Name: Nawracające opryszczkowe zapalenie rogówki zrębu u myszy, model do badania ludzkiego HSK (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj model nawracającego opryszczkowego zapalenia rogówki zrębu u myszy, który naśladuje ludzką chorobę HSV. Ta metoda pozwala badać reaktywację wirusa i oceniać potencjalne terapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Jayowi Pepose za pomoc w nauce obsługi modelu. Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) oraz z bezzasadniczego grantu Research to Prevent Blindness przyznanego Katedrze Okulistyki.

Uwaga dotycząca opieki nad zwierzętami: W tym modelu nie stosuje się leków przeciwbólowych, ponieważ wykazują one działanie przeciwzapalne, co mogłoby unieważnić wyniki modelu.
1. Przygotowanie wirusa
<ol>
	<li>Namnażać HSV-1 na komórkach Vero (80% konfluencji), stosując rozcieńczenie początkowe wynoszące 0,01 wielokrotności infekcji (w kolbie T-150, około 5 x 105 jednostek tworzących plaque) przez 3-4 dni, aż wszystkie komórki ulegną zaokrągleniu i będą łatwo oddzielone po uderzeniu w kolbę.</li>
	<li>Przenieść pożywkę do sterylnych probówek wirówkowych i wirować w wirówce Sorvall Legend RT w temperaturze 4 °C przy 3 500 rpm przez 15 min. Po usunięciu nadsączu (patrz 1.3), resuspendować duży osad z każdej probówki 50 ml w łącznie 5 ml pożywki. Sonikować przez 1 min w dwóch 30-sekundowych impulsach.</li>
	<li>Usunąć nadsącz, przelać do sterylnych probówek Oak Ridge 50 ml i wirować przy 9 000 rpm przez 1 h w temperaturze 4 °C w wirówce Beckman J2-21. Celem jest uzyskanie małego osadu wirusowego. Odrzucić nadsącz.</li>
	<li>Połączyć materiał po sonikacji z punktu 1.2 z osadem z punktu 1.3 i ponownie sonikować przez 45 s. Wirować w wirówce Sorvall Legend RT przy 1 500 rpm przez 5 min w temperaturze 4 °C. Zebrać nadsącz. Stanowi on zapas wirusa, który należy rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
	<li>Oznaczyć miano wirusa na komórkach Vero. Zazwyczaj wysiewa się rozcieńczenia od 100 do 10-8 (każde będąc rozcieńczeniem 10-krotnym) dwukrotnie z dwóch oddzielnych serii rozcieńczeń. Miareczkowanie wirusa przeprowadza się na sterylnych płytkach 12-dołkowych.</li>
</ol>
2. Zakażanie myszy
<ol>
	<li>Każdej myszy wstrzyknąć 0,1 ml koktajlu anestetycznego na 20 g masy ciała myszy (Ketamina 60 mg/kg + Ksylazyna 5 mg/kg rozpuszczone w HBSS). Koktajl ten jest stosowany, ponieważ przy zachowaniu odpowiednich dawek stanowi jeden z najbezpieczniejszych środków znieczulających, a działanie leku jest bardzo krótkotrwałe.</li>
	<li>Po znieczuleniu myszy należy podrapać rogówkę prawego oka igłą o rozmiarze 30 G, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, aby upewnić się, że rogówka nie została przebita.</li>
	<li>Każdej myszy podano dootrzewnowo 1 ml puli ludzkiej surowicy (Sigma, Temecula, Calif.; reaktywność przeciw-HSV z dawką efektywną dla 50% neutralizacji wirusa wynoszącą 1:800) w celu ochrony rogówek przed uszkodzeniem podczas pierwotnej infekcji.</li>
	<li>Ponumerować myszy za pomocą klipsów usznych lub dziurkacza do uszu.</li>
	<li>Po ponumerowaniu wszystkich myszy, za pomocą pipety 20 μl, zainfekować każde oko dawką 106 PFU (5 μl). Infekcję wywołuje się tylko w jednym oku, zazwyczaj w prawym. Do drugiego oka należy nanieść 5 μl HBSS, aby utrzymać jego wilgotność podczas znieczulenia. Ilość 5 μl jest wystarczająca do nawilżenia oczu, ponieważ procedury trwają mniej niż 10 min, a zwierzęta otrzymują odpowiednią dawkę środka anestetycznego. Infekcję potwierdza się 3 dni po zakażeniu poprzez wymaz z oczu myszy za pomocą sterylnego aplikatora bawełnianego nawilżonego w 1 ml medium do komórek Vero. Następnie 100 μl wymazu dodaje się do komórek Vero hodowanych na płytkach 48-dołkowych. Płytki te są codziennie monitorowane pod kątem efektu cytopatycznego (cpe).</li>
</ol>
3. Reaktywacja myszy z fazy utajenia
<ol>
	<li>Myszy poddaje się znieczuleniu co najmniej 5 tygodni po pierwotnym zakażeniu. Należy zaznaczyć, że przeprowadzaliśmy reaktywację u myszy nawet rok po pierwotnym zakażeniu i nie zaobserwowano istotnych różnic w odpowiedzi.</li>
	<li>Po znieczuleniu myszy umieszcza się na transiluminatorze TM20 Chromato-Vu, który emituje promieniowanie UV-B o szczytowej długości fali 302 nm, w taki sposób, aby na światło UV-B wystawione było tylko jedno oko. Każda mysz jest eksponowana na dawkę 250 mJ promieniowania UV-B na cm2.</li>
