Name: Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii kliknięć (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Poznaj metodę modyfikacji powierzchni adenowirusów za pomocą bioortogonalnej chemii kliknięć. Technika ta umożliwia przyłączanie sond fluorescencyjnych i poprawia specyficzność dostarczania genów w terapii genowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować NSF za dofinansowanie (CBET- 0846259).

<ol><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+%22Clickable%22+Amino+Acids+and+Sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li>
<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors%3A+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li>
<li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li>
<li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+%28Ad%29+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li>
<li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Strain-Promoted+%5B3+%2B+2%5D+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li>
<li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li>
<li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Rozwój chemoselektywnych i bioortogonalnych reakcji typu click, w tym reakcji z udziałem azydków, jest dynamicznie rozwijającym się obszarem badań, w związku z czym rośnie liczba dostępnych reakcji do zastosowań w biokoniugacji. Zakres niniejszego protokołu ograniczyliśmy do dwóch metod, które wybrano ze względu na ich użyteczność w naszym laboratorium oraz komercyjną dostępność wszystkich odczynników.
W pierwszej z tych dróg – cykloaddycji azydkowo-alkinowej promowanej naprężeniem (SPAAC) – a...

<table><tbody><tr><td>Adenowirus typu 5 (Ad5) zawierający transgen GFP</td><td>BCBC</td><td>391</td><td></td></tr><tr><td>Komórki ludzkiej embrionalnej nerki (HEK 293)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże Dulbecco's Modified Eagle Medium, bez metioniny, bez cysteiny (DMEM -Met / -Cys), wysoka zawartość glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>21013-024</td><td></td></tr><tr><td>Surowica z cielęcej krwi</td><td>Invitrogen</td><td>16170-078</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny 100&amp;#215; (Pen Strep)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA (10&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Szalka do hodowli komórek 100 mm, polistyren traktowany do hodowli tkankowych</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; do hodowli komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kabineta bezpieczeństwa biologicznego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy (0,2 &amp;mu;m, octan celulozy)</td><td>VWR</td><td>28145-477 (NA), 514-0061 (Europe)</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Avanti J-E</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe (50 ml, sterylne)</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Probówka, cienkościenna, Ultra-Clear, 13,2 ml, 14 x 89 mm</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka wyposażona w rotory SW 41 i SW 60</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf Biopur Safe-Lock, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5418</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do filtracji żelowej Centri-Sep</td><td>Princeton Separations</td><td>CS-901</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna igła, 18 G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawica azotowa (jeśli planowane jest beztlenowe CuAAC)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynie Dewara</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azot ciekły</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuweta elektroforetyczna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny skaner żeli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żel Ready Gel Tris-HCl</td><td>Bio-Rad</td><td>161-1105</td><td></td></tr><tr><td>L-azidohomoalanina</td><td>AnaSpec</td><td>63669</td><td></td></tr><tr><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AA005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peracetylowana &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-azydoacetylogalaktozamina (Ac&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;GalNAz)</td><td>Invitrogen</td><td>C33365</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific</td><td>88905</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7480</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu batofenantrolino-disulfonowego (BDA)</td><td>MP Biomedicals</td><td>0215011201</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tragedia Tris (tris(hydroksymetyl)aminometan)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1M HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sery albuminy wołowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS (dodecylosiarczan sodu)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek cezu (CsCl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromek miedzi(I) (CuBr)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sonda alkinowa do CuAAC*&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkin TAMRA</td><td>Invitrogen</td><td>T10183</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sonda alkinowa z naprężeniem do SPAAC*&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkin TAMRA DIBO</td><td>Invitrogen</td><td>C10410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">* Do głównych dostawców odczynników i zestawów do chemii klik należą Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools oraz Baseclick. W katalogach tych dostawców można znaleźć szeroką gamę barwników alkinowych i ligandów celujących.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Modyfikacja cząsteczek wirusowych przyciągnęła znaczną uwagę ze względu na ogromny potencjał w zakresie wpływu na terapię genową, zastosowania onkolityczne oraz rozwój szczepionek.1,2,3 Obecne podejścia do modyfikacji powierzchni wirusowych, oparte głównie na metodach genetycznych, często wiążą się z osłabieniem produkcji wirusa, jego zakaźności oraz transdukcji komórkowej.4,5 Wykorzystując chemoselektywną chemię klik, opracowaliśmy prostą, alternatywną metodę, która pozwala uniknąć tych problemów, pozostając jednocześnie wysoce elastyczną i dostępną.1,2
Celem niniejszego protokołu jest wykazanie skuteczności zastosowania bioortogonalnej chemii klik w celu modyfikacji powierzchni cząsteczek adenowirusa typu 5. Ten dwuetapowy proces może być wykorzystywany zarówno terapeutycznie1, jak i analitycznie,2,6 ponieważ umożliwia chemoselektywne wiązanie cząsteczek ukierunkowanych, barwników lub innych interesujących cząsteczek z białkami uprzednio znakowanymi tagami azydowymi. Trzema głównymi zaletami tej metody są: (1) znakowanie metaboliczne wykazuje niewielki lub żaden wpływ na sprawność wirusa,1,7 (2) można wykorzystać szeroką gamę ligandów efektorowych oraz (3) jest ona niezwykle szybka, niezawodna i łatwa do zastosowania.1,2,7
W pierwszym etapie tej procedury produkuje się cząsteczki adenowirusa zawierające azydohomoalaninę (Aha, zamiennik metioniny) lub nienaturalny cukier O-związaną N-azydoacetyloglukozaminę (O-GlcNAz), z których oba zawierają grupę funkcyjną azydową (-N3). Po oczyszczeniu zmodyfikowanych azydowo cząsteczek wirusa, sonda alkinowa zawierająca fluorescencyjny fragment TAMRA jest ligowana w sposób chemoselektywny do uprzednio oznakowanych białek lub glikoprotein. Na koniec przeprowadzana jest analiza SDS-PAGE, aby wykazać pomyślną ligację sondy do białek kapsydu wirusowego. Wykazano, że inkorporacja Aha prowadzi do oznakowania wszystkich białek kapsydu wirusowego (heksonu, pentonu i włókna), podczas gdy inkorporacja O-GlcNAz skutkuje oznakowaniem wyłącznie włókna.
W tej rozwijającej się dziedzinie pomyślnie opracowano wiele metod ligacji azydkowo-alkinowej; jednak w niniejszym materiale zaprezentowano jedynie dwie z nich, które uznaliśmy za najwygodniejsze – cykloaddycję azydkowo-alkinową promowaną naprężeniem (SPAAC) oraz cykloaddycję azydkowo-alkinową katalizowaną miedzią (CuAAC) w atmosferze beztlenowej.

