Wysokoprzepustowy sekwencyjny test ELISA do walidacji biomarkerów ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie wysokoprzepustowych sekwencyjnych testów ELISA w celu efektywnej analizy dużej liczby nowych biomarkerów odkrytych metodami proteomiki. Osiąga się to poprzez najpierw naniesienie próbek na płytkę źródłową, która służy do przygotowania rozcieńczeń dla każdego biomarkera oraz do przechowywania odzyskanej plazmy pomiędzy testami. Następnie przeprowadza się testy ELISA dla każdego białka, aby określić ich stężenia w próbkach pacjentów.

W konsekwencji możliwe jest określenie wzrostu poziomu białek tych biomarkerów w momencie wystąpienia objawów klinicznych ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość analizy wielu nowych białek za pomocą analizatorów sekwencyjnych, co nie zawsze jest dostępne na platformach wielopleksowych. Zastosowania tej techniki rozciągają się na diagnostykę ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Ponieważ biomarkery zwalidowane za pomocą tej metody są obecnie badane pod kątem opieki klinicznej, metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat powikłań po poetycznej transplantacji komórek macierzystych. Może ona zostać zastosowana również do odkrywania i walidacji biomarkerów w innych chorobach, takich jak transplantacja płuc, powikłania, rak płuc lub potencjalnie każda choroba, w przypadku której przydatne będzie diagnostyczne badanie krwi.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ ważne jest, aby poszczególne kroki były wykonywane w sposób spójny w celu zapewnienia odtwarzalności i niskiej zmienności między partiami. Dzień przed eksperymentem odwiruj alikwoty osocza przez 10 minut przy 15 300 RCF i 4 °C, aby oddzielić skrzepy na dnie i lipidy na powierzchni od osocza. Następnie nanieś 150 µL nierozcieńczonego osocza z każdej próbki na płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery V za pomocą pipetowania ręcznego zgodnie z wcześniej określonymi mapami. Owiń płytkę Paraformem i umieść ją w komorze dla próbek ludzkich w temperaturze 4 °C na maksymalnie 72 godziny.

Następnie, po rekonstytucji i rozcieńczeniu przeciwciał wychwytujących przeciwko receptorowi alfa interleukiny 2 oraz czynnikowi wzrostu hepatocytów (HGF) zgodnie ze specyfikacją producenta, nanieś 50 µL każdego przeciwciała do odpowiednich dołków 96-dołkowych płytek wysokowiążących (half-well). Następnie zabezpiecz płytki uszczelniaczem i inkubuj je przez noc w temperaturze 4 °C. Teraz rozcieńcz reg 3 alpha w buforze do powlekania producenta zgodnie z protokołem producenta i nanieś 25 µL roztworu do każdego dołka 384-dołkowej płytki no maxor.

Następnie, w pierwszym dniu eksperymentu, przechowuj tę płytkę szczelnie zamkniętą w temperaturze four degrees Celsius. Rozpocznij od przemycia płytki testowej IL two receptor alpha i zablokowania jej roztworem blotto w TBS. Po zrekonstytuowaniu standardu, przygotuj ośmiopunktową krzywą wzorcową zgodnie z protokołem producenta.

Na kolejną płytkę nanieś 50 µL nierozcieńczonej plazmy oraz 50 µL każdego standardu w dwóch powtórzeniach z płytki źródłowej na płytkę testową ELISA. Następnie inkubuj zamkniętą płytkę w temperaturze pokojowej na rotatorze do płytek ustawionym na 300 RPM. Po dwóch godzinach odzyskaj plazmę z płytki testowej ELISA dla receptora alfa IL-2 i przenieś ją z powrotem na płytkę źródłową z nierozcieńczoną plazmą.

Następnie, po przeprowadzeniu testu EIA zgodnie z protokołem producenta, odczytaj gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów. W przypadku testu Reg three alpha Eliza najpierw przenieś 10 µL nierozcieńczonej plazmy na osobną płytkę źródłową z płaskim dnem, a następnie dodaj 90 µL buforu rozcieńczającego dostarczonego przez producenta do każdej studzienki, aby przygotować płytkę źródłową z rozcieńczeniem 1:10. Po zakończeniu testu Reg three alpha Eliza zgodnie z protokołem producenta, dodaj roztwór stopujący do płytki 384-dołkowej i odczytaj gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 620 nanometrów. Po zrekonstytuowaniu i rozcieńczeniu przeciwciał wychwytujących elephant i tn FFR one zgodnie ze specyfikacją producenta, napełnij każdą studzienkę odpowiednich 96-dołkowych płytek typu half-well o wysokim powinowactwie wiązania 50 µL przeciwciał wychwytujących.

