Name: Wysokoprzepustowy sekwencyjny test ELISA do walidacji biomarkerów ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T11:45:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj wysokoprzepustowy sekwencyjny test ELISA do walidacji biomarkerów ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Ta metoda umożliwia analizę wielu białek z jednej próbki osocza, minimalizując cykle zamrażania i rozmrażania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez granty NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, fundację Hartwell Foundation oraz fundację Doris Duke Charitable Foundation. Dr Paczesny jest badaczem funduszu Eric Hartwell oraz programu badawczego Amy Strelzer Manasevit Research Program.

1. Dzień 0 eksperymentu: Przygotowanie próbek i pokrywanie płyt testowych ELISA przeciwciałem wychwytującym dla IL-2Rα, REG3α oraz HGF
<ol>
 <li>Alikwoty próbek osocza do analizy zostaną pobrane, rozmrożone i odwirowane przy 12 000 rpm przez 10 min, aby oddzielić skrzepy na dnie oraz lipidy na górze od osocza. Do każdej studzienki płyty 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V (płyta źródłowa) zostanie naniesiona ręcznie pipetą 150 μl nierozcieńczonego osocza z każdej próbki, zgodnie z wcześniej zdefiniowanymi mapami. Alikwoty zostaną owinięte parafilmem i przechowywane w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C przez cały proces, nie dłużej niż 72 hr.</li>
 <li>Przeciwciała wychwytujące IL-2Rα i HGF zostaną zrekonstytuowane i rozcieńczone zgodnie ze specyfikacją producenta, a następnie do każdej studzienki odpowiednich płyt 96-dołkowych o wysokiej zdolności wiązania (half-well) zostanie naniesiono 50 μl roztworu. Płyty zostaną zamknięte i inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C. Alternatywnie, w zależności od stabilności białka, wiele płyt można wysuszyć w temperaturze 37 °C i przechowywać w 4 °C do późniejszego użycia.</li>
 <li>Przeciwciało wychwytujące REG3α zostanie rozcieńczone zgodnie z protokołem producenta przy użyciu buforu do powlekania producenta, a następnie do każdej studzienki płyty 384-dołkowej Nunc Maxi-Sorp zostanie naniesiono 25 μl roztworu. Płyta zostanie zamknięta i inkubowana przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Dzień 1 eksperymentu: test ELISA dla IL-2Rα (Rysunek 1)
<ol>
 <li>Płytkę testową IL-2Rα przemywa się, blokuje za pomocą BLOTTO w TBS, a następnie zgodnie z protokołem producenta odtwarza standard i przygotowuje 8-punktową krzywą wzorcową.</li>
 <li>Po przemyciu płytki po etapie blokowania, 50 μl nierozcieńczonej osocza przenosi się w duplikacie z płytki źródłowej na płytkę testową ELISA, a następnie w duplikacie nanosi się 50 μl każdego standardu. Płytkę szczelnie zamyka się i inkubuje przez 2 hr w temperaturze pokojowej na rotatorze do płytek ustawionym na 300 rpm.</li>
 <li>Osocze odzyskuje się z płytki testowej IL-2Rα ELISA i przenosi z powrotem do płytki źródłowej z nierozcieńczonym osoczem. Test ELISA przeprowadza się zgodnie z protokołem producenta (z dostosowaniem objętości do płytek z półstudzienkami), a gęstość optyczną każdej studzienki odczytuje się za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, po czym dane są zapisywane i analizowane.</li>
</ol>
3. Dzień 1 eksperymentu: ELISA dla REG3α (Rycina 1)
<ol>
 <li>10 μl nierozcieńczonej plazmy przenosi się do osobnej płytki źródłowej z dnem w kształcie litery V. Do każdego dołka dodaje się 90 μl buforu do rozcieńczania dostarczonego przez producenta, aby przygotować płytkę źródłową z rozcieńczeniem 1:10.</li>
 <li>Test REG3α ELISA wykonuje się zgodnie z protokołem producenta (z objętościami dostosowanymi do płytek 384-dołkowych), a gęstość optyczną każdego dołka odczytuje się za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-620 nm, a następnie dane zapisuje się i analizuje.</li>
</ol>
4. Dzień eksperymentu 1: Powlekanie płytek testowych dla elafiny i TNFR1 przeciwciałem wychwytującym
<ol>
 <li>Przeciwciała wychwytujące Elafinę i TNFR1 należy zrekonstytuować i rozcieńczyć zgodnie ze specyfikacją producenta, a następnie 50 μl nanieść do każdej studzienki odpowiednich płytek 96-dołkowych o wysokim wiązaniu (typu half-well). Płytki należy szczelnie zamknąć i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w przypadku Elafiny oraz w temperaturze 4 °C w przypadku TNFR1.</li>
</ol>
5. Dzień eksperymentu 1-2: test ELISA dla HGF (Rysunek 1)
<ol>
 <li>Po zakończeniu testu ELISA dla IL-2Rα i upewnieniu się, że test nie wymaga powtórzenia, 60 μl nierozcieńczonej plazmy przenosi się na nową płytkę źródłową, a następnie do każdej studzienki dodaje 60 μl 1% BSA w 1 x PBS, aby przygotować płytkę źródłową z plazmą rozcieńczoną 1:2.</li>
 <li>Płytkę testową HGF przemywa się, blokuje za pomocą BLOTTO w TBS, a następnie zgodnie z protokołem producenta rekonstytuuje standard i przygotowuje 8-punktową krzywą wzorcową.</li>
 <li>Po przemyciu płytki po etapie blokowania, 50 μl plazmy rozcieńczonej 1:2 nanosi się w duplikacie na płytkę testową ELISA, a 50 μl każdego standardu nanosi się w duplikacie. Płytkę uszczelnia i inkubuje przez noc w temperaturze pokojowej na rotatorze do płytek ustawionym na 300 RPM.</li>
 <li>Plazmę rozcieńczoną 1:2 odzyskuje się z płytki testowej ELISA HGF i przenosi z powrotem na płytkę źródłową z plazmą rozcieńczoną 1:2. Test ELISA przeprowadza się zgodnie z protokołem producenta (dostosowując objętości do płytek półstudzienkowych), a gęstość optyczną każdej studzienki odczytuje się za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, po czym dane zapisuje się i analizuje.</li>
</ol>
6. Dzień 2 eksperymentu: ELISA dla elafiny
<ol>
 <li>10 μl nierozcieńczonej plazmy należy przenieść na nową płytkę źródłową, a następnie do każdej studni dodać 190 μl 1% BSA w 1 x PBS, aby uzyskać 200 μl plazmy rozcieńczonej 1:20.</li>
 <li>Test Elafin ELISA należy przeprowadzić zgodnie z protokołem producenta (z objętościami dostosowanymi do płytek o połowie standardowej wielkości studni), a gęstość optyczną każdej studni odczytać za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, a następnie zapisać i przeanalizować dane.</li>
</ol>
7. Dzień 2 eksperymentu: ELISA dla TNFR1
<ol>
 <li>Do płytki źródłowej z rozcieńczeniem 1:20 (zawierającej obecnie 100 μl osocza 1:20) należy dodać 25 μl 1% BSA w PBS, aby uzyskać 125 μl osocza rozcieńczonego 1:25.</li>
 <li>Test ELISA dla TNFR1 należy przeprowadzić zgodnie z protokołem producenta (dostosowując objętości do płytek półdołkowych), a gęstość optyczną każdego dołka należy odczytać za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, a następnie zapisać i przeanalizować dane.</li>
</ol>
8. Dzień 2 eksperymentu: test ELISA dla IL-8
<ol>
 <li>60 μl osocza rozcieńczonego 1:2 przenosi się do nowej płytki źródłowej, a następnie do każdego dołka dodaje 180 μl rozcieńczalnika IL-8, aby przygotować płytkę źródłową z osoczem rozcieńczonym 1:6.</li>
 <li>Test IL-8 ELISA wykonuje się zgodnie z protokołem producenta (z objętościami dostosowanymi do płytek półdołkowych), a gęstość optyczną każdego dołka odczytuje za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450-570 nm, po czym dane zapisuje się i analizuje.</li>
</ol>
Po zakończeniu wszystkich testów ELISA, niewykorzystany zapas plazmy zostanie przelany z powrotem do rozmrożonych alikwotów i zamrożony do przyszłego użycia.

