Name: Profilowanie glikanów polimerów roślinnej ściany komórkowej za pomocą mikromacierzy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Poznaj metodę CoMPP do profilowania glikanów ściany komórkowej roślin przy użyciu mikromacierzy i przeciwciał monoklonalnych. Technika umożliwia szybką, kompleksową analizę składu polimerów w różnych tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

IEM pragnie podziękować Duńskiej Radzie Badawczej (FTP oraz FNU) za dofinansowanie. ERL dziękuje za wsparcie w ramach grantu ARC DP. AB dziękuje za wsparcie udzielone przez grant ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls.

1. Pobieranie i przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Pobrać 100 mg świeżej masy tkanek roślinnych (minimum 10 mg masy suchej) w co najmniej trzech powtórzeniach dla każdej badanej tkanki. Poniższe kroki opisują przygotowanie materiału ścian komórkowych z tkanek wegetatywnych. W przypadku tkanek spichrzowych niepożądany skrobia jest usuwana enzymatycznie przed przystąpieniem do ekstrakcji polimerów ścian komórkowych zgodnie z wcześniejszym opisem13.</li>
	<li>Zhomogenizować próbki do postaci drobnego proszku w ciekłym azocie za pomocą Qiagen TissueLyser II, stosując zestawy adapterów do 24 probówek i kulki z węglika wolframu o średnicy 3 mm (30 Hz, 2 x 30 s). Alternatywnie, w przypadku przetwarzania tylko kilku próbek, należy użyć moździerza i tłuczka.</li>
	<li>Przenieść homogenaty do plastikowych probówek stożkowych o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Przygotować materiał ścian komórkowych, przemywając homogenaty w 10 ml 80% v/v etanolu w temperaturze pokojowej i intensywnie mieszając na wortexie przez 2 min.</li>
	<li>Wirować próbki przy 3 500 x g i odrzucić nadsącz. Powtórzyć przemywanie 70% etanolem co najmniej trzy razy lub do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny, szczególnie w przypadku tkanek zawierających chlorofil.</li>
	<li>Przeprowadzić końcowe przemywanie 100% acetonem i pozostawić osady zawierające pozostałość nierozpuszczalną w alkoholu (AIR) do wysuszenia na powietrzu przez noc.</li>
	<li>Przesiać próbki AIR przez sito o oczkach 0,4 mm2, aby uzyskać drobny, jednorodny proszek i usunąć większe, słabo zmielone cząstki, które czasem pozostają w homogenacie.</li>
	<li>Odważyć 10 mg próbki AIR do mikroprowówek, z których każda zawiera szklaną kuleczkę o średnicy 3 mm w celu ułatwienia mieszania próbek.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja glikanów ściany komórkowej
<ol>
	<li> pektyny oraz polimery z nimi powiązane są ekstrahowane z próbek poprzez dodanie 500 μl 50 μM CDTA (pH 7.5) do każdej próbki.</li>
	<li> Krótko wymieszaj próbki w wortexie, aby zapewnić kontakt rozpuszczalnika z materiałem próbki, a następnie mieszaj za pomocą TissueLyser przez 3 hr przy 8 Hz.</li>
	<li> Wirowkuj próbki przy 12 000 x g, ostrożnie zlej nadsączyny i przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
	<li> Przemyj osady w 1 ml wody dejonizowanej w celu rozcieńczenia i usunięcia pozostałego rozpuszczalnika, wymieszaj w wortexie i wirowkuj przy 13 000 x g. Powtórz ten krok, nie naruszając osadu, i usuń cały płyn z probówek przed przejściem do następnego etapu.</li>
	<li> Glikany sieciujące są ekstrahowane sekwencyjnie z pozostałego osadu ściany komórkowej przy użyciu 500 μl 4M NaOH z 0.1% w/v NaBH4, stosując tę samą procedurę opisaną w krokach 2.1 - 2.4 dla ekstrakcji CDTA. NaBH4 dodaje się w celu zredukowania grupy aldehydowej (lub ketonowej) na redukującym końcu polisacharydów do alkoholu, co zapobiega odszczepianiu polisacharydów w środowisku zasadowym.</li>
	<li> Po wirowaniu nadsączyny są ponownie usuwane i przechowywane w temperaturze 4 °C, a osady dwukrotnie przemywane wodą dejonizowaną przed przejściem do kolejnej ekstrakcji.</li>
	<li> Jako krok opcjonalny, polimery resztkowe, takie jak celuloza, są ekstrahowane za pomocą 500 μl cadoxenu (31% v/v 1,2-diaminoetanu z 0.78 M CdO), stosując tę samą procedurę, która opisana została w krokach 2.1 - 2.4. Alternatywnie, całkowitą zawartość celulozy w pozostałych osadach można określić za pomocą testów kwasu octowego/azotowego (patrz Dyskusja).</li>
</ol>
3. Drukowanie mikromacierzy
<ol>
	<li>Odwirować nadsączniki zawierające wyekstrahowane polimery ścian komórkowych przy 13 000 x g, aby usunąć wszelkie cząstki stałe.</li>
	<li>Nanieść 50 μl każdej próbki do polipropylenowej płytki mikrotytrującej z 384 dołkami, korzystając z wcześniej przygotowanego niestandardowego układu, w którym próbki są rozmieszczone zgodnie z rodzajem tkanki i sposobem ekstrakcji.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki polimerów ścian komórkowych w serii rozcieńczeń seryjnych 0, 5 i 25× przy użyciu wody dejonizowanej.</li>
