Wysokoprzepustowy sekwencyjny test ELISA do walidacji biomarkerów ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie wysokoprzepustowego sekwencyjnego systemu Eliza w celu efektywnej analizy dużej liczby nowych biomarkerów, które zostały odkryte przez proteomikę. Osiąga się to poprzez dodanie najpierw próbek do płytki źródłowej, która służy do rozcieńczenia każdego biomarkera i do przechowywania odzyskanego osocza między testami. Następnie Eliza jest uruchamiana dla każdego białka w celu określenia ich stężeń w próbkach pacjentów.

Ostatecznie można ocenić podwyższenie poziomu białka tych biomarkerów na początku objawów klinicznych ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że analizatory sekwencyjne mogą analizować wiele nowych białek, które nie zawsze są dostępne na platformach multipleksowania. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi.

Ponieważ biomarkery zwalidowane tą metodą są obecnie badane pod kątem opieki klinicznej. Chociaż ta metoda może dostarczyć wglądu w powikłania w pourazowym poetyckim przeszczepie komórek macierzystych. Może być również stosowany do odkrywania i walidacji biomarkerów dla innych chorób, takich jak przeszczep płuc, powikłania, rak płuc lub potencjalnie każda choroba, w przypadku której przydatne będzie diagnostyczne badanie krwi.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ ważne jest, aby wiele etapów było wykonywanych konsekwentnie, aby zapewnić odtwarzalność i niską zmienność partii W dniu poprzedzającym eksperyment należy odkręcać próbki osocza przez 10 minut w temperaturze 15, 300 RCF i czterech stopniach Celsjusza, aby oddzielić skrzepy na dole i lipidy na górze od osocza. Następnie rozlać 150 mikrolitrów nierozcieńczonego osocza z każdej próbki na 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery V, pipetując ręcznie zgodnie z wcześniej zdefiniowanymi mapami. Zawiń płytkę w Paraform i umieść ją w komorze dla ludzi w temperaturze czterech stopni Celsjusza na okres do 72 godzin.

Następnie, po odtworzeniu i rozcieńczeniu IL dwa receptory alfa i ludzki czynnik wzrostu lub przeciwciała wychwytujące HGF zgodnie ze specyfikacjami producenta, należy podać 50 mikrolitrów porcji każdego przeciwciała do każdej studzienki z odpowiednich 96-dołkowych płytek półdołkowych o wysokim poziomie wiązania. Następnie uszczelnij te płytki zgrzewarką do płytek i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz rozcieńczyć reg three alpha buforem powlekającym producenta zgodnie z protokołem producenta i rozlać 25 mikrolitrów roztworu do każdej studzienki 3,84 dołka bez płytki maxora.

Następnie przechowuj tę płytkę szczelnie zamkniętą w temperaturze czterech stopni Celsjusza, również pierwszego dnia eksperymentu. Zacznij od umycia płytki testowej IL z dwoma receptorami alfa i zablokowania jej blotto w TBS. Po odtworzeniu normy ustaw ośmiopunktową krzywą standardową zgodnie z protokołem producenta.

Następna płytka, 50 mikrolitrów nierozcieńczonego osocza i 50 mikrolitrów każdego wzorca w dwóch egzemplarzach od płytki źródłowej do płytki testowej ELIZA. Następnie inkubować zapieczętowaną płytkę w temperaturze pokojowej na rotatorze płytkowym ustawionym na 300 obr./min. Po dwóch godzinach odzyskaj osocze z płytki testowej IL z dwoma receptorami alfa ELIZA i umieść je z powrotem na nierozcieńczonej płytce źródłowej osocza.

Następnie, po zakończeniu EIA zgodnie z protokołem producenta, odczytaj gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów dla bogatej trzech alfa Eliza, najpierw przenieś 10 mikrolitrów nierozcieńczonej plazmy na oddzielną dolną płytkę źródłową, a następnie dodaj 90 mikrolitrów buforu rozcieńczającego dostarczonego przez producenta do każdej studzienki, aby utworzyć płytkę źródłową o rozcieńczeniu od jednego do 10. Po zakończeniu Reg three alpha Eliza, zgodnie z protokołem producenta, dodaj roztwór zatrzymujący do płytki 384-dołkowej i odczytaj gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 620 nanometrów. Po rozpuszczeniu i rozcieńczeniu słonia i tn FFR, jedno przeciwciało wychwytujące zgodnie ze specyfikacjami producenta, koduje każde dołek z odpowiednich 96-dołkowych płytek półdołkowych o wysokim poziomie wiązania z 50 mikrolitrami przeciwciał wychwytujących.

Następnie inkubować szczelnie zamknięte płytki testowe przez noc w temperaturze pokojowej dla płytki słonia i w temperaturze czterech stopni Celsjusza dla jednej płytki TN FFR. Po zakończeniu IL dwa receptory alfa Eliza przenoszą 60 mikrolitrów nierozcieńczonego osocza na nową płytkę źródłową. Następnie w 60 mikrolitrach 1% BSA w PBS do każdej studzienki, aby uzyskać jedną do dwóch rozcieńczonych płytek źródłowych osocza.

Następnie umyj i zablokuj płytkę testową HGF za pomocą BLOTTO w TBS, a następnie ustaw ośmiopunktowe rozcieńczenie krzywej standardowej. Po umyciu płytki, podążając za płytką blokującą o pojemności 50 mikrolitrów, powielić podwielokrotności jednej lub dwóch rozcieńczonych dawek osocza i każdego wzorca na płytce testowej EISA. Następnie inkubuj szczelnie zamkniętą płytkę przez noc w temperaturze pokojowej na rotatorze płytkowym ustawionym na 300 obr./min.

Następnego ranka odzyskaj rozcieńczone osocze od jednego do dwóch z płytki testowej HGF Eliza i umieść je z powrotem na jednej do dwóch rozcieńczonych płytek źródłowych osocza. Po zakończeniu EIA, zgodnie z protokołem producenta, odczytaj gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionych na 450 do 570 nanometrów w drugim dniu eksperymentu. Najpierw przenieś 10 mikrolitrów nierozcieńczonego osocza na nową płytkę źródłową, a następnie 190 mikrolitrów 1% BSA w PBS, aby uzyskać 200 mikrolitrów od jednego do 20 rozcieńczonego osocza.

Następnie po ukończeniu słonia Eliza, zgodnie z protokołem producenta, odczytała gęstość optyczną za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów. W przypadku TN FFR Eliza najpierw dodaje 25 mikrolitrów 1% BSA i PBS do jednej do 20 płytki źródłowej, co daje 125 mikrolitrów od jednego do 25 rozcieńczonego osocza na studzienkę. Następnie, po wykonaniu TN FFR jednej EIA zgodnie z protokołem producenta, odczytaj gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów dla pierwszego transferu I-L-H-E-I-A, 60 mikrolitrów jednego do dwóch rozcieńczonych osocza na nową płytkę źródłową, a następnie dodaj 180 mikrolitrów rozcieńczalnika IL osiem rozcieńczalników do każdej studzienki, aby uzyskać od jednego do sześciu rozcieńczonych płytek źródłowych plazmy.

Następnie, po wypełnieniu ILH Eliza zgodnie z protokołem producenta, odczytaj gęstość optyczną każdej studzienki za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 do 570 nanometrów. W końcu, gdy wszystkie Elizy zostaną ukończone, zamień nieużywaną plazmę rozmowy na myśl Eloqua i zamroź do wykorzystania w przyszłości. Na tym wykresie pokazano gęstości optyczne dla krzywej standardowej siedmiu różnych płytek ELIZA mierzących stężenia reg three alfa odpowiadające 1084 pacjentom przebadanym pod kątem początkowego raportu biomarkerów choroby układu pokarmowego reg three alfa przeszczep w stosunku do gospodarza Spójne gęstości optyczne między płytkami zapewniają spójne pomiary stężenia białka między eksperymentami.

Stężenia białek w próbkach osocza obliczono, porównując gęstości optyczne próbki z gęstościami optycznymi krzywej standardowej. Zrobotyzowana platforma manipulacyjna może być wykorzystana do dalszego zwiększenia odtwarzalności, przy jednoczesnym zmniejszeniu objętości plazmy zużywanej przez uruchamianie Elizy i kreatywne płytki dołkowe. Planując tę procedurę, ważne jest, aby najpierw uruchomić EIS, czyli nierozcieńczoną plazmę, aby można ją było odzyskać i wykorzystać w późniejszych eksperymentach po jej opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie proteomiki do zbadania potencjalnych biomarkerów w każdej chorobie będącej przedmiotem zainteresowania dzięki uniwersalnemu zastosowaniu sekwencyjnych Eliza s. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak walidować wiele biomarkerów za pomocą sekwencyjnego E przy użyciu małych objętości osocza i minimalizacji wolnych cykli.