Name: Szybka izolacja żywotnych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjenta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę izolacji żywotnych krążących komórek nowotworowych z krwi pacjenta za pomocą funkcjonalizowanych mikrorurek z E-selektyną. Technika ta umożliwia uzyskanie komórek o wysokiej czystości bez uszkodzeń, wspierając rozwój spersonalizowanych terapii onkologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisana praca była wspierana przez Cornell Center on the Microenvironment &amp; Metastasis w ramach grantu numer U54CA143876 z National Cancer Institute. Treść opracowania jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie musi reprezentować oficjalnych poglądów National Cancer Institute ani National Institutes of Health. Praca ta była dodatkowo częściowo finansowana przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship (A.D.H.).

Poniższy protokół dotyczy wytworzenia pojedynczego urządzenia w formie mikroprobówki.
1. Przygotowanie roztworu nanorurek haloyzytowych
<ol>
	<li>Poddać sonikacji (10-13 W (rms)) 250 μL roztworu nanorurek haloysytowych (6,6% masowych w wodzie) przez 30 s. Schłodzić roztwór zimną wodą i powtórzyć sonikację jednokrotnie. Ponownie schłodzić.</li>
	<li>Naciągnąć sonikowany roztwór do strzykawki, założyć filtr strzykawkowy 0,45 μm i przefiltrować roztwór do czystej probówki do mikrocentryfugi. Od czasu do czasu mieszać roztwór na wortexie, aby zachować jednorodność.</li>
</ol>
2. Powlekanie wewnętrznej powierzchni mikrorurki nanorurkami halloysitu
<ol>
	<li>Przygotować odcinek mikrorurki Micro-Renathane o długości 50 cm (średnica wewnętrzna 300 μm, objętość wewnętrzna 35,3 μL). Jeden koniec mikrorurki odciąć pod skosem i włożyć do małego adaptera IDEX. Igłę strzykawki 3/10 cc 29G włożyć w drugi koniec mikrorurki.</li>
	<li>Aby oczyścić mikrorurkę, zanurzyć jej otwarty koniec (ten z adapterem) w 70% etanolu i pobrać do strzykawki ok. 50 μL etanolu, aby wypełnić mikrorurkę.</li>
	<li>Wypłukać etanol z mikrorurki, pobierając do strzykawki większą objętość wody destylowanej.</li>
	<li>Odłączyć strzykawkę od mikrorurki, opróżnić ją, a następnie ponownie przyłączyć do mikrorurki.</li>
	<li>Przygotować roztwór poli-L-lizyny o stężeniu 0,02% w/v w wodzie. Pobrać 50 μL do mikrorurki i pozostawić na 5 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Pobrać 100 μL przefiltrowanego roztworu nanorurek do mikrorurki i inkubować przez 3 min w RT.</li>
	<li>Przepłukać mikrorurkę, pobierając przez nią 100 μL wody, aby usunąć roztwór nanorurek. Pozostawić powleczoną mikrorurkę wypełnioną wodą na całą noc w RT.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mikroprobówek do izolacji komórek
<ol>
	<li>Przygotować roztwór białka G o stężeniu 10 μg/mL w 1X soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (PBS, pH 7,0 - 7,2). Do mikroprobówki wciągnąć 50 μL PBS, a następnie wciągnąć 50 μL roztworu białka G i inkubować przez 1,5 h w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przygotować w PBS roztwór zawierający 5 μg/mL E-selectin-IgG oraz 50 μg/mL przeciwciał (anty-EpCAM dla większości próbek nowotworowych, anty-PSMA dla próbek raka prostaty). Do mikroprobówki wciągnąć 50 μL roztworu E-selectyny i przeciwciał, a następnie inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Nieswoiste przyleganie komórek blokuje się za pomocą 5% białka mleka. Przygotować roztwór 5% (m/v) białka mleka w PBS. Do mikroprobówki wciągnąć 50 μL roztworu białka mleka i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Do probówki wciągnąć 50 μL PBS i pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) do momentu, aż próbki krwi lub warstwy leukocytarnej (buffy coat) będą gotowe do obróbki.</li>
	<li>Na 10 min przed użyciem mikroprobówki do izolacji, wciągnąć 50 μL PBS nasyconego jonami Ca2+ („PBS+”), aby aktywować cząsteczki selektyny.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbek do izolacji komórek
<ol>
	<li>Pobrać 10 mL krwi pacjenta do probówki z heparyną.</li>
	<li>Do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL wlać 10 mL roztworu do izolacji limfocytów Ficoll-Paque. Ostrożnie nanieść 10 mL pełnej krwi na warstwę Ficollu, aby nie zmieszać krwi z roztworem.</li>
	<li>Wirować przy 2000x g przez 15 min w temperaturze 4 °C z minimalnym hamowaniem.</li>
	<li>Zdjąć warstwę leukocytów (buffy coat) i przenieść do nowej probówki.</li>
	<li>Przemyć warstwę leukocytów buforem PBS (wirować przy 230x g przez 10 min, odrzucić nadsącz).</li>
	<li>Ostrożnie resuspendować komórki w 1 mL buforu do lizy RBC i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT) w celu lizy erytrocytów.</li>
	<li>Dodać 10 mL PBS, delikatnie wymieszać i wirować przy 230x g przez 10 min. Odrzucić nadsącz i ostrożnie resuspendować osad w 3 do 4 mL PBS+.</li>
</ol>
5. Izolacja komórek
<ol>
	<li>Przyczep jeden koniec funkcjonalizowanej mikrorurki do strzykawki 5 mL, używając adapterów IDEX.</li>
	<li>Umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej.</li>
	<li>Zanurz otwarty koniec funkcjonalizowanej mikrorurki w zawiesinie komórkowej.</li>
	<li>Przepuść zawiesinę komórkową przez mikrorurkę z prędkością od 1 do 4 mL/h.</li>
	<li>Przenieś otwarty koniec mikrorurki do probówki zawierającej PBS+ i pobierz 300 μL PBS+ do strzykawki z prędkością 0,016 mL/min, aby usunąć z mikrorurki komórki nieprzywiązane i słabo związane.</li>
	<li>Umieść otwarty koniec mikrorurki w czystej probówce. Odłącz strzykawkę od mikrorurki i podłącz strzykawkę wypełnioną Accutase. Delikatnie przepłucz mikrorurkę wystarczającą ilością Accutase, aby ją wypełnić (~50 μL), i inkubuj w temperaturze RT przez 10 min.</li>
	<li>Podłącz strzykawkę wypełnioną 1 mL pożywki wzrostowej (79% RPMI, 20% FBS, 1% penicyliny i streptomycyny) i przepłucz mikrorurkę, zbierając effluent do płytki wielodołkowej przeznaczonej do hodowli tkanek.</li>
	<li>Hoduj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w warunkach zwiększonej wilgotności.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Celem tej techniki jest wyizolowanie żywych komórek nowotworowych z krwi pacjentów onkologicznych. Istnieje kilka metod identyfikacji komórek nowotworowych w hodowli, co stanowi niezbędną weryfikację skuteczności urządzenia. Wybraliśmy barwienie komórek w hodowli przeciwciałami przeciwko elementom nabłonkowym, takim jak EpCAM (cząsteczka adhezyjna komórek nabłonkowych) lub PSMA (antygen swoisty dla prostaty), a także DAPI w celu zidentyfikowania nienaruszonych jąder komórkowych (Rys. 2 i 3). Liczba komórek nowotworowych wychwyconych za pomocą tej techniki jest bezpośrednią funkcją liczby CTC w próbce wyjściowej, a zmienność między pacjentami może być wysoka. Przetwarzając próbki pobrane od pacjentów z diagnozą nowotworów w stadium IV, rutynowo wychwytujemy od 100 do 500 komórek nowotworowych na probówkę krwi, przy czystości &gt;50%. Bezpośrednio po izolacji może występować większa liczba zanieczyszczających leukocytów. Liczba ta ulegnie jednak zmniejszeniu po inkubacji w pożywce hodowlanej przez okres do 5 dni.
<img alt="Schemat oddziaływania nanorurek z wiązaniem białka G i chimerami E-selektyny w celu adhezji komórkowej." src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat funkcjonalizowanej mikrorurki do izolacji CTC, przedstawiający toczenie zależne od selektyn, a następnie statyczną adhezję zależną od przeciwciał.
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający wychwyt i czystość CTC, porównujący liczbę komórek piersi i płuc na 3,75 mL krwi." src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywne dane dotyczące izolacji CTC z próbek krwi pobranych od pacjenta z rakiem piersi i pacjenta z rakiem płuc. Liczba żywych komórek zidentyfikowanych jako CTC na podstawie barwienia EpCAM jest przedstawiona przez słupki pełne i odnosi się do lewej osi rzędnych; procent komórek zidentyfikowanych jako CTC w stosunku do całkowitej liczby wychwyconych komórek jest przedstawiony przez słupki puste i odczytywany z prawej osi rzędnych. Wyniki uzyskano po pięciu dniach hodowli.
<img alt="Obrazy z mikroskopii immunofluorescencyjnej; markery komórkowe, analiza fluorescencji, skala 50 µm, panel A, B." src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne mikrofotografie od osobnych dawców (A i B) CTC w hodowli 5 dni po izolacji z próbki krwi pacjenta z nowotworem. Komórki zostały zabarwione fluorescencyjnie na EpCAM z użyciem AlexaFluor 488 (zielony) oraz 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w celu wizualizacji jądra (niebieski).

<ol><li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li>
<li>Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHughes%2C+AD+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22">Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology</a>. , (2011).</li>
<li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li>
<li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells%3A+a+new+model+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li>
<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+Building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li>
<li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li>
<li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li>
<li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade%3A+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.</li>
<li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li>
</ol>

M.R.K. jest doradcą naukowym firmy CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).

Często zdarza się, że wczesne etapy odkrywania nowych metod leczenia nowotworów opierają się na liniach komórkowych raka, które wykazują wątpliwe podobieństwo do pierwotnych komórek nowotworowych, lecz są nadal stosowane ze względu na łatwość użycia w laboratorium. Badania nad opracowaniem nowych terapii antynowotworowych zostałyby przyspieszone, gdyby pierwotne ludzkie komórki nowotworowe były wykorzystywane na wczesnych etapach nowatorskich badań. CTC są najłatwiej dostępnym typem komórek nowotworowych ze względu na ich obecność we krwi oraz łatwość wykonania standardowego pobrania krwi. Ponadto krążące komórki nowotworowe stanowią niezbędny etap w procesie przerzutowania5,6, zatem ich znaczenie dla choroby oraz użyteczność w celowaniu w nowe leki są oczywiste. Izolacja CTC z krwi in vitro jest utrudniona przez ich niskie stężenia: rzędu jednej na milion leukocytów lub jednej na miliard erytrocytów7. Większość obecnych metod wykrywania CTC we krwi, w tym jedyna technika zatwierdzona przez FDA, CellSearch(Veridex), uszkadza lub niszczy komórki w procesie detekcji, co wyklucza ich zastosowanie poza samym liczeniem. Opisana powyżej metoda nie narusza żywotności komórek, co tym samym otwiera drogę do przyszłych badań klinicznych nad rakiem. Ponieważ celem tej techniki jest odzyskanie nienaruszonych komórek, niezbędne jest obchodzenie się z nimi z najwyższą ostrożnością, zwłaszcza podczas etapów rozdzielania krwi.
W systemie tym istnieje szereg parametrów regulowanych, które można zmodyfikować w celu zwiększenia wydajności, w zależności od kluczowych cech, takich jak rodzaj nowotworu. W opisanych powyżej etapach zdecydowaliśmy się na użycie EpCAM jako przeciwciała specyficznego dla CTC dla wszystkich typów nowotworów, z wyjątkiem próbek raka prostaty, w których zastosowano anty-PSMA. Dalsze zastępowanie przeciwciał specyficznych dla danego nowotworu może z pewnością pomóc w poprawie wyników u poszczególnych pacjentów. Ponadto można zmieniać stężenia selektyn i przeciwciał, aby zwiększyć efektywność wychwytu8.
Kluczową cechą urządzenia jest wprowadzenie cząsteczek E-selektyny na jego powierzchnię. E-selektyna jest zazwyczaj eksprymowana na powierzchni luminalnej komórek śródbłonka i odpowiada za rekrutację szybko poruszających się leukocytów do miejsc stanu zapalnego. Przepływające leukocyty wiążą się przejściowo z cząsteczkami selektyny, co skutkuje spowolnionym ruchem toczącym, który ułatwia wolniejsze i silniejsze wiązanie komórek z śródbłonkiem za pomocą integryn. Istnieją przekonujące dowody eksperymentalne potwierdzające, że CTC mogą extravasować za pomocą podobnego mechanizmu9,10. Wprowadzenie selektyny pozwala również na pracę urządzenia przy większych przepływach, które w przeciwnym razie uniemożliwiłyby wiązanie komórek z przeciwciałami11. W ten sposób nasze urządzenie fizjologicznie naśladuje żyłę, aby biomimetycznie wychwytywać przepływające CTC bez powodowania uszkodzeń komórkowych.
Poprawę wydajności urządzenia można przypisać naniesieniu powłoki z nanorurek haloysytowych na powierzchnię wewnętrzną urządzenia. Poprzednie badania wykazały, że powłoka z nanorurek składa się z trzech głównych komponentów, które umożliwiają poprawę funkcjonalności. Po pierwsze, powłoka z nanorurek zapewnia zwiększoną powierzchnię, co pozwala na większe osadzanie białek na powierzchni4. Po drugie, podczas przeprowadzania mikroskopii sił atomowych powłoki z nanorurek ustalono, że poszczególne nanorurki wystają z powierzchni w kierunku przepływu. Pozwala to na prezentację cząsteczek selektyny nawet na wysokości jednego mikrona nad powierzchnią, dzięki czemu komórki mogą być wychwytywane i rekrutowane na powierzchnię wcześniej w trakcie ich trajektorii przez rurkę4. Wreszcie powłoka z nanorurek haloysytowych jest w stanie zapobiegać adhezji i rozprzestrzenianiu się leukocytów na powierzchni, co pozwala na ograniczenie liczby leukocytów wychwytywanych wraz z CTC, a tym samym uzyskanie większej późniejszej czystości CTC3.

<table><tbody><tr><td>przewód o średnicy wewnętrznej 300 $\mu$m</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MRE025</td><td></td></tr><tr><td>Większa rurka do połączenia ze strzykawką</td><td>IDEX Health Science</td><td>1507L</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 5 ml do pompy</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Łącznik rurki małej do rurki dużej</td><td>IDEX Health Science</td><td>P-770</td><td></td></tr><tr><td>Podłączenie szerokiej rurki do strzykawki</td><td>IDEX Health Science</td><td>F-120 i P-659</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka do mikroprobówki (strzykawka insulinowa 3/10 cm³ U-100 29G 1/2')</td><td>BD Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>1000449</td><td></td></tr><tr><td>Ficol-Paque Plus</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC (Bufor EL, 1000 ml)</td><td>Qiagen</td><td>1014614</td><td></td></tr><tr><td>Białko G, 5 mg</td><td>CalBiochem (calbiochem.com)</td><td>539303</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko ludzkiemu EpCAM/TROP-1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB960</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PSMA (GCP-04)</td><td>Abcam</td><td>ab66911</td><td></td></tr><tr><td>płytki 96-dołkowe (Microtest 96)</td><td>BD Biosciences</td><td>35-3072</td><td></td></tr><tr><td>Ododtłuszczone mleko w proszku do blokowania w analizie blotting, 300 g</td><td>Bio-Rad</td><td>216005508</td><td></td></tr><tr><td>Nanorurki haloysytowe</td><td>NaturalNano</td><td>NN-HNT200</td><td></td></tr><tr><td>Węglan wapnia, 5 g</td><td>Chemia Aldrich</td><td>481807</td><td></td></tr><tr><td>chimera rhE-Selectiny/Fc, 100 ug</td><td>R&amp;D Systems</td><td>724-ES</td><td></td></tr><tr><td>pożywka RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-095</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lizyna 0,1% m/v w wodzie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator do homogenizacji próbek</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model 100</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biochemicals</td><td>S11056H</td><td></td></tr><tr><td>penicylina streptomycyna</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>P0781</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Krążące komórki nowotworowe (CTC) to komórki, które odrywają się od guza pierwotnego i rozprzestrzeniają w układzie krwionośnym, co w konsekwencji może prowadzić do powstania przerzutów w odległych miejscach. Liczbę CTC można wykorzystać do monitorowania postępu choroby na podstawie korelacji między stężeniem CTC we krwi a stopniem zaawansowania schorzenia1. Jako narzędzie terapeutyczne, CTC mogą być badane w laboratorium w celu opracowania terapii spersonalizowanych. W tym celu izolacja CTC nie może powodować uszkodzeń komórkowych, a zanieczyszczenie innymi typami komórek, zwłaszcza leukocytami, musi być w maksymalnym stopniu ograniczone2. Wiele z obecnych technik, w tym jedyne zatwierdzone przez FDA urządzenie do enumeracji CTC, niszczy komórki CTC w procesie izolacji (szczegółowe informacje znajdują się w Ref. 2). Opisano urządzenie mikrofluidyczne do wychwytywania żywych CTC, składające się z powierzchni funkcjonalizowanej glikoproteiną E-selektyną oraz przeciwciałami przeciwko markerom nabłonkowym3. Aby poprawić wydajność urządzenia, zastosowano powłokę z nanocząsteczek składającą się z nanorurek halloysite, które są krzemianowo-glinowymi nanocząsteczkami pozyskiwanymi z glinki4. Cząsteczki E-selektyny umożliwiają wychwytywanie szybko poruszających się CTC przepompowywanych przez urządzenie, co stanowi przewagę nad alternatywnymi urządzeniami mikrofluidycznymi, w których konieczny jest dłuższy czas przetwarzania, aby zapewnić komórkom docelowym wystarczająco dużo czasu na interakcję z powierzchnią. Przeciwciała przeciwko celom nabłonkowym nadają urządzeniu specyficzność wobec CTC, a także stanowią łatwo regulowany parametr pozwalający dostroić proces izolacji. Wreszcie, powłoka z nanorurek halloysite pozwala na znacznie zwiększoną efektywność izolacji w porównaniu z innymi technikami, pomagając w wychwytywaniu szybko poruszających się komórek, zwiększając powierzchnię adsorpcji białek i odpychając zanieczyszczające leukocyty3,4. Urządzenie to jest produkowane za pomocą prostej techniki z wykorzystaniem ogólnodostępnych materiałów i zostało z sukcesem użyte do wychwytywania komórek nowotworowych z krwi pacjentów z rakiem z przerzutami. Wychwycone komórki są utrzymywane w hodowli do 15 dni po izolacji, a próbki te zazwyczaj składają się w &gt;50% z żywych pierwotnych komórek nowotworowych od każdego pacjenta. Urządzenie to było wykorzystywane do wychwytywania żywych CTC zarówno z rozcieńczonej krwi pełnej, jak i z próbek warstwy leukocytarnej (buffy coat). W rezultacie prezentujemy technikę o funkcjonalności w warunkach klinicznych, służącą do opracowywania spersonalizowanych terapii nowotworowych.

Krążące komórki nowotworowe są izolowane z krwi pacjentów onkologicznych bez powodowania uszkodzeń komórkowych. Izolacja komórek nowotworowych jest realizowana przy użyciu bimolekularnej powierzchni E-selectiny oraz przeciwciał przeciwko markerom nabłonkowym. Powłoka z nanorurek specyficznie wspomaga adhezję komórek rakowych, co skutkuje wysoką czystością wychwytu.

Szybka izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów

Krążące komórki nowotworowe (CTC) to komórki, które oddzielają się od guza pierwotnego i rozprzestrzeniają w obrębie układu krwionośnego, co może w konsekwencji prowadzić do powstania wtórnych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja żywych, krążących komórek nowotworowych z próbek krwi. Należy rozpocząć od przygotowania mikrorurek do izolacji, a następnie wyizolować warstwę leukocytarną (buffy coat) z próbek krwi. W kolejnym kroku warstwę leukocytarną należy przetworzyć za pomocą funkcjonalizowanego urządzenia w postaci mikrorurki.Zebierz wyłapane komórki z mikroprobówki i utrzymaj kulturę, korzystając z urządzenia, które fizjologicznie naśladuje środowisko do biomimetycznego wychwytywania krążących komórek nowotworowych (CTCs) bez powodowania uszkodzeń komórkowych. Technika ta umożliwia zastosowanie w warunkach klinicznych w celu opracowania spersonalizowanych terapii nowotworowych. Głównymi zaletami są prostota metody, wykorzystanie powszechnie dostępnych materiałów oraz odtworzenie naturalnego procesu tkanki stałej zachodzącego w naczyniach krwionośnych.Jestem Mike King, profesor nadzwyczajny inżynierii biomedycznej na Uniwersytecie Cornella, a procedurę zademonstruje Jeff Madison, starszy technik z mojego laboratorium. Poniższy protokół dotyczy produkcji pojedynczego urządzenia w formie mikrorurki; należy poddać sonikacji 250 µL 6,6% roztworu nanorurek Halosite. Przez 30 sekund chłodzić roztwór zimną wodą.Po drugim sonykowaniu pobierz roztwór do strzykawki. Przefiltruj roztwór przez filtr strzykawkowy o porach 0,45 mikrona do czystej probówki typu micro refuse. Okresowo mieszaj roztwór w probówce nanorurek w wortexie.Aby zachować jednorodność, należy przygotować odcinek mikroprzewodu micro rehan o długości 50 centymetrów. Przeciąć wlot mikroprzewodu pod kątem, a następnie włożyć jeden koniec mikroprzewodu do małego adaptera IDEXX i wprowadzić igłę strzykawki do drugiego końca mikroprzewodu. Aby oczyścić mikroprzewód, należy zanurzyć jego otwarty koniec w 70% etanolu i pobrać do strzykawki około 50 mikrolitrów etanolu, tak aby wypełnić mikroprzewód i wypłukać z niego etanol.Naciągnij do strzykawki odpowiednią ilość wody destylowanej. Następnie odłącz strzykawkę od mikroprobówki, opróżnij ją, a potem ponownie podłącz do mikroprobówki. Naciągnij 50 µL roztworu 0,02 w/v.Wprowadź poliol lizynę do mikrorurki i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie pobierz 100 µL przefiltrowanego roztworu nanorurek do mikrorurki i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Aby wypłukać roztwór nanorurek, przepuść 100 µL wody przez mikrorurkę i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej, następnie przepuść 50 µL PBS przez mikrorurkę, a następnie 50 µL roztworu o stężeniu 10 µg/mL.Roztwór białka G inkubować przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do mikroprobówki pobrać 50 µL przeciwciał IgG przeciwko selektynie E w stężeniu 5 µg/mL oraz roztwór przeciwciał w stężeniu 50 µg/mL. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie zablokować niespecyficzne adhezje komórkowe za pomocą 5% białka mleka.Następnie inkubuje się PBS w temperaturze pokojowej, aż próbki krwi lub warstwy leukocytarnej (buffy coat) będą gotowe do przetwarzania, co powinno nastąpić na 10 minut przed użyciem mikroprobówki do izolacji komórek. Pobiera się 50 µL PBS nasyconego wapniem do aktywacji cząsteczek selektyny do probówki heparynowanej. Pobiera się 10 mL próbki krwi od pacjenta w celu izolacji limfocytów.Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml należy wlać 10 ml roztworu fol pack. Następnie delikatnie nanieść na wierzch 10 ml próbki krwi pełnej i wirować przy 2000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C z minimalnym hamowaniem. Następnie warstwę białej krwi (buffy coat) należy przenieść do nowej probówki.Przemyj warstwę leukocytarną (buffy coat) roztworem PBS i odwiruj, aby osadzić erytrocyty. Ostrożnie zawieś osad komórkowy w 1 mL buforu do lizy RBC i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 10 mL.Delikatnie wymieszaj PBS i odwiruj komórki w celu ich osadzenia. Delikatnie resuspenduj komórki w PBS, korzystając z adapterów IDEXX. Podłącz jeden koniec funkcjonalizowanej mikroprobówki do strzykawki o pojemności 5 ml.Umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej i zanurz otwarty koniec funkcjonalizowanej mikrorurki w zawiesinie komórkowej. Przepuść zawiesinę komórkową przez mikrorurkę, aby usunąć komórki niezwiązane i słabo związane. Przenieś otwarty koniec mikrorurki do probówki zawierającej PBS plus.Naciągnij 300 µL PBS plus do strzykawki. Następnie umieść otwarty koniec mikrorurki w czystej probówce. Odłącz strzykawkę od mikrorurki i podłącz strzykawkę zawierającą acuate; delikatnie przemyj mikrorurkę, aby ją wypełnić acuate.Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, podłączyć strzykawkę zawierającą jeden mililiter pożywki wzrostowej, przepłukać mikroprobówkę i zebrać odpływ do odpowiednich płytek hodowlanych w celu dalszej hodowli. Izolowane komórki nowotworowe krążące zostały wyizolowane z próbek krwi pacjenta z rakiem piersi oraz pacjenta z rakiem płuc po pięciu dniach.W hodowli. Preparaty te scharakteryzowano pod kątem wychwytywania CTC na podstawie barwienia na epitelialną cząsteczkę komórkową epican, a czystość wychwytywania jąder obliczono jako procent komórek zidentyfikowanych jako CTC w stosunku do całkowitej liczby wychwyconych komórek. Na obrazie przedstawiono reprezentatywne mikrofotografie CTC wyizolowanych od dawców A i B. Po pięciu dniach hodowli komórki poddano barwieniu fluorescencyjnemu na EPAM z użyciem Alexa Fluor 488.Jądra komórkowe zwizualizowano za pomocą barwienia DPI. Po przeprowadzeniu tej procedury żywe CTC i hodowla mogą zostać wykorzystane do uzyskania informacji specyficznych dla pacjenta, takich jak wrażliwość na leki lub ekspresja markerów komórkowych. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia.

rapid-isolation-viable-circulating-tumor-cells-from-patient-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Szybkie izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów

Ten film opisuje szczegółowy protokół izolowania krążących komórek nowotworowych z próbki krwi pełnej z mysiego modelu guza jelita grubego poddanego eutanazji. Te wyizolowane CTC mogą być hodowane i wykorzystywane do zamierzonej dalszej analizy.

Izolacja CTC z próbki krwi pełnej: metoda uzyskiwania CTC z mysiego modelu raka jelita grubego

Wykazano, że Wykazano, że krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają ważną rolę w przerzutach nowotworowych. W tym miejscu opisano metodę izolacji i namnażania CTC z krwi pełnej syngenicznego modelu guza myszy z przerzutami raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Izolacja i rozmnażanie krążących komórek nowotworowych z mysiego modelu raka

Przedstawiono protokół wykorzystania mikrofiltra pokrytego poli(N-izopropylolakrylamidem) (PIPAAm) do skutecznego wychwytywania i termoresponsywnego uwalniania żywotnych krążących komórek nowotworowych (CTC). Metoda ta umożliwia wychwycenie CTC z krwi pacjenta, a następnie uwolnienie żywego CTC do dalszej hodowli poza chipem, analiz i charakterystyki.

Wychwytywanie i uwalnianie żywotnych krążących komórek nowotworowych z krwi

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Tutaj prezentujemy zintegrowany przepływ pracy w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych, które charakteryzują krążące komórki nowotworowe (CTC). Łączymy barwienie immunologiczne na żywo i mikromanipulację mikromanipulacją pojedynczych i grupowanych CTC z technikami opartymi na pojedynczych komórkach do dalszej analizy i oceny zdolności do wysiewu przerzutów.

Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Hodowla CTC pozwala na głębszą funkcjonalną charakterystykę raka, poprzez badanie specyficznej ekspresji markerów oraz ocenę oporności na leki i zdolności do kolonizacji wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla CTC może być obiecującym narzędziem klinicznym dla medycyny spersonalizowanej w celu poprawy wyników leczenia pacjentów.

Krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych

Ten artykuł opisuje zastosowanie zautomatyzowanego sprzętu do łatwego i efektywnego oddzielania i zbierania substancji, takich jak bezkomórkowe DNA i krążące komórki nowotworowe, z krwi pełnej.

Automatyczne oddzielanie i pobieranie substancji nowotworowych z próbek klinicznych

Kliniczny chip mikroprzepływowy jest ważną techniką analizy biomedycznej, która upraszcza wstępne przetwarzanie próbek krwi pacjenta klinicznego i immunofluorescencyjnie barwi krążące komórki nowotworowe (CTC) in situ na chipie, umożliwiając szybkie wykrycie i identyfikację pojedynczego CTC.

Kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Przedstawiamy protokół ilustrujący izolację rzadkich komórek rakowych z przygotowanej próbki zawierającej pełną krew i wzbogaconą w komórki raka płuca. Protokół wykorzystuje półautomatyczną platformę do izolacji komórek bez znaków. Wzbogacone komórki są następnie analizowane pod kątem mutacji receptora czynnika wzrostu naskórka za pomocą kroplowej cyfrowej PCR.

Profilowanie mutacji DNA receptoray czynnika wzrostu naskórka w rzadkich krążących komórkach z wykorzystaniem systemu izolacji komórek i dropletowej cyfrowej PCR

Poznaj metodę izolacji żywotnych krążących komórek nowotworowych z krwi pacjenta za pomocą funkcjonalizowanych mikrorurek z E-selektyną. Technika ta umożliwia uzyskanie komórek o wysokiej czystości bez uszkodzeń, wspierając rozwój spersonalizowanych terapii onkologicznych.

Szybka izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów

Przeglądaj więcej filmów