Name: Zastosowanie LysoTracker do wykrywania zaprogramowanej śmierci komórek w zarodkach i różnicowania embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Poznaj metodę wykrywania zaprogramowanej śmierci komórek w zarodkach myszy i różnicujących się komórkach macierzystych ES za pomocą barwnika LysoTracker. Protokół umożliwia szybką analizę grubych tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Mariani za pomoc w redagowaniu protokołu. Praca ta była finansowana z grantu CIRM Postdoctoral Training Grant (JLF), stażu CIRM BRIDGES (TZTT), fundacji Robert E. and May R. Wright Foundation (FVM) oraz University of Southern California (FVM).

1. Barwienie zarodków myszy barwnikiem LysoTracker
 <ol>
 <li>Uzyskaj zarodki mysie, umieszczając młode samice (w wieku 5-6 tygodni) w klatkach z samcami. Monitoruj kolejnych poranków obecność czopa pochwowego, co wskazuje na zajście zapłodnienia. Jeśli samica jest w ciąży, południe tego dnia określa się jako 0,5 dpc (dni po kopulacji). Przedstawiona procedura jest optymalna dla zarodków w wieku 7-13 dpc.</li>
 <li>W interesującym dniu rozwoju embrionalnego uśmierć samicę zgodnie z zatwierdzonymi protokołami i usuń macicę. Wyjmij zarodki z błony decydualnej do 10 cm czystej płytki Petri z Hanks BSS (bez czerwieni fenolowej). Usuń błony pozazarodkowe i wykonaj co najmniej jedno płukanie w Hanks BSS, aby usunąć resztki tkanek i krew.</li>
 <li>Przygotuj roztwór barwiący LysoTracker dla zarodków (5 μM LysoTracker w Hanks BSS). Odpowiednia objętość dla 1-2 miotów mysich to 5 ml. Delikatnie wymieszaj, aby równomiernie rozprowadzić barwnik.</li>
 <li>Przenieś zarodki do roztworu barwiącego LysoTracker w probówce do wirówki lub fiolce i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 45 min.</li>
 <li>Płucz bardzo delikatnie w Hanks BSS cztery razy, po 5 min każdego mycia.</li>
 <li>Utwal przez noc w 4% Paraformaldehydzie.</li>
 <li>Przepłucz raz w Hanks BSS przez 10 min, aby usunąć utrwalacz.</li>
 <li>Odwodnij w serii metanolu (50%, 75%, 80%, 100%, po 5 min na każdym etapie), aby wyeliminować tło. Jest to istotne dla uzyskania dobrego stosunku sygnału do szumu podczas obrazowania.</li>
 <li>Na tym etapie próbki zarodków można przechowywać bezterminowo w metanolu w temperaturze -20 °C, chroniąc je przed światłem.</li>
 </ol>
 Uwaga: Próbkę tkanki do genotypowania DNA można pobrać na dowolnym etapie, jednak najwygodniej jest zrobić to bezpośrednio przed przechowywaniem, aby wszystkie próbki do tego momentu mogły być przetwarzane partiami. Pobierz próbkę tkanki z ogona, kończyny lub głowy z każdego zarodka i umieść je w oddzielnych probówkach. Rehydratuj próbkę tkanki i przygotuj ją do genotypowania.
 2. Barwienie LysoTrackerem różnicujących się kultur ES
 <ol>
 <li>Przygotować ciała embrionalne metodą wiszącej kropli15, stosując gęstość początkową 500 komórek na 20 μl kropli.</li>
 <li>Po 3 dniach przenieść ciała embrionalne do hodowli w zawiesinie na 10 cm nieprzylepnych płytkach Petriego (t.j. takich, które stosuje się w badaniach bakteriologicznych). Hodować przez 5 dni, wymieniając pożywkę co 2 dni.</li>
 <li>W 7. dniu przenieść ciała embrionalne na żelatynizowane szkiełka z komorami 8-dołkowymi (do komór dodać 0,1% żelatyny, odczekać 5 min, usunąć i dodać pożywkę). Przenieść 1-2 ciała embrionalne do każdej komory.</li>
 <li>Hodować przez 10 dni, wymieniając pożywkę co drugi dzień. Należy uważać, aby umieścić pipetę w rogu szkiełka z komorą, aby nie naruszyć ciała embrionalnego przytwierdzonego do powierzchni szklanej. Podczas dodawania świeżej pożywki również należy umieścić pipetę w rogu komory i powoli wlewać pożywkę.</li>
 <li>Po 10 dniach hodowli, aby wywołać apoptozę jako kontrolę pozytywną, potraktować niektóre dołki 0,1 mM i 1,0 mM H2O2 (dodać H2O2 do świeżej pożywki, wymieszać, a następnie dodać do komórek) przez 60 min. Przepłukać dwukrotnie D-PBS i hodować przez noc w zwykłej pożywce.</li>
 <li>Ostrożnie odessać istniejącą pożywkę i dodać roztwór barwiący LysoTracker Cell (końcowe stężenie 500 nM LysoTracker w pożywce, 300 μl na komorę).</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 min.</li>
 <li>Przepłukać dwukrotnie D-PBS, po 5 min za każdym razem.</li>
 <li>Utrwalić w 4% paraformaldehydzie przez 15 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przepłukać dwukrotnie D-PBS przez 5 min.</li>
 </ol>
 3. Obserwacja zarodków lub kultur ES barwionych LysoTrackerem
 <ol>
 <li>Przygotować próbki komórek do mikroskopii poprzez odessanie D-PBS, zdjęcie komory ze szkiełka, suszenie powietrzem przez około 5 min, a następnie dodanie wodnego medium montażowego (Vectashield z DAPI lub odpowiednika). Podczas suszenia zastosować barierę z folii, aby zmniejszyć blaknięcie fluoroforu. Zarodki zamontować w szklanym naczyniu z głębokim wgłębieniem lub małej szalce Petriego w medium Vectashield lub odpowiedniku.</li>
 <li>Obrazować za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub złożonego, wyposażonego w filtr rhodamine lub Texas Red (LysoTracker RED DND-99, wzbudzenie/emisja: 577/590 nm). Barwienie jest zazwyczaj bardzo intensywne, dlatego długie czasy ekspozycji zazwyczaj nie są konieczne.</li>
 </ol>
 4. Ilościowe określanie wyników za pomocą technik obrazowania
 <ol>