	<li>Reaktywację określa się poprzez wymaz z oczu sterylnym aplikatorem bawełnianym, który w dniu 0 (przed ekspozycją na UV-B w celu kontroli spontanicznego wydalania wirusa) oraz następnie w dniach od 1 do 7 po napromieniowaniu UV-B jest zanurzony w 1 ml pożywki Vero. Materiał z wymazu ocenia się zgodnie z opisem w sekcji 2.5). W przypadku wymazów zawierających wirusa zakaźnego, ilość wirusa jest miareczkowana standardowym testem plackowym z użyciem płytek 12-dołkowych.</li>
</ol>
4. Ocena kliniczna
<ol>
	<li>Myszy są oceniane pod kątem klinicznych objawów choroby oczu przez zaślepionego obserwatora przy użyciu binokularowego mikroskopu stereoskopowego.</li>
	<li>Zmętnienie rogówki ocenia się w skali od 0 do 4, gdzie 0 oznacza przejrzystą stromę, 1 oznacza lekkie zmętnienie stromy, 2 oznacza umiarkowane zmętnienie z widocznymi cechami tęczówki, 3 oznacza gęste zmętnienie z utratą wyraźnych detali tęczówki z wyjątkiem brzegów źrenicy, a 4 oznacza całkowite zmętnienie bez możliwości wglądu w tylne części oka.</li>
	<li>Neowaskularyzację ocenia się w skali od 1 do 8, dzieląc rogówkę na 4 równe kwadranty i określając stopień unaczynienia w każdym z tych kwadrantów.</li>
	<li>Zapalenie powiek mierzy się w następujący sposób: 0 – brak zmian; 1 – minimalny obrzęk powiek; 2 – umiarkowany obrzęk i strupowa wydzielina oczna; 3 – silny obrzęk, umiarkowana utrata włókien wokół oczu i zmiany skórne; oraz 4 – silny obrzęk z całkowitym zaklejeniem oczu strupami, silna utrata włókien wokół oczu oraz zmiany skórne.</li>
	<li>Objawy zapalenia mózgu obejmowały zgarbienie grzbietu, zjeżoną sierść i wyraźne nieprawidłowości neurologiczne. Myszy są uśmiercane w przypadku wystąpienia istotnych objawów zapalenia mózgu.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Opisany powyżej model nawrotów został po raz pierwszy opublikowany przez Shimelda et al. 1-3. Został on przez nich przetestowany, a nasze laboratorium stosuje jego zmodyfikowaną wersję w celu publikacji wielu prac naukowych na przestrzeni lat 4-15. Model ten wykorzystano do zdefiniowania roli, jaką cytokina interferon-γ odgrywa w nawrotowej postaci choroby wywołanej przez HSV-1 10. Jak pokazano na Rysunku 3, myszy z niedoborem IFNγ wykazywały cięższy przebieg choroby rogówki niż myszy typu dzikiego 14. Model ten z powodzeniem wykorzystano również do określenia wartości terapeutycznej kilku różnych konstruktów szczepionkowych 6,10,11. Należy zauważyć, że w jednym przypadku przetestowana szczepionka działała dobrze profilaktycznie, ale nie okazała się skuteczna terapeutycznie 6. Jednakże, gdy przetestowano szczepionkę wirusową niezdolną do replikacji, okazała się ona skuteczna nie tylko profilaktycznie, ale również bardzo skuteczna terapeutycznie 10,11 (patrz Rysunek 5 w referencji 10). Niedawno wykorzystaliśmy ten model, aby sprawdzić, czy w przypadku myszy z nawrotowym HSK można wykryć różnice ze względu na płeć. Jak demonstruje Rysunek 1, samce myszy C57BL/6 wykazują znacznie mniejszą mętność rogówki niż samice myszy C57BL/6. Podobnie, podczas oceny neowaskularyzacji rogówki, u samców myszy stwierdzono znacznie mniejszy wzrost nowych naczyń w rogówce niż u samic (Rysunek 2). Obecnie badamy, czy fenotyp ten jest specyficzny dla szczepu, przeprowadzając podobne analizy u innych szczepów myszy. Ustalimy również, czy różnica ta wynika z braku testosteronu, czy z obecności estrogenu.
<img alt="Zmętnienie rogówki w zależności od dni po naświetlaniu UV-B; wykres liniowy porównujący osobniki żeńskie i męskie." src="/files/ftp_upload/4276/4276fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Choroba rogówki u samców i samic myszy szczepu C57BL/6 po reaktywacji wywołanej promieniowaniem UV-B. U myszy z utajoną infekcją wywołano reaktywację za pomocą naświetlania UV-B, a następnie monitorowano zmętnienie rogówki przez 35 dni. Liczba myszy wykorzystanych w tych badaniach wynosiła: samce, n = 15; samice, n = 15. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. *W dniach 14-35 u samic myszy C57BL/6 zaobserwowano znacznie silniejszy przebieg choroby wywołanej wirusem (P = 0,001 do 0,01).
<img alt="Neowaskularyzacja rogówki; ekspozycja na UV-B; wykres; samce vs samice; po napromieniowaniu; analiza danych." src="/files/ftp_upload/4276/4276fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Choroba rogówki u samców i samic myszy szczepu C57BL/6 po reaktywacji indukowanej UV-B. U myszy z utajoną infekcją wywołano reaktywację za pomocą napromieniowania UV-B, a następnie monitorowano neowaskularyzację rogówki przez 35 dni. Liczba myszy wykorzystanych w tych badaniach wynosiła: samce, n = 15; samice, n = 15. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. *Odnotowano istotnie większy stopień choroby indukowanej wirusem u samic myszy C57BL/6 w dniach 14-28 (P = 0,001 do 0,01).

<ol><li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+model+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).</li>
<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+latent+infection+and+induction+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).</li>
<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+immunization+protects+the+mouse+eye+from+damage+after+herpes+simplex+virus+infection+by+limiting+spread+of+virus+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system.</a> J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).</li>
<li>Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+model+of+recurrent+herpes+simplex+viral+keratitis+induced+by+ultraviolet+B+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).</li>
<li>Keadle, T. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+ameliorates+corneal+disease+in+a+mouse+model+of+recurrent+herpetic+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Path%22%5BJournal%5D)">IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis.</a> Microbial Path. 38, 13-21 (2005).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+recombinant+glycoprotein+D+subunit+vaccine+on+the+development+of+primary+and+recurrent+ocular+infection+with+herpes+simplex+virus+type+1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inf.+Dis%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice.</a> J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines+IL-1+and+TNF-a+are+required+for+recurrent+herpetic+keratitis+in+NIH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).</li>
<li>Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+cytokine+expression+in+a+murine+model+recurrent+herpetic+stromal+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Immunol.+Inflam%22%5BJournal%5D)">Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).</li>
<li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+and+CD8%2B+cells+are+key+participants+in+the+development+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Path%22%5BJournal%5D)">CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> Microbial Path. 32, 255-262 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+immunization+with+a+virion+host+shutoff-defective%2C+replication-incompetent+herpes+simplex+virus+type+1+strain+limits+recurrent+herpetic+ocular+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection.</a> J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+vaccination+with+vhs%28-%29+herpes+simplex+virus+reduces+the+severity+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+aminoguanidine+on+primary+and+recurrent+ocular+herpes+simplex+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection.</a> Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).</li>
<li>Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL3+protects+mice+from+corneal+pathology+during+recurrent+HSV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection.</a> Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).</li>
<li>Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+gamma+is+not+required+for+recurrent+herpetic+stromal+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Virology. 380, 46-51 (2008).</li>
<li>Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Interferon-gamma+by+an+adenovirus+vector+blocks+herpes+simplex+virus+Type+1+reactivation+in+vitro+and+in+vivo+independent+of+RNase+L+and+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways.</a> J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Opisany tutaj nawrotny model opaliskowego zapaleniay keratostromalnego (HSK) umożliwia badaczowi analizę ludzkiego HSK w modelu, który jest bardziej spójny z przebiegiem obserwowanym podczas choroby u ludzi. Zatem zaletą tego modelu jest to, że choroba rozwija się w kontekście układu odpornościowego, który został już pobudzony podczas pierwotnego zachorowania. Ponieważ myszy te wykazują już odpowiedź immunologiczną na HSV-1, czynniki reaktywujące tę odpowiedź są prawdopodobnie inne niż te, które pierwotnie ją wywołały. W...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Surowica ludzka</td><td>Sigma</td><td>S7023</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-C1</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman</td><td>52-21</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminator</td><td>UVP</td><td>95-0452-02</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>Branson</td><td>Sonifier 450</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Oak Ridge</td><td>Nalgene</td><td>Z 720410</td><td></td></tr><tr><td>Kolby- 7150</td><td>Corning</td><td>430823</td><td></td></tr><tr><td>Płytki- 12-dołkowe</td><td>Corning</td><td>CLS 3513</td><td></td></tr><tr><td>Płytki- 48-dołkowe</td><td>Corning</td><td>CLS 3548</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki stożkowe- 30 ml</td><td>Corning</td><td>CLS 430828</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>Igły 30G</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Igły 25G</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>BD</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr></tbody></table>

