Name: Nagrania patch clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego wyizolowanych od danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Poznaj metodę patch clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego danio pręgowanego. Technika umożliwia badanie właściwości biofizycznych kanałów napięciowo-zależnych w układzie słuchowym i równowagi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowano z funduszy NSF (0854551).

1. Przygotowania przedeksperymentalne
<ol>
	<li>Przygotować sześć roztworów (składy znajdują się w Tabeli 1): (a) 100 ml NZR (standardowy roztwór Ringera dla danio przebrzuchego), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR +BSA; (d) 100 ml LoCaS (roztwór z niską zawartością Ca2+), (e) 10 ml LoCaS + papaina, (f) 100 ml K+-internal solution. Roztwory (a), (b), (d) i (f) można przechowywać do jednego miesiąca w temperaturze 4 °C. Roztwory (c) i (e) należy przygotować w dniu eksperymentu. Przed rozpoczęciem doświadczeń wszystkie roztwory powinny osiągnąć temperaturę pokojową.</li>
	<li>Oznaczyć i napełnić cztery szalki Petriego o średnicy 35 mm mniej więcej do połowy roztworami (a), (c), (d) i (e).</li>
	<li>Przygotować naczynie do sekcji, wypełniając szalkę Petriego o średnicy 60 mm masą Sylgard (Dow Corning, Midland, MI), a następnie wycinając w niej wgłębienie, które pozwoli rybie utrzymać się w pozycji pionowej bez przewracania się.</li>
	<li>Przygotować co najmniej dwa narzędzia do izolacji komórek, przyklejając końcówkę włosa psa (od strony mieszka) do końcówki szklanej pipety Pasteura za pomocą superglue, tak aby włos wystawał poza końcówkę pipety o około 0,5 cm. Dobrze sprawdzają się włosy psów o miękkiej sierści, np. labradorów i weimaranów.</li>
</ol>
2. Izolacja błędnika słuchowego i przedsionka
<ol>
	<li>Uśmierć jedną dorosłą danio-ostrobiu (zebrafish) poprzez zanurzenie w zlewce zawierającej NZR + Tricaine. Monitoruj wizualnie skrzela, aż do całkowitego ustania ruchów pokryw skrzelowych. Odczekaj dodatkowe dziesięć minut przed wyjęciem ryby i opłukaniem jej świeżym roztworem NZR. Procedury te zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Pepperdine, jednak zgodę należy uzyskać z własnej instytucji.</li>
	<li>Przymocuj rybę do tacki sekcyjnej grzbietem do góry, wbijając jedną standardową prostą szpilkę krawiecką (o długości ok. 2,5 cm) w każdy oczodół oraz trzecią szpilkę w osi grzbietowo-brzusznej w odległości około jednej trzeciej do połowy dystansu od głowy do ogona, zgodnie z ilustracją na Rysunku 1A.</li>
	<li>Pod stereomikroskopem sekcyjnym z powiększeniem (0,62-5x) i okularami 10x, użyj nożyczek sprężynowych (Fine Science Tools numer katalogowy 15000-02), aby odsłonić mózg i krótki odcinek rdzenia kręgowego, usuwając sklepienie czaszki od punktu położonego około 0,5 cm za poziomem skrzeli w kierunku nosa ryby. Przetnij rdzeń kręgowy i podnieś mózg za pomocą precyzyjnej pęsety (Fine Science Tools numer katalogowy 11251-30), przecinając nerwy rdzeniowe i inne przyczepy; usuń mózg i go odrzuć (Rysunek 1B).</li>
	<li>Pozostała brzuszna połowa torebki czaszki tworzy „miseczkę” zawierającą organy ucha wewnętrznego. Zaobserwuj wyraźne, białe, nieprzezroczyste otolity w lagenach i sakkulach znajdujących się symetrycznie na końcu ogonowym każdego ucha wewnętrznego oraz położone bardziej rostralnie i bocznie otolity utrykul (Rysunki 1C i 4A).</li>
	<li>Usuń kostną miseczkę, przecinając wszystkie przyczepy brzuszne i boczne, jednocześnie delikatnie wyciągając ją z głowy precyzyjną pęsetą. Umieść ją w płytce Petri zawierającej LoCaS (Rysunki 1D i 4B).</li>
