Łączenie interfejsu bioelektronicznego za pomocą biofabrykacji

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest elektrodepozycja biopolimerowych filmów oraz ich funkcjonalizacja komponentami biologicznymi, takimi jak białka i komórki. Elektrodepozycja jest realizowana poprzez wykorzystanie lokalnej zmiany pH zachodzącej przy spolaryzowanej elektrodzie w połączeniu z roztworem polisacharydu reagującego na pH. Po wybraniu strategii depozycji katodowej lub anodowej, elektrodę polaryzuje się, aby wywołać przejście sol-żel, co prowadzi do powstania cienkiego filmu o wzorze zdefiniowanym przez geometrię elektrod.

Ponadto, w trakcie procesu osadzania na elektrodzie można wprowadzać komponenty biologiczne, takie jak białka i komórki. W celu funkcjonalizacji biologicznej filmu uzyskano wyniki wykazujące, na podstawie obrazowania fluorescencyjnego, że komponenty biologiczne są zlokalizowane w obrębie filmów. Dodatkowo wykazano, że komponenty te są funkcjonalne i zdolne do oddziaływania z otoczeniem, co potwierdzono poprzez elektrochemiczną detekcję aktywności enzymatycznej oraz wykorzystanie odpowiedzi komórek reporterowych.

Biofabrykacja dostarcza nowatorskich narzędzi do tworzenia interfejsu między biologią a elektroniką. Uważamy, że jej głównymi zaletami są prostota oraz możliwość montażu w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Biologia specjalizuje się w wytwarzaniu w skali nanometrycznej poprzez samozorganizację i mechanizmy enzymatyczne. Wykorzystując te możliwości, unikamy złożonych, niebezpiecznych i czasochłonnych metod syntezy stosowanych w innych technikach montażu.

Nasz zespół badawczy wpadł na pomysł zbudowania interfejsu urządzenia BioD z wykorzystaniem materiałów i mechanizmów biologicznych, gdy zaobserwowaliśmy, że kitan może być osadzany elektrochemicznie. Kitan jest polisacharydem tworzącym błony, który reaguje na pH i potrafi rozpoznawać sygnały elektryczne generowane przez urządzenie, osadzając się w formie cienkiej warstwy. Kiedy zauważyliśmy, że kitan może być osadzany na elektrodzie, zdaliśmy sobie sprawę, że możemy wykorzystać szerszy zestaw narzędzi z zakresu biochemii i biologii molekularnej do budowy interfejsu urządzenia BioD.

Zastosowanie tej techniki rozszerza się na układy typu lab-on-a-chip, w których wymagane są funkcjonalne komponenty biologiczne, ponieważ zapewnia ona tani i łatwy sposób lokalizacji takich komponentów na elektrodzie, na której mogą one pozostać żywe. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ biofabrykowana warstwa może być delikatna i podatna na uszkodzenia. W związku z tym należy zachować ostrożność, aby nie działać zbyt gwałtownie podczas płukania lub osuszania warstwy.

Powłoka może być podatna na łatwe zaburzenia. Zaletą jest jednak możliwość ponownego wykorzystania elektrod, ponieważ powłokę można z nich łatwo usunąć. Aby rozpocząć procedurę, należy podłączyć zasilacz do wykonanych na zamówienie elektrod za pomocą przewodów połączeniowych i klipsów krokodylkowych.

Szkiełko pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) będzie pełnić funkcję anody lub elektrody roboczej, natomiast folia platynowa będzie służyć jako katoda lub elektroda przeciwna. Należy ustawić elektrodę w taki sposób, aby powierzchnia ITO przeznaczona do funkcjonalizacji była skierowana przeciwlegle do elektrody przeciwnej, przy czym powierzchnia ITO powinna być ustawiona albo pionowo, aby można ją było zanurzyć w roztworze, albo poziomo, tak aby roztwór mógł zostać utrzymany na jej powierzchni. Następnie należy przygotować roztwór do osadzania alginianu poprzez zmieszanie 1% alginianu i 0,5% węglanu wapnia w wodzie destylowanej, a następnie poddać mieszaninę autoklawowaniu. Potem należy znakować alginian fluorescencyjnie za pomocą sfer fluorescencyjnych poprzez mieszanie i wirowanie w wortexie.

Umożliwi to obrazowanie fluorescencyjne otrzymanej warstwy. Po autoklawowaniu zanurz obie elektrody w przygotowanym roztworze do osadzania, a następnie przyłóż stałą gęstość prądu wynoszącą 3 A/m² przez dwie minuty. Napięcie będzie zmieniać się w zakresie od 2 do 3 V. Po dwóch minutach odłącz elektrodę i usuń pozostały roztwór. Delikatnie wypłucz warstwę chlorkiem sodu, aby usunąć nadmiar alginianu.

Krótko inkubuj błonę w 0,1 molarnym chlorku wapnia, aby utwardzić żel. Następnie inkubuj błonę w wybranym roztworze do przechowywania. Przed współosadzaniem przeprowadź obrazowanie błony z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Wyhoduj kulturę komórek nadawczych sygnału oraz kulturę komórek odbierających sygnał zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym towarzyszącym temu filmowi. Następnie przygotuj roztwór do osadzania alginianu i węglanu wapnia. Wymieszaj roztwór z każdą z kultur komórkowych w stosunku jeden do jednego do końcowego stężenia 1% alginianu i 0.5% węglanu wapnia, przy rozcieńczeniu komórek do około połowy gęstości hodowli.

Należy użyć szkiełka przedmiotowego z naniesionymi dwiema elektrodami z ITO, ograniczonymi studzienką z polidimetylosiloksanu, oraz platynową elektrodą przeciw creando. Podłącz jedną elektrodę z ITO oraz elektrodę platynową do zasilacza. Następnie, jak wcześniej, zanurz elektrody w roztworze do osadzania zawierającym komórki biorcy.

Ustaw zasilacz na stały prąd o gęstości 3 A/m², gdzie wymiar powierzchni określony jest przez pojedynczą elektrodę, na której będzie zachodzić osadzanie. Przykładaj prąd przez dwie minuty, aby umożliwić współosadzanie komórek w matrycy alginianowej. Przepłucz film chlorkiem sodu jak wcześniej, a następnie przełącz połączenie przeciwne do sąsiedniej elektrody ITO.

Powtórzyć procedurę osadzania, wprowadzając tym razem roztwór zawierający komórki nadawcze. Chip z dwiema elektrodami, zawierający współosadzone komórki oraz argentyt wapniowy, inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym.

Uzupełniono pożywką LB 10% oraz chlorkiem wapnia 1 mM. Po inkubacji należy obrazować chip za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby rozpocząć osadzanie elektrody z chitozanu. Podłącz zasilacz do elektrod.

Podłącz klipsy krokodylkowe. Pozłacane podłoże krzemowe będzie pełniło funkcję katody, a folia platynowa będzie służyć jako anoda. Ustaw powierzchnię elektrody złotej w taki sposób, aby znajdowała się naprzeciwko elektrody pomocniczej, analogicznie jak poprzednio.

Przygotuj roztwór piasku Kato, mieszając płatki piasku Kato z wodą i powoli dodając chlorek wodoru o stężeniu 2 M w celu rozpuszczenia polisacharydów. Zgodnie z procedurą opisaną w tekście, roztwór piasku Kato można znakować fluorescencyjnie, aby obrazować warstwę osadzoną na elektrodzie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Następnie umieść elektrody w roztworze kaizan, całkowicie zanurzając obszar przeznaczony do osadzania.

Przez dwie minuty przyłóż stały prąd obliczony dla gęstości 4 A/m², w zależności od powierzchni elektrody roboczej. W tym przypadku do elektrody złotej o powierzchni 4 mm² przyłożono prąd 16 µA, a napięcie zmieni się w zakresie od 2 do 3 V. Następnie opłucz elektrodę wodą dejonizowaną, aby usunąć nadmiar chitosanu. Przejdź do obrazowania filmu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego; współosadzenie chitosanu i oksydazy glukozowej z roztworu przy gęstości prądu 4 A/m² na wzorowanej elektrodzie.

Zgodnie z procedurą osadzania elektrody z chitozanu, zostanie wytworzona warstwa kaizan z uwięzioną oksydazą glukozy. Podłącz przetworzoną elektrodę do układu trójelektrodowego jako elektrodę roboczą, drut platynowy jako elektrodę przeciwskuteczną oraz srebro/chlorek srebra jako elektrodę odniesienia, a następnie zanurz elektrody w roztworze buforu fosforanowego zawierającego chlorek sodu. Przeprowadź elektrochemiczną koniugację białka z warstwą Kazam, przykładając stałe napięcie przez 60 sekund przy użyciu chronopotencjometrii po zakończeniu koniugacji.

Umieść chip w buforze fosforanowym i myj przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej, aby usunąć nieprzereagowany chlorek sodu oraz nie sprzężoną oksydazę glukozową. Ponownie podłącz układ trzech elektrod i zanurz go w roztworze glukozy o stężeniu five millimolar. Następnie ustaw odpowiednie parametry dla woltamperometrii cyklicznej, aby przeprowadzić skanowanie potencjału w kierunku dodatnim do 0,7 volts.

Wyjąć elektrody z roztworu glukozy i opłukać je buforem fosforanowym. Następnie umieścić elektrody w zlewce o pojemności 10 ml zawierającej 8 ml buforu fosforanowego, ustawionej na mieszadle magnetycznym. Potencjał chipa funkcjonalizowanego GOX ustawić na 0,6 V, aby pełnił on funkcję elektrody roboczej.

Po ustawieniu pożądanych parametrów, przeprowadź pomiar bazowy. Dodawaj alikwoty glukozy do buforu, aby zwiększać stężenie glukozy o 4 mM z każdą alikwotą. W tym doświadczeniu do buforu dodawane są 400 µL alikwotów glukozy o stężeniu 80 mM. Powiąż uzyskany prąd z każdym stężeniem glukozy. Aby wygenerować krzywą wzorcową w celu przeprowadzenia funkcjonalizacji białek, użyj szkiełka podstawowego z naniesionymi sąsiadującymi elektrodami z złota i ITO, zamkniętych w A-P-D-M-S.

Następnie polaryzuj elektrodę złota potencjałem katodowym, aby osadzić tizen metodą elektrodepozycji, zgodnie z wcześniejszym opisem. Po wypłukaniu filmu dodaj roztwór syntazy autoinduktora dwa oznakowanego niebieskim fluorescencyjnym znacznikiem, uzupełniony o tyrozynazę. Następnie inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Opłucz film w PBS w taki sam sposób jak poprzednio, a następnie przyłóż potencjał anodowy do elektrody ITO zanurzonej w roztworze do osadzania alginianu zawierającym komórki odbiorcze. Kontynuuj zgodnie z krokami opisanymi w sekcji dotyczacej współosadzania populacji komórek w alginianie, aby enzymatycznie wygenerować sygnał przekazywany. Po opłukaniu filmów dodaj roztwór 5 µM SAH w PBS uzupełniony o 10% pożywki LB oraz 1 mM.

Przykryj elektrody chlorkiem wapnia, aby zapobiec odparowaniu roztworu, i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. Pozwoli to na uzyskanie odpowiedzi komórki odbiorczej poprzez generowanie czerwonego białka fluorescencyjnego DS red; sąsiednie elektrody można obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, dostosowując filtry w celu uchwycenia niebieskiej fluorescencji induktora dwa syntazy oraz czerwonej fluorescencji eksprymowanej przez zaadaptowane komórki odbiorcze. Nałożone sygnały elektryczne mogą tworzyć zlokalizowane mikrośrodowiska w pobliżu powierzchni elektrody, a bodźce te mogą wywołać samoorganizację polisacharydów, takich jak alginian i razan, prowadząc do ich osadzenia w formie filmu hydrożelowego na powierzchni elektrody.

Ponieważ przejście z fazy sol w żel zachodzi na powierzchni elektrody, powstała błona jest adresowana elektrycznie w sposób odpowiadający geometrii wzoru elektrod. Z wykorzystaniem alginianu współosadzono unikalne populacje komórek w oddzielnych adresach. Dowód na ich adresowanie elektrodowe obserwuje się podczas interakcji pomiędzy populacją komórek nadawczych a odbiorczych.

Cząsteczka autoinduktor dwa dyfunduje z komórek nadawczych i jest pobierana przez komórki odbiorcze, co skutkuje ekspresją czerwonego białka fluorescencyjnego DS red. Tutaj czerwona fluorescencja jest obserwowana wyłącznie przy elektrodzie, w miejscu zaadresowania odbiorców. Z kolei enzym biosensoryczny oksydaza glukozowa umożliwia detekcję glukozy poprzez reakcję enzymatyczną prowadzącą do wytworzenia nadtlenku wodoru, który może następnie zostać utleniony elektrochemicznie w celu wygenerowania prądu wyjściowego.

W ten sposób sygnał chemiczny może zostać przekształcony w elektryczny. Wykres ten pokazuje, że filmy, w których Geo X został sprzężony chemicznie, generują silny sygnał antyczny w obecności glukozy, w przeciwieństwie do filmów niezawierających Geo X. Wyniki te wskazują, że Geo X może zostać osadzony na naniesionym filmie zam i zachować aktywność katalityczną. Co więcej, w odpowiedzi na zwiększające się stężenia glukozy następuje skokowy wzrost prądu otycznego.

Przedstawiona krzywa wzorcowa pokazuje również, że stopniowe wzrosty następowały w sposób niemal liniowy, zależnie od ilości dodanego glukozy. Wyniki te wskazują, że enzym zachowuje swoją czułość po sprzężeniu z warstwą Razza; jak tu przedstawiono, I two synthase zawiera znacznik Penta tyrozyny. Tyrozynaza oddziałuje na znacznik tyrozynowy, utleniając grupy fenolowe reszt do o-chinonów, które następnie wiążą się kowalencyjnie z aminami kazan. Dowód na funkcjonalizację warstwy Kazan w obrębie I two synthase poprzez montaż tyrozynazy jest widoczny na tym obrazie fluorescencyjnym, przedstawiającym warstwę kaza na złocie, gdzie funkcjonalizowana I two synthase została znakowana fluorescencyjnie na niebiesko. Ponieważ I two synthase generuje I two z substratu SAH w taki sam sposób jak komórki nadawcze, jej bliskość względem zaadoptowanych komórek odbiorczych w obecności SAH powoduje również fluorescencyjną odpowiedź komórek odbiorczych poprzez ekspresję ds.

Czerwona fluorescencja komórek odbiorczych ponownie potwierdza interakcję między adresami wynikającą z dyfuzji ai, dwóch z jednej do drugiej, a ponadto wskazuje, że 10 enzymów unieruchomionych w tizen zachowuje aktywność po związaniu kowalencyjnym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak elektrodeponować filmy polisacharydowe oraz jak funkcjonalizować je za pomocą różnych technik. Wykazaliśmy wszechstronność tych etapów funkcjonalizacji, co pozwala nam na pracę z wieloma komponentami biologicznymi w dalszych badaniach.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonywać w zaledwie kilka minut, aby wytworzyć wyraźne wzory warstwy, na których można precyzyjnie zaszczepić komponenty biologiczne. W ten sposób jesteśmy w stanie bardzo łatwo tworzyć biologicznie wzorowane i aktywne powierzchnie na wybranych elektrodach, w sposób uporządkowany, a jednocześnie umożliwiający uzyskanie złożonych oddziaływań biologicznych. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać kreatywność zarówno w projektowaniu matrycy elektrod, jak i w doborze komponentów biologicznych, aby osiągnąć zamierzone oddziaływania.

Mamy nadzieję, że narzędzia biofabrykacji połączą dwie odrębne dziedziny – biotechnologię i mikroelektronikę, z których każda z osobna zrewolucjonizowała nasze życie. Wierzymy, że dzięki integracji tych dwóch obszarów stworzymy nowe rozwiązania dla niektórych z najbardziej palących problemów współczesnego społeczeństwa. Przykładowo, przewidujemy, że biofabrykacja może dostarczyć prostych i wszechstronnych metod wdrażania nowych sposobów detekcji, w tym rozwiązań typu point-of-care, diagnostyki chorób oraz wykrywania zagrożeń biologicznych i chemicznych.

Jednym z daleko idących przykładów może być stent tętniczy nowej generacji, który byłby w stanie monitorować profil metaboliczny pacjenta, a jednocześnie utrzymywać drożność tętnicy.