Name: Pęcherze skórne wywołane przez autoprzeciwciała zależne od granulocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Poznaj metodę wywoływania pęcherzy skórnych u myszy przez pasywny transfer przeciwciał przeciwko kolagenowi VII. Model ten replikuje fenotyp i cechy histopatologiczne ludzkiej epidermolizy pęcherzowej nabytej, umożliwiając badanie patogenezy chorób autoimmunologicznych skóry.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie w ramach grantów Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 oraz BIOSS z Wydziału Medycznego Uniwersytetu we Fryburgu (dla CS).

1. Przygotowanie przeciwciał patogennych
Uwaga: Oczyszczanie i zagęszczanie przeciwciał należy przeprowadzić tego samego dnia, ponieważ przeciwciał nie powinno się przechowywać przez noc (ON) w 0.1 M glicynie pH 2.5-3 (bufor elucyjny).
Oczyszczanie powinowactwa IgG: należy użyć 25 ml surowicy królika immunizowanego:
<ol>
 <li>Rozmrozić surowicę królika ON w temperaturze 4 °C, wymieszać ją w stosunku 1:1 z 1xPBS (buforem prowadzącym) i odwirować przy 1260 x g przez 10 min w temperaturze 20 °C. Opcjonalnie, w przypadku tłustej surowicy, po wirowaniu można przeprowadzić etap filtrowania za pomocą papieru filtrującego.</li>
 <li>W międzyczasie przemyć kolumnę wypełnioną macierzą białka G 10 objętościami złoża (objętość złoża = objętość macierzy) 1XPBS (buforem prowadzącym).</li>
 <li>Nanieść rozcieńczoną i przefiltrowaną surowicę na kolumnę i inkubować przez 1 hr na platformie kołyszącej w temperaturze pokojowej (RT).</li>
 <li>Zebrać frakcję przepływową (FT) do probówki Falcon 50 ml. Nie utylizować jej do czasu ustalenia stężenia i miana oczyszczonego IgG.</li>
 <li>Przemyć macierz 5 objętościami złoża 1XPBS, a w międzyczasie przygotować probówki Falcon 50 ml do zbierania frakcji eluentu IgG. Do każdej probówki pipetować 1 ml buforu neutralizującego pH: 1 M TRIS pH 10 (lub zachować proporcję 1:20 buforu TRIS w stosunku do ilości zbieranego eluatego).</li>
 <li>Nanieść na kolumnę 100-150 ml buforu elucyjnego: 0,1 M glicyny pH 2,5-3 i zbierać frakcje po 50 ml. Odwrócić probówkę 2-3x, zmierzyć pH i dodawać bufor neutralizujący do osiągnięcia pH 7,2-7,4.</li>
 <li>Pobrać kilka kropli eluatego IgG i, używając buforu elucyjnego jako wzorca, zmierzyć OD przy 280 nm. Jeśli OD wynosi &lt;0,1, przerwać zbieranie.</li>
 <li>Zregenerować macierz białka G i przechowywać ją zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
Koncentracja poprzez ultrafiltrację z użyciem probówek Amicon:
<ol>
 <li>Przemyj probówki do ultrafiltracji Amicon Ultra (15 ml /30KDa) roztworem 1XPBS, wirując przez 15-20 min przy 3,220 x g w temperaturze 4 °C. Odlej filtrat (FT) z Amicona.</li>
 <li>Napełnij probówki Amicon 15 ml elowanej frakcji IgG i wiruj przez 25-30 min przy 3,220 x g i 4 °C; czas wirowania zawsze zależy od zawartości białka w elucie.</li>
 <li>Odlej filtrat (FT) i powtarzaj ultrafiltrację, aż do całkowitego wykorzystania elowanej frakcji.</li>
 <li>Dokładnie przemyj skoncentrowane IgG dwukrotnie roztworem 1XPBS przez 25-30 min poprzez wirowanie.</li>
 <li>Zbierz „lepki”, żółtawy roztwór przeciwciał z filtra Amicon do końcowej objętości 1,500-2,000 μl roztworu 1XPBS.</li>
 <li>Zmierz stężenie preparatu IgG przy użyciu spektrofotometru lub NanoDrop: 
 Stężenie (mg/ml) = A(280 nm) x czynnik rozcieńczenia /1,4 </li>
 <li>Umyj i przechowuj probówki Amicon zgodnie z instrukcjami producenta. </li>
</ol>
2. Wstrzykiwanie myszom swoistych dla kolagenu VII przeciwciał IgG
Przed rozpoczęciem właściwej procedury eksperymentalnej należy upewnić się, że protokół doświadczalny został spisany, a wszystkie materiały niezbędne do przeprowadzenia eksperymentu są przygotowane.
<ol>
 <li>Przygotować arkusze danych do oceny stopnia zaawansowania choroby, testów ELISA, analizy immunofluorescencyjnej (IF) oraz oznaczenia mieloperoksydazy (MPO) 4.</li>
 <li>Oznakować probówki na krew i organy, formy do mrożenia (cryomolds) oraz kasety do obróbki histologicznej i zatapiania w parafinie.</li>
 <li>Roztwory przeciwciał należy przygotować na świeżo lub rozmrozić z zapasów i scharakteryzować pod kątem reaktywności (miano w mikroskopii IF i/lub testach ELISA). Sterylnie przefiltrowany roztwór przeciwciał należy rozcieńczyć w PBS w taki sposób, aby wymagana dawka do wstrzyknięcia mieściła się w zakresie 250-1000 μl. Należy upewnić się, że dysponuje się wystarczającą ilością IgG do przeprowadzenia całego eksperymentu.</li>
 <li>Przygotować świeży antykoagulant: heparynę 20 U/ml oraz mieszaninę ketaminy 8,7 mg/ml i ksylazyny 1,3 mg/ml do znieczulenia. Na czas uśmiercania myszy należy przygotować oznakowane probówki z 3,7% formaldehydem.</li>
 <li>Zesterylizować narzędzia chirurgiczne (skalpel, nożyczki, pęsety z ostrym końcem i zakrzywione) oraz przygotować strzykawki (strzykawki insulinowe, strzykawki 1 i 2 ml), igły, aparat cyfrowy i dodatkową kartę pamięci.</li>
</ol>
Uwaga: Wszystkie procedury należy przeprowadzać na myszach z narkozą ketaminą/ksylazyną lub izofluranem. Izofluran jest preferowaną opcją znieczulenia podczas codziennych kontroli skóry, ponieważ myszy szybko się budzą. Jednakże podczas robienia zdjęć zazwyczaj wstrzykuje się podskórnie 87 mg/kg ketaminy i 13 mg/kg ksylazyny. W przypadku eutanazji dawkę ketaminy/ksylazyny zwiększa się do 130 mg/kg ketaminy i 20 mg/kg ksylazyny.
<ol>
 <li>Oceń ogólny stan zdrowia, wygląd skóry i futra wcześniej oznakowanych zwierząt, zważ je i zmierz grubość ucha (zawsze wykonuj pomiar w tym samym uchu). </li>
 <li>Zarejestruj zaobserwowane wartości i zmiany w arkuszu oceny klinicznej. </li>
 <li>Pobierz 20-30 μl (2-3 krople) krwi z żyły ogonowej do strzykawki zawierającej taką samą objętość antykoagulanta. </li>
 <li>Zdezynfekuj futro i skórę, używając 80% etanolu.</li>
 <li>Wstrzyknij podskórnie w okolice grzbietu roztwór przeciwciał, używając strzykawki insulinowej. (W przypadku niektórych miejsc (np. uszu) możliwe jest wstrzyknięcie jedynie niewielkich objętości (10-50 μl).) </li>
</ol>
Iniekcje należy powtarzać co drugi dzień, łącznie 4 razy. U myszy Balb/c i C57BL6 o masie ciała około 20 g choroba zaczyna się rozwijać 3-4 dni po pierwszym podaniu autoprzeciwciał w dawce od 400-500 do 750 μg/g masy ciała na iniekcję.

