Name: Łączenie interfejsu bioelektronicznego z biofabrykacją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 38 s
Description: Poznaj metodę elektroosadzania filmów polisacharydowych i ich funkcjonalizacji białkami oraz komórkami. Technika ta umożliwia tworzenie interaktywnych powierzchni bioelektronicznych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Potwierdzamy otrzymanie funduszy z DTRA na wsparcie przygotowania niniejszego manuskryptu oraz z ONR, DTRA i NSF na częściowe wsparcie prowadzonych badań.

1. Elektrodepozycja alginianu
<ol>
 <li>Podłączyć zasilacz do wykonanych na zamówienie elektrod za pomocą przewodów patch z klipsami krokodylkami. Szkło pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) będzie pełnić funkcję anody (elektrody roboczej), a folia platynowa funkcję katody (elektrody przeciwnej). Ustawić elektrody tak, aby powierzchnia ITO przeznaczona do funkcjonalizacji była skierowana w stronę elektrody przeciwnej i znajdowała się albo w pozycji pionowej, aby umożliwić zanurzenie w roztworze, albo w pozycji poziomej, tak aby roztwór do osadzania znajdował się na powierzchni.</li>
 <li>Przygotować roztwór do osadzania alginianu poprzez zmieszanie 1% alginianu i 0,5% CaCO3 (masowych) w wodzie destylowanej, a następnie poddać roztwór autoklawowaniu. Zaleca się ciągłe mieszanie roztworu w czasie, gdy nie jest on używany.</li>
 <li>Zanurzyć obie elektrody w roztworze do osadzania. Zgodnie z metodą Cheng et al. 14, użyty alginian może być znakowany fluorescencyjnie za pomocą FluoroSpheres (Invitrogen), aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjne powstałej warstwy.</li>
 <li>Przyłożyć stałą gęstość prądu (3 A/m2) przez 2 minuty; napięcie będzie zmieniać się w zakresie 2-3 V.</li>
 <li>Odłączyć elektrodę i usunąć nieosadzony roztwór. Delikatnie wypłukać warstwę roztworem NaCl (0,145 M), aby usunąć nadmiar alginianu.</li>
 <li>Inkubować warstwę przez krótki czas (~1 min) w CaCl2 (0,1 M), aby wzmocnić żel. Wypłukać roztworem NaCl (0,145 M) i inkubować w wybranym roztworze uzupełnionym o CaCl2 (1 mM).</li>
 <li>Wykonać obrazowanie przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 1B).</li>
</ol>
2. Współosadzanie komunikujących się populacji komórek w alginianie
<ol>
 <li>Kulturę komórek nadających sygnał (W3110 wt E. coli), hodowaną w pożywce LB, oraz kulturę komórek odbierających sygnał (MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr), hodowaną w pożywce LB + 50 μg/mL kanamycyny i ampicyliny, należy hodować przez noc, a następnie ponowić inokulację do uzyskania gęstości optycznej (przy 600 nm) równej 1. Przed użyciem dostosować gęstość optyczną kultury komórek odbierających do poziomu 0,4-0,6 za pomocą pożywki LB.</li>
 <li>Przygotować roztwór do osadzania zawierający 2% alginianu i 1% CaCO3, a następnie zmieszać go z każdą z kultur komórek w stosunku 1:1 do końcowego stężenia 1% alginianu i 0,5% CaCO3, tak aby komórki zostały rozcieńczone do gęstości wynoszącej około połowę gęstości hodowli.</li>
 <li>Użyć szkiełka przedmiotowego z naniesionymi dwiema elektrodami ITO, ograniczonymi studzienką z polidimetylosiloksanu (PDMS) (przygotowaną zgodnie z instrukcją Sylgard i dociętą do pożądanego rozmiaru) oraz platynową elektrodą przeciw sweaty.</li>
 <li>Zanurzyć elektrody w roztworze do osadzania zawierającym komórki odbierające. Ustawić zasilacz na stały prąd o gęstości 3 A/m2, gdzie wymiar powierzchni jest definiowany przez pojedynczą elektrodę, na której nastąpi osadzanie.</li>
 <li>Przyłożyć prąd przez 2 minuty, aby umożliwić wspólne osadzanie komórek w matrycy alginianowej.</li>
 <li>Przepłukać film zgodnie z opisem w kroku 1.5.</li>
 <li>Przełączyć połączenie anodowe na drugą, sąsiednią elektrodę ITO.</li>
 <li>Powtórzyć procedurę osadzania (kroki 2.4 - 2.7), wprowadzając tym razem roztwór zawierający komórki nadające sygnał.</li>
 <li>Inkubować przez noc w 37 °C chip z dwiema elektrodami zawierający wspólnie osadzone komórki i alginian wapnia w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) uzupełnionej o 10% pożywki LB i 1 mM CaCl2.</li>
 <li>Po inkubacji wykonać obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Ryc. 2B).</li>
</ol>
3. Elektrodepozycja chitosanu
<ol>
 <li>Podłącz zasilacz do elektrod za pomocą krokodylków. Pozłacany chip krzemowy będzie pełnił rolę katody (elektrody roboczej), a folia platynowa posłuży jako anoda (elektroda przeciwna). Ustaw powierzchnię elektrody złotej naprzeciwko elektrody przeciwnej; obie powinny być ustawione albo pionowo w celu zanurzenia w roztworze, albo poziomo w taki sposób, aby roztwór do osadzania znajdował się na powierzchni.</li>
 <li>Przygotuj roztwór chitosanu, mieszając płatki chitosanu z wodą i powoli dodając 2 M HCl w celu rozpuszczenia polisacharydów (końcowe pH 5,6), postępując zgodnie z procedurą opisaną przez Meyer et al. 15.</li>
 <li>Umieść elektrody w roztworze chitosanu (0,8 %), całkowicie zanurzając obszar przeznaczony do osadzania. Użyty chitosan może być znakowany fluorescencyjnie za pomocą 5-(oraz-6)-karboksyrodaminy 6G estru succinimidylowego (Invitrogen), zgodnie z metodą Wu et al. 8, w celu obrazowania elektroosadzonej warstwy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
 <li>Zastosuj stałą gęstość prądu (4 A/m2) przez 2 minuty. Napięcie będzie zmieniać się w zakresie 2-3 V. Oblicz gęstość prądu jako funkcję powierzchni złota elektrody roboczej wystawionej na działanie roztworu do osadzania.</li>
 <li>Opłucz elektrodę wodą destylowaną (DI), aby usunąć nadmiar chitosanu. Chip można przechowywać w wodzie lub PBS (10 mM, pH 7,0).</li>
 <li>Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Rycyna 3C).</li>
</ol>
4. Transdukcja elektrochemiczna z wykorzystaniem funkcjonalizowanej błony chitozanowej
<ol>
 <li>Współosadź chitosan i oksydazę glukozową (GOx) z roztworu (1% chitosan, 680 U/mL GOx, pH 5,6) przy gęstości prądu 4 A/m2 na wzorowanej elektrodzie zgodnie z Procedurą 3 (Elektrootkładanie chitosanu). W wyniku tego procesu powstanie film chitosanu z uwięzionym GOx.</li>
 <li>Podłącz potraktowaną elektrodę do układu trójelektrodowego jako elektrodę roboczą, stosując drucik platynowy jako elektrodę pomocniczą oraz Ag/AgCl jako elektrodę odniesienia, zgodnie z opisem na Rysunku 4A.</li>
 <li>Zanurz elektrody w roztworze buforu fosforanowego (0,1 M, pH 7,0) zawierającym NaCl (0,1 M).</li>
 <li>Przeprowadź elektrochemiczną konjugację białka z filmem chitosanu poprzez przyłożenie stałego napięcia (0,9 V) przez 60 s przy użyciu chronoamperometrii10.</li>
 <li>Umieść chip w buforze fosforanowym (0,1 M, pH 7,0) i myj przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej, aby usunąć nieprzereagowany NaCl oraz nieskonjugowany GOx.</li>
 <li>Ponownie podłącz do układu trójelektrodowego zgodnie z opisem w kroku 4.2 i zanurz w roztworze 5 mM glukozy. Wykorzystując woltamperometrię cykliczną, wykonaj przesunięcie potencjału w kierunku dodatnim do 0,7 V. Użyj filmu kontrolnego, który nie zawiera oksydazy glukozowej, jako punktu odniesienia dla ilości utleniania zaobserwowanej podczas przesunięcia (Rysunek 4B).</li>
 <li>Wyjmij elektrody z roztworu glukozy i wypłucz buforem fosforanowym (0,1 M, pH 7,0), a następnie umieść elektrody w zlewce o pojemności 10 mL zawierającej 8 mL buforu fosforanowego (0,1 M, pH 7,0). Przyłóż do funkcjonalizowanego GOx chipa napięcie 0,6 V, aby służył on jako elektroda robocza (Rysunek 4C).</li>
 <li>Dodawaj do buforu alikwoty glukozy (każda alikwota zwiększa stężenie glukozy o 4 mM).</li>
 <li>Wyznacz krzywą wzorcową zależności między prądem stanu stacjonarnego a stężeniem glukozy dla funkcjonalizowanego GOx filmu chitosanu.</li>
</ol>
5. Funkcjonalizacja białek z wykorzystaniem montażu enzymatycznego
<ol>
 <li>Użyć szkiełka przedmiotowego z naniesionymi obok siebie elektrodami z złota i ITO, znajdujących się w studzience z PDMS. Przyłożyć do elektrody złotej potencjał katodowy, aby przeprowadzić elektroosadzanie chitozanu, zgodnie z wcześniejszym opisem. Krótko wypłukać film w wodzie DI, a następnie w PBS za pomocą pipety.</li>
 <li>Dodać roztwór 3 μM niebiesko fluorescencyjnie znakowanej „AI-2 Synthase” 16 (z użyciem zestawu znakującego DyLight) + 100 U/mL tyrozynazy w PBS.</li>
 <li>Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie wypłukać film w PBS.</li>
 <li>Przyłożyć potencjał anodowy do elektrody ITO, aby współosadzić roztwór alginianu zawierający komórki odbiorcze (przygotowany w krokach 2.1-2.2). Postępować zgodnie z krokami 2.3-2.6 Procedury 2 (Współosadzanie populacji komórek w alginianie).</li>
 <li>Aby enzymatycznie wygenerować sygnał transmitowany (AI-2), po wypłukaniu filmów dodać roztwór 500 μM S-adenozylohomocysteiny (SAH) w PBS, uzupełniony o 10% pożywkę LB i 1mM CaCl2. Przykryć elektrody, aby zapobiec odparowaniu roztworu, i inkubować przez noc w 37 °C. Pozwoli to na uzyskanie odpowiedzi komórek odbiorczych poprzez generowanie czerwonego białka fluorescencyjnego (dsRed).</li>
