ol>
Wskazówka: Łatwiej jest oszacować objętość komórek, korzystając z probówki typu Eppendorf. W przypadku zwiększenia skali doświadczenia należy użyć probówek Falcona.
<ol start="4">
 <li>Wirować w mikrocentry fudze przez 5 min przy 100 x g w temperaturze 4 °C, aby odwirować komórki w formie osadu.</li>
</ol>
4. Obrzękanie komórek HeLa w buforze hipotonicznym
<ol>
 <li>Ostrożnie odessać PBS z osadu komórkowego i oszacować objętość skompresowanych komórek (PCV), korzystając ze skali na probówce. Trzy konfluencyjne płytki z komórkami HeLa dają około 500 μl PCV.</li>
 <li>Do osadu komórkowego dodać bufor hypotoniczny w ilości 2X PCV. Delikatnie wstrząsnąć, aby resuspender komórki. W razie potrzeby użyć Pipetmana P1000, aby delikatnie resuspender komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół.</li>
 <li>Wirirmek w mikrocentry fudze przez 5 min przy 100 x g w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad komórkowy. *Do tego momentu komórki zaczną już pęcznieć, a ich objętość powinna wynosić teraz około 750 μl-1000 μl.</li>
 <li>Ostrożnie odessać bufor hypotoniczny i dodać nowy bufor hypotoniczny do uzyskania objętości końcowej 1.5 ml. Resuspender komórki.</li>
 <li>Inkubować resuspenderowane, spęczniałe komórki na lodzie przez 10 min.</li>
</ol>
5. Lizowanie komórek za pomocą homogenizatora Dounce'a
<ol>
 <li>Użyj buforu hipotonicznego do wypłukania homogenizatora dounce, a następnie schłodź go na lodzie. Wytrzyj tłuczik do sucha za pomocą chłonnej chusteczki (np. Kimwipe). Usuń pozostały bufor z homogenizatora dounce, używając wydłużonej końcówki do mikropipety 1000 μl.</li>
 <li>Przenieś obrzękłe komórki do homogenizatora dounce. Powoli przesuń ciasno dopasowany tłuczik homogenizatora dounce w górę i w dół 5 razy, aby zlizować komórki, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Przeprowadź analizę lizy komórek, pobierając 5 μl alikwotu komórek z homogenizatora dounce. Umieść alikwot w probówce typu Eppendorf i dodaj taką samą objętość błękitu trypanu. Umieść mieszaninę na szkiełku i zbadaj komórki pod mikroskopem świetlnym. Jądra zlizowanych komórek będą miały kolor niebieski. Idealna jest liza na poziomie około 90%.</li>
</ol>
Wskazówka – Liczba cykli homogenizacji w dounce powinna być dostosowana do stopnia dopasowania tłoka. Podczas pierwszego wykonywania tego protokołu należy określić liczbę koniecznych uderzeń, wykonując krok 5.3 po każdym ruchu dounce. Należy unikać nadmiernej homogenizacji, ponieważ zbyt wiele cykli zniszczy jądra komórkowe.
<ol start="4">
 <li>Przenieś lizowane komórki do schłodzonej wcześniej probówki Eppendorf i wiruj w mikrowirówce w temperaturze 4 °C przez 5 min przy 1500 x g. Osad zawiera jądra komórkowe. Ostrożnie przenieś nadsącz do nowej probówki, nie naruszając osadu z jądrami. Nadsącz zawiera cytoplazmę.</li>
</ol>
Wskazówka – Cytoplazmę można wykorzystać w postaci pierwotnej lub poddać dalszej obróbce w celu otrzymania frakcji S100, stosując to samo wirowanie przy wysokiej prędkości, które wykorzystuje się do ekstraktów masowych (patrz 1 w sekcji przygotowania aktywnej frakcji S100 z ekstraktów masowych).
6. Ekstrakcja jąder solna
<ol>
 <li>Oszacuj upakowaną objętość jąder (PNV), obserwując skalę na probówce. PCV wynosząca 500 μl zazwyczaj daje PNV rzędu 400 μl.</li>
 <li>Dodaj do jąder bufor niskosolowy w ilości ½ X PNV, wprowadzając końcówkę mikropipety do dna probówki i powoli wtryskując bufor do jąder przy jednoczesnym delikatnym mieszaniu. Nie pipetuj w górę i w dół. Delikatnie stuknij probówki, aby upewnić się, że osad został całkowicie resuspendowany w buforze niskosolowym przed kontynuowaniem procedury.</li>
 <li>Dodaj bufor wysokosolowy w ilości ½ X PNV i szybko wymieszaj raz poprzez odwrócenie probówki. Nie wstrząsać. Inkubuj w rotatorze w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
</ol>
Wskazówka: Należy delikatnie obchodzić się z jądrami komórkowymi w buforze o wysokim zasoleniu (High Salt Buffer), aby uniknąć ich lizy.
<ol start="4">
 <li>Wiruj w mikrocentryfudze przez 15 min przy 18,000 x g w temperaturze 4 °C. Nadfiltr stanowi nuklearny ekstrakt o wysokim zasoleniu (HS-NE). Trzy płytki z komórkami zazwyczaj pozwalają uzyskać 500-600 μl HS-NE.</li>
</ol>
7. Zagęszczanie i dializa ekstraktu jądrowego
<ol>
 <li>Przenieś 500 μl HS-NE do schłodzonych mini-centriconów (Amicon) i wiruj przez 50 min w temperaturze 4 °C w mikrowirówce przy 14000 x g. Odwróć mini-centricon (Amicon) i umieść go w nowej probówce Eppendorfa. Wiruj przez 2 min w temperaturze 4 °C przy 1000 x g, aby odzyskać HS-NE. HS-NE zostanie zagęszczony do objętości około 115 μl.</li>
 <li>Za pomocą Pipetmana P200 przenieś 45 μl aliquoty HS-NE do mini-dializatorów Slide-A-Lyzers i umieść je w 500 ml schłodzonego buforu do dializy. Upewnij się, że dno Slide-A-Lyzera jest wyrównane z dołem pływaka. Mieszaj przez 1-2 h w temperaturze 4 °C. Po dializie NE będzie mętny.</li>
</ol>
Wskazówka: Nie należy odwirować mętnego osadu obserwowanego po dializie, ponieważ wirowanie to zmniejsza aktywność ekstraktu.
<ol start="3">