Po zakończeniu eksperymentu:
<ol>
 <li>Wprowadź myszy w stan głębokiej narkozy, wstrzykując podskórnie ketaminę/ksylazynę w dawkach 130 mg/kg i 20 mg/kg, upuść krew z tylnej żyły głównej i wyciнь serce.</li>
 <li>Pobierz próbki narządów/tkanek, takich jak skóra: ogon, ucho, krew oraz przełyk, i umieść je w wcześniej oznakowanych probówkach wypełnionych PBS lub 3,7% formaldehydem.</li>
</ol>
Po powrocie do laboratorium:
<ol>
 <li>Wirować krew przy 1,200 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT) w celu oddzielenia osocza, następnie przenieść osocze do odpowiednio oznakowanych probówek i przechowywać zgodnie z procedurą.</li>
 <li>Zatopić biopsjat skóry w medium OCT (Optimal Cutting Temperature) przy użyciu form do mrożenia, odpowiednio oznakować i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
 <li>Przenieść próbki tkankowe przeznaczone do badania histologicznego do oznakowanych form do zatapiania i przechowywać w 3,7% formaldehydzie do czasu zatopienia w parafinie.</li>
</ol>
3. Kliniczna ocena ciężkości choroby
Myszy należy codziennie badać pod kątem wystąpienia zmian skórnych i błon śluzowych, a wyniki należy rejestrować w odpowiednich formularzach. Kryteriami wczesnej eutanazji są zmiany skórne obejmujące ponad 20% powierzchni ciała oraz utrata masy ciała rzędu 5-10% całkowitej masy ciała w ciągu trzech kolejnych dni, co odpowiada wynikowi punktacji choroby wynoszącemu 5 (Tabela 1).
<ol>
 <li>Połóż mysz na brzuchu. Rozpocznij od obszaru głowy, a konkretnie od prawego ucha, sprawdzając występowanie pęcherzy, nadżerek oraz strupów po stronie wewnętrznej i zewnętrznej. Postąp w ten sam sposób z lewym uchem. </li>
 <li>Oko prawe i lewe należy zbadać pod kątem obecności rumienia, łysienia, nadżerek i/lub strupów. </li>
 <li>Następnie należy przejrzeć sierść w obszarze czoła i pyszczka, kontynuując badanie w części brzusznej pyszczka, wargach oraz błonie śluzowej jamy ustnej. </li>
 <li>Zbadaj prawą przednią kończynę, zaczynając od łapy i przesuwając się ku górze; następnie powtórz czynność dla lewej przedniej kończyny. Zastosuj tę samą procedurę w przypadku prawych i lewych kończyn tylnych. </li>
 <li>Przejrzyj sierść w obszarze szyi i grzbietu, używając zakrzywionej pęsety z cienkim czubkiem. </li>
 <li>Połóż mysz na grzbiecie i w ten sam sposób sprawdź część brzuszną oraz strony brzuszne kończyn. </li>
 <li>Sprawdź ogon. </li>
 <li>Wykonaj zdjęcia odpowiednich części ciała, w których u myszy rozwinęła się choroba. Należy zwrócić uwagę na jakość i liczbę zdjęć. </li>
 <li>Oblicz kliniczne wskaźniki nasilenia choroby. </li>
</ol>
4. Analiza próbek skóry i osocza
<ol>
 <li>Przygotować, przechowywać i/lub przetworzyć wszystkie pobrane tkanki zgodnie z planem. </li>
 <li>Wyciąć skrawki zamrożonej tkanki do detekcji przeciwciał króliczych i komponentów układu dopełniacza mysiego metodą IF.</li>
 <li>Przeanalizować zawartość różnych białek i enzymów (test MPO) w zamrożonej tkance i/lub ekstraktach z organów.</li>
 <li>Wyciąć skrawki tkanki zatopionej w parafinie i zabarwić metodą H&amp;E w celu wizualizacji zakresu uszkodzeń tkanki. </li>
 <li>Przeanalizować osocze metodą ELISA oraz immunoblottingu. </li>
</ol>