Następnie inkubować szczelnie zamknięte płytki testowe przez noc w temperaturze pokojowej w przypadku płytki dla słonia oraz w temperaturze 4 °C dla płytki TN FFR. Po zakończeniu testu ELISA dla receptora IL-2 alpha przenieść 60 µL nierozcieńczonej plazmy do nowej płytki źródłowej. Następnie dodać 60 µL 1% BSA w PBS do każdej studzienki, aby przygotować płytkę źródłową z plazmą w rozcieńczeniu 1:2.

Następnie należy przemyć i zablokować płytkę testową HGF za pomocą roztworu BLOTTO w TBS, a potem przygotować ośmiopunktową krzywą kalibracyjną z rozwodnień. Po przemyciu płytki i przeprowadzeniu etapu blokowania, na płytkę testową EISA nanieść w dwóch powtórzeniach aliquoty o objętości 50 µL z rozcieńczeń osocza od 1:2 oraz każdego ze standardów. Następnie szczelnie zamkniętą płytkę inkubować przez noc w temperaturze pokojowej na rotatorze do płytek ustawionym na 300 RPM.

Następnego ranka odzyskaj osocze rozcieńczone w stosunku 1:2 z płytki testowej HGF ELISA i przelej je z powrotem do płytki źródłowej z osoczem rozcieńczonym 1:2. Po zakończeniu analizy EIA, zgodnie z protokołem producenta, odczytaj gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów w drugim dniu eksperymentu. Najpierw przenieś 10 µL nierozcieńczonego osocza do nowej płytki źródłowej, a następnie dodaj 190 µL 1%BSA w PBS, aby otrzymać 200 µL osocza rozcieńczonego w stosunku 1:20.

Następnie, po wykonaniu testu zgodnie z protokołem producenta, Eliza odczytała gęstość optyczną za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów. W przypadku testu TN FFR, Eliza dodała najpierw 25 µL 1% BSA i PBS do płytki źródłowej z rozcieńczeniem 1:20, co dało 125 µL plazmy w rozcieńczeniu 1:25 na każdą studzienkę. Następnie, po przeprowadzeniu testu TN FFR EIA zgodnie z protokołem producenta, odczytano gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów. W przypadku pierwszego transferu I-L-H-E-I-A, przeniesiono 60 µL plazmy w rozcieńczeniu 1:2 do nowej płytki źródłowej, a następnie dodano 180 µL rozcieńczalnika IL eight do każdej studzienki, aby przygotować płytkę źródłową z plazmą w rozcieńczeniu 1:6.

Następnie, po wykonaniu testu ELISA dla ILH zgodnie z protokołem producenta, odczytaj gęstość optyczną każdej dołka za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów. Na koniec, gdy wszystkie testy ELISA zostaną zakończone, przelej niewykorzystaną plazmę z powrotem do probówki i zamroź do przyszłego użycia. Na tym wykresie przedstawiono gęstości optyczne dla krzywej wzorcowej siedmiu różnych płytek ELISA mierzących stężenia reg three alpha odpowiadające 1084 pacjentom przebadanym w ramach początkowego raportu dotyczącego biomarkera reg three alpha w chorobie przeszczep przeciw gospodarzowi w obrębie przewodu pokarmowego; spójne gęstości optyczne między płytkami zapewniają powtarzalne pomiary stężenia białka pomiędzy eksperymentami.

Stężenia białek w próbkach osocza obliczono poprzez porównanie gęstości optycznych próbek z gęstościami optycznymi krzywej wzorcowej. W celu dalszego zwiększenia powtarzalności, przy jednoczesnym zmniejszeniu objętości wykorzystywanego osocza, można zastosować zrobotyzowaną platformę do obsługi próbek, przeprowadzając analizy ELISA na płytkach mikrotitracyjnych. Podczas planowania tej procedury ważne jest, aby w pierwszej kolejności przeprowadzić analizy EIS na niezyżonym osoczu, tak aby po zakończeniu prac rozwojowych można je było odzyskać i wykorzystać w późniejszych eksperymentach.

Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny proteomiki do eksploracji potencjalnych biomarkerów w dowolnej interesującej ich chorobie dzięki powszechnemu zastosowaniu sekwencyjnych testów ELISA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat walidacji wielu biomarkerów za pomocą sekwencyjnego ELISA przy jednoczesnym wykorzystaniu niewielkich objętości osocza i minimalizacji cykli wolnych.