	<li>Parametry takie jak wysokość pinów, czas poboru i czas przebywania oraz etapy płukania są ustawiane w oprogramowaniu sterującym urządzeniem do mikroarrayów.</li>
	<li>Wilgotność w komorze drukowania jest utrzymywana na poziomie 60%, aby zapobiec odparowaniu próbek.</li>
	<li>Proces drukowania jest uruchamiany za pomocą oprogramowania LabNEXT i programu odpowiadającego układowi mikroarraya.</li>
	<li>Robot wykorzystuje piny z kanałami kapilarnymi do nanoszenia roztworów z płytki z próbkami na membranę nitrocelulozową o wymiarach 20 x 20 cm, która jest przymocowana do płaskiej płyty w urządzeniu. Każda plamka na matrycy zawiera 15 nl roztworu i jest nanoszona w trzech powtórzeniach.</li>
	<li>Identyczne mikroarraye są drukowane obok siebie na membranie, a po zakończeniu procesu drukowania są wycinane na pojedyncze matryce.</li>
	<li>W każdym eksperymencie układ matryc może być modyfikowany, aby pomieścić większą lub mniejszą liczbę próbek, rozcieńczeń lub powtórzeń.</li>
</ol>
4. Skanowanie macierzy glikanowych
<ol>
	<li>Po wydrukowaniu, poszczególne macierze mikroarray należy blokować w 5% w/v roztworze odtłuszczonego mleka w proszku rozpuszczonego w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (MPBS) w temperaturze pokojowej przez 2 hr w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania.</li>
	<li>Macierze mikroarray inkubować z przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi dla epitopów glikanów ściany komórkowej przez 2 hr w MPBS. Większość przeciwciał monoklonalnych przeciwko glikanom ściany komórkowej jest dostępna komercyjnie od trzech firm: Biosupplies (<a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a>), Carbosource Services (<a href="http://www.carbosource.net" target="_blank">www.carbosource.net</a>) oraz PlantProbes (<a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a>).</li>
	<li>Należy uwzględnić kontrolę negatywną w postaci macierzy mikroarray inkubowanej wyłącznie z MPBS, bez przeciwciał pierwszorzędowych.</li>
	<li>Macierze mikroarray płukać 3 razy w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przez 5 min, aby usunąć niespecyficznie związane cząsteczki.</li>
	<li>Macierze mikroarray inkubować z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) w MPBS przez 2 hr. Większość przeciwciał monoklonalnych przeciwko glikanom ściany komórkowej wymaga przeciwciał wtórnych anty-mysich lub anty-szczurzych.</li>
	<li>Powtórzyć etapy płukania 3 razy buforem PBS przez 5 min, aby usunąć niespecyficzne wiązanie.</li>
	<li>Wywołać macierze mikroarray, stosując substraty chromogenne (3,3-diaminobenzydyna) lub chemiluminescencyjne (luminol).</li>
</ol>
5. Ilościowe oznaczanie
<ol>
	<li>Po wywołaniu zeskanuj poszczególne macierze mikroarray za pomocą skanera biurkowego o wysokiej rozdzielczości (1 200 dpi) i zapisz obrazy jako 16-bitowe pliki TIFF w negatywie (Rycina 3).</li>
	<li>Oblicz całkowitą intensywność każdego punktu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów Xplore Image Processing Software (LabNEXT) z wykorzystaniem zautomatyzowanego narzędzia do tworzenia siatki. Całkowita intensywność punktu jest wyznaczana na podstawie sumy pikseli w obszarze siatki otaczającym każdy punkt.</li>
	<li>Dane siatki dla każdej macierzy mikroarray są eksportowane do pliku txt, który można ręcznie zaimportować do arkusza Excel w celu analizy. Opracowano narzędzie online (<a href="http://arraytemplates.charliehart.com.au/" target="_blank">http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/</a>), które automatycznie tłumaczy i przetwarza dane z poszczególnych plików txt.</li>
	<li>Całkowitą intensywność punktu uśrednia się dla powtórzeń nadruku oraz rozcieńczeń, aby uzyskać wartość „średniej intensywności punktu” dla każdej próbki (Rycina 2). Alternatywnie, do ilościowego określenia względnej zawartości epitopów glikanowych dla każdej próbki wykorzystuje się sygnały z punktów odpowiadających tylko jednej wartości rozcieńczenia na macierzy.</li>
	<li>Względne średnie intensywności punktów pomiędzy różnymi próbkami są przedstawiane w formie mapy ciepła (Rycina 4) przy użyciu formatowania warunkowego w programie Excel lub internetowych narzędzi do tworzenia map ciepła (<a href="http://bar.utoronto.ca/welcome.htm" target="_blank">http://bar.utoronto.ca/welcome.htm</a>). Dane dla każdego typu przeciwciała są korygowane do wartości 100 i stosowana jest wartość odcięcia 5%, aby usunąć sygnał tła oraz wyniki fałszywie dodatnie.</li>
</ol>

