Name: Ortotopowy model guza pęcherza moczowego i ocena dopęcherzowego leczenia saRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metodę tworzenia ortotopowego modelu guza pęcherza moczowego u myszy immunokompromitowanych oraz ocenę skuteczności dopęcherzowego leczenia saRNA z wykorzystaniem ultrasonografii i obrazowania bioluminescencyjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te są finansowane z grantu AACR Henry Shepard Bladder Cancer Research Grant (09-60-30-LI).

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
 <li>Ludzką linię komórkową raka pęcherza moczowego KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) hoduje się w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 50 μg/ml gentamycyny. </li>
 <li>Kultury utrzymuje się w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2, wymieniając pożywkę co dwa do trzech dni. </li>
 <li>Komórki zbierano poprzez trawienie trypsyną i zliczano za pomocą hemocytometru. W soli fizjologicznej (PBS) przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek o stężeniu 2 x 106 komórek w 50 μl, którą przechowywano w lodzie. </li>
</ol>
2. Ortotopowy model nowotworu pęcherza moczowego
<ol>
 <li> Wykorzystano samice myszy nude (nu/nu) w wieku 8-10 tygodni (Simonsen Laboratory, Gilory, CA). </li>
 <li> Na podkładce grzewczej należy rozłożyć jałową draperię, która posłuży jako platforma chirurgiczna. Należy przygotować jałowy żel nawilżający, cewniki 24G z wprowadnikami, roztwór azotanu srebra oraz jałową wodę. </li>
 <li> Znieczulenie ogólne u myszy indukuje się za pomocą wziewnego izofluranu (3% do indukcji, 1-2% do podtrzymania), a następnie podtrzymuje za pomocą maski nosowej. Do oczu zwierzęcia nakłada się jałową maść oftalmiczną, a do utrzymania ciepłoty ciała stosuje się podkładkę grzewczą. </li>
 <li> Mysz należy ułożyć w pozycji grzbietnej.</li>
 <li> Srom myszy należy delikatnie uchwycić pincetą w celu stabilizacji. </li>
 <li> Cewnikowanie cewki moczowej myszy wykonuje się za pomocą dożylnego cewnika 24G po usunięciu igły prowadzącej. Należy zastosować obfitą ilość środka nawilżającego. Przy myszy w pozycji grzbietnej cewka moczowa znajduje się bezpośrednio za fałdami sromowymi i przed pochwą. Początkowo przyjmuje się kąt 45 stopni, aby wprowadzić cewnik do cewki moczowej i przejść pod kością łonową. Następnie stosuje się mniejszy kąt, aby przejść przez cewkę moczową do pęcherza. Pomocne może być delikatne uciskanie miednicy w celu wyprostowania cewki moczowej. Należy zachować ostrożność, aby nie naciskać zbyt mocno w przypadku napotkania oporu, ponieważ może to doprowadzić do perforacji cewki moczowej lub pęcherza. Pojawienie się moczu w cewniku potwierdza jego obecność w świetle pęcherza. </li>
 <li> Mocz z cewnika i światła pęcherza odsysa się za pomocą igły prowadzącej. Igła prowadząca jest używana do wszystkich kolejnych aspiracji i iniekcji, podczas gdy cewnik pozostaje w miejscu. Pozwala to na wstrzykiwanie precyzyjnych objętości poprzez wyeliminowanie przestrzeni martwej w cewniku i sprawia, że wielokrotne cewnikowanie staje się niepotrzebne.</li>
 <li> Aby uszkodzić warstwę glikozaminoglikanów urothelium pęcherza, wstrzykuje się 10 μL 0,5 M azotanu srebra i pozostawia go na 10 sekund. Może to doprowadzić do powstania białego osadu z pozostałym moczem. </li>
 <li> Osad oraz zawartość pęcherza należy odessać i usunąć za pomocą igły prowadzącej. </li>
 <li> Pęcherz należy przepłukać, wstrzykując 100 μL jałowej wody. Następnie wodę należy odessać i usunąć. Płukanie jałową wodą należy powtórzyć 3 razy, co daje łącznie 4 płukania. </li>
 <li> Wokół ujścia cewki moczowej należy zawiązać jedwabną nić 4-0, aby zamknąć cewkę moczową w przygotowaniu do usunięcia cewnika. </li>
 <li> Za pomocą igły prowadzącej wstrzykuje się wcześniej przygotowane 2 x 106 komórek KU-7-luc2-GFP w 50 μL. </li>
 <li> Cewnik i igłę prowadzącą należy usunąć jednocześnie, pozostawiając cewkę moczową zamkniętą jedwabną nicią. </li>
 <li> Myszy utrzymuje się w znieczuleniu ogólnym przez 2 godziny, po czym usuwa się jedwabną nić i doprowadza zwierzę do przebudzenia. </li>
</ol>
3. Ultradźwięki
<ol>
 <li>Znieczulenie ogólne indukuje się za pomocą odparowanego izofluranu i utrzymuje przy użyciu maski nosowej.</li>
 <li>Wykorzystano system wysokorozdzielczego obrazowania mikrostrukturalnego In Vivo VisualSonics Vevo 770 (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Kanada) z głowicą RMV-704 40 MHz.</li>
 <li>Myszy umieszcza się w pozycji grzbietnej na platformie do USG.</li>
 <li> tylne kończyny zwierzęcia należy przymocować taśmą, aby uniknąć nadmiernych ruchów podczas manipulowania głowicą ultradźwiękową.</li>
