Zmodyfikowana metoda EPA 1623 wykorzystująca ultrafiltrację przezroświećną z przepływem stycznym oraz etapy dysocjacji termicznej do wykrywania wodnych Cryptosporidium i Giardia spp.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie i wizualizacja gatunków cryptosporidium i giardia obecnych w wodzie. Zostaje to osiągnięte najpierw poprzez zagęszczenie próbki wody przy użyciu ultrafiltracji przepływu stycznego z wykorzystaniem włókien kapilarnych. Drugim krokiem jest elucja organizmów i usunięcie zanieczyszczeń z filtra po etapie wirowania.

Immunomagnetyczna separacja umożliwia selektywne oddzielenie pasożytów od skoncentrowanych zanieczyszczeń. Kulki magnetyczne są oddzielane od pasożytów poprzez dysocjację termiczną i usuwane za pomocą magnesu. Następnie cysty i oocysty nanosi się na szkiełko, a próbkę barwi w celu wizualizacji pod mikroskopem immunofluorescencyjnym.

Główną zaletą filtracji hofi w porównaniu z istniejącymi technikami jest fakt, że ultrafiltr jest znacznie tańszy i wychwytuje wiele mikroorganizmów oprócz Cryptosporidium i Giardia, takich jak wirusy i bakterie. Zazwyczaj osoby początkujące w separacji immunologicznej będą miały trudności z ilością i rodzajem zanieczyszczeń towarzyszących różnym próbkom pochodzącym z bardzo zróżnicowanych warunków klimatycznych. Należy rozpocząć od złożenia aparatury do ultrafiltracji wewnątrz komory bezpiecznej biologicznie.

Po złożeniu aparat działa w następujący sposób: próbka wody dostaje się do układu, przechodząc przez czarny łącznik T, następnie przepływa przez głowicę pompy, manometr i do ultrafiltra z pustych włókien; przefiltrowana woda wypływa z boku filtra do pojemnika na odpady. Zatrzymana woda zawierająca organizmy jest tłoczona do butelki z retentatem i recyrkulowana w układzie, aż do zredukowania objętości wody. Aby rozpocząć procedurę, należy zdjąć kapturek odpowietrzający i otworzyć wszystkie zaciski z wyjątkiem zacisku zaciskowego numer dwa, który powinien pozostać zamknięty, aby butelka z retentatem mogła napełnić się wodą; należy ustawić kierunek pompowania tak, aby próbka wody przepływała do filtra.

Następnie ustaw prędkość pompy na 25% i uruchom pompę, gdy butelka z renatem będzie wypełniona w dwóch trzecich. Otwórz zacisk nr dwa i szybko szczelnie zamknij butelkę za pomocą zakrętki odpowietrzającej. Sprawdź wszystkie przewody i połączenia, aby upewnić się, że nie ma żadnych wycieków.

Następnie powoli zwiększ prędkość pompy do około 1,5 litrów na minutę, korzystając z cylindra miarowego i stopera lub przepływomierza, i zweryfikuj, czy szybkość filtracji, czyli tempo wypływu wody z linii odpływowej, rzeczywiście wynosi 1,5 litrów na minutę. Monitoruj proces filtracji, dbając o to, aby butelka z retentatem nigdy nie opustoszała, choć jej objętość może nieznacznie wzrosnąć lub zmaleć. Jeśli objętość spadnie poniżej jednej trzeciej, zdejmij nasadkę odpowietrzającą i zamknij zacisk zaciskowy dwa.

Ponownie poczekaj, aż objętość w butelce wzrośnie do dwóch trzecich. Następnie szczelnie zakręć nasadkę odpowietrzającą i ponownie otwórz zacisk dwa. Gdy pojemnik z próbką będzie pusty, natychmiast zamknij zacisk zwężający, zmniejsz prędkość pompy do 20%, zdejmij nasadkę odpowietrzającą z butelki na retentat i zamknij zacisk rampy łączący rurkę odpływową kolumny filtrującej ze zbiornikiem na odpady.

Dokręć lub poluzuj zacisk rampy, aby ustawić objętość w butelce z retentatem na około 200 mililitrów. Następnie dokręć zacisk rampy dla eluentu, aby przeprowadzić eluowanie próbki. Najpierw dodaj 500 mililitrów roztworu eluentu do pojemnika z próbką, płucząc przy tym wnętrze pojemnika.