Cząsteczki adenowirusów są modyfikowane tak, aby zawierały albo nienaturalny analog aminokwasu azydohomoalaninę, albo azydocukier O-GlcNAz. Grupa azydowa każdego z nich jest chemoselektywnie łączona za pomocą reakcji chemii „click” w celu modyfikacji powierzchni wirusa.

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Modyfikacja cząsteczek wirusowych przyciągnęła znaczną uwagę ze względu na ogromny potencjał w zakresie oddziaływania na terapię genową, onkolizę...

Ogólnym celem tej procedury jest zaprezentowanie elastycznej metody modyfikacji powierzchni wirusowych za pomocą chemii klik. W pierwszym kroku tej procedury komórki embrionalne nerki człowieka są zakażane adenowirusem typu 5 i inkubowane w obecności nienaturalnego aminokwasu kwasu homoolany lub cukru aceto-pasożytniczego N-acetoacetyloglukozaminy. Po dwóch dniach cząsteczki adenowirusa znakowane azydą są zbierane i oczyszczane.Następnie wykorzystuje się chemosteryczną reakcję cykloaddycji azydo-alkinowej w celu przyłączenia sond fluorescencyjnych do powierzchni tych cząsteczek. Zgodnie z opisem w protokole pisemnym, proces ten przeprowadza się jedną z dwóch możliwych metod ligacji: napędzaną napięciem pierścienia lub katalityczną cykloaddycją azydo-alkinową z użyciem miedzi.W zastosowaniach terapeutycznych dodatki te mogą obejmować polimery polipeptydowe lub małe cząsteczki. W tym eksperymencie zastosowano sondę fluorescencyjną, aby można było wykazać ligację sondy z białkami kapsydu za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Istnieje znaczne zainteresowanie opracowywaniem wirusów jako nośników genów, szczególnie w kontekście terapeutyki, dostarczania genów, terapii onkologicznej oraz technologii szczepionek.W tym kontekście dostrojenie interfejsu wirus-gospodarz jest szczególnie istotne pod kątem uzyskania właściwości odpowiednich dla terapeutycznego celowania w tkanki w celu stymulacji odpornościowej. Istnieje szereg innych czynników istotnych w kontekście dostrajania interfejsu wirus-gospodarz. W związku z tym opracowaliśmy dwuetapowy protokół znakowania.Pierwszym krokiem jest metaboliczne wprowadzenie nienaturalnego aminokwasu lub nienaturalnego cukru. Pozwala to na zainstalowanie punktu zakotwiczenia, który następnie możemy rozbudować za pomocą bardzo wysoce selektywnej chemii, co umożliwia dopisanie do wirusów praktycznie dowolnej funkcjonalności bez znaczącego zakłócania wirusa, jego zakaźności lub ogólnej sprawności, co stanowi główną barierę i istotną przeszkodę do pokonania. Po sterylizacji komory i sprzętu laboratoryjnego przygotuj 11 naczyń hodowlanych o średnicy 100 mm z komórkami HEK 293 utrzymywanymi w medium wzrostowym HEK w temperaturze 37 °C.Gdy hodowla komórkowa osiągnie 80 do 90% konfluencji, usunąć medium wzrostowe z jednej z płytek i wypłukać raz buforem TD. Odczepić komórki za pomocą jednego mililitra trypsyny z EDTA i inkubować przez jedną minutę. Dodać dziewięć mililitrów medium wzrostowego i policzyć liczbę zebranych komórek z tej płytki.Używając hemocytometru, oblicz liczbę cząsteczek adenowirusa wymaganych do zakażenia dla każdej z 10 pozostałych szalek hodowlanych. Powoli usuń medium wzrostowe, a następnie przemyj pięć mililitrów buforu TD. Dodaj jeden mililitr buforu do zakażenia i inkubuj przez jedną godzinę w tym okresie.Po zakażeniu delikatnie potrząsaj naczyniami z boku na bok co 15 minut. Ostrożnie dodaj dziewięć mililitrów pożywki wzrostowej HEK do każdego naczynia i inkubuj przez kolejne 18 godzin. Z zagęszczonych roztwororów zapasowych HA w cystynie.Przygotować medium do znakowania HA zgodnie z protokołem pisemnym. Należy upewnić się, że roztwory stokowe zostały uprzednio przefiltrowane za pomocą filtra strzykawkowego o rozmiarze 0,2 µm. W ten sam sposób wysterylizować roztwór stokowy metioniny dla próby kontrolnej, ostrożnie usunąć medium wzrostowe i przemyć każdą płytkę hodowlaną 5 mL buforu TD.Zastąp tę objętość 10 mililitrami medium do znakowania HA i inkubuj zainfekowane komórki przez kolejne sześć godzin. Białka kapsydu wirusa będą teraz translacyjne w obecności azo homo alaniny i przy braku metioniny. Ostrożnie zastąp medium do znakowania 10 mililitrami świeżego medium wzrostowego i inkubuj przez kolejne 18 godzin.Po zakończeniu tego etapu należy przejść do procedury oczyszczania opisanej w trzecim kroku filmu. Alternatywnie znaczniki azi można wprowadzić za pomocą cukrów zawierających azi zamiast nienaturalnego aminokwasu a HA. W niniejszym protokole zastosowano n acetoacetyl galacto, prekursor metaboliczny UDPN Acetoacetyl związany z pasożytem, podczas hodowli w obecności tego