Produkcja syntetycznego jedwabiu pajęczego w skali laboratoryjnej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie syntetycznego jedwabiu pajęczego poprzez naśladowanie naturalnego procesu przędzenia, aby odtworzyć proces wytwarzania nici jedwabnych w warunkach laboratoryjnych. Duże ilości rekombinowanego białka jedwabiu są produkowane w bakteriach, a następnie oczyszczane metodą chromatografii i zagęszczane poprzez liofilizację. Białko jest solubilizowane, a następnie masa przędzalna jest tłoczona przez strzykawkę z igłą o małej średnicy do kąpieli w alkoholu odwadniającym.

Na koniec syntetyczne włókna uzyskane po przędzeniu poddawane są rozciąganiu po przędzeniu w celu zwiększenia orientacji molekularnej łańcuchów białkowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektroprzędzenie czy przędzenie na sucho, jest niższy koszt, łatwość manipulacji oraz potencjał do rozszerzenia tej procedury do formatu produkcji na dużą skalę. Zastosowania tej techniki obejmują opracowanie nowej klasy biomateriałów.

Materiały te mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań, takich jak nici chirurgiczne, kamizelki kuloodporne, a także struny do instrumentów muzycznych. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w właściwości materiałowe pajęczej nici, może ona zostać zastosowana również do badania innych rodzajów biopolimerów wytwarzanych z białek rekombinowanych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mogą napotkać trudności, ponieważ wymaga ona wiedzy z wielu dziedzin, w tym z bioinżynierii, biofizyki, biologii komórkowej i molekularnej oraz biochemii.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy odtworzyć naturalny proces przędzenia wykonywany przez pająka w celu wytworzenia syntetycznych włókien. Aby wygenerować plazmid, który zostanie wykorzystany do produkcji pajęczyny, pożądane cDNA pajęczyny jest amplifikowane przy użyciu specyficznych zestawów starterów, a następnie ligowane do prokariotycznego wektora ekspresyjnego, takiego jak pBBA topo thio fusion. Wektor ten posiada terminalny znacznik tioredoksyny na końcu N, aby ułatwić solubilizację białka jedwabiu, oraz znacznik sześciu histydyn (6x His) na końcu C w celu oczyszczania białka.

Po ligacji produkty ligacji są transformowane do kompetentnych komórek e coli, a następnie hoduje się kolonię zawierającą plazmid. Ekspresję białka jedwabiu pająka indukuje się poprzez dodanie aose, po czym komórki są pelletowane i przechowywane w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Aby zlizować komórki bakteryjne, do pelletu komórkowego dodaje się 20 ml 1x buforu lizującego i całkowicie resuspenduje komórki, aby wspomóc dalszą lizę. Dodaje się lizozym do stężenia 1 mg/ml w celu strawienia DNA chromosomalnego, co zmniejsza lepkość roztworu przy 100 µg DNA.

Następnie umieść próbkę na wytrząsarce orbitalnej i delikatnie mieszaj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Poddaj roztwór sonikacji przez jedną minutę przy ustawieniu 19 w celu jego sklarowania, a następnie wiruj w wirówce przy 16 000 Gs przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu sprawdź, czy nadosad jest klarowny i nielepki; jeśli roztwór jest mętny i lepki, dodaj więcej DNAs, ponownie poddaj sonikacji i odzyskaj nadosad.

Gdy nadfiltr stanie się klarowny, przenieś go do czystej kolumny BioRad poly prep o pojemności 25 mililitrów w celu przeprowadzenia chromatografii powinowactwa z użyciem niklu NTA. Aby oczyścić białko fuzyjne, dodaj do kolumny jeden mililitr zawiesiny niklu NTA zawierającej 0,5 mililitra kulek, szczelnie zabezpiecz korek oraz kurek, a następnie umieść kolumnę na wytrząsaciu na jedną godzinę w celu ekwilibracji i umożliwienia związania tagu sześciokrotnego his z kulkami niklu NTA. Ustaw kolumnę pionowo na statywie i poczekaj około dwóch minut, aż kulki niklu NTA osiądą.