<ol><li>Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+models+of+primary+cell+walls+in+flowering+plants%3A+consistency+of+molecular+structure+with+the+physical+properties+of+the+walls+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth.</a> Plant J. 3, 1-30 (1993).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofuels.</a> Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).</li>
<li>Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+degree+and+pattern+of+methyl-esterification+of+pectic+homogalacturonan+in+plant+cell+walls.+implications+for+pectin+methyl+esterase+action%2C+matrix+properties%2C+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion.</a> J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).</li>
<li>Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+walls%3A+the+skeleton+of+the+plant+world%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant cell walls: the skeleton of the plant world.</a> Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).</li>
<li>Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+plant+cell+wall%3A+searching+for+the+genes+that+define+structure%2C+architecture+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics.</a> Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).</li>
<li>Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+family+of+Arabidopsis+genes+related+to+xyloglucan+fucosyltransferase1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1.</a> Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).</li>
<li>Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant cell walls.</a> Science. 306, 2206-2211 (2004).</li>
<li>Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillats%2C+WGT+%22The+Plant+Cell+Wall%22">The Plant Cell Wall</a>. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).</li>
<li>Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Toolkit+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies.</a> Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).</li>
<li>Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+cell-wall+polymers+within+and+between+plants+using+novel+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays.</a> The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+characterization+of+plant+cell+walls+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).</li>
<li>Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+plant+cell-wall+polysaccharide+decomposition+in+leaf-cutting+ant+fungus+gardens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens.</a> PLoS One. 6 (3), e17506(2011).</li>
<li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+procedures+for+the+determination+of+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. , In Press (2012).</li>
<li>Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+methyl+hexagalacturonate+hapten+inhibitors+of+anti-homogalacturonan+monoclonal+antibodies+LM7%2C+JIM5+and+JIM7%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7.</a> Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).</li>
<li>Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+complexity+of+arabinan+polysaccharides+and+their+processing+in+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls.</a> Plant J. 59, 413-425 (2009).</li>
<li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNIT+12.10+Preparation+and+Analysis+of+Glycan+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2011).</li>
<li>McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+plant+cell+walls+by+microbial+xylan-specific+carbohydrate-binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules.</a> PNAS. 103, 4765-4770 (2006).</li>
<li>Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eli1+mutation+reveals+a+link+between+cell+expansion+and+secondary+cell+wall+formation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 127, 3395-3405 (2000).</li>
<li>Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-Function+Mutation+of+REDUCED+WALL+ACETYLATION2+in+Arabidopsis+Leads+to+Reduced+Cell+Wall+Acetylation+and+Increased+Resistance+to+Botrytis+cinerea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea.</a> Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).</li>
<li>Updegraff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).</li>
<li>21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+monoclonal+antibodies+against+plant+cell+wall+glycans+by+hierarchial+clustering+of+their+carbohydrate+microarray+binding+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles.</a> Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+linkage+%281%E2%86%923%29%2C%281%E2%86%924%29-%CE%B2-D-glucan+is+not+unique+to+the+Poales+and+is+an+abundant+component+of+Equisetum+arvense+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls.</a> Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).</li>
<li>Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cell+wall+polymers+during+antheridium+development+and+spermatogenesis+in+the+Charophycean+green+alga%2C+Chara%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara.</a> 2104, 1045-1056 (2009).</li>
<li>Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+outer+layer+of+the+primary+cell+wall+joins+elongating+cotton+fibers+into+tissue-like+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles.</a> Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).</li>
<li>Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+Erwinia+chrysanthemi+pectin+methylesterase+variants+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays.</a> Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

