Name: Inżynieria tkankowa jelita w modelu mysim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Naucz się techniki inżynierii tkankowej jelita cienkiego u myszy z wykorzystaniem podejścia jednostek organoidów na rusztowaniu. Ta metoda umożliwia generowanie funkcjonalnych tkanek jelitowych do zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel i Frédéric G. Sala otrzymali wsparcie z California Institute for Regenerative Medicine (CIRM), granty numery RN2-00946-1 (TCG) oraz TG2-01168 (ERB, FGS). Allison L. Speer jest stypendystką Society of University Surgeons Ethicon. Yashuhiro Torashima jest finansowany z Children's Hospital Los Angeles Saban Institute Research Career Development Fellowship.

1. Przygotowanie jednostek organoidalnych
<ol>
 <li>Narzędzia odpowiednie do sekcji myszy (nożyczki i pęsety) należy wysterylizować w autoklawie.</li>
 <li>Przeprowadź humanitarną eutanazję myszy dawcy zgodnie z lokalnymi protokołami IACUC. Przed kontynuowaniem upewnij się, że zwierzę nie żyje.</li>
 <li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej. W razie potrzeby można odchylić płaty skóry, aby poprawić widoczność.</li>
 <li>Wyciśnij jelito cienkie i przetnij je tuż za więzadłem Treitza. Oddziel jelito cienkie od jego krezki, stosując ostrą i delikatną rozdzielczą technikę tępego rozdzielania. Zidentyfikuj połączenie kątniczo-jądrzowe i przetnij jelito cienkie 5 mm proksymalnie od tego miejsca.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek otwórz jelito wzdłuż krawędzi antykrezkowej w szalce Petriego zawierającej 10 ml sterylnego, schłodzonego do 4 °C roztworu soli Hanksa (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X roztworu antybiotyków i przeciwgrzybicznych (Anti-Anti, Invitrogen). Usuń masę kałową z otwartego jelita poprzez delikatne wstrząsanie, a następnie przenieś otwarte jelito do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml z 10 ml sterylnego HBSS / 1X anti-anti w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Umyj otwarte jelito trzykrotnie w 10 ml sterylnego HBSS / 1X anti-anti w temperaturze 4 °C w probówce. Każde płukanie można przeprowadzić, delikatnie wstrząsając probówką 15 ml przez 30 s. Po wstrząsaniu tkanka jelitowa opada na dno probówki. Usuń pływający materiał, który stanowi resztki mezenchymy. Ostrożnie odessij roztwór płuczący za pomocą pipety.</li>
 <li>Posiekaj wypłukane jelito w szalce Petriego z 10 ml sterylnego HBSS / 1X anti-anti w temperaturze 4 °C na kawałki o wielkości mniejszej niż 1 mm² za pomocą nożyczek. Zbierz posiekany materiał automatyczną pipetą i umieść go w probówce.</li>
 <li>Wirować probówkę przy 500 rpm przez 8 min. Odlej nadsącz, który zawiera tłuszcz i mezenchymę.</li>
 <li>Przetraw posiekany i wypłukany materiał w 10 ml sterylnego HBSS / 1X anti-anti z dodatkiem 0,125 mg/ml dyspazy (Invitrogen) i 800 jednostek/ml kolagenazy typu 1 (Worthington, Lakewood NJ). Aby przygotować 40 ml roztworu trawiennego, odważ 5 mg dyspazy, 142 mg kolagenazy i dodaj sterylny HBSS do uzyskania objętości 40 ml. Roztwór ten należy przygotowywać świeżo przy każdym przygotowywaniu jednostek organoidów i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Dodaj roztwór trawienny bezpośrednio do osadu z kroku 1.8.</li>
 <li>Inkubuj probówkę zawierającą posiekany i wypłukany materiał z roztworem trawiennym w temperaturze 37 °C przez 20 min.</li>
 <li>Wyjmij probówkę i dalej rozdrabniaj przetrawioną tkankę poprzez tryturację pipetą 10 ml. Powtarzaj czynność od 20 do 50 razy, aż do uzyskania jednorodnego wyglądu.</li>
 <li>Wirować probówkę przez 5 min przy 800 rpm. Odlej nadsącz, który zawiera pojedyncze komórki.</li>
 <li>Zatrzymaj reakcję trawienia, dodając 10 ml sterylnego, schłodzonego do 4 °C podłoża DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen) z dodatkiem 10% v/v inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (HI-FBS, Invitrogen). Resuspenduj osad i wstrząśnij probówką.</li>