	<li>Używając dwóch par precyzyjnych pęset, rozłup miseczkę wzdłuż linii środkowej, chwytając krawędzie boczne kości i rozsuwając je lub alternatywnie oddzielając prawą i lewą połowę poprzez włożenie końców pęset w centrum i rozdzielenie połówek. Usuń dwa labirynty z kości za pomocą precyzyjnej pęsety (Rysunek 2).</li>
	<li>Obejrzyj labirynty, aby zidentyfikować narządy końcowe słuchowe i przedsionkowe: kanały półkoliste, utrykuły, sakkule i lageny (Rysunek 4C). Różowawe obszary pod każdym otolitem to maculae zawierające komórki rzęsate. Podobnie, różowy pasek wewnątrz ampull kanałów półkolistych wskazuje cupula, w której znajdują się komórki rzęsate.</li>
	<li>Ostrożnie usuń otolity z lageny i utrykuły za pomocą precyzyjnej pęsety (Rysunki 2 i 4C). Nie jest konieczne usuwanie otolitu z sakkuli, ponieważ może to uszkodzić komórki rzęsate sakkuli.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek rzęsistych
<ol>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety transferowej (numer katalogowy Fisher Scientific 13-711-9AM) przenieś organy końcowe do naczynia zawierającego LoCaS + papain, minimalizując objętość przenoszonego płynu.</li>
	<li>Inkubuj te struktury w tym roztworze przez trzydzieści minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po zakończeniu okresu inkubacji przenieś struktury do naczynia zawierającego NZR + BSA i inkubuj w tym roztworze przez co najmniej trzydzieści minut. Komórki rzęsiste pozostaną zdrowe w tym roztworze do czterech godzin, ale ich stan pogorszy się po 1-2 godzinach od izolacji (patrz kolejne kroki).</li>
	<li>W przygotowaniu do izolacji komórek przenieś jeden z organów końcowych do naczynia zawierającego NZR.</li>
	<li>W przypadku lagen i utrykulów użyj włosu psa, aby delikatnie odłączyć plamy (maculae) – arkusze różowawą tkanki nabłonkowej zawierające komórki rzęsiste (Rysunek 3A). Plamy można wybrać (używając włosa psa) spod otolitów sakulów, a kopułki (cupulae) z ich lokalizacji w ampullach kanałów półkolistych.</li>
	<li>Używając dwóch narzędzi do izolacji komórek przygotowanych w kroku 1.4, utrzyturuj plamę lub kopułkę, aby stworzyć obszar z detrytusem zawierającym komórki rzęsiste (Rysunek 3B). Pozostaw komórki na co najmniej pięć minut, aby osiadły na dnie naczynia przed jego przeniesieniem.</li>
	<li>Umieść naczynie na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w optykę kontrastową fazową. Obserwuj komórki przy powiększeniu 40X i zwróć uwagę na różnorodność morfologiczną. Wiele komórek ma kształt awokado, podczas gdy inne są długie i cienkie. Obecność apikalnych wiązek rzęsek identyfikuje je jako komórki rzęsiste, a jasność w kontraście fazowym potwierdza ich żywotność. Fotomikrografie izolowanych komórek rzęsistych przedstawiono na Rysunku 5.</li>
</ol>
4. Patch clamping komórek rzęskowych ryb danio pręgowanych
<ol>
	<li>W celu przygotowania do rejestracji metodą perforowanej pipety (perforated patch recordings)5,6, przygotuj wewnętrzny roztwór zawierający amfoterycynę w następujący sposób: umieść 5 mg amfoterycyny B (Sigma A4888) w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i dopełnij 100 μl DMSO. Natychmiast wymieszaj ten roztwór na wirówce wortex przez 10-20 sekund, aż cała amfoterycyna zostanie rozpuszczona. Następnie pipetuj 625 μl wewnętrznego roztworu K+ do drugiej probówki do mikrocentryfugi. Dodaj 10 μl roztworu amfoterycyny do wewnętrznego roztworu K+ i wymieszaj w vortex w opisany wyżej sposób. Roztwór zapasowy amfoterycyny zachowa trwałość przez kilka godzin, jednak końcowy roztwór należy odrzucić po jednej godzinie.</li>
