Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pozyskanie wielopotencjalnych komórek zrębowych z tkanki tłuszczowej w celu ich różnicowania osteogennego, z wykorzystaniem in vivo modelu defektu sklepienia czaszki u myszy. Jest to realizowane poprzez wstępne wyizolowanie komórek progenitorowych z frakcji naczyniowo-zrębowej tkanki tłuszczowej, którą można uzyskać po zabiegu liposukcji. Kolejnym krokiem jest przygotowanie trójwymiarowego stelaża, a następnie wysianie komórek na tym rusztowaniu.

Ostatnim krokiem jest utworzenie krytycznego ubytku w sklepieniu czaszki w modelu szczura, w który wprowadzane są rusztowania i komórki. Ostatecznie wyniki pokazują, że wielopotencjalne komórki zrębowe wyizolowane z tkanki tłuszczowej mają potencjał do regeneracji szkieletu in vivo. Zastosowania tej techniki obejmują szerokie spektrum możliwych wdrożeń klinicznych ze względu na niedobór tkanek dostępnych do regeneracji układu kostnego.

Chociaż autologiczne przeszczepy kostne są złotym standardem, brak miejsc poboru oraz zachorowalność w miejscu dawstwa ograniczają tę opcję. Można stosować allografty i materiały obce, jednak ich użycie jest ograniczone przez koszty, słabą integrację oraz ryzyko infekcji.

Możliwość wykorzystania tkanki tłuszczowej do izolacji komórek progenitorowych w inżynierii tkanki szkieletowej jest obiecująca. Procedurę zaprezentujemy ja oraz Michael Chung z laboratorium long anchor. W pierwszej kolejności należy pozyskać ludzką tkankę tłuszczową podskórną z planowych zabiegów liposukcji.

Należy zwrócić uwagę na dwie warstwy w aspiracie tłuszczowym. Nadpływ zawiera zdecydowaną większość przetworzonego materiału komórkowego. Dolna warstwa to głównie wstrzyknięta sól fizjologiczna.

Stromalne komórki pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być pozyskiwane z którejkolwiek z warstw, jednak wydajność jest znacznie większa w przypadku nadsączu. Aby wyizolować frakcję naczyniowo-stromalną (SVF), przemyć aspirat tłuszczowy wielokrotnie równymi objętościami 1x fosforanu soli buforowej (PBS) zawierającej 2,5% Betadyny, a następnie aspirować równą objętość 1x PBS bez Betadyny. Pozostawić do sedymentacji.

Należy przez cały czas zachować sterylność pracy, aby uniknąć kontaminacji przetworzoną tkanką ludzką. Następnie, po każdym przemyciu, odessać dolną warstwę i ją usunąć. Przenieść 15 ml tkanki tłuszczowej do konicznych probówek Falcon o pojemności 50 ml. Następnie poddać tkankę tłuszczową trawieniu w 15 ml przefiltrowanego roztworu 0,075%.

Inkubować kolagenazę typu dwa w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej przez 60 minut przy stałym mieszaniu, pamiętając o wietrzeniu probówek co 15 minut. Następnie zneutralizować aktywność enzymu za pomocą 15 ml PBS zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i odwirować. W wyniku tego procesu powstanie gęsty osad SVF, będący mieszaniną mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego oraz erytrocytów.

Najpierw odlej tłustą warstwę znad osadu, a następnie usuń nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu. Resuspenduj osad w 10 mililitrach tradycyjnej pożywki wzrostowej. Następnie połącz zawartość trzech probówek w jednej czystej probówce stożkowej o pojemności 50 mililitrów, przepuszczając ciecz przez filtr 100 mikronów, i odwiruj.

Odlej nadsącz, nie naruszając osadu, a następnie resuspenduj osad. W pięciu mililitrach tradycyjnej pożywki wzrostowej połącz dwie probówki stożkowe o pojemności 50 ml na jedną płytkę 10 cm lub pięć probówek stożkowych o pojemności 5 ml na jedną płytkę 15 cm. Hodowle pierwotne prowadź przez noc w temperaturze 37 °C przy 21% tlenu i 5% dwutlenku węgla.

Po inkubacji przez noc wypłucz płytki buforem PBS, aby usunąć pozostałe, nieprzylegające erytrocyty. Otrzymane populacje komórek to mezenchymalne komórki macierzyste pochodzenia tłuszczowego. Utrzymuj komórki na poziomach subkonfluencyjnych, aby zapobiec spontanicznemu różnicowaniu.

W temperaturze 37 °C, przy 21% tlenu i 5% dwutlenku węgla. W pożywce hodowlanej komórki zazwyczaj wymagają pasażowania co trzy do czterech dni w standardowej pożywce wzrostowej. Po osiągnięciu 50% konfluencji w naczyniu, przygotować rusztowanie zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie.

Gdy komórki osiągną poziom subkonfluencji, przemyć je dwukrotnie PBS i poddać trypsynizacji. Policz komórki w celu ich ilościowego oznaczenia. Do wysiewu przygotuj rusztowania o średnicy 4 mm, na których należy wysiać 1,5 × 10⁵ komórek.

Umieść pojedynczy rusztowanie w jednym dołku płytki 96-dołkowej, a następnie resuspenduj komórki w zwykłej pożywce wzrostowej w stężeniu około 1,5 × 10⁵ komórek na 20 µL pożywki. Zasiej rusztowanie, pipetując 20 µL roztworu bezpośrednio na rusztowanie, a następnie umieść go w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 minut.

Po 30 minutach dodaj 200 µL pożywki i inkubuj komórki na rusztowaniu przez noc. Przed operacją nie ma konieczności upewniania się, czy komórki przylgnęły do rusztowania po zasiewie. Odpowiednia liczba komórek zapewni, że większość z nich przytwierdzi się do rusztowania.

Po znieczuleniu dorosłej, 60-dniowej myszy nude szczepu CD-1, należy trzykrotnie wysterylizować pole operacyjne Betadyną i alkoholem, a następnie nałożyć lubrykant na oczy zwierzęcia. Następnie wykonuje się cięcie wzdłuż linii pośrodkowej w przedniej części skóry głowy myszy, aby odsłonić prawą kość ciemieniową. Oponę okostną należy usunąć z prawej kości ciemieniowej za pomocą tępego skrobania.

Następnie należy wykonać jednostronny defekt pełnej grubości o średnicy czterech milimetrów w prawej kości ciemieniowej, z dala od szwów czaszkowych. Używając wiertła z diamentową powłoką, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić leżącej poniżej opony twardej, ponieważ grubość czaszki myszy przed implantacją wynosi mniej niż 0,3 mm. Rusztowania należy przepłukać sterylnym PBS, aby zapobiec przeniesieniu czynników wzrostu pochodzących z pożywki.

Umieść rusztowanie w ubytku. Na koniec zaszyj skórę i monitoruj zwierzę zgodnie z ustalonymi protokołami pooperacyjnymi. Wykonaj mikro-tomografię komputerową (micro CT) u myszy i uzyskaj obraz z rekonstrukcją 3D przy użyciu oprogramowania microview.

Użyj programu Adobe Photoshop, aby dostosować rozmiar obrazów do standardowej wysokości. Zazwyczaj pomiary regeneracji sklepienia czaszki wykonujemy co dwa tygodnie. Myszy są znieczulane podczas skanowania w ramach długoterminowej obserwacji, a ostatecznie poddawane eutanazji.

Do analizy histologicznej należy wykorzystać funkcję magicznej różdżki w celu pomiaru liczby pikseli defektu kalwarialnego. Procentowy stopień gojenia defektu należy określić na podstawie kolejnych skanów CT. Po pomiarze powierzchni defektu kalwarialnego i wyznaczeniu liczby pikseli oraz podzieleniu jej przez liczbę pikseli defektu pierwotnego, należy zabarwić wiele przekrojów wzdłuż obszaru defektu, stosując barwniki histologiczne, takie jak błękit anilinowy i czerwień alizarynowa, w celu wykazania osteogenezy.

Użyj programu Adobe Photoshop, aby wyciąć wszystkie obszary znajdujące się poza defektem kalwariów, a następnie za pomocą narzędzia magiczna różdżka określ liczbę pikseli nowo powstałej kości w obszarze defektu i porównaj te wyniki z grupami kontrolnymi lub innymi zmiennymi. Poniżej przedstawiono przegląd procesu pobierania i aplikacji aspiratu tłuszczowego, od izolacji stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej, przez ich ekspansję i różnicowanie, aż po zastosowanie in vitro oraz in vivo. Tutaj znajduje się obraz z mikro-CT obrazujący gojenie in vivo krytycznego defektu kalwariów po aplikacji ASC za pomocą rusztowania z hydroksyapatytu, widoczne w dolnym rzędzie.

Kontrole, przedstawione w górnym rzędzie, obejmują brak rusztowania oraz defekt. Środkowy rząd przedstawia defekt z umieszczeniem rusztowania bez komórek. Przedstawione tutaj LS to kwantyfikacja gojenia kostnego na podstawie mikro-CT, która wykazuje istotnie zwiększone gojenie w grupie A SC.

Jest to obraz histologiczny ukazujący zwiększoną osteogenezę w grupie A SC za pomocą barwienia andal. Na niebiesko i pen AROM barwienie dla al. Na niebiesko osteoid barwi się na ciemnoniebieski w przypadku pen arom.

Przedstawione tutaj żółte barwienia osteoidu to ludzkie ASC oznakowane GFP, które zasiano na rusztowanie i pobrano po dwóch tygodniach. Barwienie wykonano z użyciem przeciwciała oznakowanego GFP, aby wykazać udział ludzkich komórek w regeneracji w obszarze defektu. Przedstawiona tutaj immunochemia ludzkiego antygenu jądrowego wykazuje przewagę ludzkich komórek w obszarze defektu po dwóch tygodniach.

Po opanowaniu techniki, obróbka tkanki tłuszczowej może zostać wykonana w ciągu czterech godzin, a procedura chirurgiczna zajmuje około 10 minut na mysz. Należy pamiętać, że kość ciemieniowa jest okrągła, podczas gdy wiertło jest płaskie, dlatego należy zachować ostrożność, aby przebić się przez cały obwód czteromilimetrowego defektu. Pamiętaj, aby wiercić powoli, aby uniknąć uszkodzenia opony twardej w mózgu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat izolacji komórek progenitorowych z tkanki tłuszczowej. Należy wysiać te komórki na rusztowanie, a następnie przeszczepić je do organizmu myszy.