CoMPP jest szybką i czułą metodą profilowania składu glikanów w setkach próbek pochodzenia roślinnego w ciągu zaledwie kilku dni. Metoda ta uzupełnia istniejące platformy macierzy glikanów bakteryjnych lub ssawich służące do wysokoprzepustowego przesiewania interakcji węglowodanów z białkami wiążącymi glikany, takimi jak lektyny, receptory i przeciwciała16. Dzięki szerokiej różnorodności dostępnych sond do wykrywania glikanów ścian komórkowych możliwe jest uzyskanie szczegółowych informacji o epitopach glikano...

<table><tbody><tr><td>Kuleczki z węglika wolframu 3 mm</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki do zbierania (1,2 mm)</td><td>Qiagen</td><td>19560</td><td>Można również stosować probówki do wirówek o pojemności 1,5 ml</td></tr><tr><td>Qiagen TissueLyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki szklane 3 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z143928</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34588</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek kadmu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202894</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diamino&amp;#8211;etan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03550</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa (rozmiar porów 0,22 &amp;mu;m)</td><td>GE-water process technologies</td><td>EP2HY00010</td><td>Membrany o różnych rozmiarach porów są odpowiednie dla różnych typów pinów</td></tr><tr><td>Robot do mikromacierzy Xact II</td><td>Labnext</td><td>001A</td><td>Robot Xact II został wyposażony w niestandardową ceramiczną płytkę 20 x 20 cm, do której przymocowano membranę nitrocelulozową</td></tr><tr><td>Piny do mikromacierzy Xtend RM</td><td>Labnext</td><td>0037-350</td><td>Piny muszą być odpowiednie do nanoszenia próbek na membrany</td></tr><tr><td>Płytki mikrotitracyjne 384-dołkowe (polipropylenowe)</td><td>Greiner</td><td>781207</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała monoklonalne przeciwglikanowe</td><td>Plant Probes/&lt;br/&gt; CarboSource/Biosupplies</td><td></td><td>Strony internetowe: PlantProbes (&lt;a href=&quot;http://www.plantprobes.net&quot; target=&quot;_blank">www.plantprobes.net&lt;/a&gt;), Carbosource (&lt;a href=&quot;http://www.carbosource.net&quot; target=&quot;_blank">www.carbosource.net&lt;/a&gt;) oraz Biosupplies (&lt;a href=&quot;http://www.biosupplies.com.au&quot; target=&quot;_blank">www.biosupplies.com.au&lt;/a&gt;).</td></tr><tr><td>Przeciwciało Anti-Rat IgG (cała cząsteczka) – peroksydaza produkowana w kozie.</td><td>Sigma</td><td>A9037</td><td>Typ przeciwciał wtórnych zależy od użytego przeciwciała pierwszorzędowego (&lt;em&gt;np.&lt;/em&gt; wytworzone u szczura, myszy, kozy itp.).</td></tr><tr><td>Tabletki SIGMA&lt;em&gt;FAST&lt;/em&gt; 3,3'-diaminobenzydyny</td><td>Sigma</td><td>D4293</td><td>Typ odczynnika wywoływującego zależy od użytych przeciwciał wtórnych i metody detekcji (kolorymetrycznej lub chemiluminescencyjnej).</td></tr><tr><td>Substrat chemiluminescencyjny SuperSignal West Pico</td><td>Thermoscientific</td><td>34080</td><td>Patrz powyżej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów Xplore</td><td>LabNext</td><td>008</td><td>Dostępnych jest wiele rodzajów oprogramowania z automatycznymi narzędziami do tworzenia siatki w celu pomiaru wartości pikseli plamek mikromacierzy.</td></tr><tr><td>Polisacharydy roślinne</td><td>Sigma/Megazyme</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Ściany komórkowe roślin to złożone macierze heterogenicznych glikanów, które odgrywają istotną rolę w fizjologii i rozwoju roślin oraz dostarczają surowców dla społeczeństw ludzkich (np. przemysł drzewny, papierniczy, tekstylny i biopaliwowy)1,2. Niemniej jednak zrozumienie biosyntezy i funkcji tych komponentów pozostaje wyzwaniem.