<ol><li>Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dermal-epidermal+separation+in+mice+by+passive+transfer+of+antibodies+specific+to+type+VII+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen.</a> J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).</li>
<li>Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+Flii+gene+increases+dermal-epidermal+blistering+in+an+autoimmune+ColVII+mouse+model+of+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 225, 401-413 (2011).</li>
<li>Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K%CE%B2+plays+a+critical+role+in+neutrophil+activation+by+immune+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes.</a> Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).</li>
<li>Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+is+required+for+neutrophil-dependent+autoantibody-induced+tissue+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage.</a> J. Pathol. 212, 56-65 (2007).</li>
<li>Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+pathway+of+complement+activation+is+critical+for+blister+induction+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).</li>
<li>Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Fc+receptor+deficiency+protects+from+tissue+injury+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).</li>
<li>Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+responses+induce+humorally+mediated+injury+in+experimental+anti-glomerular+basement+membrane+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).</li>
<li>Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthritis+provoked+by+linked+T+and+B+cell+recognition+of+a+glycolytic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme.</a> Science. 286, 1732-1735 (1999).</li>
<li>Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flavonoid+luteolin+inhibits+Fc%CE%B3-dependent+respiratory+burst+in+granulocytes%2C+but+not+skin+blistering+in+a+new+model+of+pemphigoid+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice.</a> PLoS One. 7, e31066(2012).</li>
<li>Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+passive+transfer+model+of+the+organ-specific+autoimmune+disease%2C+bullous+pemphigoid%2C+using+antibodies+generated+against+the+hemidesmosomal+antigen%2C+BP180%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180.</a> J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).</li>
<li>Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pemphigus+in+neonatal+mice+by+passive+transfer+of+IgG+from+patients+with+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease.</a> N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).</li>
<li>Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myasthenia+gravis%3A+passive+transfer+from+man+to+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse.</a> Science. 190, 397-399 (1975).</li>
<li>Rose, N. R., Bona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+criteria+for+autoimmune+diseases+%28Witebsky%27s+postulates+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Today%22%5BJournal%5D)">Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited.</a> Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).</li>
<li>Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita.</a> Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).</li>
<li>Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+type+VII+collagen+mediate+Fcgamma-dependent+neutrophil+activation+and+induce+dermal-epidermal+separation+in+cryosections+of+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin.</a> Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).</li>
<li>Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+human+pemphigoid+autoantibodies+do+not+trigger+disease+by+the+passive+transfer+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice.</a> Immunol. Lett. , (2012).</li>
<li>Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody-induced+intestinal+inflammation+and+weight+loss+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 224, 234-244 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Pasywny transfer autoprzeciwciał do zwierząt doświadczalnych jest główną metodą wykazania ich patogenności 7, -12. Modele zwierzęce uzyskane tą metodą, poza tym że stanowią pośredni dowód autoimmunizacji 13, umożliwiają badanie fazy eferentnej mechanizmu patogennego. Model pasywnego transferu przeciwciał indukujących zależne od granulocytów pęcherze skórne w nabytej błonistych skórze (EBA) został wykorzystany do analizy mechanizmów uszkodzenia tkanek w autoimmunologicznych dermatozach. Okazał się on...