 <li>Ekstrakt jądrowy (NE) można wykorzystać natychmiast lub podzielić na aliquoty. Alikwoty należy zamrozić szokowo w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. NE można przechowywać i poddawać co najmniej dwóm cyklom zamrażania i rozmrażania bez utraty aktywności.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
Niedawno opracowano wydajne układy in vitro do sprzęgania transkrypcji RNAP II ze splicingiem2-5. W układach tych wykorzystano komórki HeLa hodowane w dużych objętościach, co sprawia, że nie nadają się one do szybkiego testowania wpływu specyficznych zabiegów komórkowych na wielu próbkach. W odpowiedzi na tę potrzebę oraz ze względu na ogólną użyteczność protokołu otrzymywania ekstraktów w małej skali (patrz. Dyskusja), opracowaliśmy solidną metodę otrzymywania ekstraktów jądrowych w małej skali. Reprezentatywne dane porównujące reakcję transkrypcji/splicingu RNAP II w ekstrakcie jądrowym w małej skali z ekstraktem jądrowym w dużej objętości przedstawiono na Rysunku 2. Do analizy wykorzystano konstrukt CMV-DNA, który zawiera promotor CMV i koduje standardowy substrat do splicingu (Ftz3, Rysunek 2A). Po inkubacji tego konstruktu w ekstrakcie w dużej objętości (ścieżki 1-3) lub w ekstrakcie w małej skali (ścieżki 4-6), do 5 minuty syntezowano podobne poziomy nowo powstałego pre-mRNA (Rysunek 2, ścieżki 1 i 4). Po dodaniu α-amanityny w celu zablokowania dalszej transkrypcji, produkty pośrednie splicingu oraz produkty osplicowane gromadziły się w czasie z podobną kinetyką w obu typach ekstraktów (Rysunek 2, ścieżki 2, 3, 5, 6). Te reprezentatywne wyniki pokazują, że wydajność sprzężonego układu transkrypcji/splicingu RNAP II jest podobna w ekstraktach jądrowych w dużej objętości i w małej skali.
Aby zademonstrować użyteczność metody przygotowania ekstraktów w małej skali, przygotowano ekstrakty z komórek HeLa traktowanych inhibitorem splicingu, E7107, lub związkiem kontrolnym negatywnym pladienolidem F6,7, a następnie przeprowadzono sprzężony test transkrypcji i splicingu RNAP II. Jak pokazano na Rysunku 3, transkrypcja przez RNAP II przebiegała wydajnie w ekstraktach przygotowanych zarówno z komórek traktowanych pladienolidem F, jak i E7107 (punkty czasowe 10 min). Z kolei splicing przebiegał prawidłowo w ekstrakcie przygotowanym z komórek traktowanych pladienolidem F, ale został zniesiony w komórkach traktowanych E7107 (Rysunek 3, punkty czasowe 20-60 min). Dane te stanowią dowód koncepcji (proof of concept) zastosowania małoscale'owych ekstraktów jądrowych do specjalnego traktowania niewielkiej liczby komórek.
<img alt="Schemat procesu przygotowania małoskalarnego ekstraktu jądrowego. Kroki: zbieranie komórek, wirowanie, ekstrakcja, dializa, wyniki analizy RNA." src="/files/ftp_upload/4140/4140fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat protokołu przygotowania małoskalarnego ekstraktu. Krok P1. Komórki są hodowane w monowarstwach, zbierane z płytek za pomocą scrapera do komórek i pęcznione poprzez dodanie buforu hipotonicznego. Krok P2. Komórki są lizowane za pomocą homogenizatora Dounce'a i wirowane w celu osadzenia jąder. Krok P3. Jądra są oddzielane od cytoplazmy i poddawane ekstrakcji solnej. Krok P4. Ekstrakt jądrowy jest zagęszczany i poddawany dializie. Krok P5. Otrzymano wyniki wykazujące, że ekstrakty jądrowe są funkcjonalne (szczegóły przedstawiono na Rysunku 2).
<img alt="Wyniki elektroforezy RNA; analiza splicingu pre-mRNA; skala masowa vs. mała skala, punkty czasowe, prążki." src="/files/ftp_upload/4140/4140fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2">
Rycina 2. Małoskalowe ekstrakty jądrowe są wydajne w sprzężonym teście transkrypcji/splicingu RNAP II.A. Schemat matrycy DNA CMV-Ftz wykorzystywanej do sprzężonej transkrypcji/splicingu RNAP II. Oznaczono promotor CMV oraz rozmiary eksonów i intronu. B. Porównanie sprzężonego testu transkrypcji/splicingu RNAP II z użyciem masowego ekstraktu jądrowego lub małoskalowego ekstraktu jądrowego. α-amanitynę dodano po 5 min transkrypcji, a splicing przebiegał przez 30 i 60 min. RNA wyekstrahowano i rozdzielono na 5% denaturującym żelu poliakrylamidowym, a następnie wykryto za pomocą fosfoobrazownika. Wskazano produkty i produkty pośrednie splicingu. Oznaczono endogenne snRNA U6 oraz tRNA obecne w ekstrakcie, które zostały znakowane 32P podczas inkubacji. Szczegółowy protokół dotyczący sprzężonego systemu transkrypcji/splicingu RNAP II znajduje się w 3.
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej splicingu pre-mRNA; analiza przebiegu czasowego z użyciem Pladienolidu F i E7107." src="/files/ftp_upload/4140/4140fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Małoskalowe ekstrakty jądrowe przygotowane z komórek HeLa traktowanych inhibitorem splicingu E7107 wykazują defekt splicingu. Komórki poddano działaniu 3 μM Pladienolidu F lub E7107 zgodnie z opisem6, a następnie wykorzystano je do przygotowania małoskalowych ekstraktów jądrowych. Przeprowadzono analizę przebiegu czasowego z zastosowaniem tego samego testu transkrypcji/splicingu, co na Rysunku 2. Wskazano produkty i intermediaty splicingu oraz U6 snRNA i tRNA.

