Name: Mechaniczna stymulacja hydrożeli chondrocytowo-agarozowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-27T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Poznaj metodę dynamicznego obciążenia mechanicznego chondrocytów w hydrożelach agarozowych. Technika ta pozwala ocenić syntezę kolagenu i proteoglikanów w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Izolacja pierwotnych chondrocytów stawowych
Pobierz 10-15 plastrów chrząstki o pełnej grubości z powierzchni stawowych stawów zwierzęcych (np. stawu śródręczno-paliczkowego u dojrzałych szkieletowo krów pozyskanych z lokalnej rzeźni).
<ol>
 <li>Umieścić plasterki chrząstki w szalce Petri 100 mm i inkubować w 20 ml 0,5% proteazy w Ham's F-12 (w/v) przez 2 hr w 37 °C. Przepłukać trzykrotnie w pożywce Ham's F-12 i inkubować z 20 ml 0,15% kolagenazy A w pożywce Ham's F-12 przez noc w 37 °C.</li>
 <li>Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sito o oczkach 200 mesh do czystej szalki. Przepłukać filtr 5 ml Ham's F-12 i dodać do szalki. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 50 ml. Przepłukać szalkę Petri 10 ml Ham's F-12 i dodać do probówki stożkowej.</li>
 <li>Wirować probówkę przy 600-800 rcf przez 6-8 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Odssać nadosad, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, i ponownie zawiesić w 40 ml pożywki Ham's F-12.</li>
 <li>Wirować probówkę przy 600-800 rcf przez 6-8 min.</li>
 <li>Powtórzyć kroki 1.4 i 1.5 jeszcze dwa razy, aby łącznie wykonać je 3 razy. Przed trzecim wirowaniem resuspendować osad poprzez wytrząsanie i pobrać alikwot 500 μl do zliczenia komórek.</li>
 <li>Policzyć żywe komórki metodą wykluczania błękitu trypanu9 przy użyciu hemacytometru i odwróconego mikroskopu świetlnego.</li>
 <li>Odssać nadosad i zawiesić osad w objętości pożywki Ham's F-12 tak, aby uzyskać dwukrotność pożądanej gęstości wysiewu (np. 20 x 106 komórek/ml dla końcowego stężenia 10 x 106 komórek/ml po enkapsulacji).</li>
</ol>
2. Enkapsulacja chondrocytów w hydrożelu agarozowym
<ol>
 <li>Podgrzać 0,8 g autoklawowanej agarozy typu VII w 20 ml sterylnego 1x PBS (pH 7,4) na płycie grzewczej ustawionej na 120 °C aż do rozpuszczenia. Po rozpuszczeniu obniżyć temperaturę do 60 °C, ponieważ wyższe temperatury wpływają na żywotność komórek.</li>
 <li>W stożkowej probówce o pojemności 50 ml dokładnie wymieszać równe objętości zawiesiny komórek z agarozą o dwukrotnie wyższym stężeniu niż pożądane (np. 4% zawiesina agarozy dla końcowego 2% hydrożelu agarozowego). Unikać powstawania dużych pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one wpływać na żywotność komórek i trwałość zmęczeniową konstrukcji.</li>
 <li>Ostrożnie odmierzyć 10 ml mieszaniny chondrocytów i agarozy do szalki Petriego o średnicy 60 mm, unikając powstawania dużych pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Pozostawić na 30 min w temperaturze pokojowej do czasu zżelowania.</li>
 <li>Pobrać wymaganą liczbę próbek hydrożelu agarozowego z chondrocytami (zazwyczaj 20-30), używając wycinaka do biopsji o średnicy 4 mm.</li>
 <li>Zmierzyć i zapisać wymiary fizyczne (średnicę i wysokość) reprezentatywnych próbek za pomocą mikrometru. Konstrukcje powinny mieć wysokość około 5 mm; należy odrzucić próbki pobrane z obszaru, w którym wariancja wysokości próbki przekraczała 2%.</li>
 <li>Przenieść próbki do nowej szalki Petriego o średnicy 60 mm i uzupełnić 10 ml pożywki kompletnej (np. 20% płodowej surowicy bydlęcej w pożywce hodowlanej Ham's F-12 z 20 mM HEPES, 100 μg/ml kwasu askorbinowego oraz 2x antybiotykami/antymykotykami).</li>
</ol>
3. Stymulacja mechaniczna i znakowanie radiacyjne hydrożeli z chondrocytów i agarozy
<ol>
 <li>Zautoklawować metalowe elementy zestawu do kompresji. Komponenty plastikowe wysterylizować 70% etanolem (przez noc) oraz światłem UV (przez co najmniej 15 min).</li>
 <li>Aby zapobiec przewracaniu się konstruktów, za pomocą pęsety umieścić 12 sterylnych plastikowych pierścieni stabilizujących (o średnicy wewnętrznej większej niż średnica konstruktu) (n=6, próbki i kontrole) w dołkach płytki hodowlanej 24-dołkowej.</li>
 <li>Za pomocą pęsety ostrożnie przenieść hydrożele chondrocytowo-agarozowe z szalki Petriego do płytki 24-dołkowej, zabezpieczając każdy z nich w pierścieniu stabilizującym.</li>
 <li>Przenieść 400 μl pełnej pożywki (np. 20% FBS w pożywce hodowlanej Ham's F-12 z 20 mM HEPES, 100 μg/ml kwasu askorbinowego oraz 2x antybiotykami/antybiotykami przeciwgrzybiczymi) do każdego dołka z próbką.</li>
