Name: Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i brzusznej okolicy nakrywki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj metodę precyzyjnej analizy regulacji dopaminy w istocie czarnej i brzusznej okolicy nakrywki u gryzoni. Technika HPLC i analiza białek pozwalają zrozumieć mechanizmy molekularne neuroprzekaźnictwa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie niniejszej pracy, zgodnie z cytowaniami 2,10, zostało zapewnione częściowo z grantów badawczych przyznanych MF Salvatore przez American Federation for Aging Research, The Edward P. Stiles Trust Fund oraz Biomedical Research Foundation of Northwest Louisiana, a także BS Pruett z funduszy Ike Muslow Predoctoral Fellowship w LSU Health Sciences Center-Shreveport.

<ol><li>Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substantia+nigra+pars+reticulate+is+a+highly+potent+site+of+action+for+the+behavioral+effects+of+the+D1+antagonist+SCH23390+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat.</a> Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).</li>
<li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+reveals+a+role+for+nigral+tyrosine+hydroxylase+ser31+phosphorylation+in+locomotor+activity+generation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation.</a> PLoS ONE. 4, e8466(2009).</li>
<li>Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+controls+persistence+of+long-term+memory+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dopamine controls persistence of long-term memory storage.</a> Science. 325, 1017-1020 (2009).</li>
<li>Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+dopamine+regulation+in+mesoaccumbens+pathway+in+response+to+non-contigent+binge+and+escalating+methamphetamine+regimens+in+the+Wistar+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat.</a> Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).</li>
<li>Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+infusion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+into+the+ventral+tegmental+area+induces+long-lasting+potentiation+of+cocaine+seeking+after+withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal.</a> J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).</li>
<li>Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+reverses+toxin-induced+injury+to+midbrain+dopaminergic+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo.</a> Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).</li>
<li>Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+GDNF+administration+increases+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+rat+striatum+and+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra.</a> J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).</li>
<li>Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ventral+tegmental+area+glial+cell-line+derived+neurotrophic+factor+in+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving.</a> Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).</li>
<li>Lavicky, J., Dunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticotropin-releasing+factor+stimulates+catecholamine+release+in+hypothalamus+and+prefrontal+cortex+in+freely+moving+rats+as+assessed+by+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis.</a> J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).</li>
<li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichotomy+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+regulation+between+somatodendritic+and+terminal+field+areas+of+nigrostriatal+and+mesoaccumbens+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways.</a> PLoS ONE. 7, e29867(2012).</li>
<li>Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+nigrostriatal+and+mesolimbic+systems+in+vivo%3A+Effects+of+acute+haloperidol+and+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds.</a> J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).</li>
<li>Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization-stimulated+catecholamine+biosynthesis%3A+involvement+of+protein+kinases+and+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+sites+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ.</a> J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).</li>
<li>Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+serine-19+phosphorylation+in+regulating+tyrosine+hydroxylase+studied+with+site-+and+phosphospecific+antibodies+and+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis.</a> J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).</li>