<ol><li>Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+mutant+human+beta-globin+pre-mRNAs+are+faithfully+and+efficiently+spliced+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro.</a> Cell. 36, 993-1005 (1984).</li>
<li>Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+in+vitro+synthesis+and+splicing+of+RNA+polymerase+II+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts.</a> Rna. 6, 1325-1334 (2000).</li>
<li>Das, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coupling+of+RNAP+II+transcription+to+spliceosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly.</a> Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).</li>
<li>Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+splicing+to+Pol+II+transcription+stabilizes+pre-mRNAs+and+influences+splicing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns.</a> PLoS Biol. 4, e147(2006).</li>
<li>Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+in+vitro+system+for+co-transcriptional+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A model in vitro system for co-transcriptional splicing.</a> Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).</li>
<li>Kotake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+factor+SF3b+as+a+target+of+the+antitumor+natural+product+pladienolide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide.</a> Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).</li>
<li>Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-tumor+drug+E7107+reveals+an+essential+role+for+SF3b+in+remodeling+U2+snRNP+to+expose+the+branch+point-binding+region%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region.</a> Genes. 25, 440-444 (2011).</li>
<li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li>
<li>Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-scale+procedure+for+preparation+of+nuclear+extracts+that+support+efficient+transcription+and+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Anal.+Tech%22%5BJournal%5D)">A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing.</a> Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).</li>
</ol>

