Name: Ekstrakcja antygenów tkankowych do testów funkcjonalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji antygenów tkankowych do testów funkcjonalnych z komórkami T. Technika ta pozwala na bezpieczne przygotowanie ekstraktów bez toksycznych rozpuszczalników, umożliwiając dokładne pomiary odpowiedzi immunologicznych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta jest finansowana z grantów Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC #559007), Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) oraz Operational Infrastructure Scheme rządu stanu Victoria. Dziękujemy członkom zespołu izolacji wysepek w ramach Tom Mandel Islet Transplantation Program za udostępnienie tkanek ludzkich. Tkanki ludzkie zostały pobrane i wykorzystane za lokalną zgodą etyczną (St. Vincent's Hospital HREC-A 011/04 oraz St. Vincent's Health HREC-A 135/08).

1. Przygotowanie tkanki śledziony
<ol>
	<li>Uwaga – wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźne, a wszystkie procedury powinny być przeprowadzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II. Używając sterylnych nożyczek i pęsety, należy usunąć tłuszcz oraz tkankę włóknistą z przekrojów śledziony (o wielkości ~1-2 cm) i maksymalnie odciąć materiał torebki zewnętrznej.</li>
	<li>Odciąć mały fragment (1-2 cm3) tkanki śledziony i umieścić każdy fragment w sterylnej probówce Falcon 50 ml.</li>
	<li>Szybko zamrozić fragmenty tkanki poprzez zanurzenie w ciekłym N2.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -80 °C. Podobny protokół jest odpowiedni dla innych tkanek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ludzkich wysepek do przechowywania
<ol>
	<li>Hodować wyspy w medium CMRL. Zebrać wyspy do probówki stożkowej o pojemności 10 ml i dwukrotnie przemyć w PBS, wirując przy 1 500 rpm przez 5 min. Odlać PBS i usunąć pozostały bufor, kładąc na chwilę odwróconą probówkę na ręczniku papierowym. Należy uważać, aby nie wypłukać wysp.</li>
	<li>Po osuszeniu ponownie zamknąć probówkę, zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie ekstraktu
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę BAW (10:30:60 %v/v) i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyjąć probówkę z temperatury -80 °C. Rozmrozić w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać odpowiednią ilość lodowatego BAW, aby pokryć fragment tkanki. W przypadku wysepek stosować 3-5 ml. W przypadku tkanki śledziony stosować 10-20 ml, w zależności od wielkości fragmentu tkanki.</li>
	<li>Złożyć homogenizator tkankowy. Oczyścić poprzez „homogenizację” 10-20 ml 70% etanolu/wody.</li>
	<li>Zhomogenizować tkankę w kilku cyklach (bursts), po umieszczeniu sondy homogenizatora w probówce z tkanką i roztworem BAW. Następnie przechowywać probówkę w wiadrze z lodem.</li>
	<li>Dokładnie oczyścić homogenizator pomiędzy próbkami, homogenizując 10-20 ml 70% etanolu/wody, a następnie bufor BAW. Zapobiega to kontaminacji krzyżowej tkanek pomiędzy próbkami. Po użyciu zdemontować i oczyścić 70% etanolem/wodą.</li>
	<li>Jeśli wymagany jest ekstrakt zawierający wyłącznie materiał rozpuszczalny, zhomogenizowany ekstrakt tkankowy wirować przy 4,000 rpm w temperaturze pokojowej przez 10 min. Jeśli wymagany jest ekstrakt bardziej surowy, wirować przy 1,000 rpm w temperaturze pokojowej przez 5 min. Najodpowiedniejsza technika ekstrakcji białek nierozpuszczalnych w BAW zależy od dalszej analizy białek. Do zastosowań w funkcjonalnych testach immunologicznych sugerujemy próbę rozpuszczenia frakcji nierozpuszczalnej w 8 M mocznika, ponieważ wcześniej stwierdziliśmy, że jest ona dobrze tolerowana6.</li>
	<li>Przenieść nadsącz do czystej probówki i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie białka w ekstrakcie przy użyciu testu BCA lub analogicznego.</li>
</ol>
4. Liofilizacja ekstraktów
<ol>
	<li>W zależności od wymaganej masy białka (t.j. 100 μg na probówkę), odpowiednio rozcieńczyć homogenat i rozdzielić aliquoty do oznakowanych, sterylnych probówek Falcon 5,0 ml (12x75 mm). Często stosujemy 100 μg/probówkę.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej igły do strzykawki o rozmiarze 18-20 G wykonać 3 otwory w zakrętce każdej probówki.</li>
	<li>Zamrozić probówki, umieszczając je na suchym lodzie przez ok. 10 min lub w zamrażarce -80 °C przez &gt;1 h. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu umieszczenia w liofilizatorze.</li>
	<li>Włączyć liofilizator i pozwolić mu osiągnąć temperaturę równowagi (-100 °C). Trwa to około 30 min.</li>
	<li>W zależności od objętości liofilizacja może zostać zakończona w ciągu 3 h, jednak rutynowo pozostawiamy próbki na noc.</li>
	<li>Po zakończeniu cyklu suszenia wyłączyć pompę próżniową i powoli wyrównać ciśnienie w komorze. Wyjąć kasetę.</li>
	<li>W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza zdjąć perforowane zakrętki z probówek i zastąpić je nowymi (Falcon 352032).</li>
	<li>Przechowywać probówki w temperaturze -20 °C. Próbki można zrekonstytuować w pożywce hodowlanej lub innych buforach i wykorzystać w testach funkcjonalnych lub biochemicznych.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia barwienie żelu białkowego z naniesionym ekstraktem z śledziony i tkanki trzustkowej pozbawionej wysepek (oznaczonej jako acinar) oraz oczyszczonymi ludzkimi wysepkami (oznaczonymi jako islets). Wyniki pokazują dobrą reprezentację białek o różnych masach cząsteczkowych dla każdej z tkanek.
Zdolność ekstraktów tkankowych do stymulowania proliferacji ludzkich limfocytów T została przetestowana za pomocą testu proliferacji opartego na CFSE7 (Rycina 2). PBMC wykorzystane w tym badaniu wyizolowano od osoby z cukrzycą typu 1. Wielkość odpowiedzi wyrażono jako stosunek liczby komórek CFSEdim na 5 000 komórek CD4+, CFSEbright bez antygenu do liczby komórek CFSEdim na 5 000 komórek CD4+, CFSEbright z antygenem, na podstawie próbek wykonanych w trzech powtórzeniach7. Wyniki wykazują słabą, lecz wykrywalną proliferację w odpowiedzi na ekstrakt z komórek acynarnych (CD1=3,5) oraz silniejszą odpowiedź na ekstrakt z wysepek (6,8). Inaktywowany wirus grypy (CDI= 142,6) został włączony jako kontrola pozytywna.
<img alt="Elektroforeza w żelu SDS-PAGE wykazująca prążki białkowe z próbek śledziony, komórek acynarnych i wysepek." src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Żel białkowy. 
<img alt="Analiza cytometryczna, wykres CFSE vs. CD4 Alexa Fluor 647, porównujący odpowiedzi antygenowe w próbkach." src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wyniki testu proliferacji opartego na CFSE przeciwko ekstraktom z komórek acynarnych i wysepek trzustkowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię</a>.