 <li>Wirować probówkę przez 5 min przy 800 rpm. Ostrożnie usuń nadsącz automatyczną pipetą, aż do ostatnich kilku kropli. Do usunięcia ostatnich kilku kropli użyj jednorazowej plastikowej pipety, aby uniknąć ponownego zawieszenia osadu.</li>
</ol>
2. Obciążanie rusztowania z kwasu poliglikolowego
<ol>
 <li>Przygotować cylindryczne rusztowania o długości 2 mm i średnicy zewnętrznej 5 mm z niewiązanego kwasu poliglikolowego (grubość arkusza 2 mm, gęstość objętościowa 60 mg cm-3; porowatość &gt; 95%, Concordia Fibers, Coventry RI) zgodnie z opisem w Ref. 4. </li>
 <li>Odciąć nożyczkami, zdezynfekowanymi 70% etanolem w wodzie destylowanej, końcowe 2 mm jednorazowego końcówki do pipety o pojemności 1000 microliter. </li>
 <li>Umieścić rusztowanie w 4-dołkowej płytce hodowlanej. Za pomocą pipety o pojemności 1000 microliter nanieść jednostki organoidów na rusztowanie, najpierw do światła, a następnie na powierzchnię zewnętrzną. Użyć pęsety, aby zapewnić pokrycie światła. Nie naruszać ani nie rozrywać cylindrycznego kształtu polimeru. </li>
</ol>
3. Implantacja do myszy biorcy
<ol>
 <li>W razie możliwości należy użyć syngenicznego myszego gospodarza o tym samym tle genetycznym co dawca. W przeciwnym razie należy zastosować zwierzę z niedoborem odporności typu NOD/SCID (nonobese diabetic / severe combined immunodeficient) (Jackson Laboratories, Sacramento CA).</li>
 <li>Zastosować znieczulenie ogólne izofluranem. Ogolić, przygotować i obłożyć sterylną ściereczką brzuch myszy.</li>
 <li>Wyonać nacięcie w linii środkowej o długości 5 mm, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej. Zlokalizować i ostrożnie wyciągnąć sieciówkę większą. Umieścić załadowany polimer na sieciówce i owinąć go tkanką. Należy unikać przerwania ciągłości sieciówki.</li>
 <li>Przymocować polimer do sieciówki szwem monocryl 5-0. Delikatnie umieścić sieciówkę z owiniętym polimerem w jej anatomicznej pozycji.</li>
 <li>Zamknąć nacięcie brzuszne warstwowo, używając szwów vicryl 4-0. Przeszyć mięśnie, dbając o to, aby nie uszkodzić narządów jamy brzusznej poniżej nacięcia. Do zamknięcia skóry należy użyć szwów przerywanych.</li>
 <li>Podać przeciwbólowo po operacji 2 mg/kg ketoprofenu (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) w wodzie sterylnej w formie podskórnej guli w sąsiedztwie nacięcia. Stan zwierząt należy oceniać codziennie; jeśli zwierzę wykazuje objawy bólu lub stresu, w 2. dobie pooperacyjnej można podać dodatkową dawkę ketoprofenu. Do trzeciej doby po operacji zwierzę powinno całkowicie dojść do siebie, bez oznak bólu lub stresu. Jeśli ból lub stres utrzymują się w 3. dobie pooperacyjnej, uznaje się to za stan nieprawidłowy i należy podjąć działania zgodnie z protokołami IACUC oraz placówki opieki nad zwierzętami.</li>
 <li>Pozostawić mysz do rekonwalescencji i pozwolić na wzrost inżynieryjnie wytworzonemu jelitu przez cztery tygodnie. Zapewnić zwierzęciu dostęp ad libitum do karmy dla gryzoni (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) oraz wody z dodatkiem Septry (200 mg / 40 mg na 5 ml, Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) w rozcieńczeniu 1:100.</li>
</ol>
4. Zbiór
<ol>
 <li>Humanitarnie uśmierć zwierzę gospodarza cztery tygodnie po implantacji.</li>
 <li>Ponownie otwórz pierwotne cięcie i odsunąłem skórę w kierunku głowowym, aby ułatwić dostęp do jamy otrzewnej.</li>
 <li>Rozetnij warstwę mięśniową i zidentyfikuj konstrukt inżynierii tkankowej w postaci kuli tkanki.</li>
 <li>Usuń zrosty konstruktu z narządów wewnątrzbrzusznych za pomocą dyssekcji ostrej.</li>
 <li>Utrwal konstrukt w formalinie do późniejszego z embeddingu w parafinie lub wykorzystaj świeżą tkankę do analiz biochemicznych, takich jak real-time PCR lub izolacja białek.</li>
</ol>