 <li>Złożyć wysterylizowany zestaw do kompresji (Rysunek 1) i zabezpieczyć talerze za pomocą śrub imbusowych. Przymocować zestaw do kompresji do płytki hodowlanej 24-dołkowej.</li>
 <li>Poluzować i ponownie dokręcić śruby imbusowe, aby ustanowić kontakt między talerzem a hydrożelem (stan zerowego odkształcenia).</li>
 <li>Załadować złożony zestaw do kompresji do systemu testów mikromechanicznych Mach-1. Zabezpieczyć zestaw na stole pionowym za pomocą bolca pozycjonującego i zablokować śrubą imbusową. Usunąć szablon dystansowy.</li>
 <li>Zastosować dynamiczne obciążenie kompresyjne o żądanej amplitudzie (np. amplituda odkształcenia 10% w stosunku do pierwotnej wysokości próbek), częstotliwości (np. 1 Hz) oraz czasie trwania lub liczbie cykli (np. interwały czasowe do 60 min).</li>
 <li>Po zakończeniu stymulacji mechanicznej ponownie założyć szablon dystansowy, poluzować śrubę imbusową bolca pozycjonującego i wyjąć zestaw do kompresji oraz płytkę hodowlaną z systemu testów mikromechanicznych Mach-1.</li>
 <li>Oznakować radiacyjnie konstrukty komórkowo-hydrożelowe poprzez uzupełnienie pożywki o 5 μCi wybranego izotopu (np. znacznik białkowy [3H]-prolina dla syntezy kolagenu specyficznego dla chondrocytów oraz [35S]-siarka dla syntezy proteoglikanów).</li>
 <li>Inkubować oznakowane radiacyjnie konstrukty przez 24 hr w temperaturze 37 °C, 5% CO210.</li>
 <li>Zebrać oznakowane radiacyjnie konstrukty hydrożelowe i wypłukać 3 razy w 1x PBS (pH 7.4), aby usunąć niewbudowany izotop. Przetrawić próbki za pomocą papainy (40 μg/ml w 20 mM octanie amonu, 1 mM kwasie etylenodiaminooctowym i 2 mM ditiotreitolu w 65 °C przez 72 hr).</li>
 <li>Niezwłocznie po trawieniu papainą przeprowadzić analizę zawartości DNA w hydrolizacie przy użyciu testu z barwnikiem PicoGreen11 oraz pomiar aktywności wbudowanego izotopu, znormalizowany do zawartości DNA, za pomocą β-scyntylacji w cieczy12,13.</li>
</ol>
Uwaga: Zakup i utylizacja materiałów radioaktywnych (izotopów odpadowych oraz przedmiotów, które mogły mieć kontakt z materiałami radioaktywnymi) muszą być zgodne z odpowiednimi instytucjonalnymi (i/lub rządowymi) politykami i procedurami dotyczącymi bezpiecznego obchodzenia się z substancjami radioaktywnymi i ich utylizacji.
4. Reprezentatywne wyniki
Konstrukcje hydrożelowe z agarozy i wołowych chondrocytów stawowych (2% agarozy z enkapsulowanymi komórkami w zagęszczeniu 10 x 106 komórek/ml) poddawano stymulacji mechanicznej z amplitudą odkształcenia ściskającego 10% przy częstotliwości 1 Hz przez 20 do 60 min (lub od 1200 do 3600 cykli), a następnie analizowano zawartość DNA oraz syntezę macierzy zewnątrzkomórkowej metodą wbudowy radioizotopów. Synteza DNA i macierzy zewnątrzkomórkowej zmieniała się w sposób zależny od dawki. Zawartość DNA wykazała istotny spadek o 35% w wyniku 20 lub 30 min stymulacji (p&lt;0,01), podczas gdy 60 min stymulacji nie wywołało żadnego efektu (Rycina 2). Synteza kolagenu i proteoglikanów specyficznych dla chrząstki (oznaczona odpowiednio poprzez wbudowywanie [3H]-proliny i [35S]-siarki) wykazała istotne wzrosty o około 60% w odpowiedzi na 20 lub 30 min stymulacji (p&lt;0,01), przy czym 60 min stymulacji nie wywołało zauważalnego efektu (Rycina 3).
<img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="Schemat systemu mikrofluidycznego; montaż chipa dla laboratorium na chipie, analiza DNA, konfiguracja sterowania przepływem." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Schemat niestandardowej aparatury do kompresji dynamicznej służącej do stymulacji konstruktów chondrocytów w agarozie. Lewo: Zmontowana aparatura. Prawo: Widok rozstrzelony przedstawiający poszczególne komponenty.
<img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="Wykres zawartości DNA; wykres słupkowy przedstawia wpływ czasu stymulacji na zawartość DNA." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Zmiany zawartości DNA w hydrożelach agarozowych z chondrocytami, poddanych stymulacji mechanicznej przy amplitudzie odkształcenia ściskającego 10% z częstotliwością 1 Hz przez okres od 20 do 60 min (średnia ± SEM, n=6/grupa).
<img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy syntezy macierzy zewnątrzkomórkowej; poziomy kolagenu i proteoglikanów w zależności od czasu stymulacji." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Zmiany w syntezie macierzy zewnątrzkomórkowej (kolagenu i proteoglikanów) w hydrożelach agarozowych z chondrocytami, stymulowanych mechanicznie przy amplitudzie odkształcenia ściskającego 10% z częstotliwością 1 Hz przez 20 do 60 min (średnia ± SEM, n=6/grupa).