Następnie umieść pipetę o pojemności 10 ml, podłączoną do linii zasysania próbki, w pojemniku z roztworem elucian. Otwórz zacisk zaciskowy jeden i chwilowo zamknij zacisk zaciskowy dwa, aby zaciągnąć roztwór elucian. Po pobraniu całego roztworu zamknij zacisk zaciskowy jeden, otwórz zacisk zaciskowy dwa i pozwól roztworowi krążyć przez pięć minut przy prędkości pompy wynoszącej 20%dokręć lub poluzuj zacisk rampy, aby dostosować objętość próbki w butelce z renatem do około 100 ml.

Następnie całkowicie dokręć zacisk rampy i pozwól próbce rekirculować przez jedną minutę. W tym momencie zmień kierunek działania pompy na 20 sekund. Spowoduje to zgromadzenie około 225 mililitrów próbki w butelce tate.

Następnie wyłącz pompę. Zdejmij przewody z głowicy pompy oraz przewód wychodzący z filtra i przytrzymaj go nad butelką tate, aby wymusić przedostanie się pozostałej próbki do butelki. Następnie odłącz wszystkie przewody od butelki i zastąp nasadkę odpowietrzającą nasadką szczelną.

Przenieś skoncentrowaną próbkę do 250 mililitrowej stożkowej probówki do wirowania. Przepłucz butelkę z osadem dwukrotnie 10 mililitrami wody odczynnikowej, przenosząc płuczankę do probówki do wirowania. Wirować próbkę z prędkością co najmniej 1500 ×g przez 15 minut.

Nie należy używać funkcji hamowania, aby zatrzymać wirowanie. Po zakończeniu wirowania ostrożnie odessać nadsącz do poziomu 5 ml powyżej osadu. Należy zachować szczególną ostrożność, aby pozostać przy górnej granicy poziomu cieczy i uniknąć odessania cyst O oraz cyst znajdujących się w osadzie.

Wymieszaj zawartość probówki na wortexie, aby dokładnie resuspender osad. Następnie przenieś próbkę do probówki dyal L 10 o płaskim dnie zawierającej po jednym mililitrze 10 X buforu SL A i buforu B. Przepłucz probówkę wirówkową dwukrotnie 2,5 mililitrami wody odczynnikowej i dodaj roztwór płuczący do probówki dyal L 10. Doprowadzając objętość końcową do 12 mililitrów, dodaj do probówki po 100 mikrolitrów przeciwciał anty-Cryptosporidium oraz anty-Giardia sprzężonych z kuleczkami magnetycznymi.

Następnie obróć probówkę z prędkością 18 RPM przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na mieszalniku rotacyjnym. Przyłóż płaską stronę probówki do magnesu MP six i delikatnie nią potrząsaj przez dwie minuty, nie odsuwając probówki od magnesu. Trzymając płaską stronę u góry, odlej nadsącz.

Należy uważać, aby nie poruszyć kulek zatrzymanych na płaskiej ściance probówki w pobliżu magnesu. Wyjmij probówkę z próbką z magnesu i trzykrotnie przemyj płaską ściankę probówki 500 µl buforu A, unikając kontaktu z osadem znajdującym się po okrągłej stronie probówki. Każdą porcję płuczki przenieś do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml umieszczonej w magnesie MPCS.

Przy magnesie w pozycji pionowej zamknąć probówkę i delikatnie nią potrząsać przez jedną minutę. Następnie, pozostawiając magnes na miejscu, odessać supernatant za pomocą pipety Pasteura umieszczonej przy dnie probówki, a następnie delikatnie dodać do probówki 1 mL PBS.

Należy uważać, aby nie zaburzyć osadu z kulek. Przymocuj probówkę do ścianki w pobliżu magnesu. Usuń pasek magnetyczny i delikatnie kołysz probówką, aż kulki zostaną ponownie zawieszone.

Ponownie umieść pasek magnetyczny w pozycji pionowej. Delikatnie kołysz probówką przez minutę i odessij nadsącz, usuwając jak najwięcej zanieczyszczeń, aby nie poruszyć kulek. Po tym etapie płukania usuń magnes i dodaj 50 µL wody odczynnikowej bezpośrednio na osad z kulek.