 <li>Sąsiednie elektrody można obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, dostosowując filtry tak, aby uchwycić niebieską fluorescencję AI-2 Synthase oraz czerwoną fluorescencję ekspresjonowaną przez współosadzone komórki odbiorcze (Rysunek 5B).</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Przyłożone sygnały elektryczne mogą tworzyć lokalne mikrośrodowiska (np. pola i gradienty) w pobliżu powierzchni elektrody, a bodźce te mogą inicjować samoorganizację polisacharydów, takich jak alginian i chitosan, prowadząc do ich osadzenia w formie filmu hydrożelowego na powierzchni elektrody. Ponieważ to przejście sol-żel zachodzi na powierzchni elektrody, powstały film jest adresowany elektrycznie, a jego geometria odpowiada wzorowi elektrody (Rysunki 1B, 3C). Biokompatybilne filmy, takie jak alginian i chitosan, zapewniają powierzchnie, które mogą być funkcjonalizowane komponentami biologicznymi. Z wykorzystaniem alginianu możliwe było współosadzanie unikalnych populacji komórek w oddzielnych adresach. Dowód ich adresowania elektrycznego obserwuje się podczas interakcji między populacją komórek nadawczych a odbiorczych. Cząsteczka autoinduktora-2 (AI-2) dyfunduje z komórek nadawczych i jest pobierana przez komórki odbiorcze, co skutkuje ekspresją czerwonego białka fluorescencyjnego dsRed (Rysunek 2A). Na Rysunku 2B czerwona fluorescencja jest obserwowana tylko przy elektrodzie, w której zaadresowano komórki odbiorcze.
Grupy aminowe obecne w chitosanie zapewniają mu responsywność na pH wymaganą do elektroosadzania, a także powierzchnię odpowiednią do funkcjonalizacji. Wykorzystaliśmy te wyjątkowe właściwości, sprzęgając elektrochemicznie enzym biosensywny — oksydazę glukozową (GOx) — z elektroosadzonymi filmami chitosanowymi. Enzym ten umożliwia detekcję glukozy poprzez reakcję enzymatyczną (Rysunek 4A), w wyniku której powstaje nadtlenek wodoru, który następnie może zostać utleniony elektrochemicznie, generując prąd wyjściowy. W ten sposób sygnał chemiczny może zostać przekształcony w sygnał elektryczny. Rysunek 4B pokazuje, że filmy, w których GOx została sprzężona elektrochemicznie, generują silny sygnał anodowy w obecności glukozy, w przeciwieństwie do filmów niezawierających GOx. Wyniki te wskazują, że GOx może zostać osadzona na filmie chitosanowym i zachowuje aktywność katalityczną. Ponadto Rysunek 4C przedstawia skokowy wzrost prądu anodowego w odpowiedzi na zwiększające się stężenia glukozy. Krzywa wzorcowa, również przedstawiona na Rysunku 4C, wykazuje, że skokowe wzrosty przebiegały w sposób niemal liniowy, zależnie od ilości dodanej glukozy. Wyniki te dowodzą, że enzym zachowuje również swoją czułość na zwiększające się stężenia glukozy po sprzężeniu z filmem chitosanowym. Dolna granica detekcji nie była w tym przypadku badana, ponieważ została wcześniej opisana dla tego układu w pracy Meyera et. al.
Wykazaliśmy również kowalencyjną immobilizację enzymu, zmodyfikowanego tak, aby zawierał specjalny znacznik penta-tyrozynowy, do chitozanu w sposób kontrolowany enzymatycznie. Konkretnie, proces ten jest katalizowany przez tyrozynazę. Jak przedstawiono na schemacie na Rysunku 5A(góra), enzym AI-2 Synthase zawiera znacznik penta-tyrozynowy. Tyrozynaza oddziałuje na znacznik tyrozynowy, utleniając grupy fenolowe reszt do O-chinonów, które następnie wiążą się kowalencyjnie z aminami chitozanu. Dowód na funkcjonalizację filmu chitozanowego za pomocą AI-2 Synthase poprzez montaż tyrozynazowy widoczny jest na Rysunku 5B, gdzie AI-2 Synthase została oznakowana fluorescencyjnie na niebiesko. Ponieważ AI-2 Synthase generuje AI-2 z substratu S-adenozylohomocysteiny (SAH) w taki sam sposób jak komórki nadawcze, jej bliskość do współosadzonych komórek odbiorczych w obecności SAH powoduje również fluorescencyjną odpowiedź komórek odbiorczych poprzez ekspresję dsRed (Rysunek 5A(dół)). Czerwona fluorescencja komórek odbiorczych (Rysunek 5B) ponownie demonstruje interakcję między adresatami dzięki dyfuzji AI-2 z jednego do drugiego i dodatkowo wskazuje, że enzymy immobilizowane na chitozanie zachowują aktywność po związaniu kowalencyjnym.
<img alt="Tworzenie żelu alginianowego z węglanu wapnia; równanie reakcji; schemat eksperymentalny; dyfuzja jonów." src="/files/ftp_upload/4231/4231fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Elektrodepozycja alginianu. (A) Mechanizm elektrodepozycji alginianu: Podczas polaryzacji anodowej elektrody na jej powierzchni zachodzi elektroliza wody, co prowadzi do lokalnego obniżenia pH. Cząsteczki węglanu wapnia reagują z nadmiarem protonów, uwalniając kationy wapnia w miarę rozpuszczania się cząsteczek. W obecności łańcuchów polimerowych alginianu jony te ulegają chelatacji w sieci typu „eggbox”, tworząc sieciowany hydrożel na elektrodzie. Wraz ze wzrostem odległości od elektrody alginian wykazuje większą tendencję do pozostawania w roztworze ze względu na mniejszą obecność jonów wapnia. (B) Do elektrodepozycji alginianu wykorzystano elektrodę ITO o kształcie litery L. Do elektrody przymocowano studzienkę z PDMS, aby pomieścić roztwór do depozycji zawierający alginian znakowany zieloną fluorescencją (1%) oraz CaCO3 (0,5%). Po przeprowadzeniu elektrodepozycji przez 2 min przy gęstości prądu 3A/m2, obraz hydrożelu alginianowego uformowanego elektrochemicznie uzyskano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
<img alt="Schemat komunikacji AI-2 E. coli na elektrodach ITO i wynik mikroskopii fluorescencyjnej." src="/files/ftp_upload/4231/4231fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Współosadzanie populacji komórek. (A) Schemat przedstawiający interakcję między dwoma szczepami E. coli: jedna populacja produkuje autoinduktor-2 (AI-2), cząsteczkę sygnałową, i jest określana jako „nadawca AI-2”. Druga populacja, określana jako „odbiorca AI-2”, jest reporterem AI-2; po odebraniu AI-2 drogą dyfuzji od nadawcy, wykazuje ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego dsRed. (b) Obraz czerwonej fluorescencji pary elektrod z populacją nadawcy AI-2 współosadzoną z alginianem na lewej elektrodzie oraz populacją odbiorcy AI-2 współosadzoną z alginianem na prawej elektrodzie. Powiększony widok pokazuje ekspresję dsRed wyłącznie w przypadku odbiorców AI-2.
<img alt="Schemat procesu elektrodepozycji chitosanu z gradientem pH i układem analizy fluorescencyjnej." src="/files/ftp_upload/4231/4231fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Elektrodepozycja chitosanu. (A) Schemat przedstawiający zależną od pH elektrodepozycję chitosanu. Elektroliza wody na elektrodzie z potencjałem katodowym powoduje lokalny wzrost pH (widoczny jako lokalna zmiana barwy wskaźnika pH w pobliżu katody na mikrofotografii), co stymuluje przejście sol-żel chitosanu w tym obszarze. (B) Grupy aminowe obecne w chitosanie nadają mu właściwości reaktywne na pH. Powyżej pH 6,3 (pKa chitosanu) aminy ulegają deprotonowaniu, co ułatwia przejście z protonowanej formy rozpuszczalnej do nierozpuszczalnej formy żelu. (C) Do elektrodepozycji chitosanu wykorzystano wzorcowaną elektrodę złotą. Elektrodę, podłączoną katodowo do zasilacza, zanurzono w roztworze do depozycji chitosanu (0,8%) znakowanego zieloną fluorescencją. Po elektrodepozycji trwającej 2 min przy gęstości prądu 4 A/m2, obraz filmu chitosanowego naniesionego elektrochemicznie wykonano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
<img alt="Enzymatyczne elektrochemiczne wykrywanie glukozy; schemat, układ potencjostatu, równania reakcji." src="/files/ftp_upload/4231/4231fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Transdukcja elektrochemiczna z funkcjonalizowaną błoną chitozanową. (A) Schemat przedstawiający układ systemu trzech elektrod. Funkcjonalizowana błona chitozanowa służy jako elektroda robocza, drut platynowy jako elektroda pomocnicza, a Ag/AgCl jako elektroda odniesienia. Transdukcja elektrochemiczna glukozy przebiega poprzez przedstawione reakcje enzymatyczne i elektrochemiczne, w których powstały nadtlenek wodoru może zostać utleniony i wykryty na elektrodzie roboczej. (B) Woltammogram cykliczny (CV) na elektrodzie z błoną chitozanową zawierającą elektrochemicznie sprzężoną oksydazę glukozową (GOx) wykazuje silny sygnał anodowy w 5 mM roztworze glukozy. Błona niezawierająca GOx służyła jako kontrola i nie wykazała sygnału w tym samym roztworze. (C) Krzywa wzorcowa zależności prądu anodowego od stężenia glukozy wykazuje niemal liniową relację (każda alikwota zwiększała stężenie glukozy o 4 mM i zwiększała amplitudę prądu na wykresie wstawkowym w sposób skokowy).
<img alt="Montaż enzymatyczny, schemat syntazy AI-2, wiązanie kowalencyjne, sygnalizacja enzym-komórka, mikroskopia." src="/files/ftp_upload/4231/4231fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Funkcjonalizacja białek za pomocą montażu enzymatycznego. (A, góra) Schemat przedstawiający kowalencyjne przytwierdzanie „syntazy AI-2” z etykietą tyrozynową do błony chitozanowej za pomocą montażu tyrozynazowego. Pozostałości tyrozyny ulegają utlenieniu do O-chinonów w wyniku działania tyrozynazy i mogą reagować z grupami aminowymi na błonie chitozanowej, tworząc wiązanie kowalencyjne. (A, dół) Syntaza AI-2 generuje AI-2 z substratu (SAH); komórki odbiorcze raportują wygenerowany AI-2 poprzez ekspresję fluorescencji dsRed. (B) Obrazy fluorescencyjne przedstawiające błonę chitozanową na złocie, funkcjonalizowaną niebiesko znakowaną syntazą AI-2. Obok, komórki odbiorcze AI-2 są współosadzone z alginianem na ITO. Po dodaniu substratu enzymatycznego do studzienki i inkubacji, komórki odbiorcze AI-2 wykazują ekspresję dsRed.