<ol><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li>
<li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+CD4%2B+T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4%2B+T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy%2C+Pre-diabetic%2C+and+Diabetic+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li>
<li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li>
<li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+preparations+of+GAD65%2C+proinsulin%2C+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes%3A+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li>
<li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół został opracowany w celu uzyskania ekstraktu z tkanki ludzkiej wolnego od substancji toksycznych, takich jak detergenty. W szczególności został on wykorzystany do przygotowania ekstraktów z tkanki ludzkiej, które mogą być stosowane w testach funkcji układu odpornościowego człowieka in vitro. Ekstrakty przygotowane zgodnie z tym protokołem mogą być również rekonstytuowane w dowolnym buforze i wykorzystywane do wielu analiz biochemicznych, takich jak western blotting czy chromatografia cieczowa....

<table><tbody><tr><td>sterylne probówki polistyrenowe 5 ml 12 x 75 mm</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Zakrętki do probówek polistyrenowych (powyżej)</td><td>BD Falcon</td><td>352032</td><td></td></tr><tr><td>probówki sterylne 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Mallinckradt Chemicals</td><td>2856-10</td><td></td></tr><tr><td>Butan-1-ol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>537993-IL</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator: PRO200 </td><td>Biostrategia</td><td>01-01200</td><td>generator ząbkowany 10 x 115 mm</td></tr><tr><td>Liofilizator </td><td></td><td></td><td>Virtis, Benchtop 4K</td></tr><tr><td>Sterylna igła 18-20 G </td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 302032</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka CMRL-1066 </td><td>Sigma</td><td>C0422</td><td></td></tr><tr><td>PBS </td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy w języku angielskim, który ma zostać przetłumaczony. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych JoVE, przygotuję wierne i naturalne tłumaczenie na język polski, zachowując akademicki rejestr, precyzję terminologiczną oraz strukturę protokołów badawczych, zgodnie z przekazanymi wytycznymi.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja antygenów tkankowych do analiz funkcjonalnych

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Wiele antygenów będących celami adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, rozpoznawanych przez limfocyty B i T, nie zostało jeszcze zdefiniowanych 1. Dotyczy to w szczególności chorób autoimmunologicznych oraz nowotworów2. Naszym celem jest zbadanie antygenów rozpoznawanych przez ludzkie limfocyty T w autoimmunologicznej chorobie, jaką jest cukrzyca typu 1 1,3,4,5. Aby przeanalizować odpowiedzi ludzkich limfocytów T przeciwko tkankom, w których antygeny rozpoznawane przez te komórki nie są zidentyfikowane, opracowaliśmy metodę ekstrakcji antygenów białkowych z ludzkich tkanek w formie kompatybilnej z testami funkcjonalnymi 6. Wcześniej pomiar odpowiedzi limfocytów T na nieoczyszczone ekstrakty tkankowe był niemożliwy, ponieważ metody ekstrakcji prowadziły do uzyskania lizatu zawierającego detergenty toksyczne dla ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC). W niniejszym protokole opisujemy metodę ekstrakcji białek z ludzkich tkanek w formie nietoksycznej dla ludzkich limfocytów T. Tkanka jest homogenizowana w mieszaninie butanolu-1, acetonitrylu i wody (BAW). Po zmierzeniu stężenia białka w ekstrakcie tkankowym, znana masa białka jest rozdzielana do probówek. Po ekstrakcji rozpuszczalniki organiczne są usuwane poprzez liofilizację. Liofilizowane ekstrakty tkankowe mogą być przechowywane do czasu użycia. Do zastosowania w testach funkcji immunologicznych, zawiesinę komórek odpornościowych w odpowiedniej pożywce hodowlanej można dodać bezpośrednio do liofilizowanego ekstraktu. Produkcja cytokin oraz proliferacja PBMC w odpowiedzi na ekstrakty przygotowane tą metodą były łatwo mierzalne. Zatem nasza metoda pozwala na szybkie przygotowanie lizatów ludzkich tkanek, które mogą służyć jako źródło antygenów w analizie odpowiedzi limfocytów T. Sugerujemy, że metoda ta ułatwi analizę adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych na tkanki w transplantologii, onkologii i autoimmunologii.

Opisano prosty protokół przygotowania ekstraktów z ludzkich tkanek, które służą jako źródło antygenów w funkcjonalnych testach limfocytów T. Metoda ta pozwala na pomiar odpowiedzi limfocytów T na antygeny pochodzące z tkanek in vitro.

Ekstrakcja antygenów tkankowych do analiz funkcjonalnych

Wiele antygenów będących celami adaptacyjnej odpowiedzi odpornościowej, rozpoznawanych przez limfocyty B i T, nie zostało jeszcze zdefiniowanych 1. Dotyczy to w szczególności chorób autoimmunologicznych...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie ekstraktu tkankowego kompatybilnego z funkcjonalnymi testami immunologicznymi. Osiąga się to poprzez wstępne pobranie próbki odpowiedniej tkanki. Następnie próbkę tkanki homogenizuje się w mieszaninie butanolu, octanu, nitrylu i wody, czyli BAW.Po określeniu stężenia białka, ekstrakt zostaje podzielony na alikwoty i liofilizowany w celu usunięcia rozpuszczalników. Ostatecznie zrekonstytuowany ekstrakt służy jako źródło antygenu w testach proliferacji ludzkich limfocytów T lub wydzielania cytokin. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak liza z użyciem detergentów, jest fakt, że tak przygotowany ekstrakt jest wolny od toksycznych rozpuszczalników i detergentów.W niniejszym protokole wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźne, a wszystkie procedury powinny być przeprowadzane w laminarnym przepływie powietrza klasy drugiej. Przy użyciu sterylnych nożyczek i pęset należy usunąć tkankę tłuszczową i włóknistą z sekcji śledziony o wielkości od około jednego do dwóch centymetrów. Należy odciąć jak największą część materiału zewnętrznej torebki.Odciąć małe fragmenty tkanki śledziony i umieścić każdy z nich w sterylnej probówce Falcon o pojemności 50 ml. Zamrozić fragmenty tkanki poprzez zanurzenie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć procedurę przygotowania ludzkich wysepek do hodowli w warunkach przechowywania.Gałki oczne w pożywce CMRL w temperaturze 37 °C. Zebrano gałki oczne do probówki stożkowej o pojemności 10 ml i odwirowano przy 1 500 RPM przez pięć minut. Usunięto pożywkę i przepłukano dwukrotnie w PBS; po drugim płukaniu.Odlej PBS i usuń pozostały bufor, kładąc odwróconą probówkę na chwilę na ręczniku papierowym. Należy uważać, aby nie przesunąć przemiżanek. Po osuszeniu zamknij probówkę, zamroź ją gwałtownie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.Aby przygotować ekstrakt tkankowy, najpierw wyjmij probówkę zawierającą tkankę z temperatury -80 °C i odstaw ją do temperatury pokojowej. Tkanka zostanie zhomogenizowana w mieszaninie butanolu, acetonitrylu i wody (BAW), która została wcześniej przygotowana i przechowywana w temperaturze 4 °C. Dodaj wystarczającą ilość lodowatego roztworu BAW, aby przykryć fragment tkanki; w przypadku tkanki śledziony użytej w tej demonstracji zastosowano od 10 do 20 mL BAW.Złóż homogenizator do tkanek. Oczyść homogenizator, homogenizując 20 mililitrów 70% etanolu w wodzie. Następnie umieść sondę homogenizatora w probówce z tkanką i roztworem BAW, a następnie homogenizuj tkankę w wielu krótkich cyklach.Następnie umieść probówkę w odpowiednim pojemniku, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej tkanek między próbkami. Dokładnie oczyść homogenizator pomiędzy próbkami, homogenizując 10 do 20 mililitrów 70% etanolu w wodzie, a następnie wykonując wirowanie w buforze BAW. Homogenizowany ekstrakt tkankowy przechowuj w temperaturze pokojowej.Jeśli wymagany jest ekstrakt zawierający wyłącznie materiał rozpuszczalny, należy wirować przy 4 000 RPM przez 10 minut. Jeśli wymagany jest ekstrakt bardziej surowy, należy wirować przy 1000 RPM przez pięć minut; po odwirowaniu należy przenieść nadosad do czystej probówki i umieścić go na lodzie. Stężenie białka w ekstrakcie określa się następnie za pomocą testu BCA lub podobnego oznaczenia.Najważniejszym krokiem w tym protokole jest dokładne zmierzenie stężenia białka w ekstrakcie, aby można było liofilizować odpowiednią objętość ekstraktu. Aby uzyskać pożądaną masę białka podczas liofilizacji ekstraktów, należy najpierw rozcieńczyć homogenat zgodnie z wymaganą masą białka i rozdzielić alikwoty do opisanych, sterylnych probówek o pojemności pięciu mililitrów. W tym przykładzie na każdą probówkę przypada 100 µg białka.Używając sterylnej igły o rozmiarze od 18 do 20 G, wykonaj trzy otwory w zakrętce każdej probówki. Zamroź probówki, umieszczając je na suchym lodzie przez około 10 minut, włącz liofilizator i poczekaj, aż ustabilizuje się w temperaturze -100 °C. Zajmie to około 30 minut. Gdy liofilizator będzie gotowy, umieść w nim probówki i włącz pompę próżniową.W zależności od objętości ekstraktu liofilizacja może zostać zakończona w ciągu trzech godzin, choć próbki rutynowo pozostawia się na noc. Po zakończeniu cyklu suszenia należy wyłączyć pompę próżniową i powoli dopuścić powietrze do komory.Wyjmij statyw z probówkami w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Zdejmij perforowane nakrętki z probówek i zastąp je nowymi. Przechowuj probówki w temperaturze -20°C.Próbki można później zrekonstytuować w kulturze, pożywkach lub innych buforach i wykorzystać w funkcjonalnych testach biochemicznych. Rysunek ten przedstawia barwienie żelu białkowego z naniesionymi ekstraktami z tkanki trzustki pozbawionej wysepek śledzionowych oraz oczyszczonymi ludzkimi wysepkami. Wyniki te wykazują reprezentatywną obecność białek o różnych masach cząsteczkowych dla każdej z tkanek; zdolność ekstraktów z wysepek do stymulowania proliferacji ludzkich limfocytów T została przetestowana za pomocą testu proliferacji, w którym mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) znakowano fluorescencyjnym barwnikiem CFSE; komórki proliferujące w odpowiedzi na antygen, co skutkowało spadkiem intensywności CFSE, mierzono bezpośrednio za pomocą cytometrii przepływowej.PBMC użyte w tym przykładzie zostały wyizolowane od osoby z cukrzycą typu pierwszego. Wielkość odpowiedzi komórek C wyliczono jako stosunek liczby komórek CFSE dim na 5 000 komórek CD four dodatnich CFSE bright bez antygenu do liczby komórek CFSE dim na 5 000 komórek CD four dodatnich CFSE bright z antygenem z próbek powtórzonych trzykrotnie. Wyniki wykazują słabą, ale wykrywalną proliferację w odpowiedzi na Asana z indeksem podziału komórek (CDI) wynoszącym 3,5.Odnotowano silniejszą odpowiedź na ekstrakt z oczka z CDI wynoszącym 6,8; jako kontrolę pozytywną zastosowano inaktywowany wirus grypy po wykonaniu tej procedury. Do odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, które cytokiny są wydzielane w odpowiedzi na antygeny pochodzenia tkankowego, można wykorzystać inne metody, np. Ali Spot lub e Iza.

