Zastosowanie LysoTracker do wykrywania zaprogramowanej śmierci komórek w zarodkach i różnicowania embrionalnych komórek macierzystych

Celem poniższej procedury jest pokazanie, w jaki sposób podtrzymywać lizosomy dwóch typów próbek, zarodków myszy i zróżnicowanych komórek macierzystych za pomocą barwnika śledzącego lyo w celu wykrycia wzorców śmierci komórki. Aby przygotować próbki zarodków, zarodki są najpierw izolowane chirurgicznie i umieszczane w naczyniu w celu przygotowania zróżnicowanych komórek. Embrionalne komórki macierzyste są wykorzystywane do tworzenia ciał zarodkowych.

Te ciała zarodkowe są hodowane w zawiesinie, a następnie hodowane jako monowarstwa na szkiełku komorowym. Wszystkie zarodki sprzedawane jednowarstwowo mogą być inkubowane w kolorze czerwonym ot tracker, a następnie są płukane, a utrwalone próbki można następnie sfotografować w celu zbadania i ilościowego określenia wyników barwienia, które pokazują Liso Tracker. Barwienie to prosta procedura, którą można wykorzystać do oceny śmierci komórki w zarodkach i hodowanych komórkach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza tunelowa, jest to, że ponieważ barwnik śledzący OT jest małą cząsteczką, grubą tkankę można szybko i łatwo oznaczyć. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w wzorce zaprogramowanej śmierci komórek w zarodkach myszy i zróżnicowanych kulturach, można ją również zastosować do innych typów tkanek, takich jak zarodki kurczaków i różnicujące się dorosłe komórki macierzyste. Połącz młode samice myszy z samcem reproduktora, a następnego ranka sprawdź, czy nie ma korka dopochwowego, który wskazuje, że doszło do krycia.

Południe w dniu, w którym pojawia się czop dopochwowy, wynosi faktycznie 0,5 dnia. Po pobraniu cotus w dniu zainteresowania embrionalnym, poddaj samicę eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi protokołami i usuń macicę na 10-centymetrową szalkę Petriego za pomocą BSS Hanka i spłucz wszelką krew. Oddziel zarodki i usuń je z macicy.

Usuń dodatkowe błony embrionalne i wykonaj co najmniej jedno płukanie za pomocą BSS Hanka, aby usunąć obce tkanki i krew. Podczas czyszczenia trzymaj wypreparowane zarodki na lodzie. Pozostali.

Przygotuj pięć mililitrów roztworu do barwienia zarodków Liso tracker. Jest to objętość wystarczająca na jedno lub dwa pobrania zarodków. Delikatnie wymieszaj roztwór, aby równomiernie rozproszyć barwnik, a następnie przenieś zarodki do roztworu i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut.

Po inkubacji delikatnie opłucz zarodki w BSS Hanka cztery razy przez pięć minut przy każdym myciu. Ważne jest, aby płukać delikatnie , aby nie uszkodzić tkanki. Usuń płyn, powoli zwracając szczególną uwagę na to, gdzie znajdują się delikatne zarodki i zawsze pozostawiaj część płynu z tyłu, przykrywając je.

Następnie utrwal zarodki w 4% para formaldehydzie przez noc następnego dnia. Opłucz zarodki raz w BSS Hanka przez 10 minut, aby usunąć utrwalacz. Teraz odwodnić tkanki za pomocą serii metanolu, aby wyeliminować barwienie tła.

Ten krok poprawia stosunek sygnału do szumu podczas obrazowania przed przechowywaniem. W razie potrzeby należy pobrać próbkę tkanki z każdego zarodka do analizy genetycznej. Później należy ponownie uwodnić próbkę tkanki przed genotypowaniem.

Podziel zarodki na pojedyncze probówki z etykietami pasującymi do próbki tkanki. Teraz możliwe jest przechowywanie wyizolowanych zarodków w nieskończoność w metanolu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Chroniony przed światłem.

Zacznij od przygotowania ciał zarodków metodą wiszącej kropli. Przy początkowej gęstości 500 komórek na 20 mikrolitrów kropli po trzech dniach przenieś ciała zarodków do kultur zawiesinowych na 10-centymetrowych, nieprzylegających szalkach Petriego. Hoduj je przez pięć dni, zmieniając pożywkę co dwa dni po pięciu dniach.

Przenieś ciała zarodków do zżelatynizowanych szkiełek ośmiokomorowych, umieszczając jedno lub dwa ciała zarodków w każdej komorze. Hoduj ciała zarodków przez kolejne 10 dni. Zmieniając pożywkę co drugi dzień po 10 dniach, delikatnie odessać istniejącą pożywkę i dodać 300 mikrolitrów roztworu do barwienia komórek Lyo tracker do każdej komory.

Należy uważać, aby ręcznie odpipetować media, umieszczając końcówkę pipety w rogu komory. W ten sposób nie usuniesz przypadkowo, nadal mocując każdy korpus ze szklanej powierzchni. Podczas ponownego dodawania pożywki umieść końcówkę pipety w rogu komory i bardzo powoli dodawaj pożywkę.