<ol><li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+generation+of+pH+gradients+in+microfluidic+devices+for+biofabrication+of+freestanding%2C+semi-permeable+chitosan+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes.</a> Lab Chip. 10, 59-65 (2010).</li>
<li>Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Activated+Ionic+Gelation+of+Common+Biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers.</a> Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).</li>
<li>Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+capture+on+patterned+surfaces+coated+with+amphiphilic+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers.</a> Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+to+build+the+biology-device+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Biofabrication to build the biology-device interface.</a> Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).</li>
<li>Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+Enzymatic+Reactions+for+the+Assembly+of+Proteins+at+Electrode+Addresses%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses.</a> Langmuir. 25, 338-344 (2008).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+quantitative+visualization+and+characterization+of+chitosan+electrodeposition+with+paired+sidewall+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes.</a> Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+anodic+electrodeposition+of+calcium+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate.</a> Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).</li>
<li>Wu, L. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Selective+Deposition+of+a+Reactive+Polysaccharide+Layer+onto+a+Patterned+Template%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template.</a> Langmuir. 19, 519-524 (2003).</li>
<li>Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+of+antibodies+and+antigens+via+IgG-binding+domain+engineered+with+activatable+pentatyrosine+pro-tag.+Biotechnol%5BTitle%5D)+AND+%22bioeng%22%5BJournal%5D)">Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol.</a> bioeng. , 103-231 (2009).</li>
<li>Shi, X. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagentless+Protein+Assembly+Triggered+by+Localized+Electrical+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals.</a> Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).</li>
<li>Shi, X. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroaddressing+of+Cell+Populations+by+Co-Deposition+with+Calcium+Alginate+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).</li>
<li>de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+based+microcapsules+for+immunoisolation+of+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells.</a> Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).</li>
<li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+and+their+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications.</a> Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroaddressing+Functionalized+Polysaccharides+as+Model+Biofilms+for+Interrogating+Cell+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling.</a> Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).</li>
<li>Meyer, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan-coated+wires%3A+conferring+electrical+properties+to+chitosan+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers.</a> Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).</li>
<li>Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+biological+nanofactories+trigger+quorum+sensing+response+in+targeted+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria.</a> Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).</li>
<li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+with+chitosan%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biofabrication with chitosan.</a> Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).</li>
<li>Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiba+Benjamin%2C+D+%22Renewable+and+Sustainable+Polymers%22">Renewable and Sustainable Polymers</a>. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).</li>
<li>Koev, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%3A+an+integrative+biomaterial+for+lab-on-a-chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices.</a> Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).</li>
<li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+assembly+of+a+metabolic+pathway+enzyme+in+a+pre-packaged+reusable+bioMEMS+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device.</a> Lab Chip. 8, 420-430 (2008).</li>
<li>Spinks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+%22dual+mode%22+actuation+in+chitosan%2Fpolyaniline%2Fcarbon+nanotube+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor+Actuat+B-Chem%22%5BJournal%5D)">A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers.</a> Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).</li>
<li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+assembly+of+genetically+modified+viral+nanotemplates+via+nucleic+acid+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization.</a> Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).</li>
<li>Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-cycling+and+H2O2+generation+by+fabricated+catecholic+films+in+the+absence+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes.</a> Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).</li>
<li>Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+transdermal+delivery+of+model+drug+compounds+by+MEMS+microneedle+array%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array.</a> Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).</li>
<li>Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microbial+biosensor+based+on+bacterial+cells+immobilized+on+chitosan+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix.</a> Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).</li>
<li>Selimoglu, S. M., Elibol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+as+an+immobilization+material+for+MAb+production+via+encapsulated+hybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).</li>
<li>Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentle+cell+trapping+and+release+on+a+microfluidic+chip+by+in+situ+alginate+hydrogel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation.</a> Lab Chip. 5, 553-559 (2005).</li>
<li>Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Film+Bioprocessing+and+Immunoanalysis+with+Electroaddressable+Stimuli-Responsive+Polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides.</a> Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).</li>
<li>Cheong, M., Zhitomirsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrodeposition+of+alginic+acid+and+composite+films%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+A%22%5BJournal%5D)">Electrodeposition of alginic acid and composite films.</a> Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).</li>
<li>Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+induction+of+recombinant+proteins+by+minimally+rewiring+native+quorum+sensing+regulon+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli.</a> Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).</li>
</ol>

Produkcja i wolny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Agencję Redukcji Zagrożeń Obronnych Stanów Zjednoczonych (Defense Threat Reduction Agency).

Nasze procedury demonstrują elektrodepozycję i funkcjonalizację filmów biopolimerowych, proces ten nazywamy biofabrykacją. Poprzez funkcjonalizację komórkami i biomolekułami tworzymy powierzchnie biologiczne zdolne do oddziaływania ze sobą oraz z adresem elektrody, na której zostały zmontowane. Pierwszy etap, elektrodepozycja, zachodzi poprzez wywołany samomontaż biopolimerów (w naszych badaniach alginianu i chitosanu) w odpowiedzi na sygnał elektryczny. Jak wspomniano wcześniej, generowany jest gradient pH, który można kontrolować za pomocą gęstości prądu i czasu depozycji, co zapewnia dodatkową kontrolę nad wymiarami i właściwościami filmu 6,17. Stwierdziliśmy, że dla elektrod wskazanych w Tabeli 1 można zastosować różne kombinacje gęstości prądu i czasu depozycji. Chociaż użycie innych elektrod jest możliwe, konieczne byłoby wprowadzenie korekt do procedury. W porównaniu z innymi technikami tworzenia filmów, proces elektrodepozycji jest prosty, szybki i nie wymaga odczynników. Nie ma potrzeby posiadania rozbudowanego zestawu drogiego sprzętu ani przeprowadzania żmudnych przygotowań. Co ważne, proces ten jest odporny na niewielkie odchylenia eksperymentalne i w przypadku wystąpienia problemu można go łatwo rozpocząć od nowa.
Chitozan jest zdolny do reagowania na wysoki katodowy gradient pH dzięki istotnym właściwościom funkcjonalnym, które nadaje mu wysoka zawartość amin pierwszorzędowych. Przy wysokim pH (powyżej jego pKa wynoszącego ~6,3) aminy ulegają depresprotonowaniu, a chitozan staje się nierozpuszczalny, co umożliwia tworzenie filmu. Po osadzeniu filmy pozostaną przytwierdzone do elektrody. Istnieje jednak możliwość ich odwarstwienia, jeśli jest to pożądane. Filmy pozostaną stabilne tak długo, jak pH roztworu nie spadnie poniżej pKa. Roztwory kwasowe protonują aminy, a następujące po tym odpychanie elektrostatyczne powoduje pęcznienie żelu aż do jego rozpuszczenia 18. Oznacza to, że proces montażu/demontażu jest odwracalny na żądanie i pozwala na usuwanie osadzonych filmów oraz ponowne wykorzystanie elektrod. Co wygodne, zakres pH, w którym zachodzi przejście sol-żel, jest bliski zakresowi, w którym większość komponentów biologicznych funkcjonuje optymalnie. Sprawia to, że proces ten jest idealny dla zachowania funkcjonalności podczas montażu6.
Tworzenie filmu alginianowego jest wspomagane przez anodową elektrolizę wody oraz obecność węglanu wapnia 7. Lokalne niskie pH przy anodzie rozpuszcza węglan wapnia, co prowadzi do uwalniania kationów wapnia. Jony te są chelatowane przez alginian, tworząc sieciową strukturę na powierzchni elektrody. Filmy alginianowe są wyraźnie odwracalne dzięki konkurencji o jony wapnia ze strony innych związków chelatujących, takich jak cytrynian lub EDTA, które mogą być użyte do rozpuszczenia filmów, co umożliwia ponowne wykorzystanie znajdujących się pod nimi elektrod. W związku z tym filmy alginianowe są stosunkowo nietrwałe w warunkach fizjologicznych, ponieważ jony wapnia są łatwo usuwane z macierzy żelu, co osłabia jego strukturę i sprzyja delaminacji lub ponownemu rozpuszczaniu filmu. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, wprowadziliśmy etap inkubacji filmu w 1 M CaCl2 w celu wzmocnienia żelu. Ponadto zalecamy, aby roztwór inkubacyjny filmu (pożywka komórkowa itp.) był suplementowany CaCl2 w stężeniu 500 μM-3 mM.
Drugą główną procedurą jest funkcjonalizacja naniesionego filmu odpowiednimi komponentami biologicznymi. Można to osiągnąć na dwa sposoby, z czego pierwszym jest konjugacja elektrochemiczna – strategia umożliwiająca szybki, bezodczynnikowy montaż białek z wyjątkową kontrolą przestrzenną 10. Jednak funkcjonalizacja w ten sposób jest ograniczona przez dyfuzję jonów Cl- przez film do elektrody, a także dyfuzję HOCl, generowanego reaktywnego produktu pośredniego, z powrotem do roztworu. Zdolność cząsteczek elektrochemicznie aktywnych do przenikania przez film umożliwia transdukcję sygnałów chemicznych i biologicznych na łatwe do odczytania sygnały elektryczne 15. Wykazaliśmy, że sprzęganie za pośrednictwem tyrozynazy stanowi drugą strategię funkcjonalizacji enzymatycznej chitosanu, co zademonstrowano poprzez kowalencyjne przyłączenie syntazy AI-2. Strategia ta pozwala na kontrolowany i selektywny proces funkcjonalizacji – zależny od konkretnego odczynnika, tyrozynazy, która działa specyficznie na białka zawierające znacznik tyrozynowy 9.
Wykazujemy użyteczność i biokompatybilność systemów wieloadresowych poprzez replikację naturalnych szlaków na chipie. W pierwszej kolejności zorganizowaliśmy dwie populacje komórek (tj. „nadawców” i „odbiorców”) pod odrębnymi adresami i wykazaliśmy, że oddziaływały one za pośrednictwem sąsiednich elektrod, aby dostarczyć AI-2 i wywołać odpowiedź fluorescencyjną. Koncepcja ta została zaprezentowana również przez Cheng et al. w chipie mikrofluidycznym 14. Odtworzyliśmy to oddziaływanie, lecz zamiast tego wykorzystaliśmy enzym do syntezy dostarczanego AI-2. W ten sposób, dzięki biofabrykacji, zreplikowano syntetyczny wewnątrzkomórkowy szlak syntezy AI-2, który funkcjonował w sposób zbliżony do jego działania w roztworze.
W obu przypadkach montaż wielu adresów wiąże się z wyzwaniem uniknięcia nieswoistego wiązania między adresami, ponieważ każdy roztwór do osadzania musi zostać wprowadzony do całego układu elektrod, mimo że elektrodepozycja jest zamierzona tylko w jednym adresie. Delikatne, lecz dokładne płukanie pozwala usunąć większość pozostałego roztworu z elektrod niepodlegających polaryzacji; zastosowanie przepływu w kanałach mikrofluidycznych może dodatkowo zminimalizować nieswoistość. Szczególnie w przypadku sąsiedniej biofabrykacji adresów z chitozanu i alginianu zalecamy najpierw osadzanie filmu chitozanowego, następnie przeprowadzenie etapów biofunkcjonalizacji, a po tym elektrodepozycję alginianu. Chociaż nie zrobiliśmy tego w niniejszej procedurze, stwierdziliśmy, że blokowanie filmu chitozanowego białkami obojętnymi (takimi jak mleko, BSA itp.) znacznie zmniejsza nieswoiste wiązanie niepożądanych cząsteczek z amionowaną powierzchnią chitozanu.
Stwierdziliśmy, że tworzenie elektrod wzorowanych, często spotykanych w urządzeniach bioMEMS, jest użyteczne jako „szablony” dla złożonych układów komórek i biomolekuł. Zastosowania elektroosadzonego chitosanu w urządzeniach bioMEMS mogą wykraczać daleko poza przytoczone tutaj przykłady 19. Chitosan może być osadzany na różnych geometriach w skali mikro – na przykład w mikrokanałach i na powierzchniach niepłaskich 20,15. Filmy te mogą być również modyfikowane innymi polimerami oraz różnymi białkami, DNA, nanocząsteczkami i cząsteczkami aktywnymi redoks w celu uzyskania nowych właściwości 21,22,23. W urządzeniach bioMEMS filmy chitosanowe były wykorzystywane do dostarczania leków, detekcji potencjałów redoks i małych cząsteczek, biokatalizy oraz badań nad komórkami 20,23,24,25. Podobnie alginian jest szeroko stosowany jako matryca do unieruchamiania komórek i był badany pod kątem odwracalnego ograniczania przepływu populacji komórek oraz immunoanalizy wewnątrzfilmu 26,27,28. Za pomocą elektroosadzania alginianu wytworzono filmy kompozytowe do zastosowań w inżynierii tkankowej, zawierające komponenty takie jak hydroksyapatyt, przeznaczone do implantów ortopedycznych 29.
W naszych demonstracjach biofabrykacji wykazaliśmy, że interakcje pomiędzy komponentami biologicznymi oraz na interfejsie bioelektronicznym są równie istotne; otwiera to perspektywę integracji wszystkich rodzajów oddziaływań w celu uzyskania zaawansowanej wydajności przesyłu sygnałów na chipie. W związku z tym biofabrykacja może ułatwić wytwarzanie urządzeń o zredukowanych „minimalnych rozmiarach elementów” jako bezpośrednia kontynuacja szybkiego rozwoju mikrofabrykacji, często napędzanego przez elektronikę użytkową. Oznacza to, że urządzenia następnej generacji mogą w rzeczywistości zawierać labilne komponenty biologiczne, oferujące naturalne, niezwykle precyzyjne możliwości montażu i rozpoznawania w skalach długości jeszcze mniejszych niż w systemach stworzonych przez człowieka. Przewidujemy zastosowania w najbliższej przyszłości w instrumentacji analitycznej, czujnikach środowiskowych, a nawet w biokompatybilnych urządzeniach implantowalnych.

<table><tbody><tr><td>Zasilacz</td><td>Keithley</td><td>SourceMeter 2400</td><td></td></tr><tr><td>Potencjostat tróbelektrodowy</td><td>CH Instruments</td><td>Potencjostat/Galwanostat 600D</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda odniesienia RE-5B Ag/AgCl z elastycznym złączem </td><td>BASi</td><td>MF-2052</td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy powlekany złotem, Si 500 µm, Cr 12 nm, Au 120 nm, SiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; do izolacji</td><td>wykonany na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko przedmiotowe powlekane tlenkiem indu i cyny, prostokątne, rezystancja 8-12 Ω</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>578274</td><td></td></tr><tr><td>Blaszka/folia platynowa (0,002 cala)</td><td>Surepure Chemetals</td><td>1897</td><td></td></tr><tr><td>Slim Line 2&quot; Krokodylki (zaciski typu krokodyl) </td><td>RadioShack</td><td>270-346</td><td></td></tr><tr><td>Przewód połączeniowy z wielostopniowymi wtykami bananowymi</td><td>TSElectronic</td><td>B-36-02 B-24-02</td><td></td></tr><tr><td>zestaw elastomeru silikonowego SYLGARD 184</td><td>Dow Corning</td><td>NC9020938 od Fischera</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus Corporation</td><td>MVX10 MacroView</td><td></td></tr><tr><td>cellSens Standard </td><td>Olympus Corporation</td><td>wersja 1.3</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Sprzęt do elektrodepozycji i wizualizacji fluorescencyjnej.</td></tr><tr><td>Chitozan, średnia masa cząsteczkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448877</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny, ARISTAR, stopień czystości ACS, NF, FCC </td><td>VWR international</td><td>BDH3030</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, roztwór, 10,00 N</td><td>VWR international</td><td>VW3247</td><td></td></tr><tr><td>Kwas alginowy, sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>180947</td><td></td></tr><tr><td>Węglan wapnia wytrącony Multifex-MM, cząstki 70 nm</td><td>Speciality Minerals Inc.</td><td>100-3630-3</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Odczynniki do roztworu chitosanu i alginianu.</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia, dwuwodniany</td><td>J.T. Baker</td><td>0504</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, krystaliczny, certyfikowany ACS</td><td>Fischer Scientific</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan potasu, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>fosforan dwuwodorkowy potasu, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Tabela 3. &lt;/strong&gt; Pozostałe składniki roztworu i odczynniki buforowe.</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa z &lt;em&gt;*Aspergillus niger*&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Tyrozynaza z grzyba</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3824</td><td></td></tr><tr><td>pożywka LB, Miller (granulowana)</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP9723-2</td><td></td></tr><tr><td>&quot;AI2-syntaza&quot; (HGLPT)</td><td>Zasoby laboratoryjne &lt;sup&gt;16&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>komórki typu dzikiego W3110</td><td>Zasoby laboratoryjne &lt;sup&gt;30&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDAI2 + pCT6-&lt;em&gt;lsrR&lt;/em&gt;-&lt;em&gt;amp&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;r&lt;/sup&gt; + pET-&lt;em&gt;dsRed&lt;/em&gt;-&lt;em&gt;kan&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;Proszę o podanie tekstu źródłowego do przetłumaczenia.&lt;/sup&gt; komórki </td><td>Zasoby laboratoryjne &lt;sup&gt;30&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoroSpheres: 1&amp;mu;średnica m, Ex/Em: 505/515</td><td>Invitrogen</td><td>F8765</td><td></td></tr><tr><td>ester succinimidylowy 5-(i-6)-karboksyrodaminy 6G, Ex/Em: 525/560</td><td>Invitrogen</td><td>C-6157</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do znakowania przeciwciał DyLight, 405</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>PI-53020</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Tabela 4. &lt;/strong&gt; Enzymy, komórki i inne odczynniki do funkcjonalizacji.</td></tr></tbody></table>

Łączenie interfejsu bioelektronicznego za pomocą biofabrykacji

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Postępy w technologii lab-on-a-chip obiecują zrewolucjonizować zarówno badania naukowe, jak i medycynę dzięki obniżeniu kosztów, lepszej czułości, przenośności oraz wyższej przepustowości. Włączanie komponentów biologicznych do biologicznych mikroelektromechanicznych systemów (bioMEMS) wykazuje ogromny potencjał w osiąganiu tych celów. Mikrotela elektroniczne umożliwiają tworzenie struktur w skali mikrometrycznej oraz zapewniają połączenie elektryczne niezbędne do detekcji i sterowania. Funkcjonalne komponenty biologiczne nadają systemowi zdolność do specyficznego wykrywania analitów, pełnienia funkcji enzymatycznych oraz wykorzystywania potencjału całych komórek. Standardowe procesy mikrotwórcze oraz techniki bioanalityczne są z sukcesem wykorzystywane od dziesięcioleci odpowiednio w przemyśle komputerowym i biologicznym. Ich połączenie i integracja w środowisku lab-on-a-chip niesie jednak ze sobą nowe wyzwania. Istnieje zapotrzebowanie na techniki umożliwiające tworzenie interfejsu między elektrodą a komponentem biologicznym, który byłby łagodny dla próbek, a także łatwy w wytwarzaniu i strukturyzacji.
Biofabrykacja, opisana w niniejszym materiale, jest jednym z podejść, które wykazują duży potencjał dzięki łatwości włączania komponentów biologicznych oraz wszechstronności funkcji realizowanych na chipie. Biofabrykacja wykorzystuje materiały i mechanizmy biologiczne (samorymontaż, montaż enzymatyczny) do hierarchicznego składania struktur w podejściu bottom-up. Choć w naszych laboratoriach koncepcje te zostały zademonstrowane w wielu formatach 1,2,3, tutaj przedstawiamy proces montażu oparty na elektrodepozycji, po której następują wielokrotne zastosowania oddziaływań opartych na sygnałach. Proces montażu polega na elektrodepozycji biokompatybilnych, responsywnych na bodźce filmów polimerowych na elektrodach, a następnie ich funkcjonalizacji komponentami biologicznymi, takimi jak DNA, enzymy lub żywe komórki 4,5. Elektrodepozycja wykorzystuje gradient pH powstający na powierzchni spolaryzowanej elektrody w wyniku elektrolizy wody 6,7. Chitozan i alginian to responsywne biologiczne polimery, które pod wpływem przyłożonych sygnałów elektrycznych mogą ulegać samorymontażowi w filmy hydrożelowe 8. Grubość tych hydrożeli jest określona przez zasięg gradientu pH rozciągającego się od elektrody. Można go modyfikować, zmieniając gęstość prądu oraz czas depozycji 6,7. Niniejszy protokół opisuje sposób depozycji i funkcjonalizacji filmów chitozanowych poprzez kowalencyjne przyłączanie komponentów biologicznych do licznych grup aminowych pierwszorzędowych obecnych na filmie, przy użyciu metod enzymatycznych lub elektrochemicznych 9,10. Omówione zostaną również filmy alginianowe oraz unieruchamianie w nich żywych komórek 11. Na koniec użyteczność biofabrykacji zostanie zademonstrowana na przykładach oddziaływań opartych na sygnałach, w tym transmisji sygnałów chemiczno-elektrycznych, komórka-komórka oraz enzym-komórka.
Zarówno elektrowydzielanie, jak i funkcjonalizacja mogą być przeprowadzane w warunkach zbliżonych do fizjologicznych bez konieczności stosowania odczynników, co pozwala chronić nietrwałe komponenty biologiczne przed drastycznymi warunkami. Ponadto zarówno chitozan, jak i alginian są od dawna wykorzystywane w celach istotnych biologicznie 12,13. W ogólnym ujęciu biofabrykacja, będąca szybką techniką, którą można łatwo przeprowadzić na blacie laboratoryjnym, może być wykorzystana do tworzenia wzorów funkcjonalnych komponentów biologicznych w skali mikronowej na elektrodach i może służyć w szerokim zakresie zastosowań typu lab-on-a-chip.

Niniejszy artykuł opisuje podejście w zakresie biofabrykacji: osadzanie polisacharydów reagujących na bodźce w obecności spolaryzowanych elektrod w celu stworzenia biokompatybilnych filmów, które mogą zostać funkcjonalizowane komórkami lub białkami. Przedstawiamy laboratoryjną strategię wytwarzania tych filmów, a także ich podstawowe zastosowania w tworzeniu interaktywnych, biofunkcjonalizowanych powierzchni dla aplikacji typu lab-on-a-chip.

Postępy w technologii lab-on-a-chip obiecują zrewolucjonizować zarówno badania, jak i medycynę dzięki niższym kosztom, lepszej czułości, przenośności oraz...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest elektrodepozycja biopolimerowych filmów oraz ich funkcjonalizacja komponentami biologicznymi, takimi jak białka i komórki. Elektrodepozycja jest realizowana poprzez wykorzystanie lokalnej zmiany pH zachodzącej przy spolaryzowanej elektrodzie w połączeniu z roztworem polisacharydu reagującego na pH. Po wybraniu strategii depozycji katodowej lub anodowej, elektrodę polaryzuje się, aby wywołać przejście sol-żel, co prowadzi do powstania cienkiego filmu o wzorze zdefiniowanym przez geometrię elektrod.Ponadto, w trakcie procesu osadzania na elektrodzie można wprowadzać komponenty biologiczne, takie jak białka i komórki. W celu funkcjonalizacji biologicznej filmu uzyskano wyniki wykazujące, na podstawie obrazowania fluorescencyjnego, że komponenty biologiczne są zlokalizowane w obrębie filmów. Dodatkowo wykazano, że komponenty te są funkcjonalne i zdolne do oddziaływania z otoczeniem, co potwierdzono poprzez elektrochemiczną detekcję aktywności enzymatycznej oraz wykorzystanie odpowiedzi komórek reporterowych.Biofabrykacja dostarcza nowatorskich narzędzi do tworzenia interfejsu między biologią a elektroniką. Uważamy, że jej głównymi zaletami są prostota oraz możliwość montażu w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Biologia specjalizuje się w wytwarzaniu w skali nanometrycznej poprzez samozorganizację i mechanizmy enzymatyczne. Wykorzystując te możliwości, unikamy złożonych, niebezpiecznych i czasochłonnych metod syntezy stosowanych w innych technikach montażu.Nasz zespół badawczy wpadł na pomysł zbudowania interfejsu urządzenia BioD z wykorzystaniem materiałów i mechanizmów biologicznych, gdy zaobserwowaliśmy, że kitan może być osadzany elektrochemicznie. Kitan jest polisacharydem tworzącym błony, który reaguje na pH i potrafi rozpoznawać sygnały elektryczne generowane przez urządzenie, osadzając się w formie cienkiej warstwy. Kiedy zauważyliśmy, że kitan może być osadzany na elektrodzie, zdaliśmy sobie sprawę, że możemy wykorzystać szerszy zestaw narzędzi z zakresu biochemii i biologii molekularnej do budowy interfejsu urządzenia BioD.Zastosowanie tej techniki rozszerza się na układy typu lab-on-a-chip, w których wymagane są funkcjonalne komponenty biologiczne, ponieważ zapewnia ona tani i łatwy sposób lokalizacji takich komponentów na elektrodzie, na której mogą one pozostać żywe. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ biofabrykowana warstwa może być delikatna i podatna na uszkodzenia. W związku z tym należy zachować ostrożność, aby nie działać zbyt gwałtownie podczas płukania lub osuszania warstwy.Powłoka może być podatna na łatwe zaburzenia. Zaletą jest jednak możliwość ponownego wykorzystania elektrod, ponieważ powłokę można z nich łatwo usunąć. Aby rozpocząć procedurę, należy podłączyć zasilacz do wykonanych na zamówienie elektrod za pomocą przewodów połączeniowych i klipsów krokodylkowych.Szkiełko pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) będzie pełnić funkcję anody lub elektrody roboczej, natomiast folia platynowa będzie służyć jako katoda lub elektroda przeciwna. Należy ustawić elektrodę w taki sposób, aby powierzchnia ITO przeznaczona do funkcjonalizacji była skierowana przeciwlegle do elektrody przeciwnej, przy czym powierzchnia ITO powinna być ustawiona albo pionowo, aby można ją było zanurzyć w roztworze, albo poziomo, tak aby roztwór mógł zostać utrzymany na jej powierzchni. Następnie należy przygotować roztwór do osadzania alginianu poprzez zmieszanie 1% alginianu i 0,5% węglanu wapnia w wodzie destylowanej, a następnie poddać mieszaninę autoklawowaniu. Potem należy znakować alginian fluorescencyjnie za pomocą sfer fluorescencyjnych poprzez mieszanie i wirowanie w wortexie.Umożliwi to obrazowanie fluorescencyjne otrzymanej warstwy. Po autoklawowaniu zanurz obie elektrody w przygotowanym roztworze do osadzania, a następnie przyłóż stałą gęstość prądu wynoszącą 3 A/m² przez dwie minuty. Napięcie będzie zmieniać się w zakresie od 2 do 3 V. Po dwóch minutach odłącz elektrodę i usuń pozostały roztwór. Delikatnie wypłucz warstwę chlorkiem sodu, aby usunąć nadmiar alginianu.Krótko inkubuj błonę w 0,1 molarnym chlorku wapnia, aby utwardzić żel. Następnie inkubuj błonę w wybranym roztworze do przechowywania. Przed współosadzaniem przeprowadź obrazowanie błony z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.Wyhoduj kulturę komórek nadawczych sygnału oraz kulturę komórek odbierających sygnał zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym towarzyszącym temu filmowi. Następnie przygotuj roztwór do osadzania alginianu i węglanu wapnia. Wymieszaj roztwór z każdą z kultur komórkowych w stosunku jeden do jednego do końcowego stężenia 1% alginianu i 0.5% węglanu wapnia, przy rozcieńczeniu komórek do około połowy gęstości hodowli.Należy użyć szkiełka przedmiotowego z naniesionymi dwiema elektrodami z ITO, ograniczonymi studzienką z polidimetylosiloksanu, oraz platynową elektrodą przeciw creando. Podłącz jedną elektrodę z ITO oraz elektrodę platynową do zasilacza. Następnie, jak wcześniej, zanurz elektrody w roztworze do osadzania zawierającym komórki biorcy.Ustaw zasilacz na stały prąd o gęstości 3 A/m², gdzie wymiar powierzchni określony jest przez pojedynczą elektrodę, na której będzie zachodzić osadzanie. Przykładaj prąd przez dwie minuty, aby umożliwić współosadzanie komórek w matrycy alginianowej. Przepłucz film chlorkiem sodu jak wcześniej, a następnie przełącz połączenie przeciwne do sąsiedniej elektrody ITO.Powtórzyć procedurę osadzania, wprowadzając tym razem roztwór zawierający komórki nadawcze. Chip z dwiema elektrodami, zawierający współosadzone komórki oraz argentyt wapniowy, inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym.Uzupełniono pożywką LB 10% oraz chlorkiem wapnia 1 mM. Po inkubacji należy obrazować chip za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby rozpocząć osadzanie elektrody z chitozanu. Podłącz zasilacz do elektrod.Podłącz klipsy krokodylkowe. Pozłacane podłoże krzemowe będzie pełniło funkcję katody, a folia platynowa będzie służyć jako anoda. Ustaw powierzchnię elektrody złotej w taki sposób, aby znajdowała się naprzeciwko elektrody pomocniczej, analogicznie jak poprzednio.Przygotuj roztwór piasku Kato, mieszając płatki piasku Kato z wodą i powoli dodając chlorek wodoru o stężeniu 2 M w celu rozpuszczenia polisacharydów. Zgodnie z procedurą opisaną w tekście, roztwór piasku Kato można znakować fluorescencyjnie, aby obrazować warstwę osadzoną na elektrodzie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Następnie umieść elektrody w roztworze kaizan, całkowicie zanurzając obszar przeznaczony do osadzania.Przez dwie minuty przyłóż stały prąd obliczony dla gęstości 4 A/m², w zależności od powierzchni elektrody roboczej. W tym przypadku do elektrody złotej o powierzchni 4 mm² przyłożono prąd 16 µA, a napięcie zmieni się w zakresie od 2 do 3 V. Następnie opłucz elektrodę wodą dejonizowaną, aby usunąć nadmiar chitosanu. Przejdź do obrazowania