<li>Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tyrosine+hydroxylase+activity+and+phosphorylation+at+ser19+and+ser40+via+activation+of+glutamate+NMDA+receptors+in+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum.</a> J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Jak przedstawiono na Rysunku 1, opisane powyżej metody powinny pozwolić na uzyskanie wielu pomiarów dopaminy oraz regulujących ją białek TH, DAT i VMAT2 z jednej próbki SN lub VTA pobranej od szczura lub myszy. Ponownie podkreśla się, że korzyścią z zastosowania tego protokołu jest możliwość uzyskania przez badacza operacyjnie dopasowanych wyników dotyczących regulacji dopaminy in vivo w niemal każdym paradygmacie eksperymentalnym, co pozwala na znaczną oszczędność zasobów eksperymentalnych poprzez zmniejszenie ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;System HPLC:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Podstawowy system składa się z pompy HPLC Shimadzu LC10-ADvp, automatycznego injektora próbek Waters WISP 717 oraz kolumny Spherosorb ODS- o wymiarach 250 x 4,4 mm i wielkości cząstek 5 mikronów.&lt;strong&gt;1&lt;/strong&gt; kolumny C18 w odwróconej fazie (Waters), podwójnej elektrody z węgla szklistego Bioanalytical Systems (BAS) TL12, dwóch detektorów elektrochemicznych BAS LC4B oraz systemu zbierania i integracji danych Waters Empower 2.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Kolumnę utrzymuje się w temperaturze 30–45°C &amp;deg;C (podgrzewacz kolumny BAS LC22A). Faza ruchoma składa się z 0,1 M fosforanu sodu (pH 3,0), 0,1 mM EDTA, 0,2–0,4 mM kwasu 1-oktanosulfonowego (Eastman-Kodak) oraz 0,35% acetonitrylu (v/v), przefiltrowanych przez filtr o porach 0,45 mikrona. Szybkość przepływu wynosi 1,2 ml/min. Czterolitrowe partie fazy ruchomej są optymalizowane pod kątem rozdziałów poprzez regulację pH, stężenia kwasu oktanosulfonowego oraz temperatury kolumny. Faza ruchoma jest recyrkulowana i stale przepłukiwana helem w celu usunięcia rozpuszczonego tlenu. Recyrkulacja fazy ruchomej jest niemal niezbędna do utrzymania dobrej rozdzielczości przez odpowiednio długi czas. Trwałość fazy ruchomej jest zapewniona dzięki zastosowaniu przełącznika przepływu (sterowanego przez integrator), który przekierowuje pierwsze 2–7 min każdego pomiaru do odpadu.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Brakuje tekstu źródłowego do przetłumaczenia. Proszę o dostarczenie treści sekcji „jove_content”.&quot;&gt;Elektrody utrzymuje się na potencjałach wynoszących około 0,78 V i 0,95 V względem elektrody odniesienia Ag/AgCl. Elektrodę o wyższym potencjale wykorzystuje się wyłącznie do oznaczania tryptofanu (oraz wewnętrznego standardu NMDA). Potencjał 0,78 V zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu podczas detekcji monoamin i związków innych niż tryptofan. Chromatogramy są zapisywane na dysku twardym stacji roboczej Empower, a następnie przetwarzane, po czym dane są przenoszone bezpośrednio do arkusza Excel w celu obliczenia ilości metabolitów i zestawienia danych grupowych. &lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Dopamina jest intensywnie badanym neuroprzekaźnikiem w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Rzeczywiście, jej zaangażowanie w aktywność lokomotoryczną i zachowania związane z nagrodą stymulowało przez pięć dekad badania nad deficytami molekularnymi związanymi z regulacją dopaminy. Większość tych badań nad regulacją dopaminy w mózgu koncentruje się na molekularnych podstawach jej regulacji w obszarach pól terminalnych szlaków nigrostriatalnego i mezoakumbensowego: prążkowia oraz jądra półleżącego. Co więcej, badania te skupiały się na analizie zawartości dopaminy w tkance z normalizacją wyłącznie do masy mokrej tkanki. Badania białek regulujących dopaminę, takich jak hydroksylaza tyrozynowa (TH), fosforylacja TH, transporter dopaminy (DAT) i transporter monoamin pęcherzykowych 2 (VMAT2), często nie obejmują analizy zawartości dopaminy w tej samej próbce. Możliwość analizy zarówno zawartości dopaminy w tkance, jak i jej białek regulacyjnych (w tym modyfikacji potranslacyjnych) nie tylko zwiększa potencjał interpretacji zależności dopaminy od poziomu białek i funkcji TH, DAT lub VMAT2, ale także zwiększa oszczędność materiału badawczego. Przekłada się to na niższe koszty, a jednocześnie pozwala uzyskać wgląd w molekularną regulację dopaminy w praktycznie dowolnym paradygmacie wybranym przez badaczy. W niniejszej pracy skupiamy się na analizach w śródmózgowiu. Chociaż istota czarna (SN) i pole brzuszne nakrywki (VTA) są zazwyczaj pomijane w większości badań nad regulacją dopaminy, jądra te można łatwo wypreparować wraz z nabyciem wprawy. Możliwe jest przeprowadzenie kompleksowego pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz poziomu TH, DAT lub VMAT2. Rośnie liczba publikacji na temat wpływu funkcji dopaminy w SN i VTA na zachowanie, a także oddziaływania substancji egzogennych lub procesów chorobowych w tych obszarach 1-5. Ponadto związki takie jak czynniki wzrostu wywierają głęboki wpływ na dopaminę i białka regulujące dopaminę, w stopniu porównawczo większym w SN lub VTA 6-8. Dlatego też niniejsza metodologia jest przedstawiana jako punkt odniesienia dla laboratoriów, które chcą rozszerzyć swoje badania nad tym, jak specyficzne terapie modulują zachowanie i regulację dopaminy. Przedstawiona zostaje wieloetapowa metoda analizy zawartości dopaminy w tkance, poziomów białek TH, DAT lub VMAT2 oraz fosforylacji TH w istocie czarnej i VTA ze śródmózgowia gryzoni. Analiza fosforylacji TH może dostarczyć istotnych informacji nie tylko o tym, jak regulowana jest aktywność TH, ale także o kaskadach sygnałowych, na które wpływ mają jądra somatodendrytyczne w danym paradygmacie. Zaprezentujemy technikę dysekcji pozwalającą na odizolowanie tych dwóch jąder oraz sposób przetwarzania próbek wypreparowanej tkanki, co pozwala na uzyskanie profilu ujawniającego molekularne mechanizmy regulacji dopaminy in vivo, specyficzne dla każdego z jąder (Rysunek 1).&quot;&gt;Pompa: Shimadzu LC-10AD&lt;br/&gt; Ogniwo: BAS Cross Flow. Elektroda robocza z węgla szklistego przy potencjale 0,780 i 0,950 V.&lt;br/&gt; Detektor: BAS LC-4B pracujący w trybie dwukanałowym.&lt;br/&gt;System akwizycji danych: Waters Empower Pro 2.&lt;br/&gt;Iniektor: Waters WISP 717&lt;br/&gt;Kolumna: Waters Spherosorb ODS-1, 5 &amp;mu;Cząstka M, 4,4 mm x 250 mm.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>siarczan dodecylu sodu (SDS)</td><td>J.T. Baker</td><td>4095-02</td><td></td></tr><tr><td>Trizma baza</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl </td><td>Sigma</td><td>T3253-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G8773-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP-40</td><td>Sigma</td><td>PVP40-1KG</td><td></td></tr><tr><td>dPBS </td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Tween20 </td><td>Sigma</td><td>P1379-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna </td><td>Sigma</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S </td><td>Fluka</td><td>81460</td><td></td></tr><tr><td>błękit bromofenolowy </td><td>Sigma</td><td>B8026-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol </td><td>Sigma</td><td>D-9163</td><td></td></tr><tr><td>Standard białkowy 2 mg BSA</td><td>Sigma</td><td>P5619-25VL</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik A do oznaczania białek metodą BCA firmy Pierce</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>23223</td><td></td></tr><tr><td>Standard białka Precision Plus</td><td>Bio Rad</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>[125I]-białko A, aktywność właściwa</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Odczynniki specyficzne.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>10% SDS</td><td></td><td></td><td>10 g SDS, 100 mL wody dejonizowanej (DI H2O)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>1% SDS (pH do 8,2)</td><td></td><td></td><td>10 ml 10% SDS, 60,5 mg Trizma Base, 37,22 mg EDTA, 90 ml wody dejonizowanej (DI H2O)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>Roztwór siarczanu(II) miedzi </td><td></td><td></td><td>1 g siarczanu(VI) miedzi(II), 25 ml wody dejonizowanej&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>Bufor do próbek 3X </td><td></td><td></td><td>Trizma Base 2,27 g
SDS 6 g
Ditiotreitol 0,463 g
Glicerol 30 g
Błękit bromofenolowy 10 mg
H2O (woda destylowana)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 (początkowo dodać powyższe odczynniki do 40 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 w cylindrze miarowym; następnie dodać H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 aż do osiągnięcia objętości 100 ml) HCl (dodawać w ilości niezbędnej do osiągnięcia pH 6,85) Zamrozić roztwór w probówkach o pojemności 2,0 ml. (przygotowuje 100 ml): Wymagana objętość 3X Sample Buffer = &amp;#189; objętość SDS zastosowana w próbce.</td></tr><tr><td>Bufor do próbek 1X</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczyć 3X bufor do próbek do stężenia 1X, używając wody dejonizowanej (DI H2O)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy 10X (do przygotowania 4 l)</td><td></td><td></td><td>Trizma (zasada) 121,1 g