<ol><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).</li>
<li>Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bowel+syndrome%3A+epidemiology+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Short bowel syndrome: epidemiology and etiology.</a> Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).</li>
<li>Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+method+for+the+preparation+of+rat+intestinal+epithelial+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures.</a> J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).</li>
<li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicellular+approach+forms+a+significant+amount+of+tissue-engineered+small+intestine+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss.+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse.</a> Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).</li>
<li>Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+tissue-engineered+stomach+demonstrates+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation.</a> J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).</li>
<li>Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cell+proliferation+is+dependent+on+the+site+of+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection.</a> Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).</li>
<li>Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+corrective+pullthrough+surgery+in+a+mouse+model+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease.</a> J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).</li>
<li>Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+regarding+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).</li>
<li>Shew, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+concerns+in+malrotation+and+midgut+volvulus%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus.</a> Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).</li>
<li>Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+long-term+results+and+prognostic+factors+after+conservative+surgery+for+small+bowel+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).</li>
<li>Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+results+after+surgery+for+acute+mesenteric+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia.</a> Surgery. , 121-239 (1997).</li>
<li>Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+biopsy-proven+parenteral+nutrition-associated+liver+fibrosis+and+biochemical+cholestasis+in+children+with+short+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome.</a> J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).</li>
<li>Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+short+bowel+syndrome%3A+the+cost+of+comprehensive+care%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care.</a> Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).</li>
<li>Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+and+multivisceral+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Intestinal and multivisceral transplantation in children.</a> Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).</li>
<li>Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+intestinal+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Current status of intestinal transplantation in children.</a> J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiamy protokół wytwarzania inżynieryjnej tkanki jelita u myszy z wykorzystaniem podejścia polegającego na rozmieszczeniu jednostek organoidowych na rusztowaniu. Najbardziej krytycznymi etapami są kroki przygotowania jednostek organoidowych. Należy zadbać o odpowiednie oczyszczenie i mechaniczne przetworzenie tkanki, ale równie ważna jest ostrożność, aby nie doprowadzić do nadmiernego trawienia lub zbyt silnej tryturacji jednostek organoidowych po zakończeniu trawienia (krok 1.11). W przeciwnym razie jednostki org...

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>114170-112</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-antymykotyk 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Dyspaza</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 1</td><td>Worthington</td><td>LS004194</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose 1X</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Biofelt 100% PGA</td><td>Concordia Medical</td><td>FELT01-1005</td><td>Do przygotowania polimeru zgodnie z Ref. 4 </td></tr><tr><td>Kwas poli-&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-mlekowy</td><td>Durect</td><td>B6002-1</td><td>Do przygotowania polimeru zgodnie z Ref. 4 </td></tr><tr><td>Kolagen typu I, z ogona szczura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Do przygotowania polimeru zgodnie z Ref. 4 </td></tr><tr><td>Ketoprofen 100 mg/ml</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>71-KETOI-100-50</td><td></td></tr><tr><td>Karma dla gryzoni LabDiet 5001</td><td>LabDiet</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>Septra 200 mg / 40 mg na 5 ml, USP</td><td>Hi-Tech Pharmacal</td><td>50383-824-16</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran, USP</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>57319-507-06</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria tkankowa jelita w modelu mysim