cukru aceto.Typ 5 adenowirusa będzie posiadał grupy azyjowe wyłącznie na włóknie w celu przeprowadzenia znakowania cukrami. Najpierw wykonaj krok pierwszy z filmu, aż do pojawienia się komunikatu na ekranie. Odpowiada to krokowi 1.5 w protokole pisemnym.Przygotuj roztwór do znakowania cukrem, najpierw pipetując 100 µL roztworu zapasowego cukru ATO do probówek Falcon i pozwalając na odparowanie metanolu. Następnie dodaj 100 mL pożywki wzrostowej HEK. Przykryj komórki w każdej płytce 10 mL tej pożywki do znakowania cukrem i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 44 godziny.Przejdź do kroku trzeciego w celu przeprowadzenia oczyszczania. Przenieś medium wraz z zakażonymi komórkami z naczynia hodowlanego do dwóch probówek stożkowych i wiruj przy 2000 G przez 10 minut. W temperaturze czterech stopni.Odciąć supernatant i zawiesić każdy osad w czterech mililitrach buforu TD, wykorzystując ciekły azot oraz kąpiel w temperaturze 37 °C. Przeprowadzić trzy cykle zamrażania i rozmrażania, aby zlizować zainfekowane komórki. Po każdym cyklu wymieszać zawiesinę za pomocą wortexa.Odwiruj zawiesinę po rozmrożeniu przy 2000 G przez 10 minut, aby wytrącić szczątki komórkowe; ponieważ adenowirus użyty do infekcji w pierwszym kroku zawierał transgen GFP, aktywność fluorescencyjna na tym etapie potwierdza transdukcję i ekspresję viralnego DNA. Ostrożnie przygotuj gradient gęstości chlorku cezu od 1,25 g/ml do 1,4 g/ml. Nanieś supernatant z lizowanych komórek na gradient gęstości i odwiruj przy 126 000 G przez jedną godzinę w temperaturze 15 °C.Po wirowaniu w probówce do wirówki powinien znajdować się gęsty, szeroki prążek. Jest to zmodyfikowany wirus azi. Używając igły star L, nakłuj dno probówki tak, aby zawartość ściekała kroplami, i w ten sposób ostrożnie zbierz ten wirus.Pasma dwóch metod ligacji wykazały obecność szczepu. Droga promowana charakteryzuje się prostszymi warunkami reakcji, ale ma wadę w postaci bardziej ograniczonego wyboru komercyjnie dostępnych sond do przeprowadzania ligacji promowanej szczepem. Wymieszać 50 µL wirusa modyfikowanego azydowo w buforze do przechowywania wirusa z 0,25 µL roztworu znakującego Tamara BCN, mieszając poprzez delikatne opukiwanie dna probówki przykrytej folią, a następnie inkubować w rotatorze przez noc w temperaturze pokojowej.Oczyść wirus typu click, wykorzystując centryfużową filtrację żelową. Kolumny wirować w celu równoważenia buforem do przechowywania wirusów. Deoxygenowana cykloaddycja katalizowana miedzią(I) zapewnia większą dostępność sond, ale ma wadę w postaci konieczności użycia specjalistycznego sprzętu do utrzymania atmosfery beztlenowej.Aby przeprowadzić ligację katalizowaną miedzią, najpierw odtlenić wszystkie materiały i roztwory reakcyjne w azotowym worku rękawicowym przez sześć godzin. Po tym czasie przygotować w worku rękawicowym roztwór zapasowy katalizatora miedzi(I), aby zainicjować reakcję. Dodać 1 µL tego roztworu zapasowego miedzi do 50 µL roztworu sondy wirusowej i czynnika chelatującego.Pozostawić reakcję znakowania na noc w worku rękawicowym. Oczyścić poprzez filtrację zgodnie z krokiem czwartym. Po zagotowaniu, oczyszczony wirus poddany reakcji click oraz bufor do lizy próbek gotować przez 10 minut.Napełnij dołki wybranym wirusem oraz kontrolami, a następnie przeprowadź elektroforezę. Przykryj komorę folią, aby chronić sondę fluorescencyjną przed światłem. Po jednej godzinie zeskanuj żel za pomocą fluorescencyjnego skanera żeli.Należy zauważyć, że wirusy nienaruszone lub nieznakowane $\alpha$-HA nie powinny wypierać znaczącego znakowania fluorescencyjnego dla $\alpha$-HA; wirusy wytwarzane przy wyższym stężeniu $\alpha$-HA wykazują silniejsze znakowanie fluorescencyjne ze względu na wyższy stopień wbudowania $\alpha$-HA. Należy również odnotować, że wirus znakowany cukrem wykazuje tagi azi wyłącznie w białku kapsydu włókna. Przyjmując 80% konfluencję komórek, należy przeznaczyć dwa dni na infekcję w znakowaniu azi, pięć godzin na zbieranie i oczyszczanie znakowanego wirusa, jedną noc na reakcję click oraz dwie godziny na analizę SDS-PAGE, co daje łącznie trzy i pół dnia. Podsumowując, zaprezentowano dwie metody znakowania azi oraz dwie reakcje chemii click z użyciem azydy i alkintu.Zastosowanie i dostępne zasoby powinny określić, która metoda lub metody są najlepiej dopasowane do Państwa celu. Chociaż wszystkie materiały opisane w tym protokole są dostępne komercyjnie, stwierdzono, że synteza cukrów acetylowych HA oraz sond INE jest znacznie bardziej efektywna kosztowo i zapewnia większą elastyczność w modyfikacjach powierzchni wirusa.