 <li>Wykonaj cyfrowe zdjęcia próbek w trybie manualnym, zachowując te same warunki ekspozycji.</li>
 <li>Otwórz obrazy w programie Adobe Photoshop lub podobnym programie do edycji obrazów. Aby określić intensywność barwienia LysoTrackerem, wybierz kanał czerwony i zastosuj progowanie obrazu (konwersja obrazu na czarno-biały) w taki sposób, aby czerwone barwienie było reprezentowane przez białe piksele. Zaznacz białe piksele i użyj funkcji histogramu, aby uzyskać całkowitą liczbę pikseli.</li>
 <li>Użyj kanału niebieskiego, aby policzyć liczbę jąder komórkowych w polu widzenia. Przydatne może być zapisywanie wyników poprzez adnotowanie obrazu.</li>
 <li>Zapisz wartości, a następnie oblicz średni poziom barwienia na jedną komórkę. Powtórz tę analizę z tym samym ustawieniem progu dla wszystkich obrazów przeznaczonych do analizy.</li>
 </ol>
 5. Reprezentatywne wyniki
 Podczas rozwoju embrionalnego występuje prawidłowy wzorzec PCD, który może ulec zmianie po usunięciu genu czynnika wzrostu, takiego jak Sonic hedgehog (Shh)16,17. Ponieważ LysoTracker jest małocząsteczkowym barwnikiem o wysokiej dyfuzyjności, można wizualizować cały embrion w celu oceny obszarów PCD, nawet głęboko w obrębie mezenchymy12,13. Rycina 1 przedstawia wzorzec barwienia LysoTrackerem w prawidłowych embrionach myszy oraz u mutantów Shh-/- w 10,5dpc. Na tym etapie PCD jest znacznie zwiększone u mutantów Shh-/-, szczególnie w regionach kończyn i somytów. Wybrane części embrionu można obrazować w preparatach całych (whole-mount) przy większym powiększeniu (1B), aby ocenić ogólny wzorzec. Wypreparowane fragmenty można również przeciąć za pomocą mikrotomu wibracyjnego (1C) lub kriotomu (D-F), aby dokładniej ukazać obszary PCD.
 Analizę TUNEL najlepiej przeprowadzać na cienkich przekrojach, w których penetracja transferazy końcowej jest mniej problematyczna. Barwienie LysoTrackerem oraz test TUNEL można wykonać w tej samej tkance (Rycina 1D-G). Wyniki te pokazują, że choć nie występuje ścisła korelacja 1:1 między barwieniem LysoTrackerem a TUNEL, ogólne obszary PCD w znacznym stopniu się pokrywają. Przy większym powiększeniu można dostrzec punkty wykazujące pozytywne barwienie w teście TUNEL, ale nie barwiące się LysoTrackerem, punkty barwiące się wyłącznie LysoTrackerem oraz punkty z nakładającymi się barwieniami.
 Gdy ciało embrioidalne (EB) zostanie wysiane na powierzchni pokrytej żelatyną, różnicujące się komórki będą migrować na zewnątrz. Po 10 dniach hodowli komórki różnicują się w różne typy komórek, w tym w neurony, komórki mięśniowe i kardiomiocyty. Hodowle przedstawione na Rysunku 2 zawierają mieszane populacje tych typów komórek, jednak protokół można dostosować do badania PCD konkretnego, interesującego nas typu komórek. Na przykład EB można traktować kwasem retinowym w celu wzmocnienia różnicowania neuronów19, a następnie zastosować analizę LysoTracker do oceny śmierci komórek neuronalnych w różnych warunkach. W normalnej hodowli zróżnicowanych komórek ES występuje kilka komórek ulegających PCD, które można wykryć za pomocą analiz LysoTracker i/lub TUNEL (Rysunek 2A). PCD można indukować za pomocą szeregu różnych czynników cytotoksycznych, takich jak nadtlenek wodoru (H2O2), który wywołuje uszkodzenia oksydacyjne i inicjuje szlak apoptozy20,21. Niska dawka H2O2 zwiększa intensywność barwienia LysoTracker i TUNEL w porównaniu do braku traktowania, podczas gdy wysoka dawka prowadzi do kurczenia się komórek i rozległej pozytywności w testach LysoTracker i TUNEL. Podobnie jak w wynikach uzyskanych z zarodka, można zaobserwować punkty barwiące się pozytywnie w analizie TUNEL, ale nie barwnikiem LysoTracker, punkty barwiące się tylko barwnikiem LysoTracker oraz punkty z nakładającymi się sygnałami barwienia. Skutek zastosowania czynnika cytotoksycznego indukującego apoptozę porównano z warunkami głodzenia surowiczego, które indukują autofagię (Rysunek 2D). Komórki, które przeszły okres głodzenia surowiczego (1 godzina), wykazują inny wzorzec, w którym barwienia LysoTracker i TUNEL nie korelują ze sobą w dużym stopniu. Barwienie LysoTracker jest znacznie zwiększone w porównaniu z hodowlami nietraktowanymi, jednak pozytywność TUNEL pozostaje na normalnym poziomie.
 Wykorzystując standardowe narzędzia dostępne w programie Adobe Photoshop, barwienie LysoTracker można ilościowo określić za pomocą prostej metody progowania, która pozwala obliczyć średni poziom barwienia dla populacji komórek. Rycina 3A-B pokazuje, jak wygląda przykładowy obraz podczas procesu kwantyfikacji. Zaczynając od obrazu bazowego z barwieniem LysoTracker w kanale czerwonym i jądrami zabarwionymi DAPI w kanale niebieskim (panel 3A), dokonano progowania kanału czerwonego tego obrazu, aby przekształcić go w obraz czarno-biały, a następnie wyselekcjonowano i policzono białe piksele (Rycina 3A'). Wybrano taki poziom progowania, który reprezentuje wzór barwienia LysoTracker. Jak przy każdej metodzie kwantyfikacji wykorzystującej obrazy, ważne jest unikanie prześwietlania zdjęć, ponieważ mogłoby to doprowadzić do nadmiernego podkreślenia różnic. Liczbę jąder w polu widzenia można następnie ustalić, analizując wyłącznie kanał niebieski (Rycina 3B>) i zaznaczając jądra za pomocą narzędzia do rysowania, np. pędzla, podczas liczenia (Rycina 3B'). Poziom barwienia można następnie wyrazić poprzez obliczenie średniego poziomu barwienia na komórkę (liczba pikseli/liczba jąder). Jeśli chcieliby Państwo wykorzystać ten algorytm do screeningu wysokoprzepustowego, większość pakietów do screeningu potrafi mierzyć jasność w konkretnym kanale i posiada funkcję identyfikacji obiektów, która policzy jądra w polu; jednak w większości typowych zastosowań metoda ręczna jest szybka i prosta. Dla przykładu przeprowadzono kwantyfikację przykładowego obszaru z Ryciny 2A-C, a wyniki potwierdzają, że zwiększanie stężenia H2O2 prowadzi do wyższego poziomu barwienia LysoTracker (Rycina 3C).