<table><tbody><tr><td>antygen rekombinowany </td><td></td><td></td><td>Plazmidy kodujące rekombinowane formy mysiego kolagenu VII są dostępne u autora korespondencyjnego. </td></tr><tr><td>immunizowane surowica królicza</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.eurogentec.com/&quot; target=&quot;_blank">www.eurogentec.com&lt;/a&gt;</td><td></td><td>Królikach nowozelandzkich białych przeprowadzono immunizację dawką 200 &amp;mu;g antygenu, 3 razy w odstępach 2-tygodniowych. W tym celu wykorzystano usługi firmy Eurogentec S.A., Belgia.</td></tr><tr><td>Agaroza z Proteiną G</td><td>Roche Applied Science</td><td>11243233001</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Balb/c</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Związek OCT, Tissue-Tek</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>OCT, optymalna temperatura cięcia</td></tr><tr><td>Krioforemka standardowa</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td>25 mm &amp;#215; 20 mm &amp;#215; 5 mm</td></tr><tr><td>Krioforemka pośrednia</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td>15 mm &amp;#215; 15 mm &amp;#215; 5 mm</td></tr><tr><td>Uni-Link-Einbettkassette</td><td>R. Langenbrinck</td><td>09-0503</td><td>Kasety do przetwarzania i zatapiania histologicznego</td></tr><tr><td>Spezial-Tatowierfarbe Schwarz</td><td>H. Hauptnerund Richard Herberholz GmbH Co. KG</td><td>71492000</td><td>pasta do tatuażu</td></tr><tr><td>Tatowierzange TZ1</td><td>EBECO E. Becker Co GmbH</td><td></td><td>urządzenie do tatuażu</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Carl Roth GmbH Co.</td><td>7692.1</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37%</td><td>Carl Roth GmbH Co.</td><td>7386</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>K2753-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ksylazyny</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>sterylny PBS</td><td>Biochrom</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>aparat cyfrowy</td><td>Nikon</td><td>Coolpix 5400</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa jednostka filtrująca z nakładką na strzykawkę 0,45 &amp;mu;m</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suwmiarka </td><td>Mitutoyo 7309</td><td>1667338</td><td>Farnell (dystrybutor)</td></tr><tr><td>arkusz oceny choroby</td><td></td><td></td><td>dołączono przykład </td></tr></tbody></table>