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Sztucznie wyhodowane jelito cienkie (Tissue-engineered small intestine, TESI) zostało z powodzeniem wykorzystane do ratowania szczurów linii Lewis po rozległej resekcji jelita cienkiego, co doprowadziło do powrotu do masy ciała sprzed operacji w ciągu 40 dni.1 U ludzi rozległa resekcja jelita cienkiego może prowadzić do zespołu krótkiego jelita – funkcjonalnego stanu zaburzeń wchłaniania, który wiąże się ze znaczną zachorowalnością, śmiertelnością i kosztami opieki zdrowotnej, w tym z zależnością od żywienia pozajelitowego, niewydolnością i marskością wątroby oraz koniecznością wielonarządowego przeszczepu.2 W niniejszym artykule opisujemy i dokumentujemy nasz protokół tworzenia sztucznie wyhodowanego jelita w modelu mysim z zastosowaniem podejścia opartego na wielokomórkowych jednostkach organoidowych na rusztowaniu. Jednostki organoidowe są wielokomórkowymi agregatami pochodzącymi z jelita, które zawierają elementy zarówno śluzówkowe, jak i mezenchymalne,3 a relacja między nimi pozwala na zachowanie niszy komórek macierzystych jelita.4 W toczących się i przyszłych badaniach przeniesienie naszej techniki na model mysi pozwoli na zbadanie procesów zachodzących podczas formowania TESI z wykorzystaniem narzędzi transgenicznych dostępnych u tego gatunku.5 Dostępność szczepów myszy z niedoborem odporności pozwoli nam również zastosować tę technikę do ludzkiej tkanki jelitowej i zoptymalizować tworzenie ludzkiego TESI jako ksenoprzeszczepu mysiego przed jego wdrożeniem u ludzi. Nasza metoda wykorzystuje odczynniki i materiały zgodne z Dobrą Praktyką Wytwarzania (GMP), które zostały już zatwierdzone do stosowania u pacjentów, co stanowi znaczącą przewagę nad podejściami opartymi na decelularyzowanych tkankach zwierzęcych. Ostatecznym celem tej metody jest jej translacja na ludzi jako terapeutyczna strategia medycyny regeneracyjnej w leczeniu zespołu krótkiego jelita.

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat opisanego tutaj protokołu. Końcowym wynikiem tego protokołu jest kula lub sferyczna struktura inżynieryjnie wytworzonego jelita mysiego z lumenem, błoną śluzową, błoną podśluzową i otaczającą warstwą mięśniową. Rysunek 2A pokazuje typową kulę w porównaniu z początkowym rusztowaniem polimerowym. Rysunek 2B przedstawia tę samą konstrukcję przeciętą na pół w celu odsłonięcia lumenu. Rysunek 3 demonstruje barwiony hematok...

Niniejszy artykuł oraz towarzyszący mu film przedstawiają nasz protokół generowania inżynierowanych tkankowo jelit u myszy, z wykorzystaniem podejścia polegającego na rozmieszczeniu jednostek organoidalnych na rusztowaniu.

Inżynieria tkankowa jelita w modelu mysim

Sztucznie wyhodowane jelito cienkie (TESI) zostało z sukcesem wykorzystane w celu ratowania szczurów linii Lewis po rozległej resekcji jelita cienkiego, co doprowadziło do powrotu do...