Gdy kuleczki całkowicie osiądą, na dnie pojawi się jasnoniebieska warstwa. Zdejmij korek i pozwól roztworowi przepłynąć przez kurek. Zbierz roztwór do 15 mililitrowej probówki stożkowej.

Do dalszej analizy dodaj 20 mililitrów 1x buforu do płukania i poczekaj, aż buraki opadną. Otwórz kurek i zbierz przelew w czterech alikwotach po 5 mililitrów. W celu dalszej analizy przechowuj alikwoty w temperaturze 4 stopni Celsjusza lub -80 stopni Celsjusza, odpowiednio w celu krótkoterminowego lub długoterminowego przechowywania.

Należy pamiętać, że można zastosować dodatkowe objętości płukania w celu zmniejszenia ilości zanieczyszczających białek, jednak może to obniżyć całkowitą wydajność białka. Następnie należy dodać 20 mililitrów buforu elucyjnego 1x i pozwolić żywicy osiąść, otworzyć kurek spustowy i pozwolić roztworowi przepłynąć. Należy zebrać ten roztwór o objętości 20 mililitrów w czterech alikwotach po 5 mililitrów do dalszej analizy.

Przechowywać w temperaturze 4°C w przypadku krótkoterminowego lub -80°C w przypadku długoterminowego przechowywania. Należy pamiętać, że w razie potrzeby z żywicy Ni-NTA można zebrać dodatkowe objętości elucji. Następnie oddzielić białka na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Za pomocą analizy SDS-PAGE należy zwizualizować białka przy użyciu srebra lub barwnika Coomassie brilliant blue R-250; do kolejnych etapów należy wykorzystać wyłącznie czyste frakcje. Tożsamość oczyszczonego białka należy potwierdzić analizą Western blot. Aby usunąć sole i skoncentrować białko, należy przeprowadzić dializę, a następnie liofilizować próbkę zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie; liofilizowane próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Celem następnych kroków jest przygotowanie roztworu przędzalnego i strzykawki do procesu przędzenia, pracując pod dygestorium.

Do każdej probówki z wysuszonym proszkiem białkowym ostrożnie dodaj odpowiednią ilość heksafluoroisopropanolu lub HFIP, aby uzyskać stężenie od 200 mg/ml do 500 mg/ml, czyli od 20% do 50% w/v. Zakręć probówkę tak szybko, jak to możliwe po dodaniu HFIP, zabezpiecz probówki folią i umieść je na kołysce w celu rozpuszczenia białka, stosując w razie potrzeby wortex w celu ułatwienia solubilizacji. Proces ten może potrwać do dwóch dni.

Po rozpuszczeniu odwiruj próbkę przy 16 000 G przez dwie do trzech minut. Gdy białko znajdzie się w roztworze, taką mieszaninę nazywa się masą przędzalną. Roztwór będzie bardzo lepki.

Upewnij się, że w roztworze nie ma agregatów, ponieważ mogą one zapchać strzykawkę. W następnym kroku ostrożnie pobierz co najmniej 25 µL przędziwa do strzykawki Hamilton Gast Tight, wyposażonej w igłę o średnicy 127 micron, trzymając strzykawkę igłą do góry podczas naciskania tłoka. Bardzo ważne jest usunięcie wszelkich pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one spowodować niejednorodności w otrzymanym włóknie.

Następnie zamocuj strzykawkę do pompy strzykawki Harvard Apparatus 11 Plus. Umieść zlewkę o pojemności 400 ml wypełnioną 95% izopropanolem na ruchomym statywie w taki sposób, aby końcówka strzykawki tylko lekko przebijała powierzchnię alkoholu. Ustaw pompę strzykawki na 15 µL/min i naciśnij start.

Wytłaczanie włókna. Powinno zająć od jednej do dwóch minut, w zależności od objętości początkowej roztworu przędzalniczego. Po wyprządzeniu całego roztworu do postaci włókna, należy pozostawić je w izopropanolu na 20 minut w celu pełnej równowagi.