granulocytozależne pęcherzowanie skóry indukowane autoprzeciwciałami

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Zjawiska autoimmunologiczne występują u zdrowych osób, jednak w przypadku utraty autotolerancji odpowiedź autoimmunologiczna może prowadzić do specyficznej patologii. Zgodnie z postulatami Witebsky'ego, jednym z kryteriów rozpoznania choroby jako autoimmunologicznej jest odtworzenie tej choroby u zwierząt eksperymentalnych poprzez pasywny transfer autoprzeciwciał. W przypadku nabytej skórnej vollernejy (epidermolysis bullosa acquisita, EBA), prototypowej narządowo swoistej choroby autoimmunologicznej skóry i błon śluzowych, opracowano niedawno kilka modeli eksperymentalnych. W modelu zwierzęcym opisanym w niniejszej pracy, oczyszczone przeciwciała IgG przeciwko fragmentowi 200 aminokwasów (aa 757-967) kolagenu VII są wielokrotnie wstrzykiwane myszom, co odtwarza fenotyp pęcherzykowy oraz cechy histopatologiczne i immunopatologiczne charakterystyczne dla ludzkiej EBA 1. Pełnoobjawowa, rozsiana choroba jest zazwyczaj widoczna 5-6 dni po pierwszym wstrzyknięciu, a zakres zmian koreluje z dawką podanego IgG swoistego dla kolagenu VII. Uszkodzenie tkanek (powstawanie pęcherzy) w eksperymentalnej EBA zależy od rekrutacji i aktywacji granulocytów przez związane z tkanką autoprzeciwciała 2,-4. W związku z tym model ten pozwala na analizę zależnej od granulocytów ścieżki zapalnej uczestniczącej w autoimmunologicznym uszkodzeniu tkanek, ponieważ odtwarza on jedynie fazę niezależną od limfocytów T w eferentnej odpowiedzi autoimmunologicznej. Co więcej, jego wartość podkreśla szereg badań wykazujących potencjał autoprzeciwciał do indukowania pęcherzy in vivo oraz badających mechanizm powstawania pęcherzy w EBA 1,3,-6. Wreszcie, model ten znacznie ułatwi opracowanie nowych terapii przeciwzapalnych w chorobach indukowanych przez autoprzeciwciała. Ogólnie rzecz biorąc, zwierzęcy model pasywnego transferu EBA jest dostępnym i pouczającym modelem choroby, który pomoże badaczom analizować nie tylko patogenezę EBA, ale także odpowiadać na fundamentalne, biologicznie i klinicznie istotne pytania dotyczące autoimmunizacji.

Pasywny transfer przeciwciał specyficznych dla antygenu prowadzi do pełnoobjawowej choroby u myszy, która na poziomie klinicznym, histologicznym i immunopatologicznym przypomina ludzkie EBA. Na uszach, pyszczku, łapach, nogach, grzbiecie i wokół oczu myszy rozwijają się pęcherze, strupy, nadżerki oraz łysienie. Pierwsze objawy kliniczne choroby pojawią się najprawdopodobniej na uszach i/lub w obszarze głowy. Za pomocą bezpośredniej IF w krioskrawkach skóry okołoziebiowej wykrywane jest odkładanie się specyficznego IgG kr...

W modelu zwierzęcym opisanym w niniejszej pracy, oczyszczone przeciwciała IgG przeciwko fragmentowi 200 aminokwasów (aa 757-967) kolagenu VII są wielokrotnie wstrzykiwane myszom, co pozwala na odtworzenie fenotypu pęcherzowego oraz cech histopatologicznych i immunopatologicznych charakterystycznych dla ludzkiego nabytego prątka pęcherzowego (EBA)1.

Granulocytozależne pęcherzowanie skóry indukowane autoprzeciwciałami

Zjawiska autoimmunologiczne występują u zdrowych osób, jednak w przypadku utraty autotolerancji odpowiedź autoimmunologiczna może prowadzić do powstania konkretnych patologii. Zgodnie z...