Produkcja oraz bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Abcam, Plc.

Opracowaliśmy szybką i powtarzalną metodę przygotowania ekstraktów jądrowych z niewielkich ilości komórek HeLa hodowanych w monowarstwach. Wykazaliśmy, że ekstrakty te są stabilne, wykazując, że kinetyka i wydajność testów transkrypcji/splicingu RNAP II są podobne w ekstraktach jądrowych przygotowanych w małej skali oraz w ekstraktach masowych. Potwierdziliśmy użyteczność tych ekstraktów, wykazując, że ekstrakty przygotowane z komórek traktowanych lekiem hamującym splicing są aktywne w transkrypcji, lecz wykazują defekt w splicingu.
Nasza metoda przygotowywania mało skalowych ekstraktów jądrowych została opracowana poprzez połączenie i optymalizację metod ustanowionych wcześniej dla produkcji ekstraktów z komórek HeLa hodowanych w zawiesinie na dużą skalę1,8 oraz metody mało skalowego przygotowywania ekstraktów9. Opracowaliśmy nasz protokół, ponieważ wcześniejsze ekstrakty mało skalowe nie były funkcjonalne w niektórych testach, takich jak sprzężony test transkrypcji/splicingu. Istotną różnicą między poprzednim protokołem mało skalowym9 a naszym jest optymalizacja warunków lizy komórek przy użyciu mini-homogenizatora dounce, podczas gdy w poprzednim protokole lizę przeprowadzano poprzez przeciskanie komórek przez igłę o małym przekroju9. Liza igłowa prowadzi do powstawania pęcherzyków powietrza, co może wyjaśniać, dlaczego ekstrakty były nieaktywne i/lub trudne do odtworzenia w niektórych testach. Do naszego protokołu dodaliśmy również etap zagęszczania. Etap ten zwiększa aktywność ekstraktów, które są niezwykle wrażliwe na stężenie, a także ogranicza zmienność między ekstraktami, która jest nieodłączna dla preparacji mało skalowych. Wreszcie, nasze przygotowanie jest rutynowo przeprowadzane z użyciem zaledwie trzech płytek 150 mm z komórkami w monowarstwie, bez żadnego znaczącego wpływu na aktywność w porównaniu z ekstraktami masowymi. Zatem procedura ta jest łatwo dostosowalna do mało skalowych preparacji wymagających kosztownych odczynników lub przy ograniczonej dostępności komórek. Na przykład przygotowaliśmy mało skalowe ekstrakty z komórek z wyciszeniem RNAi oraz z komórek pacjentów z przewlekłą białaczką limfatyczną (CLL) i wykorzystaliśmy te ekstrakty w testach funkcjonalnych i/lub biochemicznych (EGF, JLH, TY oraz RR, nieopublikowane). Stwierdziliśmy, że ekstrakty te są wartościowe dla RNAi, po których następują specyficzne testy biochemiczne, takie jak immunoprecypitacje, Westerny i barwienie srebrem. Po potwierdzeniu skuteczności wyciszenia konkretnego białka można przeprowadzić bardziej szczegółowe badanie poprzez stworzenie stabilnej linii komórkowej z wyciszonym genem, która może być wykorzystana do przygotowania dodatkowych ekstraktów przy niższym koszcie. Spektrometria mas białek obecnych w immunoprecypitatach uzyskanych z tych linii komórkowych z wyciszeniem będzie również przydatnym zastosowaniem tej metody. Poza sprzężonym testem transkrypcji/splicingu, który wykorzystaliśmy jako przykład w opisie naszego protokołu, ekstrakty mało skalowe powinny być ogólnie stosowalne w licznych testach funkcjonalnych i biochemicznych, takich jak te wykorzystywane do różnych etapów ekspresji genów (np. capping, splicing, transkrypcja, poliadenylacja, przetwarzanie mikroRNA). Protokół ten może być również dostosowany do typów komórek pacjentów, które mogą być pozyskiwane w zawiesinie (tak jak komórki CLL) lub hodowane w kulturze (tak jak fibroblasty pacjentów). Wreszcie, frakcja cytoplazmatyczna uzyskana podczas procedury powinna okazać się przydatna zarówno w testach funkcjonalnych, jak i biochemicznych wymagających obecności cytoplazmy.