Glicyna 577 g
SDS 40 g</td></tr><tr><td>Bufor transferowy 10X: (na 4 L)</td><td></td><td></td><td>Glicyna 360 g Trizma Base 96 g</td></tr><tr><td>Ponceau</td><td></td><td></td><td>Ponceau S, 0,5 g kwas octowy, 5 ml wody dejonizowanej&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0,95 ml</td></tr><tr><td>0,2% roztwór HCl</td><td></td><td></td><td>5,2 ml HCl w 500 ml wody dejonizowanej (DI H2O)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>Roztwór blokujący PVP-T20 (do przygotowania 4 l)</td><td></td><td></td><td>PVP-40 40 g
dPBS 38,2 g
Tween20 2 g
Tio Mersol 0,4 g
1M Tris pH 7,6 (60,6 g Tris HCl + 13,9 g Tris Base w 500 ml wody DI)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0)- 50 ml</td></tr><tr><td>Bufor do Western blot 10X (na 4 L)</td><td></td><td></td><td>Tween 20 20 g
Tris Base 14 g
Tris HCl 61 g</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 3. &lt;/strong&gt; Wzory do oznaczania białka i analizy Western blotting.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Standardy tyrozynohydroksylazy:&lt;/strong&gt; Skalibrowane standardy białka TH oraz jego fosforylacji stosowane w tym laboratorium pochodzą z ekstraktów komórek PC12, w których przeanalizowano zawartość białka TH oraz stechiometrię fosforylacji w odniesieniu do wcześniej skalibrowanych standardów TH, które pierwotnie pochodziły z laboratorium dr. Johna Haycocka. &lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;. &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamina jest intensywnie badanym neuroprzekaźnikiem w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W istocie, jej zaangażowanie w aktywność lokomotoryczną i zachowania związane z nagrodą stymulowało przez pięć dekad badania nad deficytami molekularnymi związanymi z regulacją dopaminy. Większość tych analiz dotyczących regulacji dopaminy w mózgu koncentruje się na molekularnych podstawach jej regulacji w obszarach pól terminalnych szlaków nigrostriatalnego i mezoakumbensowego: prążkowiu oraz jądrze półleżącym. Ponadto badania te skupiały się na analizie zawartości dopaminy w tkance z normalizacją wyłącznie do masy mokrej tkanki. Badania białek regulujących dopaminę, takich jak białko hydroksylaza tyrozynowa (TH), fosforylacja TH, transporter dopaminy (DAT) oraz białko pęcherzykowego transportera monoamin 2 (VMAT2), często nie obejmują analizy zawartości dopaminy w tej samej próbce. Możliwość analizy zarówno zawartości dopaminy w tkance, jak i białek ją regulujących (w tym modyfikacji potranslacyjnych) nie tylko zwiększa potencjał interpretacji zależności dopaminy od poziomu białek i funkcji TH, DAT lub VMAT2, ale także poprawia ekonomię wykorzystania próbek. Przekłada się to na niższe koszty, a jednocześnie dostarcza wiedzy na temat molekularnej regulacji dopaminy w praktycznie każdym paradygmacie wybranym przez badaczy.
Analizy koncentrujemy na śródmózgowiu. Chociaż SN i VTA są zazwyczaj pomijane w większości badań nad regulacją dopaminy, jądra te można z łatwością wypreparować wraz z praktyką. Możliwe jest przeprowadzenie kompleksowego pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz poziomu TH, DAT lub VMAT2. Coraz więcej publikacji wskazuje na wpływ funkcji dopaminergicznej w SN i VTA na zachowanie oraz oddziaływanie substancji egzogennych lub procesów chorobowych w tych obszarach 1-5. Ponadto związki takie jak czynniki wzrostu wywierają głęboki wpływ na dopaminę i białka regulujące jej poziom, w stosunkowo większym stopniu w SN lub VTA 6-8. Dlatego niniejsza metodologia została przedstawiona jako punkt odniesienia dla laboratoriów, które chcą rozszerzyć swoje badania nad tym, jak konkretne zabiegi modulują zachowanie i regulację dopaminy. Przedstawiono tutaj wieloetapową metodę analizy zawartości dopaminy w tkance, poziomów białek TH, DAT lub VMAT2 oraz fosforylacji TH w istocie czarnej i VTA ze śródmózgowia gryzoni. Analiza fosforylacji TH może dostarczyć istotnych informacji nie tylko na temat regulacji aktywności TH, ale także kaskad sygnalizacyjnych, na które oddziałują jądra somatodendrytyczne w danym paradygmacie.
Przedstawimy technikę sekcji służącą do oddzielenia tych dwóch jąder oraz sposób przetwarzania próbek wyseczonej tkanki, który pozwala na uzyskanie profilu ujawniającego mechanizmy molekularne regulacji dopaminy in vivo, specyficzne dla każdego jądra (Rycina 1).