<ol><li>Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+remodeling+in+response+to+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).</li>
<li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+articular+cartilage+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of articular cartilage in health and disease.</a> Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).</li>
<li>Neu, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interface+of+functional+biotribology+and+regenerative+medicine+in+synovial+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).</li>
<li>Demarteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+of+cartilage+constructs+engineered+from+expanded+human+articular+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+intermittent+compressive+stimulation+improves+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).</li>
<li>Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+of+chondrocyte-seeded+fibrin+gels%3A+effects+on+matrix+accumulation+and+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).</li>
<li>Buschmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+compression+modulates+matrix+biosynthesis+in+chondrocyte%2Fagarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture.</a> Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).</li>
<li>Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+compression+alters+proteoglycan+deposition+and+matrix+deformation+around+individual+cells+in+cartilage+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants.</a> Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).</li>
<li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cartilage+matrix+by+mammalian+chondrocytes+in+vitro.+I.+Isolation%2C+culture+characteristics%2C+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology.</a> The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).</li>
<li>Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+chondrocytes+embedded+in+3D+constructs%3A+in+vitro+methods+for+assessment+of+morphological+and+metabolic+response+to+compressive+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain.</a> Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).</li>
<li>McGowan, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+quantification+of+DNA+in+human+articular+and+septal+cartilage+using+PicoGreen+and+Hoechst+33258%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).</li>
<li>Fan, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intermittent+static+biaxial+tensile+strains+on+tissue+engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage.</a> Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).</li>
<li>Kaupp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+vibrations+increase+the+proliferation+of+articular+chondrocytes+in+high-density+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+H%3A+Journal+of+Engineering+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+intermittent+shear+deformation+improves+the+quality+of+cartilaginous+tissue+formed+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+application+of+cyclic+loading+can+accelerate+matrix+deposition+and+enhance+the+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).</li>
<li>Kisiday, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dynamic+compressive+loading+on+chondrocyte+biosynthesis+in+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds.</a> Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).</li>
<li>Chowdhury, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+chondrocyte+metabolism+in+agarose+constructs+subjected+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisana metoda aplikacji kontrolowanych bodźców mechanicznych do hydrożeli agarozowych zasiewionych komórkami umożliwia bezpośrednie badanie wpływu dynamicznych sił kompresyjnych na metabolizm chondrocytów. Zastosowanie specjalnie zaprojektowanego zestawu testowego wraz z pierścieniami stabilizującymi zapewniło ograniczenie boczne konstruktów, co pozwoliło uniknąć potencjalnych problemów z przechylaniem się próbek. Wykorzystanie talerzy obciążających z obciążeniem statycznym, zabezpieczonych śrubami zestawowymi, zapewnia...