<ol><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li>
<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12(2010).</li>
<li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li>
<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li>
<li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li>
<li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li>
<li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li>
<li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li>
<li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li>
<li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines%3A+the+sequential+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li>
<li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda sekwencyjnego badania ELISA umożliwia pomiar wielu białek osocza z niewielkich objętości osocza, które mogą być trudne do pozyskania i/lub niezastąpione, takich jak próbki od ludzi z rzadkimi chorobami lub próbki osocza pobrane od myszy9,10. Badania sekwencyjne ELISA są zazwyczaj przeprowadzane w kolejności rosnącego czynnika rozcieńczenia osocza, przy czym w przypadku testów ELISA wymagających osocza rozcieńczonego ≥ 1:10 odzyskiwanie próbki zazwyczaj nie jest konieczne, choć można to zrobić w razie potrzeby. Możliwość wykonania sekwencyjnego badania ELISA jest ograniczona przez zestawy/protokoły ELISA, w których osocze jest mieszane z innymi odczynnikami lub dla których wymagane są różne bufory rozcieńczające osocze; uniemożliwia to ponowne wykorzystanie próbki ze względu na obawy, że niekompatybilny bufor/odczynnik będzie zakłócał działanie konkretnego testu. Dzięki starannemu planowaniu, na tej samej próbce osocza można przeprowadzić 10 lub więcej testów ELISA.
Poszczególne laboratoria mogą potrzebować dostosowania rozcieńczeń osocza w celu uzyskania interpretowalnych wyników, w zależności od oczekiwanych stężeń analizowanego białka w próbkach pobranych od badanych osób. Różnice w wyposażeniu laboratoryjnym mogą skutkować koniecznością optymalizacji czasów inkubacji i rozwoju kolorymetrycznego, liczby cykli płukania i/lub czasu moczenia podczas płukania w celu zoptymalizowania konkretnego testu ELISA.
Aby zwiększyć przepustowość oraz dokładność i przeprowadzać analizy w sposób kosztowo efektywny, zaleca się zastosowanie robotycznej platformy do pipetowania, umożliwiającej analizę na płytkach 384-dołkowych, oraz automatycznej myjki do płytek z modułem do sztaplowania. Sprzęt ten pozwala zwiększyć dokładność i precyzję analiz wykonywanych przez wielu użytkowników oraz pomaga zapewnić spójność analiz w celu zmniejszenia zmienności między- i wewnątrztestowej.
Zdecydowaliśmy się na sekwencyjne przeprowadzanie testów ELISA zamiast dostępnych platform multipleksowych z dwóch powodów: 1) większość par przeciwciał dla nowych białek nie może być łatwo sprzęgnięta z kuleczkami lub innym materiałem, a proces ten jest czasochłonny i kosztowny; 2) poszczególne testy ELISA są bardziej precyzyjne niż multipleksowe macierze mikroprzestrzenne lub kuleczki, co wynika z braku reakcji krzyżowych11. Jeśli zostanie opracowana niezawodna metoda przeprowadzania multipleksowych macierzy mikroprzestrzennych opartych na kuleczkach, może ona zastąpić proces sekwencyjnego badania ELISA, jednak może być ograniczona możliwością sprzęgania przeciwciał z kuleczkami i/lub liczbą białek, których analiza jest wymagana.