Glikany ścian komórkowych są chemicznie i konformacyjnie zróżnicowane ze względu na złożoność ich jednostek budulcowych, czyli reszt glikozylowych. Tworzą one wiązania w wielu pozycjach i różnią się strukturą pierścienia, konfiguracją izomeryczną lub anomeryczną, a ponadto są podstawione szeregiem reszt niecukrowych. Skład glikanów różni się w zależności od typu komórek i/lub tkanek, a nawet poddomen w obrębie jednej ściany komórkowej3. Co więcej, ich skład ulega modyfikacjom podczas rozwoju1 lub w odpowiedzi na sygnały środowiskowe4.
Przewiduje się, że ponad 2 000 genów bierze udział w biosyntezie i modyfikacji glikanów ścian komórkowych w Arabidopsis5. Ściany komórkowe roślin są złożonymi macierzami heterogenicznych glikanów. Jednak stosunkowo niewielu genów biosyntetycznych zostało scharakteryzowanych funkcjonalnie 4,5. Podejścia genetyki odwrotnej są trudne, ponieważ geny te są często różnicowo ekspresjonowane, często na niskich poziomach, w zależności od typu komórek6. Ponadto badania nad mutantami są często utrudnione przez redundancję genów lub mechanizmy kompensacyjne, które mają zapewnić utrzymanie odpowiedniej funkcji ściany komórkowej7. W związku z tym niezbędne są nowe podejścia, aby szybko scharakteryzować zróżnicowany zakres struktur glikanów i ułatwić zastosowanie metod genomiki funkcjonalnej w celu zrozumienia biosyntezy i modyfikacji ścian komórkowych.
Przeciwciała monoklonalne (mAbs)8,9 stały się istotnym narzędziem do określania struktury i rozmieszczenia glikanów w roślinach. Rozpoznają one odrębne epitopy występujące w głównych klasach glikanów ściany komórkowej roślin, w tym pektyn, ksyloglukanów, ksylanów, mannanów, glukanów i arabinogalaktanów. Ostatnio ich zastosowanie rozszerzono na wielkoskalowe badania przesiewowe w celu jednoczesnego określenia względnej zawartości glikanów w szerokim zakresie typów roślin i tkanek9,10,11.
Przedstawiamy tutaj metodę przesiewową glikanów opartą na mikrotablicach, zwaną kompleksowym profilowaniem polimerów mikrotablicowych (Comprehensive Microarray Polymer Profiling, CoMPP) (Ryc. 1 i 2)10,11, która umożliwia analizę wielu próbek (100 sek.) przy użyciu zminiaturyzowanej platformy mikrotablicowej z zredukowanymi objętościami reagentów i próbek. Sygnały z plamek na mikrotablicy mogą być formalnie kwantyfikowane, co pozwala na uzyskanie danych półilościowych dotyczących występowania epitopów glikanów. Podejście to jest dobrze dostosowane do śledzenia zmian w glikanach w złożonych systemach biologicznych12 i zapewnia globalny przegląd składu ścian komórkowych, szczególnie w sytuacjach, gdy wcześniejsza wiedza na ten temat jest niedostępna.

Względną liczebność glikanów w sześciu typach tkanek (nitkach pręcików, pyłku, zalążniach, płatkach, działkach i znaku) kwiatów Nicotiana alata określono za pomocą metody CoMPP. Rycina 3A przedstawia reprezentatywną macierz mikroprzepływową poddaną analizie z użyciem przeciwciała monoklonalnego mAb JIM5 specyficznego dla częściowo (nisko) zmetylowanego homogalakturonanu (HG), epitopu występującego w polisacharydach pektynowych14. Epitop JIM5 jest wykrywany w ekstraktach CDTA wszystkich tkanek kwiatu, ...

Opisano technikę o nazwie Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP), służącą do charakterystyki glikanów ścian komórkowych roślin. Metoda ta łączy specyficzność przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym epitopom glikanów z miniaturową analityczną platformą mikromacierzy, która umożliwia przesiewowe badanie występowania glikanów w szerokim zakresie kontekstów biologicznych.