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusowych poprzez bioortogonalną chemię kliknięcia

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Prezentujemy metodę szybkiego, odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek i funkcjonalizowanych zespołów nanocząstek do badań powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR), wykorzystując sekwencyjną bioortogonalną chemię cykloaddycji na chipie i wychwytywanie przeciwciała-antygen.

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Ta metoda opisuje użycie chemii kliknięć do pomiaru zmian w transkrypcji komórek gospodarza po zakażeniu wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12. Wyniki można wizualizować jakościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub uzyskiwać ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda można dostosować do użytku z innymi wirusami.

Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego dla danego miejsca wprowadzania sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek, a następnie sprzężenie azydu z sondą chemiczną za pomocą promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC).

Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Zaprojektowaliśmy białko kapsydu wirusa zapalenia wątroby typu E jako nanocząstkę teranostyczną (HEVNP). HEVNP samoorganizuje się w stabilną klatkę dwudziestościenną podczas dostarczania błony śluzowej. W tym miejscu opisujemy modyfikację HEVNP do celowania w guz poprzez mutację reszt wystawionych na powierzchni do cystein, które sprzęgają syntetyczne ligandy, które specyficznie wiążą komórki nowotworowe.

Funkcjonalizacja powierzchni nanocząstek wirusa zapalenia wątroby typu E przy użyciu metod koniugacji chemicznej

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy procedurę fluorescencyjnej funkcjonalizacji dwusiarczków na Qβ VLP za pomocą dibromomaleimidu. Opisujemy ekspresję i oczyszczanie Qβ, syntezę cząsteczek funkcjonalizowanych dibromomaleimidem oraz reakcję koniugacji między dibromomaleimidem a Qβ. Powstała w ten sposób żółta fluorescencyjna sprzężona cząstka może być używana jako sonda fluorescencyjna wewnątrz komórek.

Wytwarzanie indukowanych przez koniugację fluorescencyjnych pegylowanych cząstek wirusopodobnych za pomocą chemii dibromomaleimidowo-dwusiarczkowej

Opisany tutaj protokół umożliwia badaczom specyficzne modyfikowanie kapsydów adenowirusa w wybranych miejscach za pomocą prostej chemii. Można generować osłonięte cząsteczki wektorów adenowirusa i ukierunkowane wektory transferu genów, a także badać interakcje wektora z gospodarzem.

Połączone genetyczne i chemiczne modyfikacje kapsydów wektorów transferu genów opartych na adenowirusie do ekranowania i celowania

Przedstawiono protokół syntezy i pomiaru właściwości fotochemicznych modułowych związków zamkniętych w klatkach z klikalnymi cząstkami.

Projektowanie, synteza i właściwości fotochemiczne klikalnych związków w klatkach

Badanie acylacji tłuszczów ma ważne implikacje w interakcjach i chorobach białek komórkowych. Przedstawiono tutaj zmodyfikowany protokół mający na celu poprawę wykrywania chemicznego acylowanych białek tłuszczowych, który może być stosowany w różnych typach komórek i łączony z innymi testami, w tym pościgiem impulsowym i spektrometrią mas.

Zoptymalizowane wprowadzanie analogów alkinylowych kwasów tłuszczowych do wykrywania acylowanych białek tłuszczowych za pomocą chemii Click

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Poznaj metodę modyfikacji powierzchni adenowirusów za pomocą bioortogonalnej chemii kliknięć. Technika ta umożliwia przyłączanie sond fluorescencyjnych i poprawia specyficzność dostarczania genów w terapii genowej.

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Przeglądaj więcej filmów