Ostra choroba przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD), będąca główną przyczyną śmiertelności niezwiązanej z nawrotem (NRM) po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT), jest diagnozowana na podstawie dysfunkcji trzech układów narządowych: skóry, wątroby i przewodu pokarmowego (GI)4. Ostra GVHD pojawia się zazwyczaj od drugiej do ósmej tygodnia po przeszczepie, choć może wystąpić później, i często jest klinicznie nieodróżnialna od innych powikłań po HSCT, takich jak toksyczność schematu warunkowania, infekcje lub działania niepożądane leków. Dzięki zastosowaniu strategii proteomicznych i walidacji wysokoprzepustowej za pomocą sekwencyjnego testu ELISA zidentyfikowaliśmy 6 białek, których stężenia są podwyższone w momencie wystąpienia klinicznych objawów GVHD. Panel 4 biomarkerów, obejmujący IL-2Rα, TNFR1, HGF oraz IL-8, pozwala na diagnozę GVHD w momencie pojawienia się objawów klinicznych i może przewidywać przeżywalność po HSCT niezależnie od stopnia nasilenia GVHD1. Elafina, biomarker GVHD skóry, pozwala odróżnić wysypkę GVHD od wysypek o innych przyczynach, takich jak osutki lekowe, i może przewidywać przeżywalność po przeszczepie2. Niedawno zidentyfikowaliśmy REG3α jako biomarker GVHD dolnego odcinka przewodu pokarmowego, który jest narządem docelowym najsilniej powiązanym z NRM. Stężenie REG3α w osoczu pozwala wiarygodnie zidentyfikować GVHD jako przyczynę biegunek po HSCT i koreluje z histologicznym stopniem nasilenia GVHD w diagnostycznych biopsjach jelita. Stężenia REG3α w momencie wystąpienia GVHD przewodu pokarmowego mogą również przewidywać odpowiedź na terapię GVHD oraz NRM3. Włączenie tych zwalidowanych biomarkerów GVHD do opieki klinicznej jest obecnie badane w ramach badań klinicznych.
Eksperymenty te przeprowadzono na niewielkich alikwotach osocza pobranych od pacjentów poddawanych HSCT między 2000 a 2010 rokiem w momencie wystąpienia GVHD, które są niedoścignione i dostępne w ograniczonej ilości. Ze względu na cenną naturę tych próbek opracowaliśmy metodę pomiaru stężeń wielu białek osocza w sposób wydajny i powtarzalny, aby wyeliminować nadmierne cykle zamrażania i rozmrażania, czas rozmrażania oraz zużycie osocza. Technikę tę można zastosować do przeprowadzenia testów ELISA dla wielu białek/cytokin zainteresowania w tej samej próbce (lub próbkach), pod warunkiem że próbki nie wymagają mieszania z innymi odczynnikami. Jeśli zestawy ELISA nie zawierają płyt pokrytych wcześniej, można zastosować płytki 96-dołkowe typu half-well lub płytki 384-dołkowe, aby dodatkowo zminimalizować zużycie próbek/odczynników. Niniejszy artykuł koncentruje się na aspektach technologicznych pomiaru biomarkerów GVHD.