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Ściany komórkowe roślin to złożone macierze heterogenicznych glikanów, które odgrywają istotną rolę w fizjologii i rozwoju roślin oraz zapewniają...

Ogólnym celem tej procedury jest porównanie składu polimerów ściany komórkowej w szerokim zakresie roślin lub typów tkanek z wykorzystaniem mikrotablic glikanowych. W pierwszej kolejności należy zebrać interesujące tkaniny roślinne. Po homogenizacji należy przygotować osady nierozpuszczalne w alkoholu.Następnie kolejno wyekstrahować glikany ściany komórkowej, wykorzystując CDTA oraz wodorotlenek sodu. Następnie nanieść ekstrakty glikanów ściany komórkowej na macierz mikroprzepływową za pomocą robota. Przebadać macierze przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko glikanom ściany komórkowej i zmierzyć sygnały z plamek na macierzach.Ostatecznie wyniki te mogą posłużyć do określenia względnej obfitości epitopów glikanowych w badanym zestawie próbek. Opracowaliśmy tę metodę mikromacierzy, dostrzegając potrzebę uzyskania globalnego obrazu występowania glikanów ścian komórkowych w wielu typach tkanek roślinnych jednocześnie oraz wykrycia różnic w ich składzie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami tradycyjnymi, takimi jak analiza monosacharydów, jest fakt, że jest to platforma oparta na mikromacierzach, która umożliwia jednoczesne badanie setek próbek. Jest to szybka i kompleksowa metoda profilowania składu ścian komórkowych. Dla każdej badanej tkanki należy przygotować trzy powtórne próbki po 100 milligrams świeżej masy tkanek roślinnych, wykorzystując ciekły azot.Zhomogenizuj próbki do postaci drobnego proszku, a następnie przenieś homogenat do plastikowych probówek stożkowych o pojemności 10 ml w celu przygotowania materiału ścian komórkowych. Resuspenduj homogenat w 10 ml 80% etanolu w temperaturze pokojowej i wytrząsaj intensywnie na wortexie przez dwie minuty. Odwiruj próbki przy 3 500 ×g i odlej supernatant.Powtórz płukanie 70% etanolem co najmniej trzy razy lub do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny. Następnie wykonaj końcowe płukanie 100% acetonem. Odstaw osady nierozpuszczalne w alkoholu do wyschnięcia na powietrzu przez noc w celu uzyskania drobnego i homogenicznego proszku, a następnie przesiany próbki osadu nierozpuszczalnego w alkoholu przez sito o oczkach 0,4 mm².Następnie odważ 10 mg próbek osadu nierozpuszczalnego w alkoholu do mikroprobówek, z których każda zawiera szklany koralik o średnicy 3 mm służący do mieszania. W celu ekstrakcji pektyn oraz polimerów związanych z pektynami, dodaj do każdej próbki 500 µL 50 mM CDTA, krótko wymieszaj probówki w wirówce typu vortex, a następnie homogenizuj za pomocą Tissueizer przez trzy godziny przy częstotliwości 8 Hz. Próbki odwiruj przy 12 000 ×g.G. Ostrożnie usuń supernatanty i przechowuj je w temperaturze 4 °C. Przemyj osady dwukrotnie 1 ml wody dejonizowanej. Usuń cały płyn z probówek, pozostawiając jedynie osad ścian komórkowych.Następnie należy przystąpić do ekstrakcji glikanów sieciujących, wykorzystując 500 µL 4 M wodorotlenku sodu z dodatkiem 0,1% wodorku sodu. Stosując opisany wcześniej proces ekstrakcji, nadlodówki zawierające glikany sieciujące należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Osady należy przemyć dwukrotnie wodą dejonizowaną.Następnie, używając 500 µL ekstraktu Cain, odwiruj w wirówce pozostałe polimery, takie jak celuloza, aby usunąć wszelkie cząstki stałe z nadlodów zawierających wyekstrahowane polimery ścian komórkowych. Następnie nanieś 50 µL każdej próbki na polipropylenową płytkę mikrotitracyjną z 384 dołkami, korzystając z wcześniej opracowanego niestandardowego układu, w którym próbki są rozmieszczone zgodnie z rodzajem tkanki i rodzajem ekstrakcji.Następnie rozcieńcz próbki polimerów ściany komórkowej wodą dejonizowaną, aby przygotować szereg rozcieńczeń 0, 5 i 25-krotnych. Ustaw parametry mikroarray, takie jak wysokość pinu, zbieranie, czas przebywania oraz etapy płukania. Utrzymuj wilgotność w komorze drukowania na poziomie 60%, aby zapobiec odparowywaniu próbek.Teraz rozpocznij drukowanie. Robot wykorzystuje piny z kanałami kapilarnymi do nanoszenia roztworów z płytki z próbkami na membranę nitrocelulozową, która jest przymocowana do płaskiej płytki w urządzeniu. Każda plamka w macierzy zawiera 15 nanolitrów roztworu i jest nanoszona w trzech powtórzeniach.Wydrukuj identyczne mikromacierze obok siebie na membranie, a następnie potnij je na pojedyncze macierze. Aby ograniczyć niespecyficzne wiązanie, zablokuj każdą mikromacierz w 5% roztworze mleka w proszku w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Dodaj przeciwciała monoklonalne swoiste