Łączenie interfejsu bioelektronicznego z biofabrykacją

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest elektryczne osadzanie folii biopolimerowych i funkcjonalizowanie ich składnikami biologicznymi, takimi jak białka i komórki. Osadzanie elektrostatyczne uzyskuje się poprzez wykorzystanie zmiany pH, która zachodzi lokalnie na spolaryzowanej elektrodzie, w połączeniu z roztworem polisacharydowym reagującym na pH. Po wybraniu strategii osadzania katartycznego lub anodowego, elektroda jest spolaryzowana, aby wywołać przejście w żelu duszy, które generuje cienką warstwę o wzorze określonym przez geometrię elektro.

Co więcej, składniki biologiczne, takie jak białka i komórki, mogą być wprowadzane w całym procesie osadzania elektrod. W celu biologicznej funkcjonalizacji filmu uzyskuje się wyniki, które pokazują, że składniki biologiczne są zlokalizowane w foliach na podstawie obrazowania fluorescencyjnego. Ponadto komponenty są funkcjonalne i zdolne do interakcji z otoczeniem, co wykazano poprzez elektrochemiczne wykrywanie aktywności enzymatycznej i wykorzystanie odpowiedzi komórki reporterowej.

Biofabrykacja dostarcza nowatorskiego zestawu narzędzi do tworzenia interfejsu między biologią a elektroniką. Uważamy, że jego główne zalety to prostota i możliwość montażu w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Biologia jest ekspertem w wytwarzaniu w nanoskali za pomocą samoorganizacji i środków enzymatycznych Wykorzystując te możliwości, omijamy złożone, niebezpieczne i czasochłonne metody syntezy, które wykorzystują inne techniki składania.

Nasz współpracujący zespół wpadł na pomysł zbudowania interfejsu urządzenia BioD przy użyciu materiałów i mechanizmów biologicznych, gdy zaobserwowaliśmy, że ich latawce mogą być zdeponowane na elektrodach. Kitan to polisacharyd tworzący film reagujący na pH, który może rozpoznawać sygnały elektryczne narzucone przez urządzenie i osadzać się jako cienka warstwa. Gdy zobaczyliśmy, że kitan może być zdeponowany elektrodą, zdaliśmy sobie sprawę, że możemy uzyskać dostęp do szerszego zestawu narzędzi z biochemii i biologii molekularnej, aby zbudować interfejs urządzenia BioD.

Zastosowanie takiej techniki rozciąga się na ustawienia chipów labon, w których wymagany jest funkcjonalny składnik biologiczny, ponieważ zapewniają one tani i łatwy sposób lokalizacji takich komponentów na elektrodzie, gdzie mogą pozostać żywotne. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ folia biofabrykowana może być dedykowana i łatwo ulegać uszkodzeniu. W związku z tym należy uważać, aby nie być zbyt surowym podczas mycia lub kręcenia filmu.

Jak można by określić film, łatwo go zakłócić. Jednak zaletą jest to, że elektro można ponownie wykorzystać, ponieważ folię można łatwo usunąć. Aby rozpocząć ten protokół, podłącz zasilacz do specjalnie wyprodukowanych elektrod za pomocą krosowych za pomocą zacisków krokodylkowych.

Szkiełko pokryte tlenkiem indu i cyny lub ITO będzie działać jako anoda lub elektroda robocza z folii platynowej będzie służyć jako katoda lub przeciwelektroda ustawić elektrodę tak, aby powierzchnia ITO, która ma być funkcjonalizowana, była przeciwstawna do przeciwelektrody w taki sposób, że powierzchnia IT O jest ustawiona pionowo do zanurzenia w roztworze lub poziomo, tak, aby roztwór mógł być zawarty na powierzchni. Następnie przygotuj roztwór do osadzania alginianów, mieszając 1% alginian i 0,5% węglan wapnia w wodzie destylowanej i autoklawując mieszaninę. Następnie fluorescencyjnie znakuj alginian kulkami fluorowymi, mieszając i wirując.