<table><tbody><tr><td>Zestaw Duoset dla ludzkiego IL-2 R alpha</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>DY223</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Human HGF Duoset</td><td>R&amp;R&D Systems</td><td>DY294</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Human IL-8 OptEIA KIT II</td><td>Becton Dickinson</td><td>550999</td><td></td></tr><tr><td>MONTAŻ Ab-Match ludzkiego PAP1 (REG3)&amp;alpha;Zestaw</td><td>MBL International</td><td>5323</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Ab-Match UNIVERSAL</td><td>MBL International</td><td>5310</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Duoset dla ludzkiego sTNFRI/TNFRSF1A</td><td>R&amp;D Systems</td><td>DY225</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Duoset dla ludzkiej trappin-2/elafiny</td><td>R&amp;D Systems</td><td>DY1747</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe polistyrenowe płytki z dnem stożkowym</td><td>Thermo Scientific</td><td>249570</td><td>Stosowane do płytek źródła plazmy</td></tr><tr><td>płytki 96-dołkowe Costar half-well o wysokim powinowactwie wiązania (high-binding)</td><td>Corning</td><td>3690</td><td>Dla IL-2R&amp;alpha;, testy ELISA dla HGF, TNFR1 i elafiny</td></tr><tr><td>płytki Nunc MaxiSorp z 384 dołkami</td><td>Nunc</td><td>464718</td><td>Dla REG3&amp;alpha; ELISA</td></tr><tr><td>HyClone roztwór soli fosforanowo-buforowany, 1x</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V, poddana szokowi termicznemu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Blokujący BLOTTO w TBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37530</td><td>Agent blokujący dla IL-2R&amp;alpha; Testy ELISA dla HGF i TNFR1</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td>Bufor płukący dla IL-2R&amp;alpha;testy ELISA dla HGF, elafiny i TNFR1</td></tr><tr><td>Podłoże nadtlenkowe TMB</td><td>Laboratoria Kirkegaard i Perry</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Acros Organics</td><td>233362500</td><td>Bufor płuczący dla IL-2R&amp;alpha;, testy ELISA dla HGF, elafiny i TNFR1</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84720</td><td>(Rozcieńczony do 2N) jako roztwór zatrzymujący</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy sekwencyjny test elisa do walidacji biomarkerów ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Strategie bezstronnej proteomiki odkrywczej mają potencjał do identyfikacji dużej liczby nowych biomarkerów, które mogą usprawnić diagnostykę i testy prognostyczne w warunkach klinicznych oraz pomóc w kierowaniu interwencjami terapeutycznymi. W przypadku zidentyfikowania wielu potencjalnych białek, walidacja kandydatów na biomarkery w sposób szybki i wydajny może być trudna, gdy wykorzystuje się próbki osocza pacjentów pobierane w odpowiedzi na zdarzenia kliniczne, o ograniczonej objętości i niepodlegające odtworzeniu, na przykład w momencie wystąpienia ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD), która jest potencjalnie zagrażającym życiu powikłaniem allogenicznego przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT).
W niniejszym opracowaniu opisujemy proces przeprowadzania dostępnych komercyjnie testów ELISA dla sześciu zwalidowanych białek związanych z GVHD: IL-2Rα5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafiny2 oraz REG3α3 (znanego również jako PAP1) w sposób sekwencyjny, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania, czas przebywania rozmrożonej plazmy w temperaturze pokojowej oraz zużycie plazmy. W ramach tej procedury testy ELISA wykonujemy w kolejności wynikającej z czynnika rozcieńczenia próbek, ustalonej w naszym laboratorium z wykorzystaniem zestawów i protokołów ELISA producenta, z niewielkimi modyfikacjami mającymi na celu optymalizację sekwencyjnego przebiegu analiz. Uzyskane stężenia biomarkerów plazmy mogą następnie zostać zestawione i przeanalizowane pod kątem istotnych wyników w obrębie kohorty pacjentów. Chociaż biomarkery te służą obecnie wyłącznie do celów badawczych, ich wprowadzenie do praktyki klinicznej jest obecnie badane w ramach badań klinicznych.
Tę technikę można zastosować do przeprowadzenia testów ELISA dla wielu białek/cytokin w tej samej próbce lub próbkach, pod warunkiem że próbki nie muszą być mieszane z innymi odczynnikami. Jeśli zestawy ELISA nie zawierają płyt przedpowlekanych, w celu dalszej minimalizacji zużycia próbek/odczynników można zastosować płytki 96-dołkowe typu half-well lub płytki 384-dołkowe.