W niniejszym filmie zaprezentujemy naszą technikę generowania inżynieryjnie tkankowego jelita cienkiego u myszy z wykorzystaniem podejścia opartego na jednostkach organoidowych na rusztowaniu. W tym eksperymencie zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. opieki i wykorzystania zwierząt oraz placówki opieki nad zwierzętami Savon Research Institute w Children's Hospital, Los Angeles. Pierwszym krokiem jest pozyskanie całego jelita myszy.Myszą poddaną humanitarnej eutanazji oraz narzędzia przygotowuje się za pomocą 70% etanolu w wodzie, a następnie wykonuje nacięcie w linii pośrodkowej, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej. Jelito cienkie zostaje ewakuowane z jamy brzusznej i przekrojone tuż za więzadłem Treitza. Następnie oddziela się je od krezki i jej naczyń krwionośnych za pomocą preparacji ostrej i tępej.Na koniec jelito kręte zostało przecięte pięć milimetrów proksymalnie względem zastawki krętnio-kątniczej. Pobrane jelito cienkie przedstawiono w odpowiedniej skali. Następnie przystępujemy do otwarcia jelita wzdłużnie wzdłuż krawędzi przeciwmiędzybłonowej w buforze Hanksa z jednokrotnym (1X) roztworem antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych.Następnie jelito oczyszcza się z treści kałowej w naczyniu, po czym trzykrotnie płucze w roztworze HBSS za pomocą probówki. Tkanka jelitowa opada na dno probówki, natomiast pływający materiał stanowi debris mezenchymalny i może zostać usunięty. Roztwór płuczący ostrożnie odsysa się pipetą.Następnie jelito sieka się nożyczkami na kawałki o wielkości mniejszej niż jeden milimetr kwadratowy. Posiekany materiał zbiera się za pomocą automatycznej pipety. Tak przygotowany, wypłukany materiał jest gotowy do trawienia.Roztwór do trawienia zawiera DASE w stężeniu 0,125 mg/ml oraz kolagenazę w stężeniu 800 U/ml w buforze HBSS z antybiotykiem i środkiem przeciwgrzybiczym. Należy zwrócić uwagę na brązowawy kolor roztworu do trawienia w porównaniu z buforem HBSS z antybiotykiem i środkiem przeciwgrzybiczym. Roztwór jest przygotowywany bezpośrednio przed użyciem, a następnie 10 ml dodaje się do rozdrobnionego materiału.Próbkę inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 20 minut na rotatorze. Tkankę poddaje się dalszej dysrupcji poprzez pipetowanie, jak pokazano tutaj. Czynność tę powtarza się od 20 do 50 razy, aż do uzyskania jednorodnego wyglądu.Końcówka do pipety o pojemności 10 ml jest optymalnie dobrana. W tym celu reakcję zatrzymuje się, dodając 3 ml DMEM w temperaturze 4°C z 10% płodowej surowicy bydlęcej. Materiał wiruje przez 10 minut.Przy 500 RPM odrzuca się nadsącz, a osad resuspenduje w 10 mililitrach DMEM w temperaturze 4°C z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej w celu przemycia. Następnie próbkę wirowo się przez pięć minut przy 800 RPM, aby odzyskać całą tkankę z wyjątkiem pojedynczych komórek, które pozostają w nadsączu i zostają odrzucone. Osad zawiera jednostki organoidów, lżejszy materiał u góry, wskazany pęsetą, oraz materiał odpadowy.Z tej warstwy usuwa się za pomocą pipety pożywkę DMEM z surowicą. Należy uważać, aby nie zresuspenderować osadu do pipety. Ostatnie kilka kropel można bezpieczniej usunąć za pomocą jednorazowej pipety plastikowej.Przedstawiono tutaj rusztowanie polimerowe z kwasu poliglikolowego (PGA) wykorzystane w naszych eksperymentach. Dystalne dwa milimetry jednorazowej końcówki pipety o pojemności 1000 µL zostają odcięte sterylnymi nożyczkami. Osadzamy jednostki organoidów w polimerze w czterostiankowych płytkach hodowlanych, aby zminimalizować rozprzestrzenianie się materiału poza obszar polimeru.Jednostki organoidowe są nanoszone na rusztowanie za pomocą pipety, najpierw do światła, a następnie na powierzchnię zewnętrzną. Drugą pęsetą zapewnia się odpowiednie pokrycie światła, dbając o to, aby nie zaburzyć cylindrycznego kształtu polimeru. Myszą biorcą w przypadku dawcy transgenicznego jest mysz immunokompromitowana z grupy non-obese diabetic.Myszy z ciężkim złożonym niedoborem odporności z deficytem łańcucha gamma (nsg). W innym przypadku można wykorzystać biorców syngenicznych do implantacji. Po wprowadzeniu znieczulenia ogólnego brzuch zostaje ogolony, przygotowany i obłożony polem operacyjnym.Wykonuje się 0,5 centymetrowe nacięcie w linii pośrodkowej. Identyfikuje się siecią większą i ostrożnie ją ewaginuje. Załadowany polimer owija się siecią i mocuje szwem Monocryl 5-0.Kluczowe jest, aby nie doprowadzić do przerwania ciągłości sieci większej, w przeciwnym razie komórki mogą przedostać się do otrzewnej. Polimer z załadowanymi komórkami, zabezpieczony w sieci większej, zostaje wprowadzony z powrotem do jamy brzusznej, która jest zamykana warstwowo. Do zamknięcia rany stosuje się szew przerywany nicią Vicryl 4-0.Najpierw w warstwę mięśniową, a następnie podskórnie podaje się ketoprofen w wodzie sterylnej w dawce 2 mg/kg w celu zapewnienia przeciwbólowego działania pooperacyjnego; lek wstrzykuje się podskórnie w miejscu przylegającym do nacięcia. Cztery tygodnie po implantacji zwierzę gospodarza poddaje się eutanazji w sposób humanitarny i ponownie otwiera pierwotne nacięcie. Konstrukt inżynierii tkankowej jest identyfikowany jako struktura w kształcie kuli i może być przylegający do żołądka oraz trzewi jamy brzusznej.Zrosty zostają ostrożnie usunięte, a następnie pobierany jest fragment inżynieryjnie tkankowego jelita. Przedstawiony tutaj fragment pobranego jelita znajduje się w bezpośrednim porównaniu z polimerem wyjściowym. Na tym obrazie światło inżynieryjnie wytworzonego jelita zostało rozcięte, aby ukazać jego wnętrze.Tkankę można utrwalić do analizy histologicznej lub wykorzystać na świeżo do różnych analiz biologii molekularnej, co zaprezentowaliśmy w innych publikacjach. Przedstawiony tutaj mikrograf z barwieniem hematoksyliną i eozyną przy małym powiększeniu ukazuje typową, pomyślnie stworzoną konstrukcję jelita cienkiego z inżynierii tkankowej. Lewa strzałka wskazuje światło wyścielone błoną śluzową jelita, a prawa strzałka wskazuje trzustkę gospodarza.Który przykleił się do konstruktu.