Nazywam się Cassian RO i reprezentuję Katedrę Dermatologii Uniwersytetu Fryberga w Niemczech. Badania prowadzone w naszym laboratorium koncentrują się na patogenezie autoimmunologicznych chorób skóry. Jedną z interesujących nas chorób autoimmunologicznych jest Epidermolysis QUISTA lub EBAA, która jest organospecyficzną chorobą autoimmunologiczną o dobrze zdefiniowanym systemie antygen-autoprzeciwciało, a dla której dostępne są wzajemnie uzupełniające się modele exvivo oraz modele zwierzęce.Powstawanie pęcherzy w przebiegu EBA można odtworzyć poprzez pasywną transferację przeciwciał przeciwko kolagenowi typu siedem do myszy. W związku z tym w niniejszym artykule wideo przedstawimy indukcję i analizę pęcherzowania skóry u myszy poprzez pasywny transfer przeciwciał specyficznych dla kolagenu siedem. Cześć, jestem King OBA z Grupy CAS w Katedrze Dermatologii w Szpitalu Uniwersyteckim we Frebergu.W tym filmie zademonstrujemy, w jaki sposób indukuje się eksperymentalny model mysi EBA poprzez pasywny transfer patogennych autoprzeciwciał. Procedury tej używamy podczas badania potencjalnych mechanizmów patogenicznych w autoimmunologicznych schorzeniach skóry lub podczas poszukiwania epitopów patogennych. Przy tworzeniu modelu pasywnego transferu dla EBA należy wykonać kilka dodatkowych kroków przed wstrzyknięciem autoprzeciwciał myszom typu dzikiego.W pierwszym kroku białe króliki są poddawane podskórnym iniekcjom oczyszczonego antygenu rekombinowanego. Całkowite IgG z surowicy króliczej jest izolowane za pomocą chromatografii powinowactwa na kolumnie, a następnie wstrzykiwane myszom typu dzikiego. Iniekcje są podawane podskórnie co drugi dzień, łącznie cztery razy, a krew jest pobierana w odstępach dwudniowych.Myszom codziennie przeprowadza się badanie ogólnego stanu zdrowia oraz poszukuje oznak zmian skórnych. W trakcie eksperymentu dla każdej jednostki oblicza się oceny kliniczne odzwierciedlające aktywność choroby; dwa tygodnie po pierwszej iniekcji zwierzęta są uśmiercane, a pobrane próbki surowicy oraz biopsje skóry poddawane są dalszej analizie. Po czasie inkubacji kolumnę umieszcza się w statywie z pionowym wsparciem, otwiera dół, a następnie opukuje i zbiera przefiltrowany roztwór.W probówkach typu Falcon o pojemności 50 ml należy zachować frakcję przepływową aż do uzyskania potwierdzenia w analizie immunofluorescencyjnej, że jest to koncentrat wolny od swoistych przeciwciał; rozcieńczone IgG należy zagęścić metodą ultrafiltracji w specjalnych probówkach Amicon przy 3 220 ×g przez 30 minut w temperaturze 4°C. Proces zagęszczania polega na przepuszczeniu eluatu przez filtr, odrzuceniu frakcji przepływowej, ponownym napełnieniu probówki i powtarzaniu tej czynności do momentu całkowitego zużycia eluatu. W ostatnim kroku należy przemyć próbkę 1× PBS, zebrać żółtawy, lepki koncentrat IgG, zmierzyć jego stężenie i przechowywać go w odpowiednio oznakowanych probówkach.Przed rozpoczęciem właściwego wstrzykiwania autoprzeciwciał należy ocenić ich swoistość oraz miano za pomocą pośredniej immunofluorescencji. Próbki kriosiekcji normalnej skóry mysiej należy inkubować z seryjnymi rozcieńczeniami stężonego preparatu IgG i zwizualizować ich depozycję za pomocą odpowiednio dobranej przeciwciała wtórnego, dokumentując wyniki poprzez wykonanie zdjęć przed udaniem się do animalarium. Należy upewnić się, że protokół dotyczący zwierząt został opracowany, a wszystkie materiały są przygotowane.Arkusze danych do klinicznej oceny aktywności choroby, probówki z etykietami na próbki krwi i tkanek. Roztwór przeciwciał rozcieńczony w taki sposób, aby można było wstrzyknąć odpowiednią objętość. Świeży antykoagulant i środek znieczulający oraz wysterylizowane narzędzia chirurgiczne i strzykawki.Na liście kontrolnej powinny znaleźć się również suwmiarka i aparat cyfrowy. Po oczyszczeniu powierzchni roboczej i przygotowaniu instalacji izofluranu, należy zheparynować strzykawkę do pobierania krwi oraz napełnić strzykawkę insulinową roztworem przeciwciał. Wyjmij mysz z klatki, sprawdź jej numer identyfikacyjny i zważ ją.Wszystkie zmierzone i zaobserwowane dane należy wpisać do karty danych osobowych i oceny klinicznej myszy. Gdy mysz znajduje się już w stanie ssis, należy zmierzyć grubość ucha, a