Przebieg i harmonogram analiz biomarkerów szczegółowo opisano odpowiednio w Tabeli 1 oraz Tabeli 2. Po zakończeniu procesu stężenia 6 różnych białek zostały oznaczone w tej samej próbce osocza, wykorzystując łącznie 150 μL osocza. Naniesienie próbek w duplikacie dla każdego testu umożliwia wewnętrzne zapewnienie jakości, przy czym optymalne są wartości CV poniżej 10%. W przypadku przeprowadzania sekwencyjnego testu ELISA na wielu płytkach preferowane są spójne wartości gęstości optycznej wysokiego standardu, co pozwala na poprawę niezawodności pomiarów między płytkami; wartości OD krzywej standardowej można porównywać między płytkami w celu oceny niespójności w działaniu testu ELISA (Rysunek 2). Czasy utleniania z użyciem kolorymetrycznego substratu tetrametylobenzydyny oraz zaobserwowane wartości OD dla wysokich stężeń każdego biomarkera w naszym laboratorium wymieniono w Tabeli 3.
<img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig1.jpg" alt="Proces eksperymentalny ELISA, schemat blokowy, analiza wielu płytek, etapy rozcieńczania, wyniki immunoanalizy." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Schemat postępowania dla testów ELISA dla IL-2Rα, REG3α i HGF. Po naniesieniu próbek osocza na płytki testowe ELISA IL-2Rα, są one odzyskiwane w celu przygotowania płytek źródłowych do rozcieńczeń dla pozostałych testów ELISA. W przypadku testu ELISA HGF, osocze jest odzyskiwane w celu przygotowania płytki z rozcieńczeniem 1:6 dla IL-8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby powiększyć rycinę</a>.
<img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Wykres gęstości optycznej w funkcji stężenia REG3α; dane eksperymentalne, R²=0.8, p=0.006, analiza." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Gęstości optyczne dla krzywej standardowej 7 różnych płytek ELISA służących do pomiaru stężeń REG3α odpowiadających 1084 pacjentom przebadanym w początkowym raporcie dotyczącym biomarkera REG3α dla GI GVHD3. Spójne wartości OD między płytkami zapewniają powtarzalne pomiary stężeń białek między poszczególnymi płytkami. Stężenia białek w próbkach osocza są obliczane poprzez porównanie gęstości optycznej próbek z gęstościami optycznymi krzywej standardowej.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Dzień 0 eksperymentu</td>
 <td>1. Przygotowanie próbek</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>2. Przeciwciała wychwytujące IL-2Rα, HGF i REG3α</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dzień 1 eksperymentu</td>
 <td>1. ELISA dla IL-2Rα</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>2. ELISA dla REG3α</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>3. ELISA dla HGF (do etapu nakładania próbek)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>4. Przeciwciała wychwytujące dla elafiny i TNFR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dzień 2 eksperymentu</td>
 <td>1. Zakończenie testu ELISA dla HGF</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>2. ELISA dla elafiny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>3. ELISA dla TNFR1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>4. ELISA dla IL-8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>5. Ponowne zamrożenie niewykorzystanej plazmy</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Przegląd schematu analizy biomarkerów GVHD
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Dzień 0</td>
 <td colspan="3">Przygotowanie próbek i inkubacja z ciałem wychwytującym przez noc</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">ELISA</td>
 <td>IL-2Rα</td>
 <td>REG3α</td>
 <td>HGF</td>
 <td>Elafina</td>
 <td>TNFR1</td>
 <td>IL-8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Czas (godz.)</td>
 <td>0.0</td>
 <td>Blokowanie</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>1.0</td>
 <td>Próbki wysiane</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>3.0</td>
 <td>Odzyskanie próbek osocza; przeciwciało detekcyjne</td>
 <td>Blokowanie; Przygotowanie próbek (rozcieńczenie 1:10) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>4.0</td>
 <td></td>
 <td>Próbki wysiane (1:10)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>5.0</td>
 <td>Streptawidyna-HRP</td>
 <td>Detekcja Ab</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>5.5</td>
 <td>TMB</td>
 <td>Streptawidyna-HRP</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>6.0</td>
 <td>Odczyt płytki</td>
 <td>TMB</td>
 <td>Blokowanie; Przygotowanie próbek (rozcieńczenie 1:2)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>6.5</td>
 <td></td>
 <td>Odczyt płytki</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>7.0</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Próbki wysiane (1:2)</td>
 <td>Przeciwciało wychwytujące (inkubacja przez noc)</td>
 <td>Przeciwciało wychwytujące (inkubacja nocna)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dzień 2</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Czas (godz.)</td>
 <td>0.0</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Odzyskać plazmę, przeciwciało detekcyjne</td>
 <td>Blokowanie; Przygotowanie próbek (1:20)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>1.0</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Wysiew próbki (1:2)</td>
 <td>Blokowanie; Dalsze rozcieńczenie próbek z 1:20 do rozcieńczenia 1:25</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>2.0</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>HRP</td>
 <td></td>
 <td>Wysiew próbek (1:25)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>2.5</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>TMB</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>3.0</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Odczyt płytki</td>
 <td>Detekcja Ab</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>3.5</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Przygotować próbki (rozcieńczenie 1:6)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>4.0</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Detekcja Ab</td>
 <td>Wysiew próbki (1:6)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>5.0</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>HRP</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>5.5</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>TMB</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>6.0</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Odczyt płytki</td>
 <td>HRP</td>
 <td>Detekcja Ab</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>TMB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>7.0</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Odczyt płytki</td>
 <td>TMB</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>7.5</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Odczyt płytek</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">Po zakończeniu</td>
 <td colspan="6">Rozdzielić plazmę źródłową na alikwoty i zamrozić do późniejszego użycia</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Harmonogram przeprowadzania testów ELISA.
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td></td>
 <td>Współczynnik rozcieńczenia osocza</td>
 <td>Stężenie wysokiego standardu</td>
 <td>Czas rozwoju substratu (min)</td>
 <td>Wysoka OD</td>
 <td>Krzywa</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IL-2Rα</td>
 <td>1:1</td>
 <td>2,000 pg/ml</td>
 <td>5</td>
 <td>1</td>
 <td>Liniowa</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HGF</td>
 <td>1:2</td>
 <td>4,000 pg/ml</td>
 <td>22</td>
 <td>2.1</td>
 <td>4-parametrowa</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IL-8</td>
 <td>1:6</td>
 <td>200 pg/ml</td>
 <td>12</td>
 <td>2.7</td>
 <td>4-parametrowa</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>REG3α</td>
 <td>1:10</td>
 <td>100 ng/ml</td>
 <td>12</td>
 <td>1.7</td>
 <td>4-parametrowa</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Elafin</td>
 <td>1:20</td>
 <td>2,000 pg/ml</td>
 <td>20</td>
 <td>1.9</td>
 <td>4-parametrowa</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TNFR1</td>
 <td>1:25</td>
 <td>800 pg/ml</td>
 <td>8</td>
 <td>2.7</td>
 <td>Liniowa</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 3. Szczegóły testów ELISA dla 6 biomarkerów GVHD.

