Ortotopowy model guza pęcherza moczowego i ocena dopęcherzowego leczenia saRNA

Przedstawiamy metodę ustalania ortotopowego modelu guza pęcherza moczowego u myszy z obniżoną odpornością. Leczenie tych guzów za pomocą dostarczanego donaczyniowo małego dwuniciowego RNA i monitorowanie guzów zarówno za pomocą ultrasonografii pęcherza moczowego, jak i obrazowania bioluminescencyjnego. Znieczulenie ogólne indukuje się odparowanym izofem, fluorem i nakłada się sterylną maść okulistyczną.

Mysz jest następnie umieszczana w pozycji leżącej, a znieczulenie jest utrzymywane za pomocą izofluoru przez stożek nosowy. Następnie mysz musi zostać cewnikowana. Używamy cewnika dożylnego o rozmiarze 24 z usuniętym sztyftem igłowym.

Cewnikowanie jest często najtrudniejszym i najbardziej nieprzewidywalnym etapem protokołu. Wystarczające nawilżenie galaretką KY i prawidłowa technika są kluczem do udanego cewnikowania. Pokazany tutaj jest obszar sromu myszy.

Cewka moczowa leży tuż pod fałdami sromu. Po nasmarowaniu kleszczyki cewnika służą do delikatnego chwytania i stabilizacji sromu i cewki moczowej. Początkowo do kaniulacji cewki moczowej stosowano bardziej stromy kąt 45 stopni, ale po wejściu do cewki moczowej przyjmuje się bardziej płytki kąt, aby płynnie przejść do pęcherza.

Pokażemy ten proces tutaj. Po raz kolejny delikatny nacisk miednicy w celu wyprostowania cewki moczowej często może pomóc i należy zachować ostrożność, aby nie naciskać zbyt mocno na opór, ponieważ może to prowadzić do perforacji cewki moczowej lub pęcherza. Mocz widoczny tutaj w cewniku potwierdza to miejsce w świetle pęcherza moczowego.

Mocz z cewnika jest następnie usuwany za pomocą igły do sztyftu, a cewnik pozostawia się na miejscu. Około pięciu milimetrów cewnika powinno pozostać widoczne na zewnątrz cewki moczowej, tak aby końcówka cewnika pozostała w świetle pęcherza, a nie przy ścianie pęcherza. Jeśli cewnik zostanie umieszczony zbyt głęboko w cewniku, końcówka może osadzić się w ścianie pęcherza moczowego i uniemożliwić wstrzyknięcia.

Do wszystkich kolejnych wstrzyknięć. Przez cewnik wprowadza się strzykawkę umieszczoną na igle do trzpienia. Pozwala to na wstrzykiwanie dokładnych objętości poprzez eliminację martwej przestrzeni w cewniku i sprawia, że wielokrotne cewnikowanie nie jest konieczne, aby spowodować oparzenia ściany pęcherza.

Wstrzykuje się 10 mikrolitrów 0,5-molowego azotanu srebra i pozostawia na 10 sekund. Azotan srebra może tworzyć biały osad z resztkami moczu w pęcherzu. Ten osad i pozostały roztwór są usuwane z cewnika.

Następnie przystępujemy do mycia pęcherza 100 mikrolitrami sterylnej wody cztery razy za każdym razem, usuwając płyn ze światła cewnika. Po tym pierwszym płukaniu biały osad jest nadal widoczny w cewniku, ale z każdym płukaniem płyn stanie się bardziej klarowny. Do zamknięcia cewki moczowej używa się czteroosobowego jedwabnego krawata i jesteśmy teraz gotowi do wstrzyknięcia komórek rakowych.

Komórki są ładowane do strzykawki przymocowanej do igły z trzpieniem sztyftowym, a następnie wstrzykiwane są do pęcherza moczowego. Cewnik zostanie usunięty, a cewka moczowa pozostanie związana z myszą w znieczuleniu przez dwie godziny. W ustalonych odstępach czasu monitorowana jest progresja guza.

Korzystając z obrazowania bioluminescencyjnego in vivo, myszom najpierw wstrzykuje się Lucyfer i substrat za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego. Po ustaleniu znieczulenia ogólnego za pomocą odparowanego izofluoru, myszy umieszcza się w pozycji leżącej w maszynie ivus. Bioluminescencję mierzy się w jednostkach fotonów na sekundę.

Obecność siedmiu komórek KU w pęcherzach myszy jest łatwo widoczna, a intensywność bioluminescencji można śledzić w czasie. Obecność i progresję guzów pęcherza moczowego można również monitorować za pomocą obrazowania ultrasonograficznego. Po indukcji znieczulenia ogólnego za pomocą odparowanego izofu nakłada się fluor i jałową maść okulistyczną.

Mysz umieszcza się w pozycji leżącej na stole ultrasonograficznym. Znieczulenie podtrzymujące uzyskuje się za pomocą izofluoru przez stożek nosowy. Tylne nogi myszy można przymocować do stołu, aby uniknąć nadmiernego ruchu ciała podczas manipulowania sondą ultradźwiękową.

Po zakończeniu żel ultradźwiękowy nakłada się na część środkową miednicy zwierzęcia. Po nałożeniu żelu sonda o mocy 40 megaherców jest mocowana do urządzenia przytrzymującego i powoli opuszczana na ciało zwierzęcia. Pęcherz moczowy jest łatwo widoczny jako okrągła hipoechogeniczna struktura w linii środkowej.

Jeśli zwierzę nie uległo znacznemu podrażnieniu przed znieczuleniem, pęcherz moczowy jest zazwyczaj już rozdęty i stwierdziliśmy, że nie ma potrzeby cewnikowania myszy w celu uzyskania wzdęcia pęcherza. Można tu uzyskać zarówno obrazy poprzeczne, jak i podłużne. Guz jest łatwo widoczny w świetle pęcherza moczowego.

Jeśli guz zostanie znaleziony, obrazy mogą zostać zapisane w celu pomiaru wymiarów guza. Po ustaleniu guza pęcherza moczowego myszy są leczone dopęcherzowo małymi dwuniciowymi RNA sformułowanymi w nanocząsteczkach lipidowych. Ustala się znieczulenie ogólne i ponownie nakłada się maść okulistyczną.

Mysz jest następnie umieszczana w pozycji leżącej na plecach i wykonuje się cewnikowanie cewki moczowej. Jak opisaliśmy wcześniej, szew jedwabny z czterema oh służy do zamknięcia cewki moczowej wokół cewnika. Zazwyczaj dwa węzły są wiązane, jak pokazano tutaj.

Pusta strzykawka załadowana na igłę z trzpieniem jest używana do całkowitego opróżnienia pęcherza. 50 mikrolitrów małego, dwuniciowego RNA wkrapla się dopęcherzowo, co daje łączną dawkę trzech miligramów na kilogram. Następnie usuwa się igłę i cewnik.

Mysz pozostanie znieczulona z niedrożną cewką moczową przez łącznie dwie godziny. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć metodę tworzenia ortotopowego modelu guza pęcherza moczowego myszy monitorującego guz za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i ultradźwięków oraz leczenia guza za pomocą dopęcherzowo dostarczonego małego RNA. Istnieją pewne niuanse w technice, która wymaga pewnej praktyki, zwłaszcza w przypadku cewnikowania, ale ogólnie rzecz biorąc, jest to protokół, który powinien być łatwy do odtworzenia.

Odnieśliśmy duży sukces w umieszczaniu guzów pęcherza moczowego u myszy, a efekty leczenia małym RNA są bardzo obiecujące. Jednak najbardziej ekscytujące w tym protokole jest to, że podczas gdy leczyliśmy myszy małym RNA, ta sama technika może być użyta do przetestowania dowolnej terapii dopęcherzowej raka pęcherza moczowego.