Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Ogólnym celem tej procedury jest zaprezentowanie elastycznej metody modyfikacji powierzchni wirusowych za pomocą chemii klik. W pierwszym kroku tej procedury komórki embrionalne nerki człowieka są zakażane adenowirusem typu 5 i inkubowane w obecności nienaturalnego aminokwasu kwasu homoolany lub cukru aceto-pasożytniczego N-acetoacetyloglukozaminy. Po dwóch dniach cząsteczki adenowirusa znakowane azydą są zbierane i oczyszczane.

Następnie wykorzystuje się chemosteryczną reakcję cykloaddycji azydo-alkinowej w celu przyłączenia sond fluorescencyjnych do powierzchni tych cząsteczek. Zgodnie z opisem w protokole pisemnym, proces ten przeprowadza się jedną z dwóch możliwych metod ligacji: napędzaną napięciem pierścienia lub katalityczną cykloaddycją azydo-alkinową z użyciem miedzi.

W zastosowaniach terapeutycznych dodatki te mogą obejmować polimery polipeptydowe lub małe cząsteczki. W tym eksperymencie zastosowano sondę fluorescencyjną, aby można było wykazać ligację sondy z białkami kapsydu za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Istnieje znaczne zainteresowanie opracowywaniem wirusów jako nośników genów, szczególnie w kontekście terapeutyki, dostarczania genów, terapii onkologicznej oraz technologii szczepionek.

W tym kontekście dostrojenie interfejsu wirus-gospodarz jest szczególnie istotne pod kątem uzyskania właściwości odpowiednich dla terapeutycznego celowania w tkanki w celu stymulacji odpornościowej. Istnieje szereg innych czynników istotnych w kontekście dostrajania interfejsu wirus-gospodarz. W związku z tym opracowaliśmy dwuetapowy protokół znakowania.

Pierwszym krokiem jest metaboliczne wprowadzenie nienaturalnego aminokwasu lub nienaturalnego cukru. Pozwala to na zainstalowanie punktu zakotwiczenia, który następnie możemy rozbudować za pomocą bardzo wysoce selektywnej chemii, co umożliwia dopisanie do wirusów praktycznie dowolnej funkcjonalności bez znaczącego zakłócania wirusa, jego zakaźności lub ogólnej sprawności, co stanowi główną barierę i istotną przeszkodę do pokonania. Po sterylizacji komory i sprzętu laboratoryjnego przygotuj 11 naczyń hodowlanych o średnicy 100 mm z komórkami HEK 293 utrzymywanymi w medium wzrostowym HEK w temperaturze 37 °C.

Gdy hodowla komórkowa osiągnie 80 do 90% konfluencji, usunąć medium wzrostowe z jednej z płytek i wypłukać raz buforem TD. Odczepić komórki za pomocą jednego mililitra trypsyny z EDTA i inkubować przez jedną minutę. Dodać dziewięć mililitrów medium wzrostowego i policzyć liczbę zebranych komórek z tej płytki.

Używając hemocytometru, oblicz liczbę cząsteczek adenowirusa wymaganych do zakażenia dla każdej z 10 pozostałych szalek hodowlanych. Powoli usuń medium wzrostowe, a następnie przemyj pięć mililitrów buforu TD. Dodaj jeden mililitr buforu do zakażenia i inkubuj przez jedną godzinę w tym okresie.

Po zakażeniu delikatnie potrząsaj naczyniami z boku na bok co 15 minut. Ostrożnie dodaj dziewięć mililitrów pożywki wzrostowej HEK do każdego naczynia i inkubuj przez kolejne 18 godzin. Z zagęszczonych roztwororów zapasowych HA w cystynie.

Przygotować medium do znakowania HA zgodnie z protokołem pisemnym. Należy upewnić się, że roztwory stokowe zostały uprzednio przefiltrowane za pomocą filtra strzykawkowego o rozmiarze 0,2 µm. W ten sam sposób wysterylizować roztwór stokowy metioniny dla próby kontrolnej, ostrożnie usunąć medium wzrostowe i przemyć każdą płytkę hodowlaną 5 mL buforu TD.

Zastąp tę objętość 10 mililitrami medium do znakowania HA i inkubuj zainfekowane komórki przez kolejne sześć godzin. Białka kapsydu wirusa będą teraz translacyjne w obecności azo homo alaniny i przy braku metioniny. Ostrożnie zastąp medium do znakowania 10 mililitrami świeżego medium wzrostowego i inkubuj przez kolejne 18 godzin.

Po zakończeniu tego etapu należy przejść do procedury oczyszczania opisanej w trzecim kroku filmu. Alternatywnie znaczniki azi można wprowadzić za pomocą cukrów zawierających azi zamiast nienaturalnego aminokwasu a HA. W niniejszym protokole zastosowano n acetoacetyl galacto, prekursor metaboliczny UDPN Acetoacetyl związany z pasożytem, podczas hodowli w obecności tego cukru aceto.

Typ 5 adenowirusa będzie posiadał grupy azyjowe wyłącznie na włóknie w celu przeprowadzenia znakowania cukrami. Najpierw wykonaj krok pierwszy z filmu, aż do pojawienia się komunikatu na ekranie. Odpowiada to krokowi 1.5 w protokole pisemnym.