dla glikanów ściany komórkowej oraz epitopów i inkubuj przez dwie godziny. Aby usunąć nieswoiste wiązania, przemyj mikroarraye trzykrotnie w PBS przez pięć minut. Następnie, po trzech pięciominutowych przemyciach w PBS, inkubuj mikroarraye z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z peroksydazą chrzanową przez dwie godziny.Wywołać macierzy mikroprzepływowe za pomocą podłoży chromogennych lub chemiluminescencyjnych. Przeskanować poszczególne macierzy, używając skanera biurkowego o wysokiej rozdzielczości. Zapisać obrazy jako 16-bitowe negatywowe pliki TIFF.Oblicz intensywność całkowitą każdej plamki, korzystając z oprogramowania do przetwarzania obrazów explore z zainstalowanym automatycznym narzędziem do tworzenia siatki. Następnie wyeksportuj dane z siatki dla każdej macierzy mikroarray do pliku tekstowego. Ręcznie zaimportuj plik z danymi do arkusza kalkulacyjnego Excel w celu przeprowadzenia analizy.Oblicz średnią całkowitą intensywność plamek dla powtórzeń drukowania i rozcieńczeń, aby uzyskać średnią wartość intensywności plamki dla każdej próbki. Przedstaw względne średnie intensywności plamek pomiędzy różnymi próbkami w formie mapy ciepła, wykorzystując formatowanie warunkowe w programie Excel lub internetowe narzędzie do tworzenia map ciepła. Zastosuj narzędzia w celu usunięcia sygnału tła oraz wyników fałszywie dodatnich dla każdego typu przeciwciała, znormalizuj dane do 100 i wprowadź wartość odcięcia na poziomie 5%.Do pomiaru względnej liczby glikanów w sześciu typach tkanek nicotiana – nitkach pręcików, pyłku, zalążkach, płatkach, działkach kielicha i znaku – wykorzystano kompleksowe profilowanie polimerowe za pomocą mikromacierzy. Mikromacierz zbadano z użyciem przeciwciała monoklonalnego JIM 5, które jest specyficzne dla epitopu w polisacharydach pektynowych. Należy zauważyć, że epitop JIM 5 jest wykrywalny w ekstraktach CDTA ze wszystkich tkanek kwiatowych.Jest on jednak najwyższy w pyłku, a najniższy w tkance znamię. Co ciekawe, epitop JIM five jest wykrywany również w ekstraktach z wodorotlenku sodu z pyłku, ale nie w innych tkankach. Informacje ilościowe uzyskuje się poprzez generowanie krzywych wzorcowych dla różnych oczyszczonych polisacharydów, które zostały zastosowane jako standardy wewnętrzne na mikroarray w tkance zalążni.W każdej próbce obecne było około 157 µg hoog zawierającego epitop JIM 5, co stanowiło około 1,5% całkowitej zawartości pozostałości ściany komórkowej, podczas gdy w tkance pyłku obecne było 625 µg hoog Ronin zawierającego epitop JIM 5, co stanowiło około 6,25% całkowitej zawartości pozostałości ściany komórkowej. Względna liczebność 15 epitopów glikanowych we wszystkich typach tkanek została przedstawiona w formie mapy ciepła. Intensywność pasków kolorystycznych jest proporcjonalna do skorygowanej średniej intensywności plamki dla każdej próbki.Graficzna prezentacja tych danych umożliwia szybką interpretację różnic w występowaniu epitopów glikanowych pomiędzy różnymi tkankami kwiatu. Wyniki te wskazują, że poszczególne epitopy glikanowe są rozłożone w sposób unikalny pomiędzy różnymi typami kwiatów. Na przykład epitop LM 13 występuje najliczniej w nitkach pręcików oraz tkankach SE L w porównaniu do innych tkanek.Wzorzec ten wyraźnie kontrastuje z wzorcem epitopów o krótszych łańcuchach, wykrywanych preferencyjnie przez MAB LM six. Glikany sieciujące wykazują również odmienne wzorce występowania w różnych kwiatach. Na przykład epitop LM 10 występuje obficie w tkance znaku słupka w porównaniu z innymi tkankami, ale nie występuje w tkance zalążni.Epitopy glikanów LM 15 xog występują w najwyższym stężeniu w płatkach i nitkach pręcików w porównaniu z innymi tkankami, natomiast hetero maniny są najliczniejsze w nitkach pręcików. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ekstrahować i określać względną zawartość glikanów ściany komórkowej w szerokim zakresie roślin i typów tkanek. Po opanowaniu metody z wykorzystaniem mikromacierzy, technikę tę można przeprowadzić w ciągu trzech dni.Należy pamiętać o spójnym traktowaniu próbek i powtórzeń na każdym etapie postępowania zgodnie z tą procedurą. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania można zastosować inne metody, takie jak analizy kwasem octowo-azotowym. Przykładowo, jaka jest bezwzględna zawartość celulozy pozostałej po sekwencyjnej ekstrakcji pektyn i glikanów koniugowanych przy użyciu CDTA i wodorotlenku sodu?Technika ta znajduje szerokie zastosowanie w dziedzinie biologii komórki roślinnej do szybkiego porównywania występowania glikanów w roślinach modelowych, takich jak Arabidopsis i Fisca, Nutella, a także w innych, takich jak bawełna, pszenica, eukaliptus i tytoń.