Dopamina jest w sposób odrębny regulowana w jądrach śródmózgowia, w których znajdują się ciała komórek i dendryty neuronów dopaminergicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę sekcji i obchodzenia się z próbkami, mającą na celu maksymalizację wyników, a tym samym wniosków i spostrzeżeń, dotyczących regulacji dopaminy w jądrach śródmózgowia: w istocie czarnej (SN) oraz polu brzuszno-przyśrodkowym (VTA) u gryzoni.

Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

Dopamina jest intensywnie badanym neuroprzekaźnikiem w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W rzeczywistości jej udział w aktywności lokomotorycznej i zachowaniach związanych z nagrodą przyczynił się do powstania pięciu...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zmaksymalizowanie ilości informacji uzyskanych z odczytów molekularnych związanych z regulacją dopaminy z pojedynczej sekcji tkanki pobranej z obszarów somatodendrytycznych śródmózgowia. Osiąga się to najpierw poprzez wykonanie precyzyjnej sekcji w celu oddzielenia istoty czarnej od brzusznego obszaru segmentowego. Drugim krokiem jest przygotowanie tkanek do analizy poziomu dopaminy metodą HPLC oraz dalsze przetwarzanie wytrąconego białka endogennego w celu przeprowadzenia analizy.Następnie, opracowanie wytrąconego białka w celu oznaczenia całkowitej zawartości białka pozwala ustalić, które białka regulujące dopaminę lub fosforylację białek można zmierzyć w powiązaniu z odczytem zawartości dopaminy w tkance w próbce. Ostatecznie, analizy dopaminy i jej białek regulacyjnych w poszczególnych somatodendrytycznych obszarach śródmózgowia pozwalają na wyciągnięcie wniosków dotyczących mechanizmów molekularnych związanych z regulacją dopaminy.Monoaminy wpływają na wiele wyników behawioralnych, dlatego badacze w dziedzinie uzależnień, biologii i dysfunkcji lokomocyjnych, szczególnie w chorobie Parkinsona, są bardzo zainteresowani tym, jak monoaminy, takie jak dopamina, którą badamy w moim laboratorium, oddziałują na wyniki behawioralne. Znaczenie badania monoamin można dodatkowo podkreślić, jeśli zrozumiemy, w jaki sposób są one regulowane na poziomie molekularnym. Zaletą naszej techniki jest to, że z jednej próbki pobranej z tkanki OUN możemy uzyskać wiele odczytów, co pozwala nam na pełną analizę tego, jak zdarzenia molekularne wpływają na dysregulację monoamin.Uzyskane dane możemy następnie odnieść do kontekstu wpływu na zachowanie. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ oznaczenie białka i fosforylacji wymaga wiedzy na temat ilości całkowitego białka niezbędnej do uzyskania dokładnego odczytu, co zależy od przeciwciał wybranych przez badacza. Kluczowe jest zatem wizualne zaprezentowanie tej metody.Techniki sekcji oraz wyznaczanie średnich mono z białkami regulacyjnymi stanowią stosunkowo nowe podejście do analizy regulacji in vivo. Aby rozpocząć tę procedurę, schłodzić matrycę mózgu gryzonia, szalkę Petriego zawierającą pięć żyletek oraz skalpel nr 11 na warstwie mokrego lodu. Należy również wstępnie schłodzić na suchym lodzie tyle probówek, ile będzie potrzebnych do przeprowadzenia sekcji.Następnie po uśmierceniu szczura należy wyjąć jego mózg i umieścić go odwróconym do góry dnem, tak aby boczna część móżdżku pasowała do wcięć w lodowatej matrycy. Po minucie należy wsunąć zimne żyletki w schłodzony mózg, zaczynając około 2 mm rostralnie od skrzyżowania wzrokowego w celu analizy prążkowia i jądra półleżącego. Następnie należy kontynuować wkładanie zimnych żyletek w każdym sekcji o szerokości 1 mm aż do połowy mostu; należy przy tym rozmieszczać żyletki w sposób przesunięty względem siebie, aby ułatwić ich późniejsze wyjęcie z matrycy.Podczas wyciągania żyletek należy zlokalizować początek hipokampa, ponieważ stanowi on najlepszy punkt orientacyjny pozwalający upewnić się, że SN i VTA znajdują się w miejscu, w którym hipokamp całkowicie opasuje śródmózgowie. Wykonaj cięcia ostrzem skalpela nr 11, aby w pierwszej kolejności oddzielić SN od VTA. Usuń znajdującą się powyżej korę oraz hipokamp.Następnie wykonaj cięcie pionowe oddzielające obszar pigmentowy SN od VTA, dbając o to, aby żyletka miała stały kontakt z mokrym lodem podczas sekcji. Dalej wykonaj cięcie poziome w linii środkowej lub w jej pobliżu, tuż nad grzbietową i najbardziej boczną częścią SN. Na koniec oddziel SN od reszty pnia mózgu.Po usunięciu SN należy oddzielić VTA od pozostałej części śródmózgowia. Wypreparowane tkanki należy niezwłocznie umieścić w schłodzonych probówkach do wirówki. Następnie tkanki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu rozpoczęcia ich przetwarzania.W tej procedurze, bezpośrednio po wyjęciu z suchego lodu, należy delikatnie zhomogenizować tkankę, używając lodowatego 0.1 molarnego roztworu kwasu nadchlorowego z EDTA. Następnie próbkę należy ponownie umieścić na suchym lodzie. W kolejnym kroku próbki należy odwirować z prędkością 12 000 RPM w celu osadzenia materiału.Osad białkowy zostanie wykorzystany do oznaczeń metodą western blot; następnie odessajcie nadsącz do fiolki HPLC. Zamrożone osady białkowe powstałe w wyniku traktowania buforem HPLC umieśćcie na kruszonym lodzie w celu rozmrożenia i upewnijcie się, że cały bufor został usunięty i zarchiwizowany. W przypadku przetwarzania obustronnego SN do osadu dodajcie 300 µL 1%SDS zawierającego 5 mM Triss oraz 1 mM EDTA i poddajcie sonikacji, natomiast w przypadku przetwarzania obustronnego VTA wystarczy 200 µL 1%SDS.Następnie umieść próbki w wrzącej wodzie na około pięć minut, aby dokończyć denaturację białek. Pozostaw je do ostygnięcia do temperatury pokojowej, upewniając się na tym etapie, że nakrętki są szczelnie zamknięte. Następnie wykonaj test BCA, stosując krzywą wzorcową