następnie ocenić wygląd skóry i futra zwierzęcia. Szczególną uwagę należy zwrócić na okolicę głowy, grzbiet, brzuch oraz kończyny.Pobrać krew z żyły ogonowej poprzez niewielkie nacięcie wykonane w jej górnej jednej trzeciej; zdezynfekować futro, a następnie, unosząc skórę na grzbiecie, ostrożnie wstrzyknąć roztwór IgG podskórnie. Po powrocie do laboratorium wirować krew przez 10 minut przy 1 200 ×g w temperaturze pokojowej w celu uzyskania surowicy. Przenieść próbkę do odpowiednio oznakowanych probówek i przechowywać je zgodnie z planem.Codziennie badaj myszy pod kątem objawów choroby, gdy zaczną rozwijać rumień, łysienie i zmiany skórne. Oprócz pomiaru masy ciała, oceń aktywność choroby. Wstrzyknij podskórnie mieszaninę ketaminy i ksylazyny, aby wprowadzić mysz w stan znieczulenia ogólnego.Zmierz grubość małżowiny usznej, a następnie rozpocznij ogólną kontrolę ciała. Użyj zakrzywionych pęset z cienkim czubkiem, aby rozczesać futro w kierunku przeciwnym do jego wzrostu, w celu odsłonięcia ewentualnych zmian chorobowych. Przesuwaj się sukcesywnie wokół pyska.Przesunąć pysk w kierunku zewnętrznej i wewnętrznej części ucha, a następnie sprawdzić również drugą stronę głowy. Kontynuować badanie błony śluzowej jamy ustnej, brzusznej części pyska oraz obszaru brzucha. Następnie zbadać obszary grzbietowo-boczne, grzbietowe i szyjne, a także kończyny przednie i dłonie.Ilościowo określ zakres zmian chorobowych w dokumentacji, wpisując wyniki do formularza na podstawie powierzchni zajętej skóry, procentowego udziału określonych części i obszarów ciała w porównaniu do całkowitej powierzchni skóry myszy. Wynik kliniczny choroby oblicza się na podstawie całkowitej zajętej powierzchni skóry i błon śluzowych. Na koniec wykonaj zdjęcia odpowiednich części ciała oraz obszarów objętych zmianami.Po zakończeniu eksperymentu uśmierć zwierzęta pod głęboką narkozą, a następnie pobierz krew oraz próbki tkanek. W tym układzie eksperymentalnym najczęściej pobiera się uszy, ogon i przełyk. Biopsaty skóry z obszarów zmian przetnij na mniejsze paski.Umieść je w kasetkach do przetwarzania histologicznego i zatapiania, a następnie przechowuj w 3,7% formaldehydzie do czasu zatopienia w parafinie. Następnie przygotuj próbki do barwienia H&amp;E oraz analizy immunofluorescencyjnej. Zatop paski skóry perła w medium OCT (Optimal Cutting Temperature) i za pomocą kriostatu wykonaj przekroje o grubości 6 µm.Przeprowadź analizę bezpośredniej immunofluorescencji, aby zwizualizować związane z tkanką specyficzne przeciwciała królicze oraz komponenty dopełniacza mysiego, a jako dodatkowy test wykonaj analizę ELISA z użyciem płytek mikrotitracyjnych pokrytych antygenem rekombinowanym oraz seryjnymi rozcieńczeniami surowicy mysiej w celu pomiaru poziomu krążących autoprzeciwciał. Pasywny transfer przeciwciał specyficznych dla kolagenu VII prowadzi u myszy do pełnoobjawowej choroby, która na poziomie klinicznym, histologicznym i immunopatologicznym przypomina ludzkie EBA. Pęcherze, strupy, nadżerki i łysienie charakterystyczne dla ludzkiego EBA rozwijają się u myszy na uszach, wokół oczu, na pysku, łapach, nogach oraz na grzbiecie.Aktywność choroby, która wykazuje tendencję wzrostową w trakcie całego eksperymentu, jest obliczana na podstawie powierzchni zajętej skóry i błony śluzowej. Reprezentatywne wyniki przedstawiające odkładanie specyficznego króliczego IgG i mysiego dopełniacza C3 wykrytego za pomocą pośredniej immunofluorescencji w połączeniu skórno-naskórkowym. Przedstawiono je tutaj na skrawkach mrożonych skóry peral.W grupach kontrolnych nie wykryto IgG ani dopełniacza C3. Następująca analiza histologiczna skóry z obszarów zmian ujawniła pęcherze podnaskórkowe oraz naciek zapalny. Jednakże, w przypadku przeprowadzenia badania w grupie kontrolnej, nie zaobserwowano tworzenia się pęcherzy podnaskórkowych.Jak pokazano tutaj, model autoprzeciwciał indukujących pęcherze podepidermalne znacząco ułatwi analizę zależnych od ROY szlaków zapalnych wywoływanych przez autoprzeciwciała, prowadzących do uszkodzenia tkanek. Jego solidna konstrukcja oraz prosty protokół sprawiają, że nadaje się on również do opracowywania i testowania nowych terapii przeciwzapalnych w chorobach indukowanych przez autoprzeciwciała.