glycan-profiling-of-plant-cell-wall-polymers-using-microarrays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin za pomocą mikroarrayów

Biomasa roślinna jest głównym, neutralnym pod względem emisji dwutlenku węgla odnawialnym zasobem, który może być wykorzystywany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu węglowodanów pochodzących ze ścian komórkowych.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasy lignocelulozowej) Część II: Węglowodany

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Krystaliczna celuloza jest ważnym składnikiem ściany komórkowej roślin. Jednak jego kwantyfikacja w rozdzielczości komórkowej jest technicznie trudna.  W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie technologii światła spolaryzowanego i przekrojów korzeniowych w celu uzyskania informacji o składzie ściany komórkowej w rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki sekwencji glikozylu na końcu redukującym (RE) i obszarze wewnętrznym heteroksylanów poprzez znakowanie RE 2 aminobenzamidem przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą), a następnie analizę powstałych oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas (MS) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

Opisano protokół analizy strukturalnej polisacharydów metodą elektroforezy żelowej (PACE), na przykładzie mannanu.

Charakterystyka strukturalna polisacharydów ściany komórkowej Mannanów w roślinach przy użyciu PACE

Opisujemy prostą i szybką metodę przygotowania i analizy N-glikanów z różnych odmian rzodkiewki (Raphanus sativus).

Analiza N-glikanów z odmian Raphanus sativus przy użyciu PNGazy H+

Przedstawiono protokół przygotowania 13 C,15znakowanych N próbek grzybów i roślin do wielowymiarowej spektroskopii NMR w ciele stałym i badań dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP).

Przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym NMR

Ten protokół opisuje szczegółowo, w jaki sposób materiał roślinny do immunolokalizacji białek i pektyn Arabinogalaktanu jest utrwalony, osadzony w hydrofilowej żywicy akrylowej, podzielony na sekcje i zamontowany na szkiełkach podstawowych. Pokazujemy, że epitopy związane ze ścianą komórkową zostaną wykryte za pomocą specyficznych przeciwciał.

Immunolokalizacja fluorescencyjna białek i pektyn arabinogalaktanu w ścianie komórkowej tkanek roślinnych

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Analiza ekspresji genów bakteryjnych z wykorzystaniem mikromacierzy

Poznaj metodę CoMPP do profilowania glikanów ściany komórkowej roślin przy użyciu mikromacierzy i przeciwciał monoklonalnych. Technika umożliwia szybką, kompleksową analizę składu polimerów w różnych tkankach.

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Przeglądaj więcej filmów