 <li> Na miednicę myszy nakłada się żel do USG.</li>
 <li> Głowicę ultradźwiękową RMV-704 (40 MHz) opuszcza się na miednicę myszy, aby uzyskać obrazy w przekroju poprzecznym lub podłużnym.</li>
 <li> W przypadku wykrycia guza obrazy mogą zostać zapisane w celu pomiaru jego wymiarów.</li>
</ol>
4. Obrazowanie bioluminescencyjne
<ol>
 <li> Wykonaj wtrysk doszpczewnowy 200 μL (150 mg/kg) substratu lucyferyny. </li>
 <li> Wprowadź znieczulenie ogólne za pomocą odparowanego izofluranu i utrzymuj je poprzez stożek nosowy. </li>
 <li> Umieść myszy w pozycji grzbietnej w urządzeniu do obrazowania bioluminescencyjnego. </li>
 <li> Pięć minut po wtrysku lucyferyny zmierz bioluminescencję zwierzęcia w fotonach na sekundę. </li>
</ol>
5. Przygotowanie saRNA
<ol>
 <li> Zsyntetyzować oligonukleotydy RNA w skali 50-100 μmol. </li>
 <li> Przeprowadzić hybrydyzację komplementarnych jednoniciowych oligonukleotydów w celu otrzymania dwuniciowych saRNA. </li>
 <li> Nanocząsteczki lipidowe (LNP)-saRNA przygotować z wykorzystaniem jonizowalnego lipidu 1,2-dilinoleyl-4-(2- dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane (DLinKC2-DMA), dListeroylphosphatidyl choline, cholesterolu oraz PEG–DMG, stosując procedurę formulacji opartą na spontanicznym tworzeniu pęcherzyków, zgodnie z wcześniejszym opisem.1 </li>
</ol>
6. Podanie dostraszykalne sformułowanego saRNA
<ol>
 <li> Po stworzeniu ortotopowego modelu nowotworu pęcherza moczowego, myszy poddaje się leczeniu poprzez podanie dojścia do pęcherza (dożylnie) małego aktywującego RNA (saRNA) sformułowanego w nanocząsteczkach lipidowych (LNPs) (Tabela 1). </li>
 <li> Znieczulenie ogólne wprowadza się i utrzymuje za pomocą odparowanego izofluranu, a do oczu aplikuje się sterylny lubrykant oftalmiczny.</li>
 <li> Zwierzę należy ułożyć w pozycji na plecach. </li>
 <li> Należy przeprowadzić cewnikowanie moczowodu zgodnie z wcześniejszym opisem. </li>
 <li> Wokół cewki moczowej i cewnika należy zawiązać jedwabną nicią 4-0. </li>
 <li> Za pomocą pustej strzykawki i igły z prowadnikiem należy odessać cały mocz z cewnika i pęcherza. </li>
 <li> LNP-saRNA wstrzykuje się do pęcherza moczowego w całkowitej dawce 50 μL (3 mg/kg). Jednocześnie należy usunąć cewnik i igłę z prowadnikiem, pozostawiając cewkę moczową zamkniętą za pomocą jedwabnej nici.</li>
 <li> Mysz pozostaje pod narkozą z zamkniętą cewką moczową przez 2 godziny. </li>
 <li> Leczenie z wykorzystaniem LNP-saRNA podawanego do pęcherza rozpoczęto w 4. dniu po implantacji guza. Myszy leczono seryjnie, co 3 dni, łącznie przez 14 zabiegów.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Guzy pęcherza moczowego pochodzące z komórek KU-7-luc2-GFP można monitorować za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego lucyferazy (Rycina 1A i C) oraz USG pęcherza moczowego (Rycina 1B i D). Guzy są często wykrywalne w ciągu 3–5 dni po inokulacji komórek. Odnotowaliśmy pomyślną implantację guza pęcherza u ponad 90% myszy. W miarę wprowadzania leczenia wewnątrz pęcherzowego dsRNA, postęp nowotworu można monitorować za pomocą tych metod. Po uśmierceniu zwierzęcia wzrost guza można również potwierdzić za pomocą fluorescencji GFP. W ujęciu ogólnym średnia bioluminescencja korelowała ze średnimi wymiarami w badaniu USG dla guzów pęcherza, co widoczne jest na Rycynach 1C i 1D. Jednak po uśmierceniu zwierząt i potwierdzeniu obecności guza za pomocą GFP stwierdzono, że bioluminescencja ściślej korelowała z obecnością żywej tkanki nowotworowej niż pomiary USG. Było to szczególnie wyraźne u myszy leczonych saRNA (w przeciwieństwie do grupy kontrolnej), ponieważ pozostała tkanka bliznowata u leczonych myszy była często widoczna w USG, ale nie można jej było odróżnić od żywego guza.
<img src="/files/ftp_upload/4207/4207fig1.jpg" alt="Analiza bioluminescencyjna i obrazowanie ultrasonograficzne wzrostu guza; zawiera wykresy intensywności w czasie." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Kinetyka wzrostu guzów pęcherza moczowego. (A) Obrazowanie bioluminescencyjne mierzy aktywność lucyferazy w guzach pęcherza w celu potwierdzenia ich lokalizacji i wzrostu. (B) Ultrasonografia pęcherza in vivo z użyciem głowicy 40MHz generuje obrazy guzów, których wymiary można dokładnie zmierzyć. (C) Wykresy ilustrujące postępujący wzrost bioluminescencji i wymiarów ultrasonograficznych guza. Wartości reprezentują średnie pomiary (+/- odchylenie standardowe) z 6 zwierząt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4207/4207fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.