Wysokoprzepustową walidację wielu potencjalnych biomarkerów można przeprowadzić za pomocą sekwencyjnego testu ELISA, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania oraz zużycie cennych próbek osocza. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak sekwencyjnie wykonać testy ELISA dla sześciu różnych zwalidowanych biomarkerów osocza1-3 w chorobie przeszczep przeciw gospodarzowi (GVHD)4 w tej samej próbce osocza.

Wysokoprzepustowy sekwencyjny test ELISA do walidacji biomarkerów ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi

Strategie bezstronnej proteomiki odkrywczej mają potencjał do identyfikacji licznych nowych biomarkerów, które mogą usprawnić diagnostykę i prognozę...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie wysokoprzepustowych sekwencyjnych testów ELISA w celu efektywnej analizy dużej liczby nowych biomarkerów odkrytych metodami proteomiki. Osiąga się to poprzez najpierw naniesienie próbek na płytkę źródłową, która służy do przygotowania rozcieńczeń dla każdego biomarkera oraz do przechowywania odzyskanej plazmy pomiędzy testami. Następnie przeprowadza się testy ELISA dla każdego białka, aby określić ich stężenia w próbkach pacjentów.W konsekwencji możliwe jest określenie wzrostu poziomu białek tych biomarkerów w momencie wystąpienia objawów klinicznych ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość analizy wielu nowych białek za pomocą analizatorów sekwencyjnych, co nie zawsze jest dostępne na platformach wielopleksowych. Zastosowania tej techniki rozciągają się na diagnostykę ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.Ponieważ biomarkery zwalidowane za pomocą tej metody są obecnie badane pod kątem opieki klinicznej, metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat powikłań po poetycznej transplantacji komórek macierzystych. Może ona zostać zastosowana również do odkrywania i walidacji biomarkerów w innych chorobach, takich jak transplantacja płuc, powikłania, rak płuc lub potencjalnie każda choroba, w przypadku której przydatne będzie diagnostyczne badanie krwi.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ ważne jest, aby poszczególne kroki były wykonywane w sposób spójny w celu zapewnienia odtwarzalności i niskiej zmienności między partiami. Dzień przed eksperymentem odwiruj alikwoty osocza przez 10 minut przy 15 300 RCF i 4 °C, aby oddzielić skrzepy na dnie i lipidy na powierzchni od osocza. Następnie nanieś 150 µL nierozcieńczonego osocza z każdej próbki na płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery V za pomocą pipetowania ręcznego zgodnie z wcześniej określonymi mapami. Owiń płytkę Paraformem i umieść ją w komorze dla próbek ludzkich w temperaturze 4 °C na maksymalnie 72 godziny.Następnie, po rekonstytucji i rozcieńczeniu przeciwciał wychwytujących przeciwko receptorowi alfa interleukiny 2 oraz czynnikowi wzrostu hepatocytów (HGF) zgodnie ze specyfikacją producenta, nanieś 50 µL każdego przeciwciała do odpowiednich dołków 96-dołkowych płytek wysokowiążących (half-well). Następnie zabezpiecz płytki uszczelniaczem i inkubuj je przez noc w temperaturze 4 °C. Teraz rozcieńcz reg 3 alpha w buforze do powlekania producenta zgodnie z protokołem producenta i nanieś 25 µL roztworu do każdego dołka 384-dołkowej płytki no maxor.Następnie, w pierwszym dniu eksperymentu, przechowuj tę płytkę szczelnie zamkniętą w temperaturze four degrees Celsius. Rozpocznij od przemycia płytki testowej IL two receptor alpha i zablokowania jej roztworem blotto w TBS. Po zrekonstytuowaniu standardu, przygotuj ośmiopunktową krzywą wzorcową zgodnie z protokołem producenta.Na kolejną płytkę nanieś 50 µL nierozcieńczonej plazmy oraz 50 µL każdego standardu w dwóch powtórzeniach z płytki źródłowej na płytkę testową ELISA. Następnie inkubuj zamkniętą płytkę w temperaturze pokojowej na rotatorze do płytek ustawionym na 300 RPM. Po dwóch godzinach odzyskaj plazmę z płytki testowej ELISA dla receptora alfa IL-2 i przenieś ją z powrotem na płytkę źródłową z nierozcieńczoną plazmą.Następnie, po przeprowadzeniu testu EIA zgodnie z protokołem producenta, odczytaj gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów. W przypadku testu Reg three alpha Eliza najpierw przenieś 10 µL nierozcieńczonej plazmy na osobną płytkę źródłową z płaskim dnem, a następnie dodaj 90 µL buforu rozcieńczającego dostarczonego przez producenta do każdej