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Sigma</td><td>M2670-500G</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>P335-212</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Fluorek fenylometanosulfonylowy</td><td>Sigma</td><td>P7626-100G</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Ditiotreitol</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00490-5G</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa, dwuwodna</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00500-01000</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td>MP Biomedicals</td><td>800689</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Podłoże DMEM (Dulbecco&amp;#8217;s Minimal Essential Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>16140</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td></td><td>Gibco</td><td>15070</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Bufor fosforanowy (Phosphate Buffered Saline)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td></tr><tr><td>Barwnik Trypan Blue 0,4%</td><td></td><td>Gibco</td><td>15250</td></tr><tr><td>Skrobaczki do komórek</td><td></td><td>Corning</td><td>29442-200</td></tr><tr><td>Szalki 150 mm</td><td></td><td>VWR</td><td>353025</td></tr><tr><td>Wydłużony końcówka do mikropipety</td><td></td><td>Denville</td><td>P1126</td></tr><tr><td>Homogenizator Dounce'a, 1 ml, z ciasno dopasowanym tłokiem</td><td></td><td>Wheaton</td><td>357538 </td></tr><tr><td>Slidealyzers, MWCO 10 kDa</td><td></td><td>ThermoScientific</td><td>69572</td></tr><tr><td>Mini-Centricons, MWCO 3 kDa</td><td></td><td>Millipore (Amicon)</td><td>UFC500396</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.</td></tr><tr><td>Hipotoniczny</td><td>10 mM HEPES, pH 7,9</td><td>1M HEPES, pH 7,9</td><td>5 ml</td></tr><tr><td></td><td>1,5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>1M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>750 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td>10 mM KCl</td><td>3M KCl</td><td>1,67 ml</td></tr><tr><td></td><td>0,2 mM PMSF</td><td>200 mM PMSF</td><td>500 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td>0,5 mM DTT</td><td>2M DTT</td><td>125 &amp;mu;l</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dopełnić wodą do 500 ml&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Niskosolny</td><td>20 mM HEPES, pH 7,9</td><td>1M HEPES, pH 7,9</td><td>2 ml</td></tr><tr><td></td><td>1,5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>1M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>150 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td>20 mM KCl</td><td>3M KCl</td><td>667 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td>0,2 mM EDTA</td><td>0,5M EDTA</td><td>40 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td>25% Glicerol</td><td>Glicerol</td><td>25 ml</td></tr><tr><td></td><td>0,2 mM PMSF</td><td>200 mM PMSF</td><td>100 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td>0,5 mM DTT</td><td>2M DTT</td><td>25 &amp;mu;l</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dopełnić wodą do 100 ml&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Wysokosolny</td><td>20 mM HEPES, pH 7,9</td><td>1M HEPES, pH 7,9</td><td>2 ml</td></tr><tr><td></td><td>1,5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>1M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>150 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td>1,4M KCl</td><td>3M KCl</td><td>48 ml</td></tr><tr><td></td><td>0,2 mM EDTA</td><td>0,5M EDTA</td><td>40 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td>25% Glicerol</td><td>Glicerol</td><td>25 ml</td></tr><tr><td></td><td>0,2 mM PMSF</td><td>200 mM PMSF</td><td>100 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td>0,5 mM DTT</td><td>2M DTT</td><td>25 &amp;mu;l</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dopełnić wodą do 100 ml&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dializa</td><td>20 mM HEPES, pH 7,9</td><td>1M HEPES, pH 7,9</td><td>10 ml</td></tr><tr><td></td><td>100 mM KCl</td><td>3M KCl</td><td>16,625 ml</td></tr><tr><td></td><td>0,2 mM EDTA</td><td>0,5M EDTA</td><td>200 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td>20% Glicerol</td><td>Glicerol</td><td>100 ml</td></tr><tr><td></td><td>0,2 mM PMSF</td><td>200 mM PMSF</td><td>500 &amp;mu;l</td></tr><tr><td></td><td>0,5 mM DTT</td><td>2M DTT</td><td>125 &amp;mu;l</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dopełnić wodą do 500 ml&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Roztwory do przygotowania ekstraktu jądrowego.</td></tr></tbody></table>