nawracające opłykowe zapalenie stromy rogówki u myszy jako model do badania ludzkiego hsk

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Opryczkowa choroba oka, określana mianem opryczkowego zapaleniay stromo keratitis (HSK), jest potencjalnie prowadzącą do ślepoty infekcją rogówki, która skutkuje ponad 300 000 wizyt klinicznych rocznie w celu leczenia. Od 1 do 2 procent pacjentów z chorobą kliniczną doświadczy utraty wzroku w zainfekowanej rogówce. Ogromna większość tych przypadków jest wynikiem reaktywacji utajonej infekcji wywołanej przez wirus herpes simplex typu I, a nie wynika z ostrego przebiegu choroby. Co ciekawe, do badania tej choroby najczęściej wykorzystuje się model infekcji ostrej. Uznano jednak, że nawracający model HSK byłby bardziej odzwierciedlał procesy zachodzące podczas choroby klinicznej. W nawracających modelach zwierzęcych HSK wykorzystywano zarówno króliki, jak i myszy. Przewagą królików jest to, że doświadczają one reaktywacji z okresu utajenia bez żadnego znanego bodźca. Mimo to trudno jest badać rolę wielu czynników immunologicznych w nawracającym HSK, ponieważ model króliczy nie dysponuje takimi zasobami immunologicznymi i genetycznymi, jakie posiada mysz. Zdecydowaliśmy się na wykorzystanie modelu mysiego w nawracającym HSK, ponieważ daje on korzyść w postaci wielu dostępnych zasobów, a ponadto wiemy, kiedy nastąpi reaktywacja, gdyż jest ona indukowana ekspozycją na światło UV-B. Do tej pory model ten pozwolił laboratoriom go stosującym na zdefiniowanie kilku czynników immunologicznych istotnych dla tej choroby. Umożliwił nam on również przetestowanie skuteczności zarówno terapii, jak i szczepionek.