studzienki, aby przygotować płytkę źródłową z rozcieńczeniem 1:10. Po zakończeniu testu Reg three alpha Eliza zgodnie z protokołem producenta, dodaj roztwór stopujący do płytki 384-dołkowej i odczytaj gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 620 nanometrów. Po zrekonstytuowaniu i rozcieńczeniu przeciwciał wychwytujących elephant i tn FFR one zgodnie ze specyfikacją producenta, napełnij każdą studzienkę odpowiednich 96-dołkowych płytek typu half-well o wysokim powinowactwie wiązania 50 µL przeciwciał wychwytujących.Następnie inkubować szczelnie zamknięte płytki testowe przez noc w temperaturze pokojowej w przypadku płytki dla słonia oraz w temperaturze 4 °C dla płytki TN FFR. Po zakończeniu testu ELISA dla receptora IL-2 alpha przenieść 60 µL nierozcieńczonej plazmy do nowej płytki źródłowej. Następnie dodać 60 µL 1% BSA w PBS do każdej studzienki, aby przygotować płytkę źródłową z plazmą w rozcieńczeniu 1:2.Następnie należy przemyć i zablokować płytkę testową HGF za pomocą roztworu BLOTTO w TBS, a potem przygotować ośmiopunktową krzywą kalibracyjną z rozwodnień. Po przemyciu płytki i przeprowadzeniu etapu blokowania, na płytkę testową EISA nanieść w dwóch powtórzeniach aliquoty o objętości 50 µL z rozcieńczeń osocza od 1:2 oraz każdego ze standardów. Następnie szczelnie zamkniętą płytkę inkubować przez noc w temperaturze pokojowej na rotatorze do płytek ustawionym na 300 RPM.Następnego ranka odzyskaj osocze rozcieńczone w stosunku 1:2 z płytki testowej HGF ELISA i przelej je z powrotem do płytki źródłowej z osoczem rozcieńczonym 1:2. Po zakończeniu analizy EIA, zgodnie z protokołem producenta, odczytaj gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów w drugim dniu eksperymentu. Najpierw przenieś 10 µL nierozcieńczonego osocza do nowej płytki źródłowej, a następnie dodaj 190 µL 1%BSA w PBS, aby otrzymać 200 µL osocza rozcieńczonego w stosunku 1:20.Następnie, po wykonaniu testu zgodnie z protokołem producenta, Eliza odczytała gęstość optyczną za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów. W przypadku testu TN FFR, Eliza dodała najpierw 25 µL 1% BSA i PBS do płytki źródłowej z rozcieńczeniem 1:20, co dało 125 µL plazmy w rozcieńczeniu 1:25 na każdą studzienkę. Następnie, po przeprowadzeniu testu TN FFR EIA zgodnie z protokołem producenta, odczytano gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów. W przypadku pierwszego transferu I-L-H-E-I-A, przeniesiono 60 µL plazmy w rozcieńczeniu 1:2 do nowej płytki źródłowej, a następnie dodano 180 µL rozcieńczalnika IL eight do każdej studzienki, aby przygotować płytkę źródłową z plazmą w rozcieńczeniu 1:6.Następnie, po wykonaniu testu ELISA dla ILH zgodnie z protokołem producenta, odczytaj gęstość optyczną każdej dołka za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów. Na koniec, gdy wszystkie testy ELISA zostaną zakończone, przelej niewykorzystaną plazmę z powrotem do probówki i zamroź do przyszłego użycia. Na tym wykresie przedstawiono gęstości optyczne dla krzywej wzorcowej siedmiu różnych płytek ELISA mierzących stężenia reg three alpha odpowiadające 1084 pacjentom przebadanym w ramach początkowego raportu dotyczącego biomarkera reg three alpha w chorobie przeszczep przeciw gospodarzowi w obrębie przewodu pokarmowego; spójne gęstości optyczne między płytkami zapewniają powtarzalne pomiary stężenia białka pomiędzy eksperymentami.Stężenia białek w próbkach osocza obliczono poprzez porównanie gęstości optycznych próbek z gęstościami optycznymi krzywej wzorcowej. W celu dalszego zwiększenia powtarzalności, przy jednoczesnym zmniejszeniu objętości wykorzystywanego osocza, można zastosować zrobotyzowaną platformę do obsługi próbek, przeprowadzając analizy ELISA na płytkach mikrotitracyjnych. Podczas planowania tej procedury ważne jest, aby w pierwszej kolejności przeprowadzić analizy EIS na niezyżonym osoczu, tak aby po zakończeniu prac rozwojowych można je było odzyskać i wykorzystać w późniejszych eksperymentach.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny proteomiki do eksploracji potencjalnych biomarkerów w dowolnej interesującej ich chorobie dzięki powszechnemu zastosowaniu sekwencyjnych testów ELISA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat walidacji wielu biomarkerów za pomocą sekwencyjnego ELISA przy jednoczesnym wykorzystaniu niewielkich objętości osocza i minimalizacji cykli wolnych.

high-throughput-sequential-elisa-for-validation-biomarkers-acute

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test ELIS z dużą wydajnością sekwencyjny w celu zweryfikowania biomarkerów ostrej choroby przeszczepu przeciw gospodarzowi

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Ten film demonstruje test do wykrywania alloprzeciwciał HLA przeciwko dawcy u biorców narządów. Matryca peptydowa jest syntetyzowana w celu reprezentowania potencjalnych epitopów do odrzucenia narządu za pośrednictwem przeciwciał. Matryca jest inkubowana z surowicą biorcy, zawierającą alloprzeciwciała, które wiążą się z docelowymi epitopami. Wiązanie przeciwciał wykrywa się za pomocą chemiluminescencji w celu identyfikacji epitopów HLA specyficznych dla donora, które pobudzają reaktywność...

Oparte na macierzy peptydowej wykrywanie alloprzeciwciał HLA przeciwko dawcy u biorców narządów

Nowatorskie generacje testów funkcjonalnych, takich jak interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, które wykrywają produkcję cytokin na poziomie pojedynczej komórki i zapewniają zarówno ilościową, jak i jakościową charakterystykę odpowiedzi limfocytów T, mogą być używane do oceny komórkowych odpowiedzi immunologicznych skierowanych przeciwko wirusowi ospy wietrznej i półpaśca (VZV).

Opracowanie testu ELISpot IFN-γ do oceny odporności komórkowej specyficznej dla wirusa ospy wietrznej i półpaśca po przeszczepieniu krwi pępowinowej

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Niezgodności w sekwencjach ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) między parami dawców i biorców narządów są główną przyczyną odrzucenia przeszczepu narządów za pośrednictwem przeciwciał. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie niestandardowych macierzy antygenowych, które są oparte na sekwencjach HLA poszczególnych dawców, do badania alloprzeciwciał HLA przeciwko dawcom u biorców narządów.

Spersonalizowane macierze peptydowe do wykrywania alloprzeciwciał HLA w przeszczepach narządów

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych i umożliwia powtarzalne mini-endoskopowe oceny dystalnej części jelita grubego in situ pod kątem obecności, cech i ciężkości zapalenia jelita grubego u żywych myszy cierpiących na chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi jelit.

Indukcja choroby przeszczep jelitowy przeciwko gospodarzowi i jej miniendoskopowa ocena u żywych myszy

Tutaj prezentujemy protokół do wywoływania i oceniania choroby w modelu xenoGVHD (xenoGVHD) ksenogenicznej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. xenoGVHD dostarcza model in vivo do badania immunosupresji ludzkich limfocytów T. Dodatkowo opisujemy, jak wykrywać ludzkie limfocyty T w tkankach za pomocą cyfrowego PCR jako narzędzia do ilościowego określania immunosupresji.

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Modelujemy prosty multipleksowany test ECL, który łączy ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Test jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu innych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i autoimmunologicznego zespołu wielogruczołowego 1.

Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych

Zgodnie z pilną potrzebą badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i choroby koronawirusowej 2019, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 6-Plex do jednoczesnego wykrywania wszystkich czterech autoprzeciwciał wysp trzustkowych, autoprzeciwciał transglutaminazy tkankowej oraz przeciwciał przeciwko domenie wiążącej receptor koronawirusa 2 zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej.

Wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19

Testy immunologiczne oparte na krwi pełnej dostarczają łatwego i zasobooszczędnego narzędzia do analizy odporności specyficznej dla antygenu do celów diagnostycznych i badawczych. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół oparty na krwi pełnej z podwójną kostymulacją do kompleksowej analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe, w tym wersję o małej objętości dla pacjentów pediatrycznych i małych zwierząt.

Test krwi pełnej z podwójną kostymulacją do specyficznej dla antygenu analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe

Poznaj wysokoprzepustowy sekwencyjny test ELISA do walidacji biomarkerów ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Ta metoda umożliwia analizę wielu białek z jednej próbki osocza, minimalizując cykle zamrażania i rozmrażania.

Wysokoprzepustowy sekwencyjny test ELISA do walidacji biomarkerów ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi

Przeglądaj więcej filmów