małoskalowe ekstrakty jądrowe do analiz funkcjonalnych aparatów ekspresji genów

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Znaczny postęp w zrozumieniu ekspresji genów został osiągnięty dzięki wykorzystaniu systemów in vitro. W większości badań testy funkcjonalne przeprowadza się z użyciem ekstraktów przygotowywanych w dużych ilościach z 10–50 lub więcej litrów komórek hodowanych w zawiesinie. Jednakże te wielkoskalowe preparaty nie nadają się do szybkiego testowania efektów in vitro, które wynikają z różnorodnych traktowań lub warunków komórkowych in vivo. Niniejszy artykuł wideo prezentuje metodę przygotowania funkcjonalnych ekstraktów jądrowych w małej skali, na przykładzie komórek HeLa. Metoda ta jest realizowana przy użyciu zaledwie trzech płytek 150 mm z komórkami hodowanymi jako przylegające monowarstwy. Aby zilustrować wydajność ekstraktów w małej skali, wykazujemy, że są one tak samo aktywne jak seryjne ekstrakty jądrowe w sprzężonych reakcjach transkrypcji i splicingu polimerazy RNA II. Aby zademonstrować użyteczność protokołu ekstrakcji, pokazujemy, że splicing zostaje zniesiony w ekstraktach przygotowanych z komórek HeLa traktowanych inhibitorem splicingu E7107. Protokół w małej skali powinien być ogólnie możliwy do zastosowania w każdym procesie lub typie komórek, które można badać in vitro z użyciem ekstraktów komórkowych. Obejmuje to komórki pacjentów, które są dostępne jedynie w ograniczonych ilościach, lub komórki narażone na liczne czynniki, takie jak leki, czynniki uszkadzające DNA, RNAi lub transfekcja, co wymaga użycia niewielkich populacji komórek. Ponadto małe ilości świeżo wyhodowanych komórek są wygodne i/lub wymagane w niektórych zastosowaniach.

Opisano protokół przygotowania stabilnych ekstraktów jądrowych z komórek HeLa w małej skali. Protokół ten jest wartościowy dla analiz wymagających użycia niewielkich populacji komórek, takich jak komórki poddane działaniu leków lub RNAi. Metoda powinna być możliwa do zastosowania w szerokim zakresie analiz ekspresji genów oraz w przypadku innych typów komórek, w tym komórek pobranych od pacjentów.