filmu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego; współosadzenie chitosanu i oksydazy glukozowej z roztworu przy gęstości prądu 4 A/m² na wzorowanej elektrodzie.Zgodnie z procedurą osadzania elektrody z chitozanu, zostanie wytworzona warstwa kaizan z uwięzioną oksydazą glukozy. Podłącz przetworzoną elektrodę do układu trójelektrodowego jako elektrodę roboczą, drut platynowy jako elektrodę przeciwskuteczną oraz srebro/chlorek srebra jako elektrodę odniesienia, a następnie zanurz elektrody w roztworze buforu fosforanowego zawierającego chlorek sodu. Przeprowadź elektrochemiczną koniugację białka z warstwą Kazam, przykładając stałe napięcie przez 60 sekund przy użyciu chronopotencjometrii po zakończeniu koniugacji.Umieść chip w buforze fosforanowym i myj przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej, aby usunąć nieprzereagowany chlorek sodu oraz nie sprzężoną oksydazę glukozową. Ponownie podłącz układ trzech elektrod i zanurz go w roztworze glukozy o stężeniu five millimolar. Następnie ustaw odpowiednie parametry dla woltamperometrii cyklicznej, aby przeprowadzić skanowanie potencjału w kierunku dodatnim do 0,7 volts.Wyjąć elektrody z roztworu glukozy i opłukać je buforem fosforanowym. Następnie umieścić elektrody w zlewce o pojemności 10 ml zawierającej 8 ml buforu fosforanowego, ustawionej na mieszadle magnetycznym. Potencjał chipa funkcjonalizowanego GOX ustawić na 0,6 V, aby pełnił on funkcję elektrody roboczej.Po ustawieniu pożądanych parametrów, przeprowadź pomiar bazowy. Dodawaj alikwoty glukozy do buforu, aby zwiększać stężenie glukozy o 4 mM z każdą alikwotą. W tym doświadczeniu do buforu dodawane są 400 µL alikwotów glukozy o stężeniu 80 mM. Powiąż uzyskany prąd z każdym stężeniem glukozy. Aby wygenerować krzywą wzorcową w celu przeprowadzenia funkcjonalizacji białek, użyj szkiełka podstawowego z naniesionymi sąsiadującymi elektrodami z złota i ITO, zamkniętych w A-P-D-M-S.Następnie polaryzuj elektrodę złota potencjałem katodowym, aby osadzić tizen metodą elektrodepozycji, zgodnie z wcześniejszym opisem. Po wypłukaniu filmu dodaj roztwór syntazy autoinduktora dwa oznakowanego niebieskim fluorescencyjnym znacznikiem, uzupełniony o tyrozynazę. Następnie inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Opłucz film w PBS w taki sam sposób jak poprzednio, a następnie przyłóż potencjał anodowy do elektrody ITO zanurzonej w roztworze do osadzania alginianu zawierającym komórki odbiorcze. Kontynuuj zgodnie z krokami opisanymi w sekcji dotyczacej współosadzania populacji komórek w alginianie, aby enzymatycznie wygenerować sygnał przekazywany. Po opłukaniu filmów dodaj roztwór 5 µM SAH w PBS uzupełniony o 10% pożywki LB oraz 1 mM.Przykryj elektrody chlorkiem wapnia, aby zapobiec odparowaniu roztworu, i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. Pozwoli to na uzyskanie odpowiedzi komórki odbiorczej poprzez generowanie czerwonego białka fluorescencyjnego DS red; sąsiednie elektrody można obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, dostosowując filtry w celu uchwycenia niebieskiej fluorescencji induktora dwa syntazy oraz czerwonej fluorescencji eksprymowanej przez zaadaptowane komórki odbiorcze. Nałożone sygnały elektryczne mogą tworzyć zlokalizowane mikrośrodowiska w pobliżu powierzchni elektrody, a bodźce te mogą wywołać samoorganizację polisacharydów, takich jak alginian i razan, prowadząc do ich osadzenia w formie filmu hydrożelowego na powierzchni elektrody.Ponieważ przejście z fazy sol w żel zachodzi na powierzchni elektrody, powstała błona jest adresowana elektrycznie w sposób odpowiadający geometrii wzoru elektrod. Z wykorzystaniem alginianu współosadzono unikalne populacje komórek w oddzielnych adresach. Dowód na ich adresowanie elektrodowe obserwuje się podczas interakcji pomiędzy populacją komórek nadawczych a odbiorczych.Cząsteczka autoinduktor dwa dyfunduje z komórek nadawczych i jest pobierana przez komórki odbiorcze, co skutkuje ekspresją czerwonego białka fluorescencyjnego DS red. Tutaj czerwona fluorescencja jest obserwowana wyłącznie przy elektrodzie, w miejscu zaadresowania odbiorców. Z kolei enzym biosensoryczny oksydaza glukozowa umożliwia detekcję glukozy poprzez reakcję enzymatyczną prowadzącą do wytworzenia nadtlenku wodoru, który może następnie zostać utleniony elektrochemicznie w celu wygenerowania prądu wyjściowego.W ten sposób sygnał chemiczny może zostać przekształcony w elektryczny. Wykres ten pokazuje, że filmy, w których Geo X został sprzężony chemicznie, generują silny sygnał antyczny w obecności glukozy, w przeciwieństwie do filmów niezawierających Geo X. Wyniki te wskazują, że Geo X może zostać osadzony na naniesionym filmie zam i zachować aktywność katalityczną. Co więcej, w odpowiedzi na zwiększające się stężenia glukozy następuje skokowy wzrost prądu otycznego.Przedstawiona krzywa wzorcowa pokazuje również, że stopniowe wzrosty następowały w sposób niemal liniowy, zależnie od ilości dodanego glukozy. Wyniki te wskazują, że enzym zachowuje swoją czułość po sprzężeniu z warstwą Razza; jak tu przedstawiono, I two synthase zawiera znacznik Penta tyrozyny. Tyrozynaza oddziałuje na znacznik tyrozynowy, utleniając grupy fenolowe reszt do o-chinonów, które następnie wiążą się kowalencyjnie z aminami kazan. Dowód na funkcjonalizację warstwy Kazan w obrębie I two synthase poprzez montaż tyrozynazy jest widoczny na tym obrazie fluorescencyjnym, przedstawiającym warstwę kaza na złocie, gdzie funkcjonalizowana I two synthase została znakowana fluorescencyjnie na niebiesko. Ponieważ I two synthase generuje I two z substratu SAH w taki sam sposób jak komórki nadawcze, jej bliskość względem zaadoptowanych komórek odbiorczych w obecności SAH powoduje również fluorescencyjną odpowiedź komórek odbiorczych poprzez ekspresję ds.Czerwona fluorescencja komórek odbiorczych ponownie potwierdza interakcję między adresami wynikającą z dyfuzji ai, dwóch z jednej do drugiej, a ponadto wskazuje, że 10 enzymów unieruchomionych w tizen zachowuje aktywność po związaniu kowalencyjnym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak elektrodeponować filmy polisacharydowe oraz jak funkcjonalizować je za pomocą różnych technik. Wykazaliśmy wszechstronność tych etapów funkcjonalizacji, co pozwala nam na pracę z wieloma komponentami biologicznymi w dalszych badaniach.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonywać w zaledwie kilka minut, aby wytworzyć wyraźne wzory warstwy, na których można precyzyjnie zaszczepić komponenty biologiczne. W ten sposób jesteśmy w stanie bardzo łatwo tworzyć biologicznie wzorowane i aktywne powierzchnie na wybranych elektrodach, w sposób uporządkowany, a jednocześnie umożliwiający uzyskanie złożonych oddziaływań biologicznych. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać kreatywność zarówno w projektowaniu matrycy elektrod, jak i w doborze komponentów biologicznych, aby osiągnąć zamierzone oddziaływania.Mamy nadzieję, że narzędzia biofabrykacji połączą dwie odrębne dziedziny – biotechnologię i mikroelektronikę, z których każda z osobna zrewolucjonizowała nasze życie. Wierzymy, że dzięki integracji tych dwóch obszarów stworzymy nowe rozwiązania dla niektórych z najbardziej palących problemów współczesnego społeczeństwa. Przykładowo, przewidujemy, że biofabrykacja może dostarczyć prostych i wszechstronnych metod wdrażania nowych sposobów detekcji, w tym rozwiązań typu point-of-care, diagnostyki chorób oraz wykrywania zagrożeń biologicznych i chemicznych.Jednym z daleko idących przykładów może być stent tętniczy nowej generacji, który byłby w stanie monitorować profil metaboliczny pacjenta, a jednocześnie utrzymywać drożność tętnicy.