<table><tbody><tr><td>Pożywka Ham's F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH3001002</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki/antybiotyki przeciwgrzybicze</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop Canada Ltd.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanu</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr Reichert Bright-Line&lt;strong&gt; &lt;/strong&gt;</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Papaina z lateksu papai</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa, typ VII</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>Filtr z siatki (200)</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>S4145</td><td></td></tr><tr><td>Mikromechaniczny tester Mach-1</td><td>Biomomentum Inc.</td><td>V500cs</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do obciążania ściskaniem</td><td>Własnej konstrukcji</td><td></td><td>Podobny produkt może zostać dostarczony przez Biomomentum Inc.</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka hodowlana Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B353047</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Licznik scyntylacyjny w cieczy</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td></td></tr><tr><td>[3H] Prolina</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NET323005MC</td><td></td></tr><tr><td>[35S] Siarka</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEX041005MC</td><td></td></tr></tbody></table>

mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Chrząstka stawowa wykazuje ograniczoną zdolność do regeneracji w przypadku uszkodzeń mechanicznych lub degradacji wywołanej chorobą, taką jak choroba zwyrodnieniowa stawów. Aby zniwelować ten niedobór, opracowano kilka interwencji medycznych. Jedną z takich metod jest pokrycie uszkodzonego obszaru chrząstką otrzymaną metodami inżynierii tkankowej; jednak tkanka taka zazwyczaj nie posiada właściwości biochemicznych i trwałości chrząstki natywnej, co stawia pod znakiem zapytania jej długoterminową przeżywalność. Ogranicza to zastosowanie inżynierii tkankowej chrząstki do naprawy małych ubytków ogniskowych, w której ochrona wszczepionego materiału zależy od otaczającej go tkanki. W celu poprawy właściwości opracowanej tkanki popularną metodą wykorzystywaną do zwiększenia syntezy pozakomórkowej macierzy chrzęstnej, a także wynikających z tego właściwości mechanicznych tkanki inżynieryjnej, jest stymulacja mechaniczna. Stymulacja mechaniczna polega na przyłożeniu do konstruktów tkankowych sił analogicznych do tych występujących in vivo. Opiera się to na założeniu, że środowisko mechaniczne w części reguluje rozwój i utrzymanie tkanki natywnej1,2. Najczęściej stosowaną formą stymulacji mechanicznej w inżynierii tkankowej chrząstki jest kompresja dynamiczna przy fizjologicznych odkształceniach wynoszących około 5-20% przy częstotliwości 1 Hz1,3. Liczne badania nad efektami kompresji dynamicznej wykazały jej pozytywny wpływ na metabolizm i biosyntezę chondrocytów, co w ostateczności wpływa na właściwości funkcjonalne opracowanej tkanki4-8. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę mechanicznej stymulacji konstruktów z hydrożelu agarozy z chondrocytami pod wpływem kompresji dynamicznej oraz analizujemy zmiany w biosyntezie za pomocą testów biochemicznych i radioizotopowych. Metodę tę można łatwo zmodyfikować w celu oceny wszelkich potencjalnych zmian w odpowiedzi komórkowej wywołanych bodźcami mechanicznymi.