 <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig1.jpg" alt="Porównanie rozwoju zarodka; barwienie LysoT i TUNEL, analiza z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Barwienie LysoTrackerem w normalnych zarodkach i zarodkach Shh-/-. A,A'. Normalne zarodki myszy i zarodki Shh-/- w 10,5 dpc, barwione LysoTracker Red, zamontowane w Vectashield i sfotografowane pod mikroskopem stereoskopowym z epifluorescencją. Nawiasy wskazują położenie przednich kończyn. B,B'. Przednia kończyna normalnych zarodków i zarodków Shh-/- obrazowana przy większym powiększeniu. Zwróć uwagę na normalne obszary śmierci komórek, w tym „tylną strefę nekrozy” (oznaczoną gwiazdką) oraz obszar w proksymalnym mezenchym pączka kończyny (oznaczony strzałką). Kończyny z delecją Shh wykazują silniejsze barwienie w części przyśrodkowej i dystalnej. C,C'. Przekroje strzałkowe przez pączek przedniej kończyny zarówno w pączkach normalnych, jak i z delecją. Zwróć uwagę na obecność barwienia w proksymalnym mezenchym (strzałka) i AER (grot strzałki) w normalnym pączku kończyny oraz na silne barwienie w grzbietowym, brzusznym i dystalnym mezenchym w pączku z delecją. D-F. Ten sam przekrój (przekrój mrożony, 12 micron) obrazowano pod kątem barwienia LysoTrackerem i TUNEL (Roche 1684795). Przekrój przechodzi przez dystalną część mezenchymu z delecją Shh. Grot strzałki wskazuje AER. Zauważ, że ogólny wzór jest bardzo podobny w obu metodach, jednak barwienie nie pokrywa się całkowicie. G,G'. Przy większym powiększeniu AER i mezenchymu można dostrzec zarówno punkty, które są pozytywne tylko dla LysoTrackera lub TUNEL, jak i punkty z nakładającym się barwieniem. 
 <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna barwień LysoTracker i TUNEL; analiza apoptozy komórek pod wpływem stresu wywołanego H₂O₂." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Barwienie LysoTracker w zróżnicowanych komórkach ES. Komórki w procesie różnicowania wysiano na szkiełka z 8 komorkami w obecności LIF. Aby porównać barwienie LysoTracker i TUNEL, szlak apoptozy indukowano za pomocą dwóch różnych dawek H2O2, natomiast szlak autofagii indukowano poprzez 1-godzinne głodzenie seryjne. Zdjęcia wykonano za pomocą konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM5. A-A'': Niepoddane działaniu odczynników hodowle wykazują pewien poziom naturalnej apoptozy, co wskazuje barwienie LysoTracker i TUNEL. Wzorce obu technik w większości się pokrywają (białe strzałki), jednak widoczne są nieliczne punkty dodatnie tylko dla LysoTracker (czerwone strzałki). B-B'', C-C": Leczenie zwiększającymi się ilościami H2O2 stymuluje apoptozę. Niższa dawka wykazuje więcej punktów dodatnich dla LysoTracker i TUNEL w porównaniu do komórek niepoddanych działaniu odczynników. Wyższa dawka indukuje jeszcze więcej punktów dodatnich dla LysoTracker i TUNEL. Białe strzałki wskazują na nakładające się barwienia, natomiast czerwone strzałki wskazują na punkty dodatnie tylko dla LysoTracker. Można również zauważyć punkty dodatnie wyłącznie dla barwienia TUNEL (zielone strzałki). D-D": Głodzenie seryjne może indukować autofagię, co może stymulować akumulację materiału w lizosomach i autofagolizosomach. Zauważmy, że widocznych jest znacznie więcej punktów LysoTracker w porównaniu do hodowli niepoddanych działaniu odczynników. Obecne są punkty dodatnie dla TUNEL (z których większość ma nakładające się barwienie LysoTracker, białe strzałki), jednak ich liczba nie wzrosła znacząco w porównaniu do warunków kontrolnych. Dodatkowo, w warunkach głodzenia seryjnego, bardzo często występują punkty dodatnie wyłącznie dla LysoTracker (czerwone strzałki).
 <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig3.jpg" alt="Analiza fluorescencji LysoTracker, barwienie jąder komórkowych, wykres odpowiedzi na H₂O₂; mikroskopia, analiza komórkowa." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Metoda ilościowa służąca do oceny poziomu barwienia w populacji komórek z wykorzystaniem programu Adobe Photoshop. A: Wybrano fragment Rysunku 2A; na tym panelu przedstawiono barwienie LysoTracker (kanał czerwony) oraz DAPI (jądra komórkowe, kanał niebieski). A': Kanał czerwony z Rysunku 3A poddano progowaniu, aby przekształcić go w obraz czarno-biały. Następnie białe piksele można wybrać i policzyć za pomocą funkcji histogramu. B-B': Kanał niebieski pokazuje jądra komórkowe; podczas ich liczenia obraz można oznaczać za pomocą funkcji rysowania, np. pędzla. C: Jest to przykład ilościowego wyznaczenia próbki z paneli 2A-C. Dane przedstawiono jako liczbę pikseli na jądro komórkowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4254/4254fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.