białka w zakresie od 2 do 40 µg białka.Aby określić stężenie białka w próbkach o objętości 5 µL, należy wykorzystać wartość mediany uzyskaną z analizy w trzech powtórzeniach, aby wyznaczyć ilość białka na podstawie krzywej wzorcowej. Wynik należy podzielić przez objętość próbki, aby obliczyć stężenie białka. Następnie, jeśli jest to konieczne (co zasygnalizuje kolor buforu), należy przygotować próbki z użyciem buforu do próbek zawierającego DIO three etol do redukującej elektroforezy SDS na żelu akryloamidowym 10%.Zmienić kolor na żółty, dodając 1 M Tris base pH 8.2 do próbki w przyrostach 10 µL, aż pojawi się niebieski kolor. Aby zapewnić prawidłowe pH, należy przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE odpowiedniej ilości całkowitego białka na żelu z 10% akryloamidu, a następnie przenieść białka na membranę nitrocelulozową o rozmiarze porów 0,45 µm; ustawić komorę Hoffera na co najmniej 27 V i pozostawić transfer na noc.Następnego dnia suszyć blot przez co najmniej 30 minut. Następnie barwić go roztworem Ponceau S przez około pięć minut. Po tym czasie intensywnie odbarwiać go 0,2% roztworem kwasu solnego, aż poszczególne prążki białkowe zostaną wyraźnie rozdzielone, a zabarwienie tła zostanie usunięte.Następnie należy uzyskać obraz barwienia poncho S przy użyciu programu ImageJ, aby dalej określić ilościowo względne obciążenia białkiem w każdej ścieżce i znormalizować wyniki dla hydroksylazy tyrozynowej, transportera dopaminy lub pęcherzykowego transportera monoamin typu 2; tutaj przedstawiono western blot dla Ser31 phosphorylated tyrosine hydroxylase w próbkach prążkowia szczura. Skalibrowana krzywa wzorcowa dla Ser31 phosphorylated tyrosine hydroxylase obejmuje zakres od 0.3 ng do 2.0 ng i mieści się w liniowym zakresie detekcji. Tutaj przedstawiono western blot dla Ser40 phosphorylated tyrosine hydroxylase w próbkach brzusznejstycznej pola nakrywy szczura.Skalibrowana krzywa wzorcowa dla fosforylowanej tyrozynohydroksylazy SN 40 mieści się w zakresie od 0,2 nanogramów do 1,5 nanogramów i znajduje się w liniowym zakresie detekcji. Ważne jest zachowanie odpowiedniej temperatury, a także prawidłowe oznakowanie probówek. Istotna jest również normalizacja białek w celu zmniejszenia wariancji otrzymanych wyników.Niniejszy protokół, po dokładnym zastosowaniu, może dostarczyć badaczom z zakresu funkcji motorycznych i zachowań uzależnień szeroki zakres odczytów molekularnych dotyczących regulacji monoamin w mózgu, ze szczególnym uwzględnieniem dopaminy, która jest przedmiotem naszego zainteresowania. W rezultacie odczyty te mogą umożliwić bardzo szczegółową i wnikliwą analizę wpływu tych procesów na wyniki behawioralne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak zmaksymalizować odczyty regulacji monoamin w istocie czarnej oraz polu brzuszno-pokrywowym z jednej sekcji tkanki.