Biosynteza chrzęstnej macierzy pozakomórkowej przez chondrocyty może ulegać zmianom pod wpływem bodźców mechanicznych. Niniejsza metoda opisuje technikę aplikowania dynamicznych odkształceń ściskających do chondrocytów zamkniętych w konstrukcjach 3D oraz ocenę indukowanych zmian w metabolizmie chondrocytów.

Mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy

Chrząstka stawowa charakteryzuje się ograniczoną zdolnością do regeneracji w przypadku uszkodzeń mechanicznych lub degradacji wywołanej chorobami, takimi jak choroba zwyrodnieniowa stawów. Aby zaradzić...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest poddanie hydrożeli z zasianymi komórkami dynamicznemu mechanicznemu obciążeniu ściskającemu. W tym celu komórki pierwotne pozyskuje się poprzez sekcję i trawienie enzymatyczne plastrów chrząstki. Wyizolowane komórki są zamykane w 2% hydrożelu agros, a konstrukty z zasianymi komórkami są tworzone przy użyciu wycinaka do biopsji.Następnie próbki umieszcza się w uchwycie do obciążania ściskającego, a następnie wprowadza do mikro-stymulatora mechanicznego Mach One. Do konstruktów zasianych komórkami stosuje się dynamiczne obciążenie ściskające w celu oceny syntezy kolagenu i proteoglikanów. Po inkubacji konstrukty są znakowane radioaktywnie w celu oceny wbudowania.Izotopy są oznaczane ilościowo za pomocą zliczania scyntylacyjnego, a uzyskane dane są normalizowane do ilości DNA. Zawartość wykazuje zmiany w syntezie macierzy zewnątrzkomórkowej po stymulacji mechanicznej. Metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o odpowiedzi w miejscu kontaktu oraz o stymulacji mechanicznej.Metodę tę można zastosować również do innych układów, takich jak komórki macierzyste, inne tkanki łącznej lub komórki mechanoreceptywne. Stawy śródręczno-paliczkowe od dojrzałych szkieletowo krów użyte w tej procedurze zostały pobrane z lokalnej rzeźni w sterylnym obszarze sekcyjnym. W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy umieścić plastry chrząstki w szalce Petri o średnicy 100 mm zawierającej 20 mL pożywki Ham's F 12 z dodatkiem 0,5% proteazy, a następnie inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 °C.Po inkubacji odessać roztwór proteazy za pomocą aspiratora próżniowego i wypłukać skrawki, dodając pożywkę hodowlaną Ham's F 12, delikatnie mieszając, a następnie odsysając zawartość. Powtórzyć tę czynność jeszcze dwukrotnie; po trzecim płukaniu odessać pożywkę hodowlaną za pomocą aspiratora próżniowego.Dodać 20 ml pożywki Ham's F 12 zawierającej 0,15% kolagenazy A i inkubować szalki przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia przepuścić pipetą zawiesinę komórkową przez sito o oczkach 200 mesh do czystej szalki Petriego; aby wypłukać filtr, przepuścić pipetą dodatkowe 5 ml pożywki Ham's F 12, zbierając przefiltrowaną ciecz do tej samej szalki. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.Przemyj szalkę Petriego 10 mililitrami pożywki hams F 12. Następnie przelej roztwór z płukania do probówki stożkowej. Wirowarkuj probówkę przy 600 do 800 RCF przez sześć do ośmiu minut w temperaturze pokojowej.Po zakończeniu wirowania odessać nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Resuspendować osad w 40 ml pożywki hodowlanej. Wirować probówkę przy 600 do 800 RCF przez sześć do ośmiu minut.Powtórz aspirację, resuspensję i wirowanie jeszcze dwukrotnie, tak aby łącznie przeprowadzić ten proces trzy razy przed trzecim wirowaniem. Resuspenduj podniebienie poprzez wytrząsanie i pobierz alikwot o objętości 500 µL do zliczenia komórek. Podczas trzeciego wirowania użyj komory countingowej (hemocytometru) oraz odwróconego mikroskopu świetlnego, aby zliczyć żywe komórki w alikwocie metodą wykluczania błękitu trypanu.Po określeniu liczby komórek i zakończeniu trzeciego wirowania, odessaj nadsącz i resuspenduj osad. Zawieś osad w objętości pożywki hodowlanej odpowiadającej dwukrotności pożądanego zagęszczenia wysiewu. W tym przypadku chondrocyty są resuspendowane w stężeniu 20 × 10⁶ komórek na ml.Kolejnym krokiem procedury jest enkapsulacja wyizolowanych pierwotnych chondrocytów stawowych w hydrożelu aros; w zlewce zawiesić 0,8 g aros w 20 ml sterylnego PBS. Zlewkę należy umieścić na płycie grzewczej ustawionej na 120 °C, aż aros całkowicie się rozpuści.Obniż temperaturę do 60 °C w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Połącz równe objętości zawiesiny komórkowej z podwójnym pożądanym stężeniem podgrzanego roztworu agro. W tym przypadku 5 ml zawiesiny komórkowej dodaje się do 5 ml 4% zawiesiny agro, aby uzyskać końcowe 2% hydrożelu agro; wymieszaj dokładnie za pomocą pipety, unikając tworzenia dużych pęcherzyków powietrza, które mogą wpłynąć na żywotność komórek.Następnie ostrożnie przelej 10 milliliters mieszaniny chondrocytów do szalki Petriego o średnicy 60 millimeter. Ponownie unikaj tworzenia dużych pęcherzyków powietrza. Przykryj szalkę pokrywką.Następnie pozostawić mieszaninę na 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zestaleniu mieszaniny, za pomocą przebijaka do biopsji o średnicy 4 mm, pobrać jak największą liczbę próbek hydrożelu z chondrocytami. Zazwyczaj jest to od 20 do 30 próbek.Umieść próbki w czystej szalce Petriego, używając mikrometru, a następnie zmierz i zapisz średnicę oraz wysokość każdej próbki. W idealnym przypadku konstrukty powinny mieć około pięciu milimetrów wysokości; należy odrzucić wszystkie próbki pobrane z obszaru, w którym wysokość próbki przekracza 2%. Przenieś próbki do nowej szalki Petriego o średnicy 60 milimetrów zawierającej 10 mililitrów pożywki kompletnej. W tej części protokołu konstrukty zasiedlone komórkami zostaną poddane mechanicznej stymulacji poprzez dynamiczną kompresję.Zostanie to zrealizowane przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do kompresji, które mechanicznie łączy płytki dociskowe obciążeń konstrukcji z modelowym mikromechanicznym systemem kontrolującym stopień kompresji przyłożonej do konstruktów. Najtrudniejszym elementem procedury jest umieszczanie próbek w urządzeniu do kompresji. Ważne jest prawidłowe wyregulowanie płytek w urządzeniu, aby zapewnić odpowiednie przyłożenie dynamicznego obciążenia kompresyjnego.Przed użyciem wysterylizuj metalowe elementy zestawu kompresyjnego w autoklawie. Elementy plastikowe wysterylizuj 70% etanolem przez noc oraz światłem UV przez co najmniej 15 minut. Zapobiegnie to przewracaniu się konstruktów hydrożelowych z chondrocytami.Za pomocą pęsety umieścić 12 sterylnych plastikowych pierścieni stabilizujących w dołkach 24-dołkowej płytki hodowlanej. Średnice wewnętrzne pierścieni stabilizujących powinny być większe od średnic konstruktów. Należy postępować ostrożnie, używając pęsety.Przenieś hydrożele chondro aros z szalki Petriego do płytki 24-dołkowej, mocując każdy z nich w pierścieniu stabilizującym. Do każdej próbki przenieś 400 µL pożywki kompletnej. Następnie złóż wysterylizowany zestaw do kompresji i za pomocą śrub nastawnych zamocuj elementy PLA.Przymocuj zestaw do kompresji do 24-dołkowej płytki hodowlanej, aby ustanowić kontakt z hydrożelem, zwolnić go, a następnie ponownie zabezpieczyć. Odkształcenie konstrukcji śrub ustalających zostanie zastosowane do tego stanu referencyjnego bez obciążenia lub stanu zerowego odkształcenia. Załaduj zmontowany