<ol><li>Baehrecke, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+death+shapes+life+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">How death shapes life during development.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).</li>
<li>Meier, P., Finch, A., Evan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in development.</a> Nature. 407, 796-801 (2000).</li>
<li>Ikonomidou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+apoptotic+neurodegeneration+and+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome.</a> Science. 287, 1056-1060 (2000).</li>
<li>Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+embryonic+cell+populations+to+ethanol-induced+apoptosis%3A+implications+for+alcohol-related+birth+defects+and+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).</li>
<li>Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+of+5-FU-treated+fetal+rat+limbs+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+Lysotracker%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker.</a> Cytometry A. 53, 9-21 (2003).</li>
<li>Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in animal development.</a> Cell. 88, 347-354 (1997).</li>
<li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147, 742-758 (2011).</li>
<li>Qu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+gene-dependent+clearance+of+apoptotic+cells+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development.</a> Cell. 128, 931-946 (2007).</li>
<li>Grimsley, C., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cues+for+apoptotic+cell+engulfment%3A+eat-me%2C+don%27t+eat-me+and+come-get-me+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals.</a> Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).</li>
<li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+cells%3A+getting+rid+of+the+corpses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li>
<li>Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lysosomal+compartment+as+intracellular+calcium+store+in+MDCK+cells%3A+a+possible+involvement+in+InsP3-mediated+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release.</a> Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).</li>
<li>Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+of+apoptosis+in+organogenesis-stage+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos.</a> Cytometry. 33, 348-354 (1998).</li>
<li>Zucker, R. M., Hunter, E. S. 3rd, Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+morphology+in+mouse+embryos+by+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy.</a> Methods. 18, 473-480 (1999).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).</li>
<li>Chiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manifestation+of+the+limb+prepattern%3A+limb+development+in+the+absence+of+sonic+hedgehog+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function.</a> Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).</li>
<li>Ishibashi, M., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sonic+hedgehog-dependent+signaling+relay+regulates+growth+of+diencephalic+and+mesencephalic+primordia+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo.</a> Development. 129, 4807-4819 (2002).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> Brain Res. 913, 201-205 (2001).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Dumont, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+is+CD95-independent%2C+requires+the+release+of+mitochondria-derived+reactive+oxygen+species+and+the+activation+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB.</a> Oncogene. 18, 747-757 (1999).</li>
<li>Hampton, M. B., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+caspase+activity+by+hydrogen+peroxide%3A+implications+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis.</a> FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).</li>
<li>Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+engulf+and+clear+apoptotic+footplate+cells+in+macrophageless+PU.1+null+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos.</a> Development. 127, 5245-5252 (2000).</li>
<li>Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+induction+of+autophagy+by+Atg1+inhibits+cell+growth+and+induces+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death.</a> Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).</li>
<li>Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracker+dyes+to+probe+mitochondrial+autophagy+%28mitophagy%29+in+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes.</a> Autophagy. 2, 39-46 (2006).</li>
<li>Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+autophagy+visualized+in+live+cells%3A+from+autophagosome+formation+to+fusion+with+endo%2Flysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes.</a> Autophagy. 1, 23-36 (2005).</li>
<li>Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+autophagy+is+related+to+programmed+cell+death+during+the+development+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).</li>
<li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).</li>
<li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes.</a> Autophagy. 4, 151-175 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Ważnymi cechami charakterystycznymi dla apoptozy są: wykrycie uszkodzeń DNA za pomocą testu TUNEL, wykazanie aktywności kaspaz (wykrywanej za pomocą przeciwciał monoklonalnych lub cząsteczki wiążącej, takiej jak ZVAD-fmk), obserwacja zmian komórkowych oraz obecność fosfatydyloseryny (PS) na powierzchni błony (wykrywana poprzez wiązanie Annexiny V). Każda z tych metod posiada pewne ograniczenia. Na przykład transferaza końcowa stosowana w teście TUNEL nie przenika głębiej niż przez kilka warstw komórek. Ponadto Annexina V...

