Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Ogólnym celem tej procedury jest porównanie składu polimerów ściany komórkowej w szerokim zakresie roślin lub typów tkanek z wykorzystaniem mikrotablic glikanowych. W pierwszej kolejności należy zebrać interesujące tkaniny roślinne. Po homogenizacji należy przygotować osady nierozpuszczalne w alkoholu.

Następnie kolejno wyekstrahować glikany ściany komórkowej, wykorzystując CDTA oraz wodorotlenek sodu. Następnie nanieść ekstrakty glikanów ściany komórkowej na macierz mikroprzepływową za pomocą robota. Przebadać macierze przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko glikanom ściany komórkowej i zmierzyć sygnały z plamek na macierzach.

Ostatecznie wyniki te mogą posłużyć do określenia względnej obfitości epitopów glikanowych w badanym zestawie próbek. Opracowaliśmy tę metodę mikromacierzy, dostrzegając potrzebę uzyskania globalnego obrazu występowania glikanów ścian komórkowych w wielu typach tkanek roślinnych jednocześnie oraz wykrycia różnic w ich składzie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami tradycyjnymi, takimi jak analiza monosacharydów, jest fakt, że jest to platforma oparta na mikromacierzach, która umożliwia jednoczesne badanie setek próbek. Jest to szybka i kompleksowa metoda profilowania składu ścian komórkowych. Dla każdej badanej tkanki należy przygotować trzy powtórne próbki po 100 milligrams świeżej masy tkanek roślinnych, wykorzystując ciekły azot.

Zhomogenizuj próbki do postaci drobnego proszku, a następnie przenieś homogenat do plastikowych probówek stożkowych o pojemności 10 ml w celu przygotowania materiału ścian komórkowych. Resuspenduj homogenat w 10 ml 80% etanolu w temperaturze pokojowej i wytrząsaj intensywnie na wortexie przez dwie minuty. Odwiruj próbki przy 3 500 ×g i odlej supernatant.

Powtórz płukanie 70% etanolem co najmniej trzy razy lub do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny. Następnie wykonaj końcowe płukanie 100% acetonem. Odstaw osady nierozpuszczalne w alkoholu do wyschnięcia na powietrzu przez noc w celu uzyskania drobnego i homogenicznego proszku, a następnie przesiany próbki osadu nierozpuszczalnego w alkoholu przez sito o oczkach 0,4 mm².

Następnie odważ 10 mg próbek osadu nierozpuszczalnego w alkoholu do mikroprobówek, z których każda zawiera szklany koralik o średnicy 3 mm służący do mieszania. W celu ekstrakcji pektyn oraz polimerów związanych z pektynami, dodaj do każdej próbki 500 µL 50 mM CDTA, krótko wymieszaj probówki w wirówce typu vortex, a następnie homogenizuj za pomocą Tissueizer przez trzy godziny przy częstotliwości 8 Hz. Próbki odwiruj przy 12 000 ×g.

G. Ostrożnie usuń supernatanty i przechowuj je w temperaturze 4 °C. Przemyj osady dwukrotnie 1 ml wody dejonizowanej. Usuń cały płyn z probówek, pozostawiając jedynie osad ścian komórkowych.

Następnie należy przystąpić do ekstrakcji glikanów sieciujących, wykorzystując 500 µL 4 M wodorotlenku sodu z dodatkiem 0,1% wodorku sodu. Stosując opisany wcześniej proces ekstrakcji, nadlodówki zawierające glikany sieciujące należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Osady należy przemyć dwukrotnie wodą dejonizowaną.

Następnie, używając 500 µL ekstraktu Cain, odwiruj w wirówce pozostałe polimery, takie jak celuloza, aby usunąć wszelkie cząstki stałe z nadlodów zawierających wyekstrahowane polimery ścian komórkowych. Następnie nanieś 50 µL każdej próbki na polipropylenową płytkę mikrotitracyjną z 384 dołkami, korzystając z wcześniej opracowanego niestandardowego układu, w którym próbki są rozmieszczone zgodnie z rodzajem tkanki i rodzajem ekstrakcji.

Następnie rozcieńcz próbki polimerów ściany komórkowej wodą dejonizowaną, aby przygotować szereg rozcieńczeń 0, 5 i 25-krotnych. Ustaw parametry mikroarray, takie jak wysokość pinu, zbieranie, czas przebywania oraz etapy płukania. Utrzymuj wilgotność w komorze drukowania na poziomie 60%, aby zapobiec odparowywaniu próbek.

Teraz rozpocznij drukowanie. Robot wykorzystuje piny z kanałami kapilarnymi do nanoszenia roztworów z płytki z próbkami na membranę nitrocelulozową, która jest przymocowana do płaskiej płytki w urządzeniu. Każda plamka w macierzy zawiera 15 nanolitrów roztworu i jest nanoszona w trzech powtórzeniach.

Wydrukuj identyczne mikromacierze obok siebie na membranie, a następnie potnij je na pojedyncze macierze. Aby ograniczyć niespecyficzne wiązanie, zablokuj każdą mikromacierz w 5% roztworze mleka w proszku w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Dodaj przeciwciała monoklonalne swoiste dla glikanów ściany komórkowej oraz epitopów i inkubuj przez dwie godziny. Aby usunąć nieswoiste wiązania, przemyj mikroarraye trzykrotnie w PBS przez pięć minut. Następnie, po trzech pięciominutowych przemyciach w PBS, inkubuj mikroarraye z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z peroksydazą chrzanową przez dwie godziny.

Wywołać macierzy mikroprzepływowe za pomocą podłoży chromogennych lub chemiluminescencyjnych. Przeskanować poszczególne macierzy, używając skanera biurkowego o wysokiej rozdzielczości. Zapisać obrazy jako 16-bitowe negatywowe pliki TIFF.

Oblicz intensywność całkowitą każdej plamki, korzystając z oprogramowania do przetwarzania obrazów explore z zainstalowanym automatycznym narzędziem do tworzenia siatki. Następnie wyeksportuj dane z siatki dla każdej macierzy mikroarray do pliku tekstowego. Ręcznie zaimportuj plik z danymi do arkusza kalkulacyjnego Excel w celu przeprowadzenia analizy.

Oblicz średnią całkowitą intensywność plamek dla powtórzeń drukowania i rozcieńczeń, aby uzyskać średnią wartość intensywności plamki dla każdej próbki. Przedstaw względne średnie intensywności plamek pomiędzy różnymi próbkami w formie mapy ciepła, wykorzystując formatowanie warunkowe w programie Excel lub internetowe narzędzie do tworzenia map ciepła. Zastosuj narzędzia w celu usunięcia sygnału tła oraz wyników fałszywie dodatnich dla każdego typu przeciwciała, znormalizuj dane do 100 i wprowadź wartość odcięcia na poziomie 5%.

Do pomiaru względnej liczby glikanów w sześciu typach tkanek nicotiana – nitkach pręcików, pyłku, zalążkach, płatkach, działkach kielicha i znaku – wykorzystano kompleksowe profilowanie polimerowe za pomocą mikromacierzy. Mikromacierz zbadano z użyciem przeciwciała monoklonalnego JIM 5, które jest specyficzne dla epitopu w polisacharydach pektynowych. Należy zauważyć, że epitop JIM 5 jest wykrywalny w ekstraktach CDTA ze wszystkich tkanek kwiatowych.

Jest on jednak najwyższy w pyłku, a najniższy w tkance znamię. Co ciekawe, epitop JIM five jest wykrywany również w ekstraktach z wodorotlenku sodu z pyłku, ale nie w innych tkankach. Informacje ilościowe uzyskuje się poprzez generowanie krzywych wzorcowych dla różnych oczyszczonych polisacharydów, które zostały zastosowane jako standardy wewnętrzne na mikroarray w tkance zalążni.

W każdej próbce obecne było około 157 µg hoog zawierającego epitop JIM 5, co stanowiło około 1,5% całkowitej zawartości pozostałości ściany komórkowej, podczas gdy w tkance pyłku obecne było 625 µg hoog Ronin zawierającego epitop JIM 5, co stanowiło około 6,25% całkowitej zawartości pozostałości ściany komórkowej. Względna liczebność 15 epitopów glikanowych we wszystkich typach tkanek została przedstawiona w formie mapy ciepła. Intensywność pasków kolorystycznych jest proporcjonalna do skorygowanej średniej intensywności plamki dla każdej próbki.

Graficzna prezentacja tych danych umożliwia szybką interpretację różnic w występowaniu epitopów glikanowych pomiędzy różnymi tkankami kwiatu. Wyniki te wskazują, że poszczególne epitopy glikanowe są rozłożone w sposób unikalny pomiędzy różnymi typami kwiatów. Na przykład epitop LM 13 występuje najliczniej w nitkach pręcików oraz tkankach SE L w porównaniu do innych tkanek.

Wzorzec ten wyraźnie kontrastuje z wzorcem epitopów o krótszych łańcuchach, wykrywanych preferencyjnie przez MAB LM six. Glikany sieciujące wykazują również odmienne wzorce występowania w różnych kwiatach. Na przykład epitop LM 10 występuje obficie w tkance znaku słupka w porównaniu z innymi tkankami, ale nie występuje w tkance zalążni.

Epitopy glikanów LM 15 xog występują w najwyższym stężeniu w płatkach i nitkach pręcików w porównaniu z innymi tkankami, natomiast hetero maniny są najliczniejsze w nitkach pręcików. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ekstrahować i określać względną zawartość glikanów ściany komórkowej w szerokim zakresie roślin i typów tkanek. Po opanowaniu metody z wykorzystaniem mikromacierzy, technikę tę można przeprowadzić w ciągu trzech dni.

Należy pamiętać o spójnym traktowaniu próbek i powtórzeń na każdym etapie postępowania zgodnie z tą procedurą. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania można zastosować inne metody, takie jak analizy kwasem octowo-azotowym. Przykładowo, jaka jest bezwzględna zawartość celulozy pozostałej po sekwencyjnej ekstrakcji pektyn i glikanów koniugowanych przy użyciu CDTA i wodorotlenku sodu?

Technika ta znajduje szerokie zastosowanie w dziedzinie biologii komórki roślinnej do szybkiego porównywania występowania glikanów w roślinach modelowych, takich jak Arabidopsis i Fisca, Nutella, a także w innych, takich jak bawełna, pszenica, eukaliptus i tytoń.