Pozwoli to na obrazowanie fluorescencyjne powstałej folii Po autoklawowaniu roztwór zanurza obie elektrody w przygotowanym roztworze do osadzania, przykładając stałą gęstość prądu wynoszącą trzy ampery na metr kwadratowy przez dwie minuty. Napięcie zmieni się w zakresie od dwóch do trzech woltów Po dwóch minutach odłącz elektrodę i usuń roztwór, który nie zawiera osadów. Delikatnie spłucz folię chlorkiem sodu, aby usunąć zbędny alginian.

Krótko inkubować film w 0,1-molowym chlorku wapnia w celu wzmocnienia żelu. Folia jest następnie inkubowana w żądanym roztworze do przechowywania. Przystąp do obrazowania filmu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przed koosadzaniem.

Wyhoduj hodowlę komórek nadawczych sygnału i hodowlę komórek odbiornika sygnału zgodnie z zaleceniami w pisemnym protokole dołączonym do tego filmu. Następnie przygotuj roztwór do osadzania alginianu i węglanu wapnia. Wymieszać roztwór z każdą kulturą komórkową w stosunku jeden do jednego do końcowego stężenia 1% alginianu i 0,5% węglanu wapnia z komórkami rozcieńczonymi do około połowy gęstości hodowli.

Użyj szkiełka podstawowego z dwoma elektrodami ITO umieszczonymi w studzience polidimetylosilanu i przeciwelektrodzie platynowej. Podłącz jedną elektrodę ITO i elektrodę platynową do źródła zasilania. Tak jak poprzednio, zanurz elektrody w roztworze osadzającym zawierającym ogniwa odbiorcze.

Ustaw zasilacz na stały prąd o gęstości trzech amperów na metr kwadratowy, gdzie wymiar powierzchni jest definiowany przez pojedynczą elektrodę, na której nastąpi osadzanie. Stosować prąd przez dwie minuty, aby umożliwić koosadzanie komórek w matrycy alginianowej. Przepłukać folię chlorkiem sodu jak poprzednio, przełączyć antyczne połączenie na sąsiednią elektrodę ITO.

Powtórz procedurę osadzania, ale tym razem. Przedstawiamy rozwiązanie zawierające komórki nadawcze. Inkubować chip z dwiema elektrodami zawierającymi komórki osadzone co i argenian wapnia przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.

Uzupełniony pożywką 10% LB i jednym milimolowym chlorkiem wapnia. Po inkubacji zobrazuj chip za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby rozpocząć osadzanie elektrody chitozanu. Podłącz zasilacz do elektrod.

Ogniste zaciski krokodylkowe. Pokryty złotem krzemowy chip będzie działał jako katoda, a folia platynowa będzie służyć jako anoda. Ustaw powierzchnię złotej elektrody tak, aby złożyła przeciwelektrodę jak poprzednio.

Przygotuj roztwór piasku Kato, mieszając płatki piasku Kato z wodą i powoli dodając dwa molowe chlorowodór w celu rozpuszczenia polisacharydów. Postępując zgodnie z procedurą opisaną w tekście, roztwór piasku Kato można znakować fluorescencyjnie w celu zobrazowania filmu osadzonego na elektrodzie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej Następne miejsce. Elektrody zanurzają się w roztworze kaizan, całkowicie zanurzając żądany obszar do osadzania.

Przez dwie minuty przykładaj stały prąd obliczony przy gęstości czterech amperów na metr kwadratowy w oparciu o powierzchnię elektrod roboczych. W tym przypadku prąd o natężeniu 16 mikroamperów jest przykładany do czteromilimetrowej złotej elektrody o powierzchni czterech milimetrów kwadratowych, napięcie zmieni się w zakresie od dwóch do trzech woltów po przepłukaniu elektrody wodą dejonizowaną w celu usunięcia zbędnego chitozanu. Przystąp do obrazowania filmu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, chitozanu copos i oksydazy glukozowej z roztworu o gęstości prądu czterech ramp na metr do kwadratu na elektrodzie wzorzystej.