Następnie próbkę pobiera się za pomocą urządzenia do nawijania. Wykorzystane tutaj urządzenie do nawijania zostało wykonane poprzez przyklejenie metalowych grzebieni do suwmiarki cyfrowej. Jak pokazano na tym obrazie, na obu stronach grzebienia w urządzeniu do nawijania należy nakleić taśmę dwustronną.

Następnie przymocuj urządzenie nawijające do silnika. Ustaw silnik tak, aby nawijał nici z prędkością 2 RPM. Następnie, używając pęsety, delikatnie chwyć jeden koniec włókna i powoli wyciągnij je z izopropanolu.

Przymocuj go do krawędzi jednego z ramion grzebienia na szpuli. Korzystając z dwustronnej taśmy, kolejne kilka kroków należy wykonać bez przerwy, aby zapobiec wysychaniu włókien. Włącz silnik i za pomocą szklanej rurki delikatnie naprowadź włókno na urządzenie do nawijania.

Należy dopilnować, aby włókna nie zaplątały się i nie nakładały na siebie. Taśma dwustronna powinna zapobiegać przesuwaniu się całego włókna i umożliwiać selektywne rozciąganie wewnętrznych segmentów włókien w obrębie ramion suwmiarki.

Po nawinięciu całego włókna, odłącz szpulę od silnika i nałóż klej na krawędź każdego włókna jedwabiu na dwustronnej taśmie. Pozwala to na przymocowanie jedwabiu pająka do aparatu. Przymocuj szpulę do siłownika liniowego, aby przeprowadzić wyciąganie po przędzeniu.

Wyznacz początkową długość włókien za pomocą C. Jest to długość wewnętrzna włókna. Nie obejmuje ona długości części przyklejonej i nawiniętej na szpulę. Zanurz szpulę w kąpieli z 75% izopropanolu.

Pozostaw włókna na 10 minut w celu wyrównania stanu równowagi. Ustaw prędkość siłownika liniowego na 1.5 millimeters per second. Na podstawie długości początkowej oblicz długość końcową dla pożądanego współczynnika rozciągania po wyciąganiu z pojemnika.

Stopień rozciągnięcia można kontrolować w zależności od prędkości lub długości, zależnie od konfiguracji układu. Na przykład, przy długości początkowej 15 mm i pożądanym współczynniku rozciągania po wyciągnięciu wynoszącym 3x, długość końcowa powinna wynosić 45 mm. Można to również obliczyć, uruchamiając siłownik liniowy na 20 s przy prędkości 1,5 mm/s.

Po drugie, po zakończeniu wyciągania z pojemnika, powoli podnieś szpulę z izopropanolu. Pozostaw krople izopropanolu do odparowania przez jedną minutę przed pobraniem próbek. W pierwszej kolejności odetnij jeden koniec włókna, trzymając drugi koniec pęsetą.

Odetnij ten koniec i zamocuj włókno na ramkach z brystolu lub folii w celu przeprowadzenia testów. Jeśli pożądane są dalsze współczynniki rozciągania po wyciągnięciu z pojemnika, ponownie zanurz szpulę w kąpieli z 75% izopropanolu. Pozostaw włókna na 10 minut w celu wyrównania stanu, a następnie przejdź do kolejnego pojemnika.

Współczynnik wydłużenia. Zapisz wilgotność i temperaturę, które mogą wpływać na włókna. Właściwości mechaniczne.

Pozostaw pobrane próbki do czasu wyrównania ich warunków z warunkami standardowego środowiska laboratoryjnego. Optymalne parametry to 40% wilgotności i 25 °C przez co najmniej jedną godzinę przed wykonaniem testów mechanicznych. Po zamocowaniu włókna na ramce z brystolu, nałóż superglue na krawędzie brystolu lub folii, aby unieruchomić włókno na ramce.

Należy odnotować wielkość otworu ramki. Jest to początkowa długość badanego włókna. Przedstawiono ramkę z otworem o szerokości jednej uncji; używając mikroskopu świetlnego z powiększeniem 100x lub większym, należy dokonać pomiarów średnicy wzdłuż osi podłużnej włókna.