Większość badań nad opryszczkowym zapaleniem rogówki wykorzystuje model infekcji pierwotnej. Jednakże infekcja pierwotna HSV-1 zazwyczaj nie prowadzi do rozwoju choroby u ludzi. W niniejszej pracy opisujemy model nawrotowy opryszczkowej choroby rogówki, który dokładniej naśladuje przebieg choroby u ludzi.

Nawracające opłykowe zapalenie stromy rogówki u myszy jako model do badania ludzkiego HSK

Opryszczkowa choroba oka, określana jako opryszczkowe zapalenieytstromy rogówki (HSK), jest potencjalnie prowadzącą do ślepoty infekcją rogówki, która skutkuje ponad 300 000 przypadków klinicznych...

Ogólnym celem tej procedury jest badanie nawrotowej infekcji wirusem prostego opryczu lub HSV. Osiąga się to poprzez najpierw zainfekowanie myszy w taki sposób, aby doszło do infekcji utajonej bez uszkodzenia rogówki. Po pełnym ustanowieniu stanu utajenia, kolejnym krokiem jest reaktywacja wirusa poprzez ekspozycję na światło UVB; w ostatnim etapie pobiera się film łzowy w celu wykrycia uwalniania wirusa, a następnie mysz jest obserwowana przez co najmniej pięć tygodni w celu monitorowania przebiegu choroby.Ostatecznie stopień zaawansowania choroby u myszy można ocenić poprzez punktację stopnia zaawansowania opałowego zapalenia keratostromowego. Jest to choroba dotykająca wiele osób na całym świecie. To konkretne schorzenie jest jedną z głównych przyczyn infekcyjnej ślepoty.Posługujemy się modelem u myszy, który naśladuje tę konkretną chorobę. Istnieją inne modele, które również potrafią odwzorować tę chorobę, jednak uważamy, że ten stanowi najlepszą reprezentację tego konkretnego schorzenia. Chciałbym poświęcić teraz kilka minut na przedstawienie osób, które zobaczą Państwo w tym filmie.To jest Chloe, która współpracuje ze mną od kilku ostatnich miesięcy. To jest Nippo, student praktykant pracujący w laboratorium. Rozpocznij eksperyment od hodowli HSV one na komórkach Vero przez trzy do czterech dni, aż do osiągnięcia 80% konfluencji w kolbie T one 50.Do tego czasu komórki powinny się zaokrąglić i będą łatwo odczepiać się po uderzeniu w kolbę. Przenieś zawiesinę komórkową do sterylnych probówek stożkowych o pojemności 50 ml, a następnie odwirowuj komórki przez 15 minut. Ustaw wirowarkę stołową na 1 510 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie przenieś naddestynat do sterylnych probówek Oak Ridge o pojemności 50 ml, a następnie rozdziel łącznie pięć mililitrów medium pomiędzy poszczególne probówki stożkowe w celu resuspensji. Resuspenduj duże osady, a następnie poddaj je sonikacji przez jedną minutę w dwóch seriach po 32 sekundy. Po odwirowaniu naddestynatu w wysokoprędkościowej wirówce stacjonarnej powstanie mały osad wirusowy.Po odlaniu nadosadu połącz osad z małymi peletami wirusowymi i ponownie poddaj sonikacji przez 45 sekund. Następnie wiruj roztwór sonikowanych komórek i wirusów w wirówce stołowej przez pięć minut przy 280 ×g i 4 °C, a następnie podziel nadosad na alykwoaty i przechowuj jako zapas wirusa w temperaturze -70 °C do czasu miareczkowania na płytkach.Dziesięciokrotne rozcieńczenia wirusa z supernatantu zapasu wirusowego od 10⁰ do 10⁻⁸, wykonane dwukrotnie z dwóch osobnych serii rozcieńczeń komórek Vero w sterylnych płytkach 12-dołkowych. Procedurę infekcji rozpoczyna się od znieczulenia myszy. Mysz powinna