Zgodnie z procedurą osadzania elektrody chitozanowej zostanie wygenerowany film kaizan uwięziony w oksydazie glukozowej. Podłącz obrabianą elektrodę do układu trzech elektrod jako elektrody roboczej, drutu platynowego jako przeciwelektrody i srebra, chlorku srebra jako elektrody odniesienia, zanurz elektrody w roztworze buforowym fosforanu zawierającym chlorek sodu. Elektrochemicznie sprzęż białko z filmem Kazamu, przykładając stałe napięcie przez 60 sekund za pomocą chronopirometrii po koniugacji.

Umieść chip w buforze fosforanowym i myj przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej w celu usunięcia niereaktywnego chlorku sodu i niesprzężonej oksydazy glukozowej. Ponownie zamocuj system trzech elektrod i zanurz roztwór pięciomilimolowej glukozy. Następnie ustaw pożądane parametry dla cyklicznej telemetrii wolum, aby przemiatać potencjał w dodatnim kierunku do 0,7 wolta.

Usunąć elektrody z roztworu glukozy i spłukać buforem fosforanowym. Następnie umieść elektrody między 10-mililitrową zlewką zawierającą osiem mililitrów buforu fosforanowego na magnetycznej płytce mieszającej. Chip funkcjonalny GOX do 0,6 V, aby służyć jako elektroda robocza.

Po ustawieniu żądanych parametrów zbierz nagranie bazowe. Dodaj podwielokrotności glukozy do buforu, aby zwiększyć stężenie glukozy o cztery milimolowe na każdą podwielokrotność W tym eksperymencie do buforu dodaje się 400 mikrolitrowych podwielokrotności 80-milimolowej glukozy. Skoreluj prąd wyjściowy z każdym stężeniem glukozy Aby wygenerować krzywą standardową w celu przeprowadzenia funkcjonalizacji białka, użyj szkiełka z wzorem sąsiedniej elektrody ze złota i ITO zawartej w A-P-D-M-S.

Dobrze odchyl złotą elektrodę o potencjale katharsis do tizen osadu elektrody, jak pokazano wcześniej. Po wypłukaniu folii dodać roztwór niebieskiej fluorescencyjnie znakowanej syntazy dwóch autoinduktorów uzupełnionych tyrozynazą. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej.

Przepłukać folię PBS jak poprzednio, przyłożyć potencjał anodowy do elektrody ITO zanurzonej w roztworze do osadzania alginianów zawierającym komórki odbiorcze. Kontynuuj te same kroki, które opisano w koosadzaniu populacji komórek w alginianie, aby wygenerować przesyłany sygnał enzymatycznie. Po wypłukaniu folii dodać roztwór pięciu mikromolowych, SAH i PBS uzupełniony pożywką 10% LB i jednym milimolowym.

Chlorek wapnia przykrywa elektrody, aby zapobiec parowaniu roztworu i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pozwoli to na odpowiedź komórki odbiorczej poprzez wygenerowanie czerwonego białka fluorescencyjnego DS czerwone sąsiednie elektrody mogą być obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez justowanie. Filtry do wychwytywania niebieskiej fluorescencji syntazy indukującej również dwa i czerwonej fluorescencji wyrażonej przez dokooptowane sygnały elektryczne narzucone komórkom odbiorczym mogą tworzyć zlokalizowane mikrośrodowiska w pobliżu powierzchni elektrody, a bodźce te mogą wyzwalać samoorganizację polisacharydów, takich jak alginian i razan, w celu osadzenia się jako film hydrożelowy na powierzchni elektrody.

Ponieważ to przejście w żelu duszy zachodzi na powierzchni elektrody, powstała warstwa jest adresowana elektroelektrycznie, a jej geometria pasuje do wzoru elektrody. Za pomocą alginianu zdeponowano unikalne populacje komórek pod różnymi adresami. Dowody na ich adresy elektrod obserwuje się po interakcji między populacją komórek nadawczych i odbiorczych.