Należy odnotować co najmniej trzy pomiary. Im większe powiększenie oraz im więcej wykonanych pomiarów, tym lepsza dokładność. Przymocuj ramkę z brystolu do mechanicznej ramy obciążeniowej Tenter.

Następnie przetnij ramkę z obu stron, tak aby naprężenie występowało wyłącznie w obrębie włókna. Zerwij próbkę i zbierz dane. Zalecana standardowa prędkość odkształcania wynosi 2% na sekundę.

Procedura zbierania danych mechanicznych może się różnić w zależności od marki ramki naprężeniowej użytej w badaniach. Na podstawie zebranych danych dotyczących średniej średnicy można wykreślić krzywą naprężenie-odkształcenie w programie Microsoft Excel. Przerwane włókno można teraz zamontować w skaningowym mikroskopie elektronowym w celu analizy morfologicznej i pomiaru średnicy w miejscu pęknięcia.

Segment włókna oddalony od miejsca przerwania można wykorzystać do oszacowania i sprawdzenia początkowej średnicy zmierzonej za pomocą mikroskopu świetlnego. Białko pajęczego jedwabiu MASP 1 zostało wyeksprymowane i oczyszczone z bakterii w celu określenia czystości białka przed przędzeniem włókna; białka poddano frakcjonowaniu według wielkości. Analiza SDS-PAGE z późniejszą wizualizacją za pomocą barwienia srebrem, jak pokazano tutaj, wykazuje w sześciu roztworach, że większość próbki uwalnia się w ciągu pierwszych czterech frakcji.

Białko jedwabiu pająka TUSP one zostało również wytworzone zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem i przędzone w włókna w celu określenia właściwości mechanicznych syntetycznych jedwabi o formie rurkowej. Włókna jedwabiu zostały przędzone, a następnie poddano je zwiększającym się stopniom rozciągania wtórnego. Kolory na tym obrazie przedstawiają włókna poddane różnym stopniom rozciągania wtórnego w zakresie od 2,5x do 6x. Włókna wykazują niską zmienność w obrębie grupy o tym samym stopniu rozciągania.

Wraz ze wzrostem współczynnika rozciągania w procesie przędzenia zwiększa się wytrzymałość włókna, natomiast jego rozciągliwość ulega zmniejszeniu. Włókna wykazywały jednak równoważne poziomy udarności. Aby ocenić ultrastrukturę włókien, wykonano obrazy z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej dla włókien przędzionych z rekombinowanych białek tsp one, co przedstawiono tutaj. Gładką powierzchnię zewnętrzną można zaobserwować przy powiększeniu 500x oraz 5 000x.

Gęsty rdzeń wewnętrzny można zaobserwować w miejscu naturalnego przełamania włókna. Sugeruje to, że białka rekombinowane prawidłowo montują się i upakowują podczas procesu ekstruzji. Po opanowaniu techniki, przy właściwym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu 10 dni.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest usunięcie wszystkich soli z oczyszczonego białka rekombinowanego przed etapem liofilizacji, a także upewnienie się, że zastosowano odpowiednie stężenie prz пряdki, aby zapobiec zapchaniu igły podczas procesu ekstruzji zgodnie z tą procedurą. Inne fibroiny, takie jak mes, P one TUSB one oraz P ysb one, mogą być prządane w formie pojedynczych włókien lub kompozytów w celu wytworzenia szerokiej gamy biomateriałów po ich opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny bioinżynierii i inżynierii materiałowej do badania zastosowań syntetycznych jedwabi pajęczych w medycynie wojskowej, sztuce, sporcie oraz przemyśle motoryzacyjnym.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo lepiej rozumieć sposób przędzenia syntetycznych włókien jedwabnych lub materiałów kompozytowych z wykorzystaniem białek oczyszczonych z bakterii. Należy pamiętać, że praca z AFib może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak praca pod dygestorium.