pozostawać w pełnej narkozie przez 20 do 30 minut, aby umożliwić wchłonięcie wirusa przed przebudzeniem zwierzęcia.Następnie pod mikroskopem stereoskopowym, używając igły o rozmiarze 30 G, należy naciąć rogówkę prawego oka. Teraz należy ponumerować zwierzę za pomocą dziurkacza do uszu. Następnie wstrzyknij myszy jeden mililitr połączonego serum ludzkiego, aby chronić rogówki przed uszkodzeniem podczas pierwotnej infekcji.Następnie za pomocą pipety 20 µL zainfekuj porysowane oko dawką 10⁶ jednostek tworzących plakietki, a do drugiego oka wprowadź 5 µL HBSS, aby utrzymać jego wilgotność podczas znieczulenia zwierzęcia w celu potwierdzenia infekcji. Nawilż sterylną patyczkową aplikatorem 1 mL pożywki Vero. Trzy dni po infekcji przemyj zainfekowane oko aplikatorem, a następnie przenieś 100 µL pobranej pożywki do komórek Vero hodowanych na płytkach 48-dołkowych co najmniej pięć tygodni po pierwotnej infekcji.Przetrzyj zakażone oko znieczulonej myszy za pomocą wymazówki, tak jak pokazano. Oznacz datę wykonania wymazu jako dzień zero na pokrywce płytki 48-dołkowej, aby kontrolować spontaniczne mruganie. Następnie umieść mysz w transluminatorze emitującym UVB o szczytowej długości fali 302 nanometrów w taki sposób, aby na światło UVB wystawione było tylko jedno oko, i naświetl mysz dawką 250 milidżuli światła UVB na centymetr kwadratowy.Następnie codziennie od pierwszego do siódmego dnia pobieraj wymazy z oka. Po naświetlaniu UVB, w przypadku wymazów zawierających zakaźnego wirusa, określ ilość wirusa za pomocą standardowego testu plackowego z wykorzystaniem płytek 12-dołkowych, aby ocenić myszy pod kątem klinicznych objawów choroby oka. Umieść mysz pod stereomikroskopem.Zmętnienie rogówki ocenia się w skali od zera do czterech, gdzie zero oznacza przejrzystą stromoę, a jeden wskazuje na łagodne zmętnienie stromy. Dwa oznacza umiarkowane zmętnienie z widoczną tęczówką. Trzy wskazuje na gęste zmętnienie z utratą szczegółów tęczówki, z wyjątkiem brzegów źrenicy, a cztery oznacza całkowite zmętnienie bez możliwości widoczności struktur tylnych.Neowaskularyzację ocenia się w skali od jeden do ośmiu poprzez podział rogówki na cztery równe kwadranty i określenie zakresu unaczynienia w każdym z nich. Na pierwszej rycinie przedstawiono myszy z utajoną infekcją, u których wywołano reaktywację za pomocą promieniowania UVB, a następnie monitorowano zmętnienie rogówki przez 35 dni. Dane te wykazują, że samce myszy C 57 black six wykazują znacznie mniejsze zmętnienie rogówki niż samice myszy C 57 black six, ponieważ w dniach od 14 do 35 u samic myszy C 57 black six zaobserwowano znacznie silniejszy przebieg choroby wywołanej przez wirusa.Analogicznie, gdy oceniano neowaskularyzację rogówki w tych samych warunkach eksperymentalnych, u samców myszy stwierdzono znacznie mniejszy wzrost nowych naczyń w rogówce niż u samic, i ponownie zaobserwowano znacznie silniejszą indukowaną wirusem chorobę u samic myszy C 57 black six w dniach od 14 do 28. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pełnym znieczuleniu myszy, aby pozostały w stanie uśpienia przez okres od 20 do 30 minut. Mam nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu zrozumieją Państwo, jak wykorzystać model mysi nawracającego zapaleniay rogówki w celu badania tej ludzkiej choroby.