<ol><li>Semple, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+cationic+lipids+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rational design of cationic lipids for siRNA delivery.</a> Nature. 28, 172-176 (2010).</li>
<li>Li, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+dsRNAs+induce+transcriptional+activation+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).</li>
<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+effect+of+dsRNA-induced+p21%28WAF1%2FCIP1%29+gene+activation+in+human+bladder+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells.</a> Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).</li>
<li>Chancellor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+results+of+myoblast+injection+into+the+urethra+and+bladder+wall%3A+a+possible+method+for+the+treatment+of+stress+urinary+incontinence+and+impaired+detrusor+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+urodynamics%22%5BJournal%5D)">Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility.</a> Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).</li>
<li>Hadaschik, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumour+inoculation+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+international%22%5BJournal%5D)">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU international. 100, 1377-1384 (2007).</li>
<li>Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bladder+Wall+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Bladder Wall Injection.</a> J. Vis. Exp. (53), e2523(2011).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Model+of+Murine+Bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Model of Murine Bladder.</a> Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535(2011).</li>
<li>Dinney, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+urology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).</li>
</ol>

L.C.L. jest wymienionym wynalazcą w oczekujących wnioskach patentowych dotyczących saRNA, które zostały złożone przez University of California San Francisco i licencjonowane firmie Alnylam Pharmaceuticals.

Przedstawiamy protokół ustanowienia ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pęcherza moczowego u myszy, a następnie leczenia guzów metodą wewnątrz pęcherzową z zastosowaniem saRNA sformułowanego w LNP, który celuje w promotor p21CIP1/WAF1 (p21) w celu aktywacji transkrypcyjnej.2, 3 Powstałe guzy można potwierdzić i monitorować za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego oraz USG pęcherza moczowego. Modele ortotopowe mogą być lepsze od modeli doszczepowych, podskórnych lub dożylnych, ponieważ z...

<table><tbody><tr><td>Komórki KU-7-luc-GFP</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>128091</td><td></td></tr><tr><td>myszy nago-tymiczne (nu/nu)</td><td>Simonsen Laboratories</td><td>wiek 6-7 tygodni</td><td>Sim:(NCr) nu/nu fisol</td></tr><tr><td>Urządzenie do ultrasonografii</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>Vevo 770</td><td>sonda RMV-704</td></tr><tr><td>Urządzenie do bioluminescencji</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>IVIS Spectrum</td><td> </td></tr><tr><td>Kaniula Exel safelet</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24G X &amp;#190;&quot;</td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8157</td><td> </td></tr><tr><td>Strzykawka Hamiltona</td><td>Hamilton Co</td><td>80301</td><td> </td></tr><tr><td>LNP-saRNA</td><td>Alnylam Pharmaceuticals</td><td></td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.</td></tr></tbody></table>

ortotopowy model nowotworu pęcherza moczowego oraz ocena leczenia wewnątrz pęcherzowego za pomocą sarna

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

Przedstawiamy nowatorską metodę leczenia raka pęcherza moczowego z wykorzystaniem wewnątrz pęcherzowego podania małych aktywujących RNA (saRNA) w ortotopowym modelu ksenoprzeszczepu guza pęcherza moczowego u myszy. Model mysi jest opracowywany poprzez cewnikowanie cewki moczowej w znieczuleniu ogólnym wziewnym. Następnie, aby uszkodzić warstwę glikozaminoglikanów pęcherza i umożliwić przyleganie komórek, w śluzówce pęcherza wywołuje się oparzenie chemiczne za pomocą wewnątrz pęcherzowego roztworu azotanu srebra. Po kilkukrotnym przemyciu sterylną wodą, ludzkie komórki raka pęcherza moczowego KU-7-luc2-GFP są wprowadzane przez cewnik do pęcherza, gdzie pozostają przez 2 godziny. Następujący po tym wzrost guzów pęcherza jest potwierdzany i monitorowany za pomocą ultradźwiękowego badania pęcherza in vivo oraz obrazowania bioluminescencyjnego. Następnie guzy są leczone wewnątrz pęcherzowo za pomocą saRNA sformułowanego w nanocząsteczkach lipidowych (LNPs). Wzrost guza jest monitorowany za pomocą ultradźwięków i bioluminescencji. Wszystkie etapy tej procedury są zaprezentowane w towarzyszącym filmie.

Ustanowienie ortotopowego modelu nowotworu pęcherza moczowego w celu oceny efektów przeciwnowotworowych wewnątrz pęcherzowo podanego saRNA oraz monitorowanie wzrostu guza za pomocą ultradźwięków i obrazowania bioluminescencyjnego.

Ortotopowy model nowotworu pęcherza moczowego oraz ocena leczenia wewnątrz pęcherzowego za pomocą saRNA

Przedstawiamy nowatorską metodę leczenia raka pęcherza moczowego z zastosowaniem wewnątrz pęcherzykowego podawania małych aktywujących RNA (saRNA) w ortotopowym ksenoprzeszczepie pęcherza moczowego myszy...

Przedstawiamy metodę tworzenia ortotopowego modelu nowotworu pęcherza moczowego u myszy z niedoborem odporności. Nowotwory te są leczone za pomocą dostarczanego do naczyń krwionośnych krótkiego dwuniciowego RNA, a ich monitorowanie odbywa się przy użyciu ultrasonografii pęcherza moczowego oraz obrazowania bioluminescencyjnego. Znieczulenie ogólne indukuje się za pomocą odparowanego izofluranu, a do oczu aplikuje się sterylną maść oftalmiczną.Myszy umieszcza się następnie w pozycji na plecach, a znieczulenie utrzymuje się za pomocą izofluranu podawanego przez stożek nosowy. Następnie należy przeprowadzić kaniulację myszy. Stosujemy kaniulę dożylną o rozmiarze 24G po usunięciu prowadnika igły.Cewnikowanie jest często najtrudniejszym i najmniej przewidywalnym etapem protokołu. Obfite nawilżenie żelem KY oraz poprawna technika są kluczami do skutecznego cewnikowania. Przedstawiony tutaj jest obszar sromu myszy.Cewka moczowa znajduje się bezpośrednio pod fałdami sromowymi. Po nawilżeniu, za pomocą kleszczy do cewników, delikatnie chwyta się i stabilizuje srom oraz cewkę moczową. Początkowo, w celu kaniulacji cewki moczowej, zastosowano większy kąt 45 stopni, lecz po wprowadzeniu do cewki przyjęto mniejszy kąt, aby gładko przejść do pęcherza.W tym miejscu zaprezentujemy ten proces. Ponownie podkreślamy, że delikatny ucisk miednicy w celu wyprostowania cewki moczowej może często pomóc; należy jednak zachować ostrożność, aby nie naciskać zbyt mocno w przypadku napotkania oporu, ponieważ może to doprowadzić do perforacji cewki moczowej lub pęcherza. Widoczny tutaj w cewniku mocz potwierdza prawidłowe umieszczenie w świetle pęcherza.Mocz znajdujący się w cewniku zostaje następnie usunięty za pomocą igły styletu, a cewnik pozostaje w miejscu. Około pięciu milimetrów cewnika powinno pozostać widocznych na zewnątrz cewki moczowej, aby końcówka cewnika znajdowała się w świetle pęcherza, a nie opierała się o jego ścianę. Jeśli cewnik zostanie wprowadzony zbyt głęboko, końcówka może wbić się w ścianę pęcherza i uniemożliwić wstrzykiwanie substancji.W przypadku wszystkich kolejnych wstrzyknięć strzykawkę nałożoną na igłę kaniuli wprowadza się przez cewnik. Pozwala to na podanie precyzyjnych objętości poprzez wyeliminowanie przestrzeni martwej wewnątrz cewnika, a także sprawia, że wielokrotne cewnikowanie w celu wywołania oparzenia ściany pęcherza staje się zbędne.Wstrzyknięto 10 µL 0,5 M azotanu srebra i pozostawiono go na 10 sekund. Azotan srebra może tworzyć biały osad w reakcji z resztkowym moczem w pęcherzu. Osad ten oraz pozostała ciecz są usuwane z cewnika.Następnie przystępujemy do płukania pęcherza 100 µL sterylnej wody czterokrotnie, za każdym razem usuwając płyn z kanału cewnika. Po tym pierwszym płukaniu w cewniku wciąż widoczny jest biały osad, jednak z każdym kolejnym płukaniem płyn staje się coraz bardziej przejrzysty. Do zamknięcia cewki moczowej używa się nici jedwabnej 4-0, po czym jesteśmy gotowi do wstrzyknięcia komórek nowotworowych.Komórki wprowadza się do strzykawki przymocowanej do igły stiletowej, a następnie wstrzykuje do pęcherza moczowego. Cewnik zostaje usunięty, a cewka moczowa pozostaje podwiązana przez dwie godziny, podczas gdy mysz znajduje się pod wpływem znieczulenia. W ustalonych odstępach czasu monitoruje się progresję nowotworu.Z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego in vivo, myszy otrzymują najpierw wtryśnięcie lucyferazy i substratu drogą domięśniową. Po wprowadzeniu znieczulenia ogólnego za pomocą odparowanego izofluranu, myszy są umieszczane w pozycji grzbietnej w urządzeniu IVIS. Bioluminescencję mierzy się w jednostkach fotonów na sekundę.Obecność komórek KU7 w pęcherzach myszy jest wyraźnie widoczna, a natężenie bioluminescencji można śledzić w czasie. Obecność i progresję guzów pęcherza można również monitorować za pomocą obrazowania ultradźwiękowego. Po wprowadzeniu w narkozę ogólną za pomocą odparowanego izofluranu, stosuje się sterylną maść oftalmiczną.Myszy kładzie się w pozycji grzbietowej na stole do badań ultrasonograficznych. Utrzymanie znieczulenia odbywa się poprzez podawanie izofluranu za pomocą maski nosowej. Tylne kończyny myszy można przymocować do stołu, aby uniknąć nadmiernych ruchów ciała podczas manipulowania głowicą USG.Po zakończeniu tej czynności na środkową część miednicy zwierzęcia nakłada się żel ultradźwiękowy. Po nałożeniu żelu głowicę o częstotliwości 40 MHz mocuje się w uchwycie i powoli opuszcza na ciało zwierzęcia. Pęcherz moczowy jest wyraźnie widoczny jako okrągła, położona w linii środkowej struktura hipoechogeniczna.Jeśli zwierzę nie uległo znacznemu podrażnieniu przed znieczuleniem, pęcherz jest zazwyczaj już rozciągnięty i w naszej ocenie cewnikowanie myszy w celu uzyskania rozciągnięcia pęcherza jest zbędne. W takim przypadku można uzyskać obrazy zarówno w przekroju poprzecznym, jak i podłużnym. Guz jest łatwo widoczny w świetle pęcherza.W przypadku wykrycia guza obrazy mogą zostać zapisane w celu pomiaru jego wymiarów. Po ustaleniu obecności guza pęcherza moczowego, myszy są poddawane leczeniu wewnątrz pęcherzowemu za pomocą małych dwuniciowych RNA sformułowanych w nanocząsteczkach lipidowych. Podaje się środek znieczulający i ponownie aplikuje maść oftalmiczną.Następnie mysz umieszcza się w pozycji grzbietowej i przeprowadza kaniulację cewki moczowej. Zgodnie z wcześniejszym opisem, do zamknięcia cewki moczowej wokół cewnika używa się szwu jedwabnego o grubości 4-0. Zazwyczaj zawiązuje się dwa węzły, tak jak pokazano tutaj.Do całkowitego opróżnienia pęcherza wykorzystuje się pustą strzykawkę z założoną igłą z prowadnikiem. Wewnątrz pęcherza podaje się 50 µL krótkich dwuniciowych RNA, aby uzyskać całkowitą dawkę 3 mg/kg. Następnie usuwa się igłę oraz cewnik.Mysz pozostanie pod narkozą z zamkniętą cewką moczową przez łącznie dwie godziny. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć metodę tworzenia ortotopowego modelu guza pęcherza moczowego u myszy, monitorowania guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i ultrasonografii oraz leczenia guza za pomocą wewnątrz pęcherzowego podania małego RNA. Technika ta ma pewne niuanse, które wymagają praktyki, zwłaszcza w zakresie kateteryzacji, ale ogólnie jest to protokół, który powinien być łatwy do powtórzenia.Osiągnęliśmy sukces w szczepieniu guzów pęcherza moczowego u myszy, a efekty leczenia za pomocą małego RNA są bardzo obiecujące. Jednak najbardziej ekscytującym aspektem tego protokołu jest fakt, że choć w tym przypadku myszy leczyliśmy małym RNA, tę samą technikę można wykorzystać do testowania dowolnej terapii wewnątrz pęcherzowej w leczeniu raka pęcherza moczowego.I.

an-orthotopic-bladder-tumor-model-evaluation-intravesical-sarna

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model ortotopowego guza pęcherza i ocena leczenia saRNA wewnątrzmięśniowego

Guzy pęcherza moczowego u myszy żeńskich indukuje się w sposób małoinwazyjny poprzez cewnikowanie, lokalną kauteryzację oraz następującą po niej adhezję komórek raka do miejsc oparzeń.

Ortotopowy model mysiego raka pęcherza moczowego

W tym filmie opisujemy ortotopową transplantację hodowanych organoidów guza pęcherza moczowego do mysiego pęcherza moczowego, aby zbadać rolę środowiska narządu w rozwoju nowotworów.

Model organoidów guza pęcherza moczowego: metoda ortotopowego przeszczepu organoidów pęcherza moczowego do mysiego pęcherza biorcy

W tym filmie opisujemy dopęcherzową procedurę dostarczania komórek rakowych do pęcherza moczowego modelu mysiego. Procedura ta pomaga wygenerować ortotopowy model guza pęcherza moczowego, który można wykorzystać do opracowania strategii terapeutycznych.

Modelowanie ortotopowego guza pęcherza moczowego w modelu mysim: procedura dopęcherzowego podawania komórek rakowych do mysiego pęcherza moczowego

Implantacja komórek nowotworowych do narządu pochodzenia może służyć jako użyteczny model przedkliniczny do oceny nowych terapii. Komórki raka pęcherza moczowego MB49 mogą być hodowane w pęcherzu moczowym po wkropleniu dopęcherzowym. Protokół ten demonstruje cewnikowanie pęcherza myszy w celu implantacji guza i dostarczenia adenowirusa.

Ortotopowy model raka pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Tutaj opisana jest metoda tworzenia syngenicznego mysiego modelu ortotopowego guza pęcherza moczowego w celu oceny skuteczności przeciwnowotworowej białka bakteryjnego HP-NAP.

Ocena skuteczności białka H. pylori HP-NAP jako narzędzia terapeutycznego w leczeniu raka pęcherza moczowego w ortotopowym modelu myszy

Ten protokół opisuje powstawanie mysich ortotopowych guzów pęcherza moczowego u samic myszy C57BL/6J oraz monitorowanie wzrostu guza.

Mysi ortotopowy model guza pęcherza moczowego i system wykrywania guzów

Guzy pęcherza moczowego u myszy są wywoływane przez rakotwórczy N-butyl-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoaminowy czynnik rakotwórczy (BBN). Wytwarzanie guzów pęcherza moczowego jest niejednorodne; Dlatego konieczna jest dokładna ocena obciążenia guzem przed randomizacją do leczenia eksperymentalnego. Tutaj przedstawiamy szybki, niezawodny protokół MRI do oceny wielkości i stadium guza.

Rezonans magnetyczny Ocena rakotwórczych guzów pęcherza moczowego myszy

Ten protokół opisuje generowanie modeli ortotopowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów poprzez dopęcherzowe wkraplanie komórek raka urotelialnego o wysokim stopniu złośliwości lub dodoodbytnicze wstrzykiwanie komórek raka jelita grubego do myszy z nieotyłym cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) w celu pierwotnego wzrostu guza i spontanicznych przerzutów pod wpływem komórek zrębu węzłów chłonnych, co naśladuje postęp ludzkich chorób przerzutowych.

Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów pobrane od pacjentów dla ludzkiego raka urotelialnokomórkowego i raka jelita grubego, wzrostu guza i spontanicznych przerzutów

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Poznaj metodę tworzenia ortotopowego modelu guza pęcherza moczowego u myszy immunokompromitowanych oraz ocenę skuteczności dopęcherzowego leczenia saRNA z wykorzystaniem ultrasonografii i obrazowania bioluminescencyjnego.

Ortotopowy model nowotworu pęcherza moczowego oraz ocena leczenia wewnątrz pęcherzowego za pomocą saRNA

Przeglądaj więcej filmów