bridging-the-bio-electronic-interface-with-biofabrication

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Łączenie interfejsu bioelektronicznego z biofabrykacją

W tym artykule opisujemy różne techniki dla platform szybkiego prototypowania mikroprzepływów. Proponowane techniki opierają się na epoksydach wrażliwych na promieniowanie ultrafioletowe (UV) i utwardzanych temperaturowo, rurkach na bazie polidimetylosiloksanu (PDMS), łączeniu drutem i anizotropowych foliach adhezyjnych. Przedstawione procedury montażu zostały opracowane zarówno dla urządzeń jednorazowego użytku, jak i systemów mikroprzepływowych wielokrotnego użytku.

Wysokowydajne, mikroprzepływowe, szybkie i tanie metody prototypowania

Ten artykuł zawiera szczegółowy opis procesu produkcji płaskiej elektrody nerwowej o wysokiej gęstości kontaktu (FINE). Elektroda ta jest zoptymalizowana pod kątem selektywnego rejestrowania i stymulowania aktywności neuronalnej w nerwach obwodowych.

Wytwarzanie elektrod nerwowych o płaskim interfejsie o dużej gęstości kontaktowej do zastosowań związanych z rejestracją i stymulacją

Ten artykuł przedstawia serię protokołów do rozwoju inżynieryjnych komórek i funkcjonalizowanych powierzchni, które umożliwiają syntetycznie modyfikowanym E. coli kontrolowanie i manipulowanie programowalnymi powierzchniami materiałów.

Wykorzystanie biologii syntetycznej do inżynierii żywych komórek, które łączą się z programowalnymi materiałami

W tym artykule prezentujemy protokół selektywnego osadzania materiałów organicznych na tekstyliach, który pozwala na bezpośrednią integrację organicznych urządzeń elektronicznych z urządzeniami do noszenia. Wyprodukowane urządzenia można w pełni zintegrować z tekstyliami, szanując ich mechaniczny wygląd i umożliwiając wykrywanie.

Prosta i skalowalna metoda wytwarzania organicznych urządzeń elektronicznych na tekstyliach

Ta publikacja opisuje produkcję urządzenia typu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego oznaczania oporu elektrycznego przezśródbłonka (TEER). W celu walidacji bariera krew-mózg została naśladowana wewnątrz tego urządzenia mikroprzepływowego i monitorowano jego funkcję bariery. Przedstawione metody integracji elektrod i bezpośredniego oznaczania ilościowego TEER mają ogólne zastosowanie.

Produkcja i walidacja systemu Organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej

Wykazaliśmy, że wytrawianie nano-architektury w wewnątrzkorowych urządzeniach mikroelektrodowych może zmniejszyć reakcję zapalną i ma potencjał do poprawy zapisów elektrofizjologicznych. Opisane w niniejszym dokumencie metody nakreślają podejście do wytrawiania nanoarchitektur na powierzchni niefunkcjonalnych i funkcjonalnych mikroelektrod krzemowych z pojedynczym trzpieniem wewnątrzkorowym.

Litografia z użyciem skupionej wiązki jonów do wytrawiania nanoarchitektur w mikroelektrodach

Rusztowanie inspirowane biologią jest wytwarzane techniką miękkiej fotolitografii przy użyciu mechanicznie wytrzymałych i elektrycznie przewodzących hydrożeli. Hydrożele z mikrowzorem zapewniają kierunkowe wyrównanie komórek kardiomiocytów, co skutkuje dostosowanym kierunkiem uruchamiania. Elastyczne mikroelektrody są również zintegrowane z rusztowaniem, aby zapewnić kontrolę elektryczną dla samoczynnie działającej tkanki serca.

Miękki robot inspirowany biologicznie z wbudowanymi mikroelektrodami

Dwie najnowsze technologie - tatuaż i tekstylia - wykazały obiecujące wyniki w zakresie czucia skóry. W tym miejscu przedstawiamy metody wytwarzania i oceny elektrod do tatuażu i elektrod tekstylnych do elektrofizjologicznego wykrywania skóry. Te interfejsy elektroniczne wykonane z przewodzących polimerów przewyższają istniejące standardy pod względem komfortu i czułości.

Dopasowane elektrody do noszenia: od produkcji do oceny elektrofizjologicznej

Tutaj prezentujemy protokół użycia organicznych tranzystorów elektrochemicznych (OECT) do translacji aktywności zewnątrzkomórkowego transferu elektronów (EET) w Shewanella oneidensis na sygnały elektryczne. Hybrydowy system OECT zapewnia zwiększoną solidność, czułość i potencjał do szybkich, wysokowydajnych testów, co czyni go skutecznym narzędziem do pomiarów EET.

Translacja zewnątrzkomórkowych działań związanych z przenoszeniem elektronów za pomocą organicznych tranzystorów elektrochemicznych

Protokół ten przedstawia zaawansowane metody wytwarzania materiałów i ex vivo badania serca szczurów do optycznego i elektrycznego dwukierunkowego biointerfejsu, umożliwiając precyzyjną stymulację serca, rejestrację i modelowanie zawału na potrzeby badań bioelektronicznych.

Dwukierunkowe interfejsy elektryczne i optoelektroniczne w zdrowych i niedokrwionych sercach szczurów ex vivo

Protokół ten opisuje wytwarzanie jednoczęściowego tranzystora polowego (ISFET) na bazie tlenku indu i cyny (ITO), który może być skonstruowany jako czujnik FET bramkowany roztworem (np. czujnik pH) przy użyciu krótkiego i prostego procesu (około pół dnia). Ten jednoczęściowy tranzystor ITO-ISFET może być również stosowany do biodetekcji.

Wytwarzanie jednoczęściowego tranzystora na bazie tlenku indu i cyny z bramką rozpuszczającą, umożliwiającego czułą biodetekcję

Poznaj metodę elektroosadzania filmów polisacharydowych i ich funkcjonalizacji białkami oraz komórkami. Technika ta umożliwia tworzenie interaktywnych powierzchni bioelektronicznych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Łączenie interfejsu bioelektronicznego za pomocą biofabrykacji

Przeglądaj więcej filmów