Małoskalowe ekstrakty jądrowe do analiz funkcjonalnych aparatów ekspresji genów

Znaczny postęp w rozumieniu ekspresji genów został osiągnięty dzięki zastosowaniu systemów in vitro. W większości badań testy funkcjonalne są przeprowadzane z wykorzystaniem...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest analiza ekspresji genów przy użyciu funkcjonalnych aparatów jądrowych wyekstrahowanych z komórek. Osiąga się to poprzez wstępne zebranie i napęcznienie komórek HeLa. Następnie komórki poddaje się lizie i wirowaniu w trzecim kroku, aby uzyskać osad jąder komórkowych.Jądra komórkowe poddawane są ekstrakcji solnej, zagęszczaniu i dializie w celu uzyskania rozpuszczalnych i funkcjonalnych aparatów ekspresji genów. Ostatecznie funkcjonalność ekstraktów jądrowych można ocenić na podstawie ich aktywności transkrypcyjnej i splicingowej, za pomocą sprzężonego systemu polimerazy RNA do transkrypcji i splicingu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przygotowywanie masowych ekstraktów jądrowych, jest możliwość wykorzystania niewielkiej liczby komórek do przygotowania ekstraktu jądrowego.Rozpocznij od wysiania komórek HeLa na trzech płytkach 150 mm w pożywce DMEM uzupełnionej o FBS i antybiotyki. Hoduj kultury w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, aż komórki osiągną 90% konfluencji. W tym momencie odessaj pożywkę z kultur komórek HeLa i przemyj je raz 13 ml PBS o temperaturze pokojowej na każdą płytkę, a następnie odessaj PBS. Ustaw każdą płytkę na boku na kilka sekund i odessaj resztę PBS.Następnie, używając skrobaka do komórek, zgarnij komórki do dolnej krawędzi każdej płytki, a następnie przenieś je do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Na koniec odwiruj komórki w mikrowirówce przez pięć minut przy 100 ×g i w temperaturze 4 °C. Teraz odessaj PBS znad osadu komórkowego i oszacuj objętość skondensowanych komórek (PCV), obserwując skalę na probówce.Następnie do osadu komórkowego dodać bufor hipotoniczny w objętości dwukrotności PCV. Delikatnie potrząsnąć probówką, aby resuspenderć komórki. W razie potrzeby delikatnie pipetować zawiesinę komórkową w górę i w dół za pomocą pipety 1000 µL, aby rozbić skupiska komórek.Następnie odwirowano komórki w tych samych warunkach wirowania co poprzednio. Po wirowaniu ostrożnie odessano warstwę buforu hiptonicznego. Komórki zaczęły pęcznieć, a ich objętość zwiększyła się do około 750 do 1000 µL.Dodać nowy bufor hipotoniczny do uzyskania końcowej objętości 1,5 milliliters i resuspender komórki w buforze. Ponownie. Na koniec inkubować resuspenderowane, obrzęknięte komórki na lodzie przez 10 minutes w celu ich schłodzenia. Przepłukać homogenizator buforem hipotonicznym, a następnie umieścić go na lodzie wraz z komórkami.Następnie, używając delikatnej ściereczki do precyzyjnych prac, takiej jak chusteczka Kim, osusz tłuczek. Użyj wydłużonej końcówki do mikropipety 1000 µL, aby usunąć bufor z probówki. Teraz za pomocą pipety przenieś schłodzone, napęczniałe komórki do probówki.Najtrudniejszym elementem tej procedury, kluczowym dla sukcesu, jest sprawdzenie lizy. Po każdym etapie pod mikroskopem powoli przesuń ciasno dopasowany tłuczek w górę i w dół pięć razy, aby zlizować komórki, uważając, by nie powstawały pęcherzyki powietrza. Następnie przenieś 5 µL aliquotu zawiesiny zlizowanych komórek do probówki typu Eppendorf i dodaj 10 µL błękitu trypanowego oraz 15 µL 1X PBS.Nanieś zawiesinę komórkową na szkiełko i sprawdź pod mikroskopem świetlnym, czy doszło do lizy; jądra zlizowanych komórek przybiorą niebieski kolor po trzech uncjach. Liza jest niewystarczająca, ponieważ widoczne są liczne żywe komórki. Po pięciu uncjach stopień lizy jest odpowiedni.Na koniec przenieś lizowane komórki do schłodzonej wcześniej probówki typu Eppendorf i odwiruj zawiesinę komórkową przez pięć minut w mikrocentryfudze przy 1500 ×g i temperaturze czterech stopni Celsius. Następnie ostrożnie przenieś nadsącz do nowej probówki, nie naruszając osadu. Teraz oszacuj objętość jąder w zawiesinie (PNV), korzystając ze skali na probówce.Napełnić końcówkę mikropipety buforem o niskim zasoleniu w ilości odpowiadającej połowie PNV. Następnie wprowadzić końcówkę mikropipety do jąder komórkowych znajdujących się na dnie probówki typu Eppendorf. Powoli wstrzykiwać bufor do jąder, delikatnie mieszając.Delikatnie opukaj probówkę, aby upewnić się, że osad został całkowicie resuspendowany. Następnie dodaj bufor wysokosolny w ilości odpowiadającej połowie PNV i szybko wymieszaj raz, odwracając probówkę. Inkubuj probówkę w rotatorze przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Na koniec odwiruj jądra w mikrowirówce przez 15 minut przy 18 000 ×g w temperaturze 4 °C. Rozpocznij od przeniesienia 500 µL supernatantu do schłodzonych mikrofiltrów. Odwiruj wysokosolny ekstrakt jądrowy przez 15 minut przy 14 000 ×g w temperaturze 4 °C; po wirowaniu odwróć minikoncentrator i umieść go w nowej, oddzielnej probówce EPR.Po wirowaniu przez dwie minuty przy 1000 ×g i temperaturze 4°C, wysokosolny ekstrakt jądrowy zostanie skoncentrowany do objętości około 115 µL. Następnie przenieś 45 µL aliquoty wysokosolnego ekstraktu jądrowego do mini dializacyjnych SLI. Upewnij się, że dno slajdu styka się z dnem pływaka.Następnie umieść SLIs w 500 mililitrach schłodzonego buforu do dializy. Na koniec mieszaj alikwoty przez jedną do dwóch godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza; po dializie ekstrakt jądrowy stanie się mętny. Ten rysunek przedstawia reprezentatywne dane porównujące sprzężoną reakcję transkrypcji polimerazy RNA dwa i splicingu w niewielkiej ilości ekstraktu jądrowego w porównaniu z ekstraktem jądrowym w skali masowej.Kiedy konstrukt A-C-M-V-D-N-A inkubowano w ekstraktach w skali masowej lub małej, do piątej minuty po dodaniu alfa i maninu w celu zablokowania dalszej transkrypcji syntetyzowano podobne poziomy nowo powstałego pre-mRNA; produkty i półprodukty splicingu gromadziły się w czasie z podobną kinetyką w obu typach ekstraktów. Te reprezentatywne wyniki potwierdzają, że wydajność sprzężonego systemu transkrypcji polimerazą RNA II i splicingu jest podobna w ekstraktach jądrowych w skali masowej i małej. Aby zademonstrować użyteczność ekstraktu w małej skali, przygotowano ekstrakty z komórek HeLa traktowanych inhibitorem splicingu E 7 1 0 7 lub związkiem kontrolnym Platyanaly F, a następnie przeprowadzono sprzężony test transkrypcji polimerazą RNA II i splicingu, jak pokazano na tej rycinie; transkrypcja przez polimerazę RNA II zachodziła wydajnie w ekstraktach przygotowanych zarówno z komórek traktowanych Platyanaly F, jak i E 7 1 0 7.W przeciwieństwie do tego, splicing przebiegał prawidłowo w ekstrakcie przygotowanym z komórek traktowanych analy F, lecz został zniesiony w komórkach traktowanych E 7 1 0 7. Dane te stanowią dowód koncepcji wykorzystania małoscale’owych ekstraktów jądrowych do specjalnego traktowania komórek w małej skali. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w czasie krótszym niż pięć godzin.