Przygotuj roztwór do znakowania cukrem, najpierw pipetując 100 µL roztworu zapasowego cukru ATO do probówek Falcon i pozwalając na odparowanie metanolu. Następnie dodaj 100 mL pożywki wzrostowej HEK. Przykryj komórki w każdej płytce 10 mL tej pożywki do znakowania cukrem i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 44 godziny.

Przejdź do kroku trzeciego w celu przeprowadzenia oczyszczania. Przenieś medium wraz z zakażonymi komórkami z naczynia hodowlanego do dwóch probówek stożkowych i wiruj przy 2000 G przez 10 minut. W temperaturze czterech stopni.

Odciąć supernatant i zawiesić każdy osad w czterech mililitrach buforu TD, wykorzystując ciekły azot oraz kąpiel w temperaturze 37 °C. Przeprowadzić trzy cykle zamrażania i rozmrażania, aby zlizować zainfekowane komórki. Po każdym cyklu wymieszać zawiesinę za pomocą wortexa.

Odwiruj zawiesinę po rozmrożeniu przy 2000 G przez 10 minut, aby wytrącić szczątki komórkowe; ponieważ adenowirus użyty do infekcji w pierwszym kroku zawierał transgen GFP, aktywność fluorescencyjna na tym etapie potwierdza transdukcję i ekspresję viralnego DNA. Ostrożnie przygotuj gradient gęstości chlorku cezu od 1,25 g/ml do 1,4 g/ml. Nanieś supernatant z lizowanych komórek na gradient gęstości i odwiruj przy 126 000 G przez jedną godzinę w temperaturze 15 °C.

Po wirowaniu w probówce do wirówki powinien znajdować się gęsty, szeroki prążek. Jest to zmodyfikowany wirus azi. Używając igły star L, nakłuj dno probówki tak, aby zawartość ściekała kroplami, i w ten sposób ostrożnie zbierz ten wirus.

Pasma dwóch metod ligacji wykazały obecność szczepu. Droga promowana charakteryzuje się prostszymi warunkami reakcji, ale ma wadę w postaci bardziej ograniczonego wyboru komercyjnie dostępnych sond do przeprowadzania ligacji promowanej szczepem. Wymieszać 50 µL wirusa modyfikowanego azydowo w buforze do przechowywania wirusa z 0,25 µL roztworu znakującego Tamara BCN, mieszając poprzez delikatne opukiwanie dna probówki przykrytej folią, a następnie inkubować w rotatorze przez noc w temperaturze pokojowej.

Oczyść wirus typu click, wykorzystując centryfużową filtrację żelową. Kolumny wirować w celu równoważenia buforem do przechowywania wirusów. Deoxygenowana cykloaddycja katalizowana miedzią(I) zapewnia większą dostępność sond, ale ma wadę w postaci konieczności użycia specjalistycznego sprzętu do utrzymania atmosfery beztlenowej.

Aby przeprowadzić ligację katalizowaną miedzią, najpierw odtlenić wszystkie materiały i roztwory reakcyjne w azotowym worku rękawicowym przez sześć godzin. Po tym czasie przygotować w worku rękawicowym roztwór zapasowy katalizatora miedzi(I), aby zainicjować reakcję. Dodać 1 µL tego roztworu zapasowego miedzi do 50 µL roztworu sondy wirusowej i czynnika chelatującego.

Pozostawić reakcję znakowania na noc w worku rękawicowym. Oczyścić poprzez filtrację zgodnie z krokiem czwartym. Po zagotowaniu, oczyszczony wirus poddany reakcji click oraz bufor do lizy próbek gotować przez 10 minut.

Napełnij dołki wybranym wirusem oraz kontrolami, a następnie przeprowadź elektroforezę. Przykryj komorę folią, aby chronić sondę fluorescencyjną przed światłem. Po jednej godzinie zeskanuj żel za pomocą fluorescencyjnego skanera żeli.

Należy zauważyć, że wirusy nienaruszone lub nieznakowane $\alpha$-HA nie powinny wypierać znaczącego znakowania fluorescencyjnego dla $\alpha$-HA; wirusy wytwarzane przy wyższym stężeniu $\alpha$-HA wykazują silniejsze znakowanie fluorescencyjne ze względu na wyższy stopień wbudowania $\alpha$-HA. Należy również odnotować, że wirus znakowany cukrem wykazuje tagi azi wyłącznie w białku kapsydu włókna. Przyjmując 80% konfluencję komórek, należy przeznaczyć dwa dni na infekcję w znakowaniu azi, pięć godzin na zbieranie i oczyszczanie znakowanego wirusa, jedną noc na reakcję click oraz dwie godziny na analizę SDS-PAGE, co daje łącznie trzy i pół dnia. Podsumowując, zaprezentowano dwie metody znakowania azi oraz dwie reakcje chemii click z użyciem azydy i alkintu.

Zastosowanie i dostępne zasoby powinny określić, która metoda lub metody są najlepiej dopasowane do Państwa celu. Chociaż wszystkie materiały opisane w tym protokole są dostępne komercyjnie, stwierdzono, że synteza cukrów acetylowych HA oraz sond INE jest znacznie bardziej efektywna kosztowo i zapewnia większą elastyczność w modyfikacjach powierzchni wirusa.