Inkubuj komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie spłucz je dwukrotnie DPBS przez pięć minut na płukanie. Teraz utrwal komórki w 4% paraldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń utrwalacz za pomocą DPBS w dwóch pięciominutowych płukaniach. Aby zamontować zarodki, umieść je w szkiełku z głębokim wgłębieniem lub małej osłonie infekcyjnej na szalce Petriego. Przygotuj próbki komórek do mikroskopii, odsysając DPBS.

Wyjmij komorę ze szkiełka i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez około pięć minut. Przykryj folią, aby zabezpieczyć fluro. Następnie dodaj wodne podłoże montażowe, takie jak osłona wektorowa z dappy i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu.

Teraz zjeżdżalnia została zamontowana i jest gotowa do obrazowania. Wizualizuj próbki za pomocą mikroskopu preparacyjnego lub złożonego wyposażonego w filtr pręcikowy, dominowy lub czerwony teksański. Barwienie jest zazwyczaj dość jasne, więc długie ekspozycje zwykle nie są konieczne w trybie ręcznym.

Wykonaj cyfrowe zdjęcia wszystkich próbek w tych samych warunkach ekspozycji. Aby określić ilościowo obrazy, otwórz je w programie Adobe Photoshop lub podobnym programie do obrazowania. Aby określić stopień zabarwienia lyo trackera, wybierz czerwony kanał.

Zwróć uwagę na liczbę pikseli dla całego obrazu, zgodnie z funkcją histogramu. Następny próg, obraz taki, że czerwone zabarwienie jest teraz reprezentowane przez białe piksele. Spowoduje to konwersję obrazu na czarno-biały.

Wybierz poziom progowy i użyj go dla wszystkich obrazów w zestawie. Wybierz białe piksele za pomocą narzędzia zakresu kolorów i użyj funkcji histogramu, aby uzyskać całkowitą liczbę białych pikseli. Użyj niebieskiego kanału, aby policzyć liczbę jąder w polu.

Przydatne może być prowadzenie rejestru liczby poprzez dodawanie adnotacji do obrazu, zapisywanie wartości i używanie ich do obliczania średniego poziomu barwienia na komórkę. Powtórz tę analizę z tym samym ustawieniem progu dla wszystkich pozostałych obrazów. Do pobierania próbek użyto trackera do barwienia zmutowanych zarodków jeża sonicznego.

Ponieważ ly O tracker jest małą, wysoce dyfuzyjną cząsteczką, obszary głęboko w meen całego zarodka, wybarwione 10,5 dnia po cotus, zaprogramowana śmierć komórki lub PCG była znacznie zwiększona w zarodkach z mutacją sonic hedgehog, szczególnie w kończynach, a więc i w regionach możliwych. Pąki kończyn zostały zobrazowane w otworach w większym powiększeniu, aby ocenić ogólny wzór. Wypreparowane fragmenty zostały również pocięte wibrującymi mikrotonami.

Grot strzały wskazuje na zwiększone barwienie w sonicznym jeżu zerowym dystalnym końcówce w sekcjach uzyskanych za pomocą barwienia tunelowego kriostatu w połączeniu z OT Tracker w tych warstwach, chociaż nie ma ścisłej korelacji jeden do jednego między trackerem lyo a barwieniem tunelowym, ogólne obszary PCD znacznie się pokrywają przy większym powiększeniu. Możliwe jest zobaczenie nakłucia, które zabarwiło się pozytywnie w teście tunelowym, ale nie nakłucia matrycy otra, które plami tylko za pomocą matrycy lira i nakłucia, które mają nakładające się barwienie. Po 10 dniach hodowli ciała zarodka komórki różnicują się w różne typy komórek, w tym neurony, komórki mięśniowe i kardiomiocyty.

W normalnej hodowli zróżnicowanych komórek ES znajduje się kilka komórek, które przeszły PCD, jak wykryto za pomocą lyo trackera i testów tunelowych. Kolejne komórki potraktowano nadtlenkiem wodoru w celu wywołania śmierci komórki w wyniku stresu oksydacyjnego. Niska dawka nadtlenku wodoru zwiększała zarówno lyo tracker, jak i barwienie tunelowe w porównaniu z brakiem leczenia.

Podobnie jak wyniki w zarodku, oba barwniki oznaczały wspólne i unikalne komórki. Wysoka dawka nadtlenku wodoru spowodowała kurczenie się komórek i bardziej rozpowszechnienie śledzenia OT i pozytywności tunelowej. Dla porównania, głód surowicy stosowano do wywołania autofagii po jednej godzinie głodzenia surowicy.

Zwiększone barwienie trackera OT. Jednak dodatnie nastawienie do tuneli pozostało na normalnym poziomie. Tak więc, chociaż reer jest łatwy i użyteczny, ważne jest, aby przeprowadzić dodatkowe testy w celu ustalenia, czy barwienie reprezentuje apoptozę lub autofagię po ilościowym określeniu próbek.

Korzystając z prostej metody Photoshopa pokazanej wcześniej, wyniki potwierdziły, że rosnące stężenie nadtlenku wodoru spowodowało wyższy poziom barwienia lys tracker Po opanowaniu tej procedury barwienia można wykonać w mniej niż dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak barwienie immunologiczne NX in five lub lc three, można wykonać w celu potwierdzenia rodzaju śmierci komórki. Nie zapominaj, że obecnie Trecker green działa tylko na żywych komórkach, więc Reca red jest najlepszą opcją dla próbek, które wymagają fiksacji.