	<li>Wykonaj pipety do patch-clampu ze szkła borokrzemowego BF 150-86-10 (Sutter Instruments) za pomocą wieloetapowej wyciągarki (Sutter P-1000). Pipety powinny mieć średnicę końcówki około 2 μm i oporność 1-3 MΩ w roztworach podanych w Tabeli 1. Ustawienia wyciągarki, które sprawdzają się najlepiej, to: Heat=Ramp minus10, Pull=0, Velocity=18, Delay=1, Pressure=600. Kształt końcówki dobrej pipety jest widoczny na zdjęciu w insertcie c na Rysunku 5. Preferowane są tępe pipety o kształcie „pocisku”, ponieważ oferują one najmniejszą oporność dostępu podczas rejestracji elektrofizjologicznej.</li>
	<li>Użyj igły strzykawki Microfil o rozmiarze 28 gauge (MF28G-5; World Precision Instruments), aby wypełnić elektrodę rejestrującą do połowy wewnętrznym roztworem K+ zawierającym amfoterycynę.</li>
	<li>Przymocuj elektrodę do głowicy wzmacniacza patch-clamp. Aplikuj skoki napięcia -10 mV przez 10 ms z częstotliwością 10 Hz i utrzymuj dodatnie ciśnienie w elektrodzie podczas jej przemieszczania przez granicę powietrze/roztwór i opuszczania na dno naczynia rejestracyjnego w pobliże komórek.</li>
	<li>Ustaw elektrodę prostopadle do zdrowo wyglądającej komórki. Gdy elektroda znajdzie się wystarczająco blisko komórki, tak że ta zacznie oddalać się od wypływającego roztworu, szybko odwróć ciśnienie, przykładając do elektrody lekką próżnię, aż komórka „przeskoczy” na nią. Natychmiast przerwij ssanie elektrody i przyłóż potencjał utrzymujący -70 mV do wnętrza elektrody. W ciągu kilku sekund utworzy się uszczelnienie gigaohmove (gigaohm seal).</li>
	<li>Obserwuj przejściowe prądy pojemnościowe na początku i końcu skoków napięcia, które pojawiają się wkrótce po utworzeniu uszczelnienia. Kontynuuj monitorowanie perforacji błony pod elektrodą przez amfoterycynę, obserwując wzrost amplitudy tych przelotów aż do osiągnięcia ich maksymalnej wartości (po około dziesięciu minutach).</li>
	<li>Aby potwierdzić ustanowienie konfiguracji whole-cell (perforowanej) w zdrowej komórce, wywołaj prądy wyjściowe K+ poprzez aplikację hiperpolaryzujących i depolaryzujących skoków napięcia. Większość komórek rzęsek wykazuje wyraźne prądy wyjściowe (patrz Rysunek 6).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Rycina 4 przedstawia obrazy wykonane podczas etapów izolacji komórek. Na panelu A widać otolity związane z lagenami, sacculi i utriculi przez cienką warstwę kości, która je przykrywa. Te nieprzezroczyste struktury stanowią wygodne punkty orientacyjne, które pomagają w bezpiecznym usunięciu narządów końcowych z organizmu zwierzęcia podczas kolejnych kroków sekcji. Panel B pokazuje kostną „miseczkę” zawierającą nienaruszone labirynty oraz wyraźne otolity w utriculi, lagenach i sacculi. Panel C przedstawia labirynt usunięty z kości. Należy zwrócić uwagę na duży otolit z karbowanym brzegiem w lagenie, otolit w kształcie soplek w sacculi oraz otolit w kształcie fasoli w utriculi. Część zróżnicowania wielkości i morfologii obserwowanych w komórkach izolowanych z lageny zilustrowano na Rycynie 5. Zdrową komórkę można łatwo zidentyfikować po jasnym obrazie w kontraście fazowym i ostrym obrysie. Kształty komórek można w przybliżeniu podzielić na dwie klasy: w kształcie awokado (avo) oraz długie i cienkie (thn), choć rozmiary komórek wewnątrz każdej z grup mogą się znacząco różnić (porównaj na przykład avo 1 i avo 3). Wstawka a pokazuje skupisko trzech komórek, które nie zostały całkowicie odizolowane od siebie. Czarny kolor i ziarnisty wygląd komórki we wstawce b jednoznacznie identyfikuje tę komórkę jako martwą. Wstawka c pokazuje końcówkę pipety patch, ilustrując kształt i wymiary odpowiednie do rejestracji z tych komórek.