granulocyte-dependent-autoantibody-induced-skin-blistering

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przewlekła choroba przewlekła z otoczenia krwinek granulocytów

Opryszczkowe zapalenie skóry (DH) jest przewlekłym stanem zapalnym charakteryzującym się reakcją autoimmunologiczną między IgA a transglutaminazą epidermalną (eTG). DH rozwija się u niewielkiej części pacjentów z nadwrażliwością na gluten i/lub celiakią. Wyniki niniejszego badania wskazują, że DH może rozwijać się również u małpy z gatunku makaka rezusa z objawami idiopatycznego zapalenia skóry.

Rozpoznanie transglutaminazy epidermalnej przez przeciwciała IgA i przeciwciała przeciwko tkankowej transglutaminazie 2 w rzadkim przypadku zapalenia skóry u Rhesus

Testy immunofluorescencyjne pośrednie (IIF) były tradycyjnie używane do wykrywania przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) w ludzkiej surowicy. Obecność tych przeciwciał może pomóc w diagnostyce układowych autoimmunologicznych chorób reumatycznych (SARD). Protokół ten pokazuje, jak skutecznie wykonać technikę IIF w celu dokładnego wykrycia tych autoprzeciwciał.

Badania przesiewowe przeciwciał przeciwjądrowych przy użyciu komórek HEp-2

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Tutaj prezentujemy demonstrację modelu przywołania pęcherza ssącego na skórę. Model ten umożliwia prosty dostęp do badania in vivo adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych u ludzi, na przykład w kontekście opracowywania szczepionek.

Protokół blistra ssącego do badania reakcji przywołania ludzkich limfocytów T in vivo

Ten protokół opisuje generowanie mieszanych chimer mysiego szpiku kostnego ze spontanicznymi autoimmunologicznymi centrami zarodkowymi, w których autoreaktywne limfocyty zawierają fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (PA-GFP). Daje to możliwość powiązania lokalizacji komórkowej w tkankach z dalszymi analizami molekularnymi i funkcjonalnymi.

Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji

Test aktywacji bazofili jest uzupełniającym testem diagnostycznym in vitro do oceny reakcji alergicznych zależnych od IgE, opartym na wykryciu aktywacji bazofili w obecności określonego bodźca poprzez pomiar markerów aktywacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Test aktywacji bazofili do diagnozy alergii

Badanie pokazuje rolę skóry w modulacji odpowiedzi immunologicznych u myszy poprzez immunizację epikutanną (EC). Szczepienie EC antygenem białkowym może hamować odpowiedzi immunologiczne w przypadku nadwrażliwości kontaktowej lub odwracać supresję indukowaną przez skórę, gdy jest połączona z molekularnymi wzorcami związanymi z patogenem. Szczepienia EC wykazują obiecujące zastosowanie jako skuteczne, bezigłowe podejście do immunoterapii.

Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę

Zmiany skórne są powszechnymi i ważnymi cechami w wielu chorobach reumatycznych, a biopsja z analizą patologiczną odgrywa kluczową rolę w diagnostyce. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy przegląd standaryzowanej procedury biopsji skóry i, na przykładzie tocznia rumieniowatego krążkowego, podkreśla istotną rolę dermatopatologii w diagnozowaniu chorób reumatycznych.

Biopsja skóry w celu rozpoznania tocznia rumieniowatego krążkowego

Optymalizacja eksperymentalnego modelu chomika w leiszmaniozie skórnej poprzez wstrzyknięcie promastigot Leishmania do skóry grzbietu. Podejście to jest przydatne podczas inokulacji, obserwacji, charakteryzacji zmian, stosowania leczenia oraz pobierania próbek klinicznych. Zachowane zostają zdolność poruszania się, poszukiwanie pokarmu i wody, zabawa oraz aktywności społeczne.

Leiszmanioza skóry na grzbietowej skórze chomików: użyteczny model do przesiewowych badań leków przeciwleiszmanialnych

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Poznaj metodę wywoływania pęcherzy skórnych u myszy przez pasywny transfer przeciwciał przeciwko kolagenowi VII. Model ten replikuje fenotyp i cechy histopatologiczne ludzkiej epidermolizy pęcherzowej nabytej, umożliwiając badanie patogenezy chorób autoimmunologicznych skóry.

Granulocytozależne pęcherzowanie skóry indukowane autoprzeciwciałami

Przeglądaj więcej filmów