Cząsteczka autoinduktora drugiego dyfunduje z komórek nadawczych i jest wychwytywana przez komórki odbiorcze, powodując ekspresję białka czerwonej fluorescencji DS. Tu. Czerwona fluorescencja jest obserwowana tylko na elektrodzie, do której adresowane są odbiorniki. I odwrotnie, enzym biosensoryczny oksydaza glukozowa zapewnia zdolność wykrywania glukozy poprzez reakcję enzymatyczną poprzez wytwarzanie nadtlenku wodoru, który można następnie elektrochemicznie utlenić w celu wytworzenia prądu wyjściowego.

W ten sposób sygnał chemiczny może zostać przekształcony w sygnał elektryczny. Wykres ten pokazuje, że folie, w których Geo X był chemicznie sprzężony, wytwarzają silny sygnał antyczny w obecności glukozy, w przeciwieństwie do folii nie zawierających Geo X. Wyniki te wskazują, że Geo X może być montowany na zdeponowanej folii zam i / lub zachować aktywność katalityczną. Ponadto w odpowiedzi na rosnące stężenie glukozy następuje skokowy wzrost prądu otycznego.

Obecna również krzywa standardowa pokazuje, że przyrost krokowy przebiegał w sposób niemal liniowy w zależności od ilości dodanej glukozy. Wyniki te pokazują, że enzym zachowuje również swoją wrażliwość po sprzężeniu z filmem Razza, jak pokazano tutaj, syntaza I dwa zawiera znacznik Penta tyrozyny. Tyrozynaza działa na znacznik tyrozyny, utleniając reszty grup fenolowych do chinonów, które następnie kowalencyjnie wiążą się z aminą kazana, dowód funkcjonalizacji filmu Kazam w obrębie syntazy a i dwóch przez zespół tyrozynazy obserwuje się na tym obrazie fluorescencyjnym pokazującym film kaza na złocie, w którym funkcjonalizowana syntaza I dwa została fluorescencyjnie oznaczona na niebiesko, ponieważ syntaza I dwa generuje I dwa z substratu SAH w ten sam sposób jako komórki nadawcze, jego bliskość do dokooptowanych komórek odbiorczych w obecności SAH powoduje również, że komórki odbiorcze reagują fluorescencyjnie poprzez ekspresję DS.

Czerwono-czerwona fluorescencja komórek odbiorczych ponownie demonstruje interakcję między adresami spowodowaną dyfuzją AI, dwóch z jednego do drugiego, a ponadto wskazuje, że 10 enzymów unieruchomionych do tizen zachowuje aktywność po kowalencyjnym związaniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak elektro osadzać folie polisacharydowe i jak je funkcjonalizować przy użyciu różnych technik. Wykazaliśmy wszechstronność tych etapów funkcjonalizacji, co pozwala nam pracować z wieloma komponentami biologicznymi w dalszych testach.

Po opanowaniu technika ta może być wykonana w ciągu zaledwie kilku minut, aby wygenerować dobrze zdefiniowane wzory folii, na które można precyzyjnie przeszczepić składniki biologiczne. W ten sposób jesteśmy w stanie bardzo łatwo wygenerować biologicznie wzorzyste i aktywne powierzchnie na wyznaczonych elektrodach, wszystko to wykonane w zorganizowany sposób, a mimo to jesteśmy w stanie osiągnąć złożone interakcje biologiczne. Zgodnie z tą procedurą, kreatywność może być wykorzystana zarówno w projektowaniu matrycy elektrycznej, jak i w doborze komponentów biologicznych w celu osiągnięcia interakcji projektowej.

Mamy nadzieję, że narzędzia do biofabrykacji połączą dwie odmienne dziedziny, biotechnologię i mikroelektronikę, z których każda z osobna zrewolucjonizowała nasze życie. Wierzymy, że łącząc te dwie dziedziny, stworzymy nowe rozwiązania niektórych z najbardziej palących problemów społecznych. Na przykład przewidujemy, że biofabrykacja może dostarczyć prostych i wszechstronnych metod nowych sposobów wykrywania, diagnozowania chorób w miejscu opieki nad pacjentem oraz wykrywania zagrożeń biologicznych i chemicznych.

Jednym z dalekosiężnych przykładów może być to, że następny stent tętniczy nowej generacji będzie również w stanie monitorować profil metaboliczny, a także utrzymywać otwartą tętnicę.