Mieszaj probówkę w wstrząsarce wirowej (vortex) z maksymalną prędkością przez 50 sekund, aby resuspender kuleczki. Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 80 °C przez 10 minut, aby umożliwić dysocjację cyst Giardia oraz oocyst Cryptosporidium z kuleczek. Po inkubacji mieszaj próbkę w wstrząsarce wirowej przez 30 sekund. Następnie umieść pasek magnetyczny w urządzeniu MPCS w pozycji skośnej, aby oddzielić kuleczki od zawieszonych w próbce cyst i oocyst.

Przenieś supernatant zawierający cysty i O-cysty na szkiełko z wgłębnikami. Powtórz etapy dodawania wody, mieszania w wortexie oraz dysocjacji termicznej po raz drugi, dodając supernatant na to samo szkiełko. Następnie umieść szkiełko na podgrzewaczu do szkiełek o temperaturze 37 °C, aby wysuszyć zawiesinę.

Zacznij od naniesienia 50 µL metanolu na szkiełko w celu utrwalenia próbki, a następnie pozostaw je do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 50 µL roztworu DPI i inkubuj szkiełko przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Aby zabarwić jądra komórkowe, użyj chusteczki Kim wipe do odsączenia nadmiaru cieczy z dołka, uważając, aby nie dotknąć jego ścianek.

Następnie dodaj 50 µL barwnika easy stain, aby zabarwić ścianę komórkową cyst Giardia i cyst cryptosporidium o. Inkubuj próbkę w temperaturze 35 °C przez 30 minut. Usuń barwnik za pomocą chusteczki Kim wipe, analogicznie jak poprzednio.

Następnie powoli dodaj 300 µL zimnego buforu utrwalającego easy stain, ostrożnie umieszczając końcówkę pipety poza dołkiem i pozwalając cieczy wpłynąć do jego wnętrza. Inkubuj preparat przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie usuń bufor za pomocą chusteczki KimWipe i nałóż 10 µL medium montażowego; delikatnie połóż szkiełko nakrywkę na próbce, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza, i zabezpiecz krawędzie szkiełka bezbarwnym lakierem do paznokci. Używając mikroskopu fluorescencyjnego, zbadaj preparat przy powiększeniu od 200x do 1000x oraz przy użyciu filtra FITC i DPI; przy powiększeniu 200x cysty i O-cysty pojawiają się jako jaskrawoniezelone fluorescencyjne struktury jajowate z wyraźnie podkreślonymi krawędziami.

Cysty Cryptosporidium O są okrągłe i mają rozmiary od czterech do sześciu mikronów. Cysty Giardia są większe, o szerokości od pięciu do 15 mikronów i długości od ośmiu do 18 mikronów i przy powiększeniu 1000 x mogą być okrągłe lub owalne. Dzięki zastosowaniu filtra DPI można lepiej dostrzec strukturę wewnętrzną cyst.

Zazwyczaj wewnątrz cyst Cryptosporidium O cys oraz Giardia Cys.DIC widocznych jest do czterech sporozoitów, których jądra wybarwione metodą DPI mają jasnoniebieski kolor. Mikroskopia może również pomóc w prawidłowej identyfikacji pasożytów, gdyż pozwala na dostrzeżenie dodatkowych cech morfologicznych. Sporozoity Cryptosporidium mogą być widoczne w obrazowaniu DIC, natomiast cysty Giardia często wykazują jedną lub więcej rozpoznawalnych struktur wewnętrznych, takich jak widoczne jądra, narządy w kształcie półksiężyca zwane ciałkami medianami oraz wewnętrzne struktury wiciowe zwane aksonami.

Należy zauważyć, że procedura ultrafiltracji za pomocą włókien holo umożliwia wychwycenie wielu mikroorganizmów. Ponadto do skoncentrowanych próbek można zastosować inne testy detekcyjne, takie jak qPCR i genotypowanie, co czyni tę metodę bardziej elastyczną i łatwiejszą do dostosowania do konkretnych zastosowań. Dziękujemy za oglądanie i prosimy o kontakt w przypadku jakichkolwiek pytań.