Nawracające opłykowe zapalenie stromy rogówki u myszy jako model do badania ludzkiego HSK

Ogólnym celem tej procedury jest badanie nawrotowej infekcji wirusem prostego opryczu lub HSV. Osiąga się to poprzez najpierw zainfekowanie myszy w taki sposób, aby doszło do infekcji utajonej bez uszkodzenia rogówki. Po pełnym ustanowieniu stanu utajenia, kolejnym krokiem jest reaktywacja wirusa poprzez ekspozycję na światło UVB; w ostatnim etapie pobiera się film łzowy w celu wykrycia uwalniania wirusa, a następnie mysz jest obserwowana przez co najmniej pięć tygodni w celu monitorowania przebiegu choroby.

Ostatecznie stopień zaawansowania choroby u myszy można ocenić poprzez punktację stopnia zaawansowania opałowego zapalenia keratostromowego. Jest to choroba dotykająca wiele osób na całym świecie. To konkretne schorzenie jest jedną z głównych przyczyn infekcyjnej ślepoty.

Posługujemy się modelem u myszy, który naśladuje tę konkretną chorobę. Istnieją inne modele, które również potrafią odwzorować tę chorobę, jednak uważamy, że ten stanowi najlepszą reprezentację tego konkretnego schorzenia. Chciałbym poświęcić teraz kilka minut na przedstawienie osób, które zobaczą Państwo w tym filmie.

To jest Chloe, która współpracuje ze mną od kilku ostatnich miesięcy. To jest Nippo, student praktykant pracujący w laboratorium. Rozpocznij eksperyment od hodowli HSV one na komórkach Vero przez trzy do czterech dni, aż do osiągnięcia 80% konfluencji w kolbie T one 50.

Do tego czasu komórki powinny się zaokrąglić i będą łatwo odczepiać się po uderzeniu w kolbę. Przenieś zawiesinę komórkową do sterylnych probówek stożkowych o pojemności 50 ml, a następnie odwirowuj komórki przez 15 minut. Ustaw wirowarkę stołową na 1 510 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przenieś naddestynat do sterylnych probówek Oak Ridge o pojemności 50 ml, a następnie rozdziel łącznie pięć mililitrów medium pomiędzy poszczególne probówki stożkowe w celu resuspensji. Resuspenduj duże osady, a następnie poddaj je sonikacji przez jedną minutę w dwóch seriach po 32 sekundy. Po odwirowaniu naddestynatu w wysokoprędkościowej wirówce stacjonarnej powstanie mały osad wirusowy.

Po odlaniu nadosadu połącz osad z małymi peletami wirusowymi i ponownie poddaj sonikacji przez 45 sekund. Następnie wiruj roztwór sonikowanych komórek i wirusów w wirówce stołowej przez pięć minut przy 280 ×g i 4 °C, a następnie podziel nadosad na alykwoaty i przechowuj jako zapas wirusa w temperaturze -70 °C do czasu miareczkowania na płytkach.

Dziesięciokrotne rozcieńczenia wirusa z supernatantu zapasu wirusowego od 10⁰ do 10⁻⁸, wykonane dwukrotnie z dwóch osobnych serii rozcieńczeń komórek Vero w sterylnych płytkach 12-dołkowych. Procedurę infekcji rozpoczyna się od znieczulenia myszy. Mysz powinna pozostawać w pełnej narkozie przez 20 do 30 minut, aby umożliwić wchłonięcie wirusa przed przebudzeniem zwierzęcia.

Następnie pod mikroskopem stereoskopowym, używając igły o rozmiarze 30 G, należy naciąć rogówkę prawego oka. Teraz należy ponumerować zwierzę za pomocą dziurkacza do uszu. Następnie wstrzyknij myszy jeden mililitr połączonego serum ludzkiego, aby chronić rogówki przed uszkodzeniem podczas pierwotnej infekcji.

Następnie za pomocą pipety 20 µL zainfekuj porysowane oko dawką 10⁶ jednostek tworzących plakietki, a do drugiego oka wprowadź 5 µL HBSS, aby utrzymać jego wilgotność podczas znieczulenia zwierzęcia w celu potwierdzenia infekcji. Nawilż sterylną patyczkową aplikatorem 1 mL pożywki Vero. Trzy dni po infekcji przemyj zainfekowane oko aplikatorem, a następnie przenieś 100 µL pobranej pożywki do komórek Vero hodowanych na płytkach 48-dołkowych co najmniej pięć tygodni po pierwotnej infekcji.

Przetrzyj zakażone oko znieczulonej myszy za pomocą wymazówki, tak jak pokazano. Oznacz datę wykonania wymazu jako dzień zero na pokrywce płytki 48-dołkowej, aby kontrolować spontaniczne mruganie. Następnie umieść mysz w transluminatorze emitującym UVB o szczytowej długości fali 302 nanometrów w taki sposób, aby na światło UVB wystawione było tylko jedno oko, i naświetl mysz dawką 250 milidżuli światła UVB na centymetr kwadratowy.

Następnie codziennie od pierwszego do siódmego dnia pobieraj wymazy z oka. Po naświetlaniu UVB, w przypadku wymazów zawierających zakaźnego wirusa, określ ilość wirusa za pomocą standardowego testu plackowego z wykorzystaniem płytek 12-dołkowych, aby ocenić myszy pod kątem klinicznych objawów choroby oka. Umieść mysz pod stereomikroskopem.

Zmętnienie rogówki ocenia się w skali od zera do czterech, gdzie zero oznacza przejrzystą stromoę, a jeden wskazuje na łagodne zmętnienie stromy. Dwa oznacza umiarkowane zmętnienie z widoczną tęczówką. Trzy wskazuje na gęste zmętnienie z utratą szczegółów tęczówki, z wyjątkiem brzegów źrenicy, a cztery oznacza całkowite zmętnienie bez możliwości widoczności struktur tylnych.

Neowaskularyzację ocenia się w skali od jeden do ośmiu poprzez podział rogówki na cztery równe kwadranty i określenie zakresu unaczynienia w każdym z nich. Na pierwszej rycinie przedstawiono myszy z utajoną infekcją, u których wywołano reaktywację za pomocą promieniowania UVB, a następnie monitorowano zmętnienie rogówki przez 35 dni. Dane te wykazują, że samce myszy C 57 black six wykazują znacznie mniejsze zmętnienie rogówki niż samice myszy C 57 black six, ponieważ w dniach od 14 do 35 u samic myszy C 57 black six zaobserwowano znacznie silniejszy przebieg choroby wywołanej przez wirusa.

Analogicznie, gdy oceniano neowaskularyzację rogówki w tych samych warunkach eksperymentalnych, u samców myszy stwierdzono znacznie mniejszy wzrost nowych naczyń w rogówce niż u samic, i ponownie zaobserwowano znacznie silniejszą indukowaną wirusem chorobę u samic myszy C 57 black six w dniach od 14 do 28. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pełnym znieczuleniu myszy, aby pozostały w stanie uśpienia przez okres od 20 do 30 minut. Mam nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu zrozumieją Państwo, jak wykorzystać model mysi nawracającego zapaleniay rogówki w celu badania tej ludzkiej choroby.