extraction-of-tissue-antigens-for-functional-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ekstrakcja antygenów tkankowych do badań funkcjonalnych

Opisano protokół przygotowania stabilnych ekstraktów jądrowych z komórek HeLa w małej skali. Protokół ten jest wartościowy dla analiz wymagających użycia niewielkich populacji komórek, takich jak komórki poddane działaniu leków lub RNAi. Metoda powinna być możliwa do zastosowania w szerokim zakresie analiz ekspresji genów oraz w przypadku innych typów komórek, w tym komórek pobranych od pacjentów.

Małoskalowe ekstrakty jądrowe do analiz funkcjonalnych aparatów ekspresji genów

Ten film demonstruje użycie testu ELISpot do oceny funkcji komórek B wydzielających przeciwciała, ASC. Przeciwciała wydzielane przez ASC oddziałują z fragmentami przeciwciał poliklonalnych związanymi z błoną, które są wykrywane przez przeciwciała IgG lub IgM sprzężone z enzymem. Kolorowa plamka wytworzona w każdym dołku wskazuje na obecność specyficznego izotypu przeciwciała, który koreluje z aktywnością wydzielniczą limfocytów B.

Ocena funkcjonalna limfocytów B wydzielających przeciwciała za pomocą testu ELISpot

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany, szczegółowy protokół podwójnego barwienia immunologicznego w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i obwodowych węzłów chłonnych (LN).

Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

Translacyjne badania nad rakiem są zależne od ekstrakcji tkanek ludzkich. Wiele pracy włożono w optymalizację metod ekstrakcji do analizy ex vivo. W tym miejscu opisujemy metody przetwarzania tkanek pozwalające na maksymalne uzyskanie danych wyjściowych z ograniczonej liczby próbek.

Praca z tkankami ludzkimi w translacyjnych badaniach nad rakiem

Opisana jest prosta, ale skuteczna metoda, która wykorzystuje magnetyczne nanocząstki do wykrywania i wzbogacania komórek B reagujących na antygen do analizy funkcjonalnej i fenotypowej.

Wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji

Tutaj opisujemy metodę, która łączy barwienie in situ MHC-tetrameru z immunohistochemią w celu określenia lokalizacji, fenotypu i ilości limfocytów T specyficznych dla antygenu w tkankach. Protokół ten służy do określania charakterystyki przestrzennej i fenotypowej limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w stosunku do innych typów komórek i struktur w tkankach.

In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach

Niezgodności w sekwencjach ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) między parami dawców i biorców narządów są główną przyczyną odrzucenia przeszczepu narządów za pośrednictwem przeciwciał. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie niestandardowych macierzy antygenowych, które są oparte na sekwencjach HLA poszczególnych dawców, do badania alloprzeciwciał HLA przeciwko dawcom u biorców narządów.

Spersonalizowane macierze peptydowe do wykrywania alloprzeciwciał HLA w przeszczepach narządów

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Testy immunologiczne oparte na krwi pełnej dostarczają łatwego i zasobooszczędnego narzędzia do analizy odporności specyficznej dla antygenu do celów diagnostycznych i badawczych. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół oparty na krwi pełnej z podwójną kostymulacją do kompleksowej analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe, w tym wersję o małej objętości dla pacjentów pediatrycznych i małych zwierząt.

Test krwi pełnej z podwójną kostymulacją do specyficznej dla antygenu analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

Poznaj metodę ekstrakcji antygenów tkankowych do testów funkcjonalnych z komórkami T. Technika ta pozwala na bezpieczne przygotowanie ekstraktów bez toksycznych rozpuszczalników, umożliwiając dokładne pomiary odpowiedzi immunologicznych in vitro.

Ekstrakcja antygenów tkankowych do analiz funkcjonalnych

Przeglądaj więcej filmów