Prądy przedstawione na Rysunku 6 uzyskano w odpowiedzi na kroki hiperpolaryzujące i depolaryzujące potencjału przyłożone do komórki lageny podobnej do avo 2 pokazanej na Rysunku 5. Odpowiedzi prądowe w komórkach o różnych rozmiarach i kształtach mogą się znacznie różnić, co sugeruje różnorodność w zestawie kanałów sterowanych napięciem.
Ryciny 1-3: Schematy przedstawiające etapy izolacji komórek rzęskowych.
<img alt="Schemat sekcji mózgu ryby pokazujący proces usuwania błędnika; utriculusy, kanały półkoliste." src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Usuwanie torebki czaszki zawierającej błędniki ucha wewnętrznego u danio-pręgowanego. A. Przymocowanie uśmierconego danio-pręgowanego grzbietem do góry do naczynia sekcyjnego za pomocą szpilek. B. Otwarcie czaszki, usunięcie i utylizacja mózgu. C. Obserwacja otolitów w utriculusach, lagenach i sacculi. D. Usunięcie brzusznej części torebki czaszki zawierającej błędniki.
<img alt="Schemat procesu podziału komórkowego z opisanymi etapami A, B, C ilustrującymi fazy mitozy." src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Usuwanie labiryntów z torebki czaszki. A. Rozdzielenie torebki czaszki wzdłuż linii środkowej. B. Usunięcie labiryntów z kości. C. Usunięcie otolitów z lagen i utriculi za pomocą pęsety.
<img alt="Schemat układu przedsionkowego; proces stymulacji komórek rzęsnych pipetą Pasteura i analiza sygnału." src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Izolacja komórek rzęsnych z labiryntów. A. Delikatnie oddziel plamki za pomocą włosa psa. B. Rozetrzyj plamki dwoma włosami psa. C. Wykorzystaj izolowane komórki rzęsiste do techniki patch clamp.
<img alt="Anatomia mikroskopowa z opisanymi schematami, przedstawiająca sekcje tkanek i regiony komórkowe." src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Obrazy wykonane podczas poszczególnych etapów izolacji pojedynczych komórek. A. Po usunięciu mózgu widoczne są otolity związane z dwiema lagenami i sakkulami (strzałki) oraz utrykułami (groty strzałek). B. Po usunięciu z organizmu brzusznej części torebki czaszki zawierającej organy ucha wewnętrznego. Schemat w prawej części obrazu B wskazuje lokalizację lewego utrykułu, lageny i sakkuli. Linia przerywana oznacza przybliżoną pozycję lewego labiryntu. C. Prawy labirynt (widok przyśrodkowy) D: Schemat ilustrujący kluczowe części labiryntu widocznego na obrazie C. a: przedni kanał półkolisty, b: kanał poziomy, c: kanał tylny, d: otolit utrykuły, e: otolit sakkuli, f: otolit lageny. Pasek skali w D reprezentuje 1 mm dla A i B oraz 0,5 mm dla C i D.