tissue-engineering-of-the-intestine-in-a-murine-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Inżynieria tkankowa jelita na modelu mysim

Ten film opisuje szczegółowy protokół resekcji jelita w modelu mysim. Technika ta zapewnia wgląd w zaburzenia wchłaniania żółci wywołane ileektomią, nadmierną akumulację i toksyczność w jelicie myszy.

Model resekcji jelita krętego u myszy: badanie metabolizmu żółci wywołanego ileektomią w modelu mysim

Ten film demonstruje generowanie modelu pętli jelita krętego do badania przepuszczalności jelit w modelu mysim. Metoda ta zapewnia żywy model do zrozumienia funkcji bariery nabłonkowej i wynikającej z niej odpowiedzi immunologicznej.

Model pętli jelita krętego myszy: model chirurgiczny do badania przepuszczalności jelit u myszy

Artykuł opisuje metodologię produkcji bezkomórkowej macierzy z jelita szczura. Wyprowadzenie rusztowań jelitowych jest ważne dla przyszłych zastosowań w inżynierii tkankowej, biologii komórek macierzystych i testowaniu leków.

Metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej

Techniki obrazowania małych zwierząt pozwalają na seryjne badania diagnostyczne i interwencje terapeutyczne in vivo. W ostatnim czasie zakres zastosowań znacznie się poszerzył i obecnie obejmuje ocenę rozwoju guza jelita grubego, gojenie się ran oraz monitorowanie stanu zapalnego. Protokół ten ilustruje te różnorodne potencjalne zastosowania endoskopii mysiej skóry.

Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych

Komórki macierzyste nabłonka jelitowego (ISC) są zmieszane z komórkami Panetha. Komórki te są zróżnicowanym potomstwem ISC, które wspiera ISC i zapewnia ochronę przeciwbakteryjną. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy transgeniczne warunkowe modele myszy, aby ustalić, że komórki Panetha odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu nabłonka jelitowego.

Protokoły analizy roli komórek Panetha w regeneracji jelita mysiego przy użyciu warunkowych modeli myszy Cre-lox

Tutaj opisujemy szczegółową procedurę niedokrwienia jelit u myszy, która prowadzi do powtarzalnego uszkodzenia bez śmiertelności, aby zachęcić do standaryzacji tej techniki w całej dziedzinie. Ten model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego jelit może być wykorzystany do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów uszkodzenia i regeneracji.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego jelit

Niedrożność jelit to częściowe lub całkowite zablokowanie jelita, które może powodować silne bóle brzucha, nudności, wymioty i uniemożliwiać oddawanie stolca. Ta procedura tworzenia częściowych zatkań jelit u myszy jest wiarygodna w badaniu mechanizmów leżących u podstaw patologicznego wzrostu i śmierci komórek w jelicie.

Mysi model częściowej niedrożności jelit

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Opisujemy mysi model pooperacyjnej niedrożności jelit generowany przez manipulację jelitową. Funkcję pasażu pokarmowego, zmiany patologiczne i aktywację komórek odpornościowych oceniano 24 godziny po zabiegu.

Pooperacyjny model mysiej niedrożności jelit

Naucz się techniki inżynierii tkankowej jelita cienkiego u myszy z wykorzystaniem podejścia jednostek organoidów na rusztowaniu. Ta metoda umożliwia generowanie funkcjonalnych tkanek jelitowych do zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Inżynieria tkankowa jelita w modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów