Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzusznym nakrywy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest maksymalizacja informacji z odczytów molekularnych związanych z regulacją dopaminy z pojedynczej sekcji tkanki z obszarów somatodendrytycznych średniego mózgu. Osiąga się to najpierw poprzez wykonanie precyzyjnej sekcji w celu oddzielenia istoty czarnej od brzusznego obszaru segmentowego. Drugim krokiem jest przygotowanie tkanek do analizy poziomu dopaminy metodą HPLC oraz dalsze przetwarzanie wytrąconego endogennego białka w celu przeprowadzenia analizy.

Następnie, opracowanie osadzonego białka w celu oznaczenia całkowitej zawartości białka pozwala ustalić, które białka regulujące dopaminę lub fosforylację białek można zmierzyć w połączeniu z odczytem zawartości dopaminy w tkance próbki. Ostatecznie, analizy dopaminy i jej białek regulujących w odrębnych somato-dendrytycznych obszarach śródmózgowia umożliwiają wyciągnięcie wniosków dotyczących mechanizmów molekularnych związanych z regulacją dopaminy.

Monoaminy wpływają na wiele wyników behawioralnych, dlatego badacze w dziedzinie uzależnień, biologii oraz dysfunkcji ruchowych, szczególnie w chorobie Parkinsona, są bardzo zainteresowani tym, jak monoaminy, takie jak dopamina, którą badamy w moim laboratorium, wpływają na te wyniki. Jednak znaczenie badania monoamin można jeszcze bardziej podkreślić, jeśli zrozumiemy, w jaki sposób są one regulowane na poziomie molekularnym. Zaletą naszej techniki jest to, że z jednej próbki pobranej z tkanki OUN możemy uzyskać wiele odczytów, dzięki czemu otrzymujemy pełny obraz tego, jak zdarzenia molekularne wpływają na dysregulację monoamin.

Dane te możemy następnie wykorzystać do analizy wpływu na zachowanie. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ oznaczenie białka i fosforylacji wymaga wiedzy na temat ilości całkowitego białka niezbędnego do uzyskania dokładnego odczytu, co zależy od przeciwciał wybranych przez badacza. Kluczowe jest zatem wizualne zaprezentowanie tej metody.

Techniki sekcji oraz wyznaczanie środków mono z białkami regulacyjnymi stanowią stosunkowo nową metodę analizy regulacji in vivo. Aby rozpocząć tę procedurę, schłodzić macierz mózgu gryzonia, szalkę Petriego zawierającą pięć żyletek i skalpel nr 11 na podłożu z mokrego lodu. Należy również wcześniejszym chłodzeniem przygotować na suchym lodzie tyle probówek, ile jest wymagane do przeprowadzenia sekcji.

Następnie po uśmierceniu szczura należy wyjąć mózg i umieścić go odwróconym do góry dnem, tak aby boki móżdżku pasowały do wcięć w lodowatej matrycy. Po minucie należy wsunąć zimne żyletki do schłodzonego mózgu, zaczynając od miejsca około 2 mm rostralnie od skrzyżowania wzrokowego w celu analizy prążkowia i jądra półleżącego. Następnie należy kontynuować wsuwanie zimnych żyletki w odstępach co 1 mm, aż do połowy mostu; kolejne żyletki należy rozmieszczać zakładkowo, aby ułatwić ich późniejsze wyjęcie z matrycy.

Podczas wyciągania żyletek należy zlokalizować początek hipokampa, ponieważ stanowi on najlepszy punkt orientacyjny potwierdzający obecność SN i VTA w miejscu, gdzie hipokamp całkowicie opasuje śródmózowie. Wykonaj przekroje za pomocą ostrza skalpela nr 11, aby najpierw oddzielić SN od VTA. Usuń nadległą korę oraz hipokamp.

Następnie wykonaj cięcie pionowe oddzielające obszar zpigmentowany SN od VTA, upewniając się, że brzytwa pozostaje w stałym kontakcie z mokrym lodem podczas sekcji. Dalej wykonaj cięcie poziome na linii środkowej lub w jej pobliżu, tuż powyżej najbardziej grzbietowej i bocznej części SN. Na koniec oddziel SN od reszty pnia mózgu.

Po usunięciu SN należy oddzielić VTA od pozostałej części śródmózgu. Przełożone tkanki należy natychmiast umieścić w schłodzonych wcześniej probówkach do wirówki. Następnie tkanki należy przechowywać w temperaturze minus 80 °C do momentu rozpoczęcia ich przetwarzania.

W tej procedurze należy delikatnie zhomogenizować tkankę bezpośrednio po wyjęciu z suchego lodu, używając lodowatego 0,1 M roztworu kwasu nadchlorowego z EDTA. Następnie próbkę ponownie umieścić na suchym lodzie. W dalszej kolejności próbki należy odwirować z prędkością 12 000 RPM w celu odsączenia osadu.

Osad białkowy zostanie wykorzystany do oznaczeń metodą western blot, a następnie należy odessać nadsącz do fiolki HPLC. Zamrożone osady białkowe powstałe w wyniku traktowania buforem HPLC umieścić na mokrym lodzie w celu rozmrożenia i upewnić się, że cały bufor został usunięty i zarchiwizowany. W przypadku obróbki dwustronnej SN do osadu należy dodać 300 µL 1% SDS zawierającego 5 mM Tris oraz 1 mM EDTA i poddać sonikacji, natomiast w przypadku obróbki dwustronnej VTA wystarczające będzie 200 µL 1% SDS.

Następnie umieść próbki w wrzącej wodzie przez około pięć minut, aby dopełnić denaturację białek. Następnie pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej, upewniając się na tym etapie, że nakrętki są szczelnie zamknięte. Potem wykonaj test BCA, stosując krzywą wzorca białka w zakresie od 2 do 40 µg białka.

Aby określić stężenie białka w próbkach o objętości 5 µL, należy wykorzystać wartość mediany uzyskaną z analizy trzech powtórzeń, aby wyznaczyć ilość białka na podstawie krzywej wzorcowej. Wynik należy podzielić przez objętość próbki, aby obliczyć stężenie białka. Następnie, jeśli kolor buforu do próbek na to wskazuje, należy przygotować próbki z buforem zawierającym DTT w celu przeprowadzenia redukcyjnej elektroforezy SDS na żelu akrylamidowym 10%.

Zmienić kolor na żółty, dodając 1 M tris base pH 8.2 w przyrostach 10 µL do próbki, aż pojawi się niebieski kolor. Aby zapewnić właściwe pH, przeprowadzić analizę odpowiedniej ilości całkowitego białka za pomocą SDS page na żelu z 10% akryloamidem, a następnie przenieść białka na membranę nitrocelulozową o rozmiarze porów 0.45 µm. Ustawić komorę Hoffera na co najmniej 27 V i pozostawić proces transferu na całą noc.

Następnego dnia suszyć membranę przez co najmniej 30 minut. Następnie barwić ją roztworem Ponceau S przez około pięć minut. Po tym czasie intensywnie odbarwiać membranę 0,2% roztworem kwasu solnego, aż poszczególne prążki białkowe staną się wyraźne, a zabarwienie tła zostanie usunięte.

Następnie, przy użyciu programu ImageJ, należy uzyskać obraz barwienia poncho S, aby dalej określić ilościowo względne obciążenia białek w każdej ścieżce i znormalizować wyniki dla hydroksylazy tyrozynowej, transportera dopaminy lub pęcherzykowego transportera monoamin typu dwa. Przedstawiony tutaj western blot obrazuje fosforylowaną hydroksylazę tyrozynową Ser31 w próbkach prążkowia czarnego szczura. Skalibrowana krzywa standardowa dla fosforylowanej hydroksylazy tyrozynowej Ser31 obejmuje zakres od 0,3 nanograms do 2,0 nanograms i mieści się w liniowym zakresie detekcji. Tutaj przedstawiono western blot fosforylowanej hydroksylazy tyrozynowej Ser40 w próbkach brzusznejstrefy przykrywki szczura.

Skalibrowana krzywa wzorcowa dla SN 40 fosforylowanej tyrozynowej hydroksylazy obejmuje zakres od 0,2 nanograma do 1,5 nanograma i mieści się w liniowym zakresie detekcji. Ważne jest zachowanie odpowiedniej temperatury oraz prawidłowe etykietowanie probówek. Istotna jest również normalizacja białka w celu zmniejszenia wariancji wyników.

Niniejszy protokół, przy dokładnym zastosowaniu, może zapewnić badaczom w dziedzinie funkcji lokomocyjnych i zachowań uzależnieniowych szeroki zakres odczytów molekularnych dotyczących regulacji monoamin w mózgu, ze szczególnym uwzględnieniem dopaminy, która jest przedmiotem naszego zainteresowania. W konsekwencji odczyty te mogą dostarczyć bardzo szczegółowej i gruntownej analizy ich znaczenia dla wyników behawioralnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak zmaksymalizować odczyty regulacji monoamin w istocie czarnej i polu brzuszno-przyśrodkowym obszaru tegmentum z jednej sekcji tkanki.