comprehensive-profiling-dopamine-regulation-substantia-nigra-ventral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Kompleksowe badanie regulacji dopaminy w substancji czarnej i brzusznym obszarze zakrętu przedmostowego

Opisano protokół wykonywania jednostronnych uszkodzeń wiązki przedniej części mózgu (MFB) za pomocą 6-OHDA u myszy. Metoda ta charakteryzuje się niskim wskaźnikiem śmiertelności (13,3 %), przy czym u 89% przeżywających zwierząt stwierdzono &gt;95% ubytku dopaminy w prążkowiu oraz tendencję do rotacji ipsypsilaternej w stronę strony uszkodzenia na poziomie 90,63±-4,02 %.

Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA

Wykorzystanie szybkoskanującej woltamperometrii cyklicznej do pomiaru elektrycznie wywołanej dynamiki dopaminy presynaptycznej w skrawkach mózgowych prążkowia.

Dynamika dopaminy presynaptycznej w przekrojach mózgu w obrębie prążka z wykorzystaniem szybkiej woltamperometrii cyklicznej

Ten film demonstruje wszczepienie elektrod i kaniul u znieczulonego szczura w celu pomiaru uwalniania dopaminy w jądrze półleżącym za pomocą potencjostatu oraz infuzji leków w celu modulacji aktywności dopaminergicznej w brzusznej części nakrywki.

Monitorowanie uwalniania dopaminy w modelu szczurzym za pomocą manipulacji receptorem neuronów dopaminergicznych VTA

Ten protokół opisuje dwie różne manipulacje środowiskowe oraz równoległy protokół infuzji mózgu do badania wywołanych przez środowisko zmian w mózgu, leżących u podstaw adaptacyjnego zachowania i naprawy mózgu u dorosłych myszy.

Środowiskowe modulacje liczby neuronów dopaminowych śródmózgowia u dorosłych myszy

Szybko-skanująca cykliczna woltamperometria może monitorować in vivo neurotransmisję dopaminy w kontekście leków, chorób i innych eksperymentalnych manipulacji. W niniejszej pracy opisano implementację QNsim1.0, oprogramowania do modelowania elektrycznie stymulowanych odpowiedzi dopaminy zgodnie z ilościowym modelem neurobiologicznym w celu ilościowego oszacowania dynamiki uwalniania i wychwytu zwrotnego dopaminy.

Modelowanie danych szybkiego skanowania woltamperometrii cyklicznej na podstawie elektrycznie stymulowanych danych neurotransmisji dopaminy przy użyciu QNsim1.0

Wychwyt synaptosomalnej dopaminy i wysokosprawna chromatografia cieczowa stanowią eksperymentalne narzędzia do badania homeostazy dopaminy u myszy, oceniając odpowiednio funkcję transportera dopaminy i poziom dopaminy w tkance prążkowia. W tym miejscu przedstawiamy protokoły pomiaru zawartości dopaminy w tkance oraz oceny funkcjonalności transportera dopaminy.

Ocena homeostazy dopaminergicznej u myszy za pomocą analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej i wychwytu synaptosomalnego dopaminy

Identyfikacja receptora D1-alfa dopaminy w jądrze półleżącym jest kluczowa dla wyjaśnienia dysfunkcji receptora D1 podczas choroby ośrodkowego układu nerwowego. Przeprowadziliśmy nowatorski test hybrydyzacji RNA in situ, aby uwidocznić pojedyncze cząsteczki RNA w określonym obszarze mózgu.

Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ

Celem tego protokołu jest bezpośrednie manipulowanie receptorami brzusznego obszaru nakrywki w celu zbadania ich udziału w subsekundowym uwalnianiu dopaminy.

Skojarzona infuzja i stymulacja z woltamperometrią cykliczną Fast-Scan (CIS-FSCV) w celu oceny regulacji dopaminy fazowej przez receptory brzusznego obszaru nakrywki

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

Ten protokół pokazuje, jak pozyskać dane z rezonansu magnetycznego wrażliwego na neuromelaninę istoty czarnej.

Standaryzowane pozyskiwanie danych do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego wrażliwego na neuromelaninę istoty czarnej

Poznaj metodę precyzyjnej analizy regulacji dopaminy w istocie czarnej i brzusznej okolicy nakrywki u gryzoni. Technika HPLC i analiza białek pozwalają zrozumieć mechanizmy molekularne neuroprzekaźnictwa.

Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

Przeglądaj więcej filmów