<img alt="Obraz mikroskopowy analizy morfologii komórek; struktury oznaczone do naukowej analizy pierwotniaków." src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
 Rycina 5. Izolowane, zdrowe komórki z lagena ilustrujące różnorodność morfologiczną; avo: komórki o kształcie awokado; thn: komórki długie i cienkie. Wstawka a: skupisko trzech nie w pełni izolowanych komórek; wstawka b: martwa komórka; wstawka c: końcówka elektrody płatkowej użytej w rejestracjach elektrofizjologicznych z komórek rzęsek ryby zebrafish. Pasek skali = 20 μm odnosi się do głównego obrazu i wszystkich wstawek.
<img alt="Prądy w pomiarze clampy napięciowej, wykres elektrofizjologiczny, pomiar aktywności neuronalnej, od +70 do -20 mV." src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
 Rycina 6. Prądy zarejestrowane w komórce rzęsnej poddanej technice patch-clamp. Uśrednione odpowiedzi w komórce (podobnej do avo 2 na Rycynie 5) na trzy prezentacje skoków napięcia przyłożonych w przyrostach 10 mV od -140 mV do +70 mV z potencjału spoczynkowego -70 mV. Zwróć uwagę na prąd inaktywujący, który pojawia się przy bardziej zdepolaryzowanych potencjałach. Wartości skoków napięcia są przedstawione obok niektórych przebiegów.

<ol><li>Lewis, R. S., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+solitary+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage- and ion-dependent conductances in solitary vertebrate hair cells.</a> Nature. 304, 538-5341 (1983).</li>
<li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> J. Physiol. 385, 207-242 (1987).</li>
<li>Sugihara, I., Furukawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+aspects+of+two+different+types+of+hair+cells+in+the+goldfish+sacculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional aspects of two different types of hair cells in the goldfish sacculus.</a> J. Neurophysiol. 62, 1330-1343 (1989).</li>
<li>Lee, S., Briklin, O., Hiel, H., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+inactivation+of+calcium+channels+in+cochlear+hair+cells+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent inactivation of calcium channels in cochlear hair cells of the chicken.</a> J. Physiol. 583, 909-922 (2007).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li>
<li>Rae, J. R., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+access+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Low access perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J. Neurosci. Meth. 37, 15-26 (1991).</li>
<li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Ca2%2B+entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 92, 10297-10301 (1995).</li>
<li>Liang, J., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+and+fine+dissection+of+inner+ear+sensory+epithelia+in+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gross and fine dissection of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish (Danio rerio).</a> J. Vis Exp. 27, e1211(2009).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 275-297 (1988).</li>
<li>Parsons, T. D., Lenzi, D., Almer, W., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-triggered+exocytosis+in+an+isolated+presynaptic+cell%3A+capacitance+measurements+in+saccular+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Calcium-triggered exocytosis in an isolated presynaptic cell: capacitance measurements in saccular hair cells.</a> Neuron. 13, 875-883 (1994).</li>
<li>Kim, M. -H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2%2B+imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis Exp. 59, e3345(2012).</li>
<li>Housley, G. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+the+action+of+acetylcholine+on+isolated+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Lond.+B%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of the action of acetylcholine on isolated outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 244, 161-167 (1991).</li>
<li>Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+hearing+and+balance+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of hearing and balance in zebrafish.</a> Ann. Rev. Genetics. 39, 9-22 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Staranna dyssekcja narządów końcowych oraz delikatne obchodzenie się z komórkami są kluczowe dla pomyślnej izolacji zdrowych, nienaruszonych i fizjologicznie aktywnych komórek rzęsatych. Przestrzeganie poniższych wskazówek zapewni sukces:
<ol>
 <li>Łatwiej jest uzyskać zdrowe komórki z mniejszych ryb (o długości 2-2,5 cm). Większe ryby posiadają znacznie więcej kropel tłuszczu, które utrudniają wizualizację podczas procesu sekcji.</li>
 <li>Należy zachować ostrożność podczas usuwania otolitów, które znajdują się nad komórkami rzęskami. Należy unikać dotykania komórek podczas chwytania otolitów pincetą.</li>
 <li>Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy maculae i cupulae są podnoszone jako płaty, a komórki są oddzielane od nabłonka poprzez tryturację.</li>
 <li>Stwierdziliśmy, że użycie włosa psa do tryturacji komórek jest skuteczniejsze niż inne metody, w tym użycie ludzkich rzęs7, które nie są tak zwężone i są mniej elastyczne.</li>
 <li>Podczas metody patch clamp ważne jest zastosowanie dodatniego ciśnienia w elektrodzie w momencie przechodzenia przez granicę powietrze/roztwór, aby utrzymać czystość końcówki. Równie istotne jest zwolnienie dodatniego ciśnienia, aby komórka mogła „zeskoczyć” na elektrodę. Metoda ta usuwa niewielką objętość roztworu zawierającego amfoterycynę z obszaru końcówki, co zwiększa prawdopodobieństwo utworzenia uszczelnienia gigaohmicznego z komórką. W naszych eksperymentach stosujemy technikę rejestracji z perforowanym otworem (perforated patch) zamiast tradycyjnej konfiguracji whole-cell ze względu na kruchość komórek. Próba przejścia w tryb „whole cell” często prowadzi do utraty uszczelnienia gigaohmicznego.</li>
</ol>
Opisana tutaj metoda pozwoli na uzyskanie setek zdrowych komórek słuchowych z jednego zwierzęcia. Technikę tę można przeprowadzić w temperaturze pokojowej i nie wymaga ona żadnego specjalistycznego sprzętu poza mikroskopem operacyjnym. Wcześniejsza publikacja w JoVE opisuje dysekcję ucha wewnętrznego ryb danio-ostrobramowych z wykorzystaniem podejścia brzusznego8. Autorzy ci demonstrują dysekcję całych organów ucha wewnętrznego utrwalonych w paraformaldehydzie. Zachęcamy czytelnika do obejrzenia tego filmu w celu porównania z naszymi metodami. Jedną z zalet zaprezentowanych tutaj metod jest możliwość pozyskania żywych komórek, które są użyteczne w badaniach fizjologicznych. Poza zastosowaniem w eksperymentach patch-clamp do badania kanałów sterowanych napięciem (jak pokazano tutaj), wykorzystanie tych komórek można rozszerzyć na badanie rezonansu komórkowego9,10, monitorowanie uwalniania neuroprzekaźników poprzez pomiary pojemności11,12, badanie neuromodulacji indukowanej aktywacją kanałów sterowanych ligandem13, a także wykorzystanie bogactwa informacji, jakie można uzyskać dzięki zastosowaniu mutantów wpływających zarówno na słuch, jak i na równowagę14.

<table><tbody><tr><td>(a) NZR (roztwór Ringera dla zdrowych rybek zebrafish) (w mM)</td><td>116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 3 glukozy, 5 Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;-HEPES, pH 7,35.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(b) NZR + tricaina</td><td>NZR + 0,02% metanosulfonianu estrów etylowych kwasu 3-aminobenzoowego (Sigma A5040).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(c) NZR + BSA</td><td>NZR + 0,4% albuminy surowicy bydlęcej (Sigma A2153).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(d) LoCaS (niska zawartość wapnia)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Roztwór (w mM)</td><td>100 NaCl, 2 KCl, 0,05 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0,05 MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 3 glukozy, 30 Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;-HEPES, pH 7,35.