zestaw do kompresji do systemu mikro-testów mechanicznych Mach one, korzystając z kołka pozycjonującego.Przymocuj urządzenie do etapu pionowego, a następnie za pomocą śruby dociskowej zablokuj je w miejscu. Usuń przymiar dystansowy. W interfejsie oprogramowania Mach one ustaw częstotliwość na 1 Hz, amplitudę na 350 µm oraz liczbę cykli na 1 200.Procedura ta polega na zastosowaniu dynamicznego obciążenia ściskającego z amplitudą odkształcenia 10% w stosunku do pierwotnej wysokości próbek. Aby rozpocząć stymulację mechaniczną, należy nacisnąć przycisk start w siłowniku Mach One. Urządzenie obciążające, mocowane do płytki hodowlanej, posiada sześć wcięć poruszających się w górę i w dół, co pozwala na jednoczesną stymulację sześciu próbek.Niestymulowane próbki kontrolne znajdują się w tej samej płytce hodowlanej, ale nie są umieszczane w dołkach z wgłębieniami. Po zakończeniu cyklu urządzenie mach wyda sygnał dźwiękowy, a siłownik przesunie się do stanu referencyjnego bez obciążenia. Po zakończeniu stymulacji mechanicznej należy ponownie zamontować szablon dystansowy.Poluzuj śrubę blokującą trzpień ustalający, a następnie wyjmij zestaw do kompresji i płytkę hodowlaną z systemu testowego. Do każdej studni z konstruktami komórkowymi z hydrożelu pipetuj 5 µCi znakownika białek Tritium Prolene do oznaczania syntezy kolagenu specyficznego dla chondrocytów oraz S 35 dla syntezy proteoglikanów. Inkubuj oznakowane radiologicznie konstrukty przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aby zebrać oznakowane konstrukty hydrożelowe. Za pomocą pęsety wypłucz każdy konstrukt hydrożelowy trzykrotnie poprzez zanurzenie w PBS. W celu usunięcia nieprzyłączonych izotopów umieść wypłukany konstrukt w probówce o pojemności 1,5 ml.Następnie do probówek o pojemności 1,5 ml należy dodać 500 µl roztworu pape. Probówki należy umieścić na bloku grzejnym i inkubować w temperaturze 65 °C przez 72 h w celu przeprowadzenia trawienia. Po zakończeniu procesu trawienia próbka powinna być stosunkowo przejrzysta.Bezpośrednio po trawieniu papainą należy pobrać z każdej próbki alikwoty o objętości 100 µL w celu oznaczenia zawartości DNA za pomocą testu pico green D. Następnie należy pobrać alikwotę 100 µL z każdej próbki, aby określić aktywność wbudowanego izotopu za pomocą beta-scyntylacyjnego licznika cieczowego. Otrzymaną aktywność izotopu należy następnie znormalizować do zawartości DNA w celu przeprowadzenia analizy.Konstrukcje z hydrożelu aros zawierające wołowe chondrocyty stawowe, składające się z 2% aros z zagęszczeniem 10 × 10⁶ komórek na ml enkapsulowanych komórek, poddano stymulacji mechanicznej przy amplitudzie odkształcenia ściskającego 10% z częstotliwością 1 Hz przez 20 do 60 minut, lub od 1 200 do 3 600 cykli. Następnie przeprowadzono analizę zawartości DNA oraz syntezy macierzy zewnątrzkomórkowej metodą wbudowy radioizotopu.Jak widać tutaj, synteza DNA i macierzy zewnątrzkomórkowej była zależna od dawki. Zawartość DNA wykazala istotny 35% spadek w wyniku 20 lub 30 minut stymulacji, przy wartości p mniejszej niż 0,01; stymulacja przez 60 minut nie wywołała żadnego efektu. Syntezę kolagenu specyficznego dla chrząstki oraz proteoglikanów określono odpowiednio poprzez wbudowywanie trytu, proliny i siarki S 35.Wykazały one istotne wzrosty o około 60% w odpowiedzi na 20 lub 30 minut stymulacji, przy wartości p mniejszej niż 0,01; 60 minut stymulacji nie wywołało zauważalnego efektu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak mechanicznie stymulować hodowle w hydrożelu za pomocą dynamicznego ucisku oraz jak dostosować ten protokół do zastosowań w podobnych badaniach.