<table><tbody><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>#L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Sól zrównoważona Hanksa (Hanks BSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMD</td><td>EM-PX0055-3</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>WEKTOR</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy niepodstawowe</td><td>Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>pirowinian sodu</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>płytki surowicy wołowej (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.02</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>$\beta$-merkaptoetanol&amp;#8211;etanol, 50 mM </td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy z komorkami LabTek-II &lt;br/&gt; (8-dołkowa)</td><td>Nalge Nunc International</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>0,1% żelatyny</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>bufor fosforanowy Dulbecco (D-PBS) </td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Sposoby przygotowania roztworów&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;4% Paraformaldehyd&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content1&quot;&gt;Dla 100 ml:&lt;/p&gt; &lt;ol&gt; &lt;li&gt;Zmieszać 4 g paraformaldehydu, 90 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O oraz NaOH (kropla 2N NaOH). Paraformaldehyd nie rozpuści się do momentu dodania NaOH w celu zwiększenia pH.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Mieszać i podgrzewać do 60°C &amp;deg;Mieszać, aż cały proszek rozpuści się w roztworze (~10-20 min). &lt;strong&gt;Nie przegrzewać.&lt;/strong&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Dodać ok. 10 ml 10x PBS, aby uzyskać objętość końcową 100 ml.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Przechowywać w temperaturze -20°C &amp;deg;C w wygodnych alikwotach (~10 ml lub ~40 ml).&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt; &lt;p class=&quot;jove_content1&quot;&gt;&lt;strong&gt;OSTRZEŻENIE: Paraformaldehyd w formie „frill” (prasowane małe pellety) mniej pyli, dlatego jego odważanie może odbywać się poza dygestorium. Niemniej jednak podczas pracy z tym odczynnikiem należy nadal stosować ochronną maskę przeciwpyłową (co najmniej N95).&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Pożywka do hodowli ciałek zarodkowych (EB)&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content1&quot;&gt;Do przygotowania 500 ml pożywki EB:&lt;/p&gt; &lt;tabela ramka=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;DMEM:&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;404,5 ml&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;FBS:&lt;/td&gt; &lt;td&gt;75,0 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;L-glutamina:&lt;/td&gt; &lt;td&gt;5,0 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Penicylina/Streptomycyna:&lt;/td&gt; &lt;td&gt;5,0 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Aminokwasy niezasadnicze:&lt;/td&gt; &lt;td&gt;5,0 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Pirowinian sodu:&lt;/td&gt; &lt;td&gt;5,0 ml&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;etanol:&lt;/td&gt; &lt;td&gt;500 &amp;mu;l&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt;</td></tr></tbody></table>

zastosowanie lysotracker do wykrywania programowanej śmierci komórki w embrionach i różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programowana śmierć komórki (PCD) występuje u osobników dorosłych w celu utrzymania prawidłowej homeostazy tkanek oraz podczas rozwoju embrionalnego w celu formowania tkanek i narządów1,2,6,7. W trakcie rozwoju substancje toksyczne lub zmiany genetyczne mogą spowodować zwiększenie poziomu PCD lub zmianę wzorców PCD, co prowadzi do anomalii rozwojowych i wad wrodzonych3-5. Aby zrozumieć etiologię tych wad, badania embrionów można uzupełnić o testy in vitro z wykorzystaniem różnicujących się embrionalnych komórek macierzystych (ES).
Apoptoza jest dobrze przebadaną formą PCD, która angażuje zarówno wewnątrzkomórkowe, jak i zewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne w celu aktywacji kaskady enzymatycznej kaspaz. Charakterystyczne zmiany komórkowe obejmują pęcherzykowanie błony komórkowej, kondensację jądra komórkowego oraz fragmentację DNA. Inne formy PCD nie wiążą się z aktywacją kaspaz i mogą być końcowym wynikiem przedłużonej autofagii. Niezależnie od szlaku PCD, obumarłe komórki muszą zostać usunięte. U osobników dorosłych funkcję tę pełnią komórki odpornościowe, natomiast w embrionach, gdzie układ odpornościowy nie jest jeszcze rozwinięty, usuwanie odbywa się poprzez alternatywny mechanizm. Mechanizm ten polega na tym, że sąsiednie komórki (zwane „niefagocytarnymi fagocytami”) przejmują rolę fagocytarną – rozpoznają sygnał „zjedz mnie” na powierzchni obumierającej komórki i pochłaniają ją8-10. Po pochłonięciu szczątki są transportowane do lizosomów w celu degradacji. Zatem niezależnie od mechanizmu PCD, wzrost aktywności lizosomalnej może być skorelowany ze zwiększoną śmiercią komórek.
Aby badać PCD, użytecznym może być prosty test do wizualizacji lizosomów w grubych tkankach i wielowarstwowych kulturach różnicujących się. Barwnik LysoTracker jest wysoce rozpuszczalną małą cząsteczką, która kumuluje się w kwaśnych przedziałach podkomórkowych, takich jak lizosomy11-13. Barwnik jest pobierany przez dyfuzję oraz poprzez krążenie. Ponieważ penetracja nie stanowi przeszkody, możliwa jest wizualizacja PCD w grubych tkankach i kulturach wielowarstwowych12,13. W przeciwieństwie do tego, analiza TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)14 jest ograniczona do małych próbek, skrawków histologicznych i kultur monowarstwowych, ponieważ procedura ta wymaga przenikania terminalowej transferazy.
W przeciwieństwie do błękitu anilinowego, który dyfunduje i rozpuszcza się w rozpuszczalnikach, LysoTracker Red DND-99 jest utrwalny, jasny i stabilny. Barwienie można wizualizować przy użyciu standardowej mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej w preparatach całych obiektów lub w przekrojach, stosując wodne lub rozpuszczalnikowe media montażowe12,13. Opisujemy tutaj protokoły z wykorzystaniem tego barwnika do badania PCD w prawidłowych embrionach myszy oraz embrionach z mutacją null w genie sonic hedgehog. Ponadto demonstrujemy analizę PCD w różnicujących się kulturach komórek ES i przedstawiamy prostą metodę ilościową. Podsumowując, barwienie LysoTrackerem może stanowić doskonałe uzupełnienie innych metod wykrywania PCD.

Przedstawiamy prosty protokół wizualizacji obszarów programowanej śmierci komórek (PCD) w embrionach myszy oraz w hodowlach różnicujących się embrionalnych komórek macierzystych (ES) przy użyciu wysoce rozpuszczalnego barwnika o nazwie LysoTracker.

Zastosowanie LysoTracker do wykrywania programowanej śmierci komórki w embrionach i różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych

Programowana śmierć komórki (PCD) występuje u osobników dorosłych w celu utrzymania prawidłowej homeostazy tkankowej oraz podczas rozwoju embrionalnego w celu kształtowania tkanek i ...

Celem poniższej procedury jest zademonstrowanie sposobu barwienia lizosomów w dwóch rodzajach próbek: embrionów myszy oraz zróżnicowanych komórek macierzystych przy użyciu barwnika LysoTracker w celu wykrycia wzorców śmierci komórkowej. W celu przygotowania próbek embrionów, embriony są najpierw izolowane chirurgicznie i umieszczane w szalce w celu przygotowania zróżnicowanych komórek. Do stworzenia ciał embrionalnych wykorzystuje się embrionalne komórki macierzyste.Zarodki te są hodowane w zawiesinie, a następnie namnażane jako monowarstwa na szkiełku komorowym. Zarodki w monowarstwie można inkubować z LysoTracker Red, a następnie przemyć i utrwalić próbki; tak przygotowane próbki można sfotografować w celu zbadania i ilościowego określenia wyników barwienia wykazujących obecność LysoTracker. Barwienie jest prostą procedurą, którą można wykorzystać do badania programowanej śmierci komórki w zarodkach i hodowlach komórkowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza TUNEL, jest fakt, że dzięki zastosowaniu barwnika OT tracker, który jest małą cząsteczką, grube tkanki można badać szybko i łatwo. Choć metoda ta pozwala na wgląd w wzorce programowanej śmierci komórkowej w embrionach myszy i kulturach zróżnicowanych, może być ona również stosowana w innych typach tkanek, takich jak embriony kurczaków i różnicujące się dorosłe komórki macierzyste. Sparuj młode samice myszy z samcem rozpłodnicowym i każdego kolejnego ranka sprawdzaj obecność czopu pochwowego, który wskazuje na zajście zapłodnienia.Południe w dniu pojawienia się czopu pochwowego uznaje się za 0,5 dnia. Po kopulacji, w interesującym badacza dniu embrionalnym, przeprowadzić eutanazję samicy zgodnie z zatwierdzonymi protokołami, a następnie przenieść macicę do 10-centymetrowej szalki Petriego z roztworem Hank's BSS i wypłukać krew. Wyseparować embriony i wyjąć je z macicy.Usuń nadmiar błon zarodkowych i wykonaj przynajmniej jedno płukanie w roztworze Hank's BSS, aby usunąć zbędne tkanki i krew. Przechowuj wypreparowane zarodki na lodzie podczas oczyszczania. Pozostałe.Przygotuj pięć mililitrów roztworu barwiącego zarodki Liso tracker. Jest to objętość wystarczająca dla jednej lub dwóch kolekcji zarodków. Delikatnie wymieszaj roztwór, aby równomiernie rozprowadzić barwnik, następnie przenieś zarodki do roztworu i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 45 minut.Po inkubacji delikatnie przemyj embriony w roztworze Hank's BSS czterokrotnie, wykonując każde płukanie przez pięć minut. Ważne jest, aby płukać delikatnie, aby nie uszkodzić tkanki. Powoli usuń ciecz, uważnie obserwując położenie delikatnych embrionów i zawsze pozostawiając niewielką ilość płynu, która będzie je zakrywać.Następnie utrwalaj zarodki w 4% paraformaldehydzie przez noc w dniu następnym. Przepłucz zarodki raz w roztworze Hank's BSS przez 10 minut, aby usunąć utrwalacz. Teraz odwodnij tkanki za pomocą serii metanolu, aby wyeliminować barwienie tła.Ten etap poprawia stosunek sygnału do szumu podczas obrazowania przed przechowywaniem. Jeśli jest to konieczne, pobierz próbkę tkanki z każdego zarodka do analizy genetycznej. Następnie rehydratuj próbkę tkanki przed genotypowaniem.Rozdziel zarodki do poszczególnych probówek z etykietami odpowiadającymi próbce tkanki. Obecnie możliwe jest nieograniczone przechowywanie wyizolowanych zarodków w metanolu w temperaturze -20 °C, w warunkach ochrony przed światłem.Rozpocznij od przygotowania ciał embrionalnych metodą wiszącej kropli. Przy początkowej gęstości 500 komórek na 20 µL kropli, po trzech dniach przenieś ciała embrionalne do kultur zawiesinowych na 10 cm nieadhezyjnych szalkach Petriego. Inkubuj je przez pięć dni, zmieniając po pięciu dniach pożywkę co dwa dni.Przenieś ciała zarodków do zżelatynizowanych szkiełek z ośmioma komorami, umieszczając jedno lub dwa ciała zarodków w każdej komorze. Inkubuj ciała zarodków przez kolejne 10 dni. Po 10 dniach, zmieniając medium co drugi dzień, ostrożnie odessij istniejące medium i dodaj 300 µL roztworu barwiącego komórki Lyo tracker do każdej komory.Należy ostrożnie odessać pożywkę ręcznie, umieszczając końcówkę pipety w narożniku komory. W ten sposób uniknie się przypadkowego usunięcia ciał, które wciąż przywierają do szklanej powierzchni. Podczas ponownego dodawania pożywki należy umieścić końcówkę pipety w narożniku komory i dodawać pożywkę bardzo powoli.Inkubuj komory w temperaturze 37°C przez 15 minut. Następnie przemyj je dwukrotnie DPBS, płucząc przez pięć minut podczas każdego przemycia. Teraz utrwal komórki w 4% paraldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie usuń utrwalacz za pomocą DPBS, wykonując dwa pięciominutowe płukania. Aby zamontować embriony, umieść je na szkiełku przedmiotowym z wgłębieniem lub w małej płytce Petriego. Przygotuj próbki komórkowe do mikroskopii, odsysając DPBS.Zdejmij komorę z preparatu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez około pięć minut. Przykryj folią, aby chronić fluorofory. Następnie dodaj wodny medium montażowe, taki jak Vector Shield z DAPI, i nałóż na wierzch szkiełko cover slip.Preparat został zamontowany i jest gotowy do obrazowania. Próbki należy wizualizować za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub złożonego, wyposażonego w filtr ROD, domine lub Texas red. Barwienie jest zazwyczaj dość intensywne, więc w trybie manualnym długie czasy naświetlania zazwyczaj nie są konieczne.Wykonaj cyfrowe zdjęcia wszystkich próbek przy tych samych warunkach ekspozycji. Aby przeprowadzić analizę ilościową obrazów, otwórz je w programie Adobe Photoshop lub podobnym programie do obróbki obrazu. W celu określenia stopnia barwienia lyo trackerem wybierz kanał czerwony.Zanotuj liczbę pikseli dla całego obrazu, wyświetloną przez funkcję histogramu. Następnie przeprowadź progowanie obrazu w taki sposób, aby czerwone zabarwienie zostało przedstawione białymi pikselami. Operacja ta konwertuje obraz na czarno-biały.Wybierz poziom progu i zastosuj go do wszystkich obrazów w zestawie. Zaznacz białe piksele za pomocą narzędzia zakresu kolorów (color range), a następnie użyj funkcji histogramu, aby uzyskać całkowitą liczbę białych pikseli. Wykorzystaj kanał niebieski do policzenia liczby jąder komórkowych w polu widzenia.Przydatne może być prowadzenie rejestru zliczeń poprzez adnotowanie obrazu, zapisywanie wartości i wykorzystanie ich do obliczenia średniego poziomu barwienia na komórkę. Powtórz tę analizę z tym samym ustawieniem progu dla wszystkich pozostałych obrazów. Do pobrania próbek wykorzystano LyO Tracker do barwienia embrionów mutantów sonic hedgehog.Ponieważ ly O tracker jest małą, łatwo dyfundującą cząsteczką, obszary głęboko wewnątrz całego zarodka barwionego w 10,5 dnia po kopulacji wykazały znaczny wzrost zaprogramowanej śmierci komórki (PCD) w embrionach z mutacją null genu sonic hedgehog, szczególnie w regionach kończyn i somytów. Pączki kończyn obrazowano w preparatach całych przy większym powiększeniu w celu oceny ogólnego wzorca. Wypreparowane fragmenty poddano również cięciu za pomocą wibracyjnego mikrotomu.Grot strzałki wskazuje na zwiększone barwienie w dystalnej końcówce u embrionów z knockoutem sonic hedgehog w przekrojach wykonanych za pomocą kriostatu. W tych plastrach barwienie TUNEL zastosowano w połączeniu z LysoTracker; mimo że nie występuje ścisła korelacja jeden do jednego między barwieniem LysoTracker a TUNEL, ogólne obszary PCD w znacznym stopniu nakładają się na siebie przy większym powiększeniu. Można zaobserwować komórki, które wybarwiły się dodatnio w teście TUNEL, ale nie w LysoTracker, komórki barwiące się wyłącznie LysoTrackerem oraz komórki z nakładającymi się obydwoma barwieniami. Po 10 dniach hodowli ciała embrionów komórki zróżnicowały się w różnorodne typy komórek, w tym neurony, komórki mięśniowe i kardiomiocyty.W normalnej hodowli zróżnicowanych komórek ES występuje kilka komórek, które uległy PCD, co wykryto za pomocą testów lyo tracker i tunnel. Następnie komórki poddano działaniu nadtlenku wodoru w celu wywołania śmierci komórkowej wskutek stresu oksydacyjnego. Niska dawka nadtlenku wodoru zwiększyła intensywność barwienia lyo tracker i tunnel w porównaniu do grupy bez zastosowania leczenia.Podobnie jak w wynikach dla zarodka, oba barwienia objęły zarówno komórki wspólne, jak i unikalne. Wysoka dawka nadtlenku wodoru spowodowała kurczenie się komórek oraz bardziej rozległą pozytywność dla znacznika OT i tunelu. Dla porównania, w celu indukowania autofagii zastosowano głodówkę surowiczą przez jedną godzinę.Zbarwienie trackera OT wzrosło. Jednakże odsetek komórek TUNEL-dodatnich pozostał na normalnym poziomie. Zatem, choć metoda reer jest łatwa i użyteczna, ważne jest przeprowadzenie dodatkowych analiz po kwantyfikacji próbek, aby ustalić, czy barwienie reprezentuje apoptozę czy autofagię.Stosując prostą metodę w programie Photoshop, zaprezentowaną wcześniej, wyniki potwierdziły, że zwiększanie stężeń nadtlenku wodoru prowadziło do wyższego poziomu barwienia LysoTracker. Po opanowaniu techniki, procedura barwienia ta może zostać przeprowadzona w czasie krótszym niż dwie godziny, pod warunkiem właściwego postępowania zgodnie z instrukcją. W celu potwierdzenia rodzaju śmierci komórkowej można zastosować inne metody, takie jak barwienie immunocytochemiczne NX-5 lub LC-3. Należy pamiętać, że obecnie LysoTracker Green działa tylko na żywych komórkach, dlatego w przypadku próbek wymagających fiksacji najlepszym wyborem jest LysoTracker Red.

use-lysotracker-to-detect-programmed-cell-death-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie LysoTracker do wykrywania programowanej śmierci komórkowej w zarodkach i różnicujących się zarodkowych komórkach macierzystych

W niniejszym filmie przedstawiono techniki znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia in vivo przeszczepionych komórek macierzystych za pomocą obrazowania optycznego oraz do korelacji histopatologicznych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

W związku z rosnącym zainteresowaniem terapiami komórkami macierzystymi, techniki obrazowania molekularnego są idealne do monitorowania zachowania tych komórek po transplantacji. Geny reporterowe lucyferazy umożliwiły nieinwazyjną, powtarzalną ocenę przeżywalności, lokalizacji i proliferacji komórek in vivo. W niniejszym filmie zaprezentrowano sposób śledzenia proliferacji hESC w żywej myszy.

Obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.

Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Podczas gdy infiltrujące makrofagi są stale rekrutowane do tkanek dorosłych z krążących prekursorów, makrofagi rezydentne zasiewają swoją tkankę podczas rozwoju, gdzie są utrzymywane bez dalszego wkładu ze strony przodków. Niedawno zidentyfikowano prekursorów rezydujących makrofagów. W tym miejscu przedstawiono metody genetycznego mapowania losów rezydentnych przodków makrofagów.

Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Dostępne systemy różnicowania komórek macierzystych pluripotencjalnych (PSC) do funkcjonalnych komórek są obecnie utrudnione przez problemy związane z poważną zmiennością między liniami i między partiami. Tutaj, używając różnicowania serca jako głównego przykładu, przedstawiamy protokół inteligentnego monitorowania i modulowania procesu różnicowania PSC w oparciu o uczenie maszynowe oparte na obrazie.

Strategia uczenia maszynowego oparta na obrazie żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych

Protokół ten opisuje metodę obrazowania żywymi komórkami do monitorowania przepuszczalności błony lizosomalnej podczas nekroptozy, wykorzystującą sondy fluorescencyjne wykrywające zmiany w integralności błony lizosomalnej i zakwaszeniu.

Obrazowanie żywymi komórkami permeabilizacji błony lizosomalnej podczas nekroptozy

Ten artykuł przedstawia protokół LysoTracker dla żywych komórek w celu zmierzenia remodelacji lizosomalnej podczas starzenia się w  fibroblastach ludzkich IMR-90.

Analiza lizosomalna z użyciem LysoTracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w fibroblastach ludzkich

Poznaj metodę wykrywania zaprogramowanej śmierci komórek w zarodkach myszy i różnicujących się komórkach macierzystych ES za pomocą barwnika LysoTracker. Protokół umożliwia szybką analizę grubych tkanek.

Zastosowanie LysoTracker do wykrywania zaprogramowanej śmierci komórek w zarodkach i różnicowania embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie LysoTracker do wykrywania programowanej śmierci komórki w embrionach i różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych

Przeglądaj więcej filmów