small-scale-nuclear-extracts-for-functional-assays-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Małe ekstraktu jądrowe dla funkcjonalnych testów mechanizmów ekspresji genów

W niniejszej pracy opisujemy test wykorzystujący mikroiniekcję w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu dokładnego pomiaru kinetyki eksportu mRNA z jądra w somatycznych komórkach ssaków.

Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

RNA polimeraza II syntetyzuje prekursorowy RNA, który wykracza poza koniec 3' dojrzałego mRNA. Koniec dojrzałego RNA jest generowany kotranskrypcyjnie, w miejscu dyktowanym przez sekwencje RNA, poprzez aktywność endonukleazy kompleksu rozszczepienia. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę badania reakcji rozszczepienia in vitro.

Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro

Mechanizmy skalowania komórkowego i wewnątrzkomórkowego pozostają nieuchwytne. Stosowanie ekstraktów z zarodków Xenopus staje się coraz bardziej powszechne w celu wyjaśnienia mechanizmów regulacji wielkości organelli. Metoda ta opisuje przygotowanie ekstraktu z zarodka i nowatorski test skalowania jądrowego, za pomocą którego można zidentyfikować mechanizmy regulacji wielkości jądra.

Bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

SINEUPs to syntetyczne, antysensowne, niekodujące RNA, które zawierają domenę wiążącą (BD) i domenę efektorową (ED) oraz regulują w górę translację docelowego mRNA. W tym miejscu opisujemy metody wykrywania SINEUP w hodowanych liniach komórkowych, analizę ich aktywności promującej translację za pomocą Western-blot oraz półautomatyczny system obrazowania o wysokiej przepustowości.

Testy komórkowe niekodujących RNA SINEUP, które mogą specyficznie poprawić translację mRNA

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Domeny wewnętrznie nieuporządkowane są ważne dla funkcji czynnika transkrypcyjnego fuzji onkogennej. Aby terapeutycznie ukierunkować te białka, konieczne jest bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów regulacyjnych stosowanych przez te domeny. Tutaj używamy transkryptomiki do mapowania ważnych cech strukturalnych wewnętrznie nieuporządkowanej domeny EWS w mięsaku Ewinga.

Mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.

Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Poznaj metodę przygotowania małoskalowych ekstraktów jądrowych z komórek HeLa do testów ekspresji genów. Technika ta umożliwia badania transkrypcji i splicing z użyciem ograniczonych populacji komórek.

Małoskalowe ekstrakty jądrowe do analiz funkcjonalnych aparatów ekspresji genów

Przeglądaj więcej filmów