mechanical-stimulation-of-chondrocyte-agarose-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mechanika Stymulacja Hydrożeli Chondrocytowo-agarozowych

Opisano trójwymiarowy system hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w wysokim stężeniu płynu stawowego. Płyn stawowy odzwierciedla najbardziej naturalne mikrośrodowisko dla chrząstki stawowej, a jego pozyskanie i przechowywanie są łatwe. System ten może zatem być wykorzystywany do badania regeneracji chrząstki oraz do przesiewu terapeutyków stosowanych w leczeniu zapalenia stawów.

System 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej.  Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.

Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej

Stres mechaniczny może indukować chondrogenne różnicowanie komórek macierzystych, dostarczając potencjalnego podejścia terapeutycznego do naprawy uszkodzonej chrząstki. Przedstawiamy protokół indukowania chondrogennego różnicowania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) za pomocą grawitacji odśrodkowej (CG). Indukowana przez CG regulacja w górę SOX9 powoduje rozwój fenotypów chondrogennych.

Indukcja różnicowania chondrogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przez grawitację odśrodkową

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Ten artykuł zawiera szczegółowe metody wytwarzania i charakteryzowania pneumatycznie uruchamiającego urządzenia mikroprzepływowego do kompresji chondrocytów.

Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

To badanie opisuje metodę wytwarzania sferoid chondrocytarnych poprzez agregację komórek w sferoidy w warunkach niskiej adhezji przy użyciu grawitacji, a następnie hodowlę powstałych sferoid w mini-bioreaktorach.

Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Poznaj metodę dynamicznego obciążenia mechanicznego chondrocytów w hydrożelach agarozowych. Technika ta pozwala ocenić syntezę kolagenu i proteoglikanów w inżynierii tkankowej.

Mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy

Przeglądaj więcej filmów