recurrent-herpetic-stromal-keratitis-mice-model-for-studying-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Nawrotowa rzeżączkowa stromatytka rogówki u myszy, model do badań nad ludzką rzeżączkowa stromatytką rogówki

W niniejszym artykule wideo opisujemy zastosowanie nowego modelu ex vivo ostrej infekcji nabłonka rogówki wirusem prostego typu I.

Ex Vivo organotypowy model rogówki w ostrym zakażeniu nabłonka wirusem opryszczki prostym typu I

Ten film demonstruje metodę generowania podwójnie humanizowanego modelu myszy z ludzkim układem odpornościowym i komórkami wątroby. Polega na przeszczepieniu ludzkich komórek wątroby oraz hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych transgenicznej myszy z niedoborem odporności poprzez wstrzyknięcie dośledzionowe, co prowadzi do wszczepienia komórek wątroby i rozwoju ludzkich komórek odpornościowych.

Opracowanie humanizowanego modelu myszy z ludzkimi komórkami wątroby i komórkami odpornościowymi

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane za pomocą laserowej fotokoagulacji siatki beleczkowej w oczach myszy. Ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) utrzymuje się podwyższone przez kilka miesięcy po leczeniu laserowym. Spadek ostrości wzroku i wrażliwości na kontrast u zwierząt doświadczalnych monitoruje się za pomocą testu optomotorycznego.

Mysi model przewlekłego nadciśnienia ocznego indukowany laserem w celu scharakteryzowania wad wzroku

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Skóra jest jednym z celów ludzkiego patogenu wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1). Aby zbadać drogę inwazji HSV-1 do tkanki, ustaliliśmy model infekcji ex vivo mysich arkuszy naskórka, które reprezentują najbardziej zewnętrzną warstwę skóry.

Ex vivo Zakażenie mysiego naskórka wirusem opryszczki pospolitej typu 1

Ten protokół zapewnia metodę tworzenia humanizowanych myszy (hu-NSG) poprzez dowątrobowe wstrzykiwanie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych do kondycjonowanych promieniowaniem noworodków NSG. Mysz hu-NSG jest podatna na zakażenie wirusem HIV i skojarzoną terapię antyretrowirusową (cART) i służy jako odpowiedni model patofizjologiczny do badań replikacji i latencji HIV.

Humanizowany mysi modelNOD/SCID/IL2rγ null (hu-NSG) do badań replikacji i latencji HIV

Opisane tutaj są trzy eksperymentalne podejścia do badania dynamiki infekcji HIV u humanizowanych myszy. Pierwsza z nich pozwala na badanie przewlekłych zdarzeń infekcyjnych, podczas gdy dwie ostatnie pozwalają na badanie ostrych zdarzeń po pierwotnym zakażeniu lub reaktywacji wirusa.

Przewlekłe, ostre i reaktywowane zakażenie wirusem HIV w humanizowanych modelach myszy z niedoborem odporności

Model inokulacji opuszki stopy jest cennym narzędziem do charakteryzowania indukowanych przez wirusy reakcji neurozapalnych in vivo. W szczególności zapewnia jasną ocenę kinetyki wirusa i związanych z nią procesów immunopatologicznych inicjowanych w obwodowym układzie nerwowym.

Model inokulacji opuszki stopy myszy do badania reakcji neurozapalnych wywołanych wirusem

Opisujemy użycie rogówki świni do testowania skuteczności przeciwwirusowej eksperymentalnych leków.

Eksplant tkanki rogówki świni w celu zbadania skuteczności leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi opryszczki pospolitej-1

Nadwrażliwość kontaktowa (CHS) to mysi eksperymentalny model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry (ACD). CHS opiera się na uczuleniu na reaktywny hapten poprzez malowanie ogolonej skóry klatki piersiowej i brzucha, a następnie prowokację skóry ucha rozcieńczonym haptenem, powodując reakcję obrzęku, która jest oceniana na różne sposoby.

Nadwrażliwość kontaktowa jako mysi model alergicznego kontaktowego zapalenia skóry

Ten protokół wyjaśni, jak ustanowić model myszy z bliznami przerostowymi, który zwiększa sygnalizację mechanotransdukcji, aby symulować blizny podobne do ludzkich. Metoda ta polega na zwiększeniu napięcia mechanicznego w poprzek gojącego się nacięcia u myszy i użyciu specjalistycznego urządzenia do stworzenia powtarzalnej, nadmiernej tkanki bliznowatej do szczegółowych analiz histologicznych i bioinformatycznych.

Mysi model napędzanych mechanotransdukcją, podobnych do ludzkich blizn przerostowych

Poznaj model nawracającego opryszczkowego zapalenia rogówki zrębu u myszy, który naśladuje ludzką chorobę HSV. Ta metoda pozwala badać reaktywację wirusa i oceniać potencjalne terapie.

Nawracające opłykowe zapalenie stromy rogówki u myszy jako model do badania ludzkiego HSK

Przeglądaj więcej filmów