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(e) LoCaS + papaina</td><td>LoCaS + 0,05% L-cysteiny (Sigma C1276) + 0,2% papainy (Sigma P3375).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(f) K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;-roztwór wewnętrzny (w mM)</td><td>52 K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 38 KCl, 1 K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;-EGTA, 5 K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;-HEPES, pH 7,3.</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę o dostarczenie treści do przetłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przełożenia tekstu z języka angielskiego na język polski, dbając o rygorystyczne przestrzeganie terminologii akademickiej, dokładność protokołów badawczych oraz naturalny styl publikacji naukowych.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Roztwory.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

rejestracje metodą patch-clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego wyizolowanych z ryby danio-ostrobramowej

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Analizy metodą patch-clamp w odniesieniu do kanałów sterowanych napięciem w komórkach rzęskowych sensorycznych izolowanych od różnych gatunków zostały opisane wcześniej1-4, jednak niniejszy film stanowi pierwsze zastosowanie tych technik w odniesieniu do komórek rzęskowych ryby danio pręgowanego (zebrafish). Prezentujemy tutaj metodę izolacji zdrowych, nienaruszonych komórek rzęskowych ze wszystkich narządów końcowych ucha wewnętrznego: sakula, lageny, utricula oraz kanałów półkolistych. Ponadto wykazujemy zróżnicowanie rozmiarów i morfologii komórek rzęskowych oraz przedstawiamy przykłady rejestracji metodą patch-clamp, jakie można uzyskać. Przewaga zastosowania tego modelu zebrafish nad innymi wynika z dostępności mutantów zebrafish, u których zaburzony jest zarówno słuch, jak i równowaga. W połączeniu z wykorzystaniem linii transgenicznych oraz innych technik opartych na analizie i manipulacjach genetycznych, przedstawione tutaj metody izolacji komórek i badania elektrofizjologiczne powinny ułatwić lepsze zrozumienie roli, jaką komórki rzęskowe odgrywają w pośredniczeniu tych modalności sensorycznych.

Celem tego filmu jest zaprezentowanie procedur pozyskiwania zdrowych, nienaruszonych komórek rzęskowych z organów ucha wewnętrznego dorosłych danio pręgowanych, a następnie wykorzystania ich w badaniach metodą patch clamp w celu scharakteryzowania właściwości biofizycznych ich kanałów sterowanych napięciem.

Rejestracje metodą patch-clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego wyizolowanych z ryby danio-ostrobramowej

Analizy metodą patch-clamp kanałów sterowanych napięciem w komórkach rzęskowych sensorycznych wyizolowanych od różnych gatunków były opisywane wcześniej1-4, lecz ta...

Celem niniejszej procedury jest przedstawienie metod pozyskiwania zdrowych, nienaruszonych komórek rzęskowych z narządów słuchu i równowagi dorosłych danio prążkowanych w celu wykorzystania ich w badaniach metodą patch-clamp. Badania te mają na celu charakteryzację właściwości biofizycznych ich kanałów sterowanych napięciem. Procedura ta polega na uprzednim usunięciu mózgu ryby, a następnie wyjęciu brzusznej części skrzyni mózgowej zawierającej labirynty.Drugim krokiem jest rozbicie kapsuły kostnej w celu wyizolowania błędników zawierających organy końcowe: sakulę, utrykułę i kanały półkoliste. Następnie, za pomocą włosa psa, z organów końcowych oddziela się płaty nabłonka zawierające komórki rzęsate. Ostatnim krokiem jest wyizolowanie poszczególnych komórek rzęsatych poprzez rozdzielenie płatów nabłonkowych za pomocą dwóch włosów psa.Ostatecznie, rejestracje metodą patch-clamp można przeprowadzić na izolowanych komórkach rzęskowych w celu scharakteryzowania właściwości kanałów sterowanych napięciem. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest wskazanie sposobu pozyskiwania żywotnych komórek rzęskowych z genetycznie podatnego organizmu modelowego, jakim jest zebrafish. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii słuchu i układu przedsionkowego, takie jak te dotyczące zrozumienia mechanizmów kontrolujących uwalnianie neuroprzekaźników z komórek pośredniczących w procesach słyszenia i równowagi.Procedurę rozpoczyna się od przygotowania sześciu różnych roztworów zgodnie z towarzyszącym artykułem. Następnie należy opisać i wypełnić 4 płytki Petriego o średnicy 35 mm mniej więcej do połowy roztworami wskazanymi w towarzyszącym artykule. Po tym etapie należy przygotować naczynie do sekcji, wycinając otwór w kształcie ryby w płytce Petriego o średnicy 60 mm wypełnionej utwardzonym sil guardem.Zapobiegnie to przewracaniu się zwierzęcia podczas sekcji. Przygotuj co najmniej dwa narzędzia do izolacji komórek, przyklejając końcówkę z mieszkowatym włosem psa do końca szklanej pipety Pasteura za pomocą superglue, tak aby włos wystawał poza koniec pipety o około 0,5 centymetra. Następnie uśmierć jedną dorosłą rybkę danio, zanurzając ją w zlewce zawierającej roztwór Ringera dla rybek danio (normal zebra fish ringers, NZR) i tricainę.Obserwuj wizualnie skrzela, aż ustaną wszystkie ruchy małżowinowe. Odczekaj co najmniej kolejne 10 minut przed wyjęciem ryby i opłukaniem jej świeżym NZR. Następnie umieść rybę w naczyniu do sekcji stroną grzbietową do góry.Wbij jedną standardową szpilkę krawiecką w każde z oczodołów oraz trzecią szpilkę wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej. Pod stereomikroskopem, w odległości około jednej trzeciej do jednej połowy długości ciała od głowy do ogona, odsłoń mózg i krótki odcinek rdzenia kręgowego, usuwając sklepienie czaszki od punktu oddalonego o około 0.5 cm w stronę ogona od poziomu skrzeli aż do nosa ryby za pomocą nożyczek sprężynowych. Następnie przetnij rdzeń kręgowy i unieś mózg precyzyjną pęsetą, przecinając nerwy oraz pozostałe połączenia.Następnie należy usunąć i wyrzucić mózg. Pozostała brzuszna część torebki czaszki tworzy zagłębienie zawierające organy ucha wewnętrznego. Obserwujemy wyraźne, białe, nieprzezroczyste otolity OTA w legina i sculli, znajdujące się symetrycznie w ćwiartce każdego ucha wewnętrznego, oraz położone bocznie otolity utricle.Większa liczba. Struktury te stanowią przydatne punkty orientacyjne, które pomagają w nienaruszonym usunięciu labiryntu za pomocą precyzyjnej pęsety i nożyczek sprężynowych. Usuń miseczkę kostną, przecinając wszystkie przyczepy brzuszne i boczne, delikatnie wyjmując ją z głowy.Następnie umieść go w szalce Petri zawierającej roztwór o niskiej zawartości wapnia lub low cas. Rozłam czaszkę wzdłuż linii środkowej i oddziel prawą oraz lewą połowę, wkładając końcówki precyzyjnej pęsety w środek i rozsuwając obie części. Następnie wyjmij oba labirynty z kości.Obejrzyj labirynty i zidentyfikuj narządy końcowe słuchowe i błędnikowe. Kanały półkoliste, utriculum, sacculum i lagena. Ostrożnie usuń listki otolityczne z lageny i utriculum za pomocą precyzyjnych pęset.W tej procedurze przenieś organy końcowe do naczynia zawierającego locas i propan. Za pomocą plastikowej pipety transferowej inkubuj te struktury przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu okresu inkubacji przenieś struktury do naczynia zawierającego NZR i BSA i inkubuj przez co najmniej 30 minut.Dalsze przygotowania do izolacji komórek. Przenieś jeden z narządów końcowych, na przykład nogę, do szalki zawierającej NZR. Szalkę tę należy następnie umieścić na stoliku stereomikroskopu z zoomem.Użyj włosa psa, aby delikatnie oderwać z plamki płat różowawej tkanki nabłonkowej zawierającej komórki rzęsiste. Plamkę można również usunąć z utriculi i sacculi, a komórki rzęsiste można wyizolować z ich lokalizacji wewnątrz kanałów półkolistych. Używając dwóch wcześniej przygotowanych narzędzi do izolacji komórek, rozdrobnij plamkę, aby stworzyć pole odłamków, w którym znajdą się komórki rzęsiste.Pozostaw komórki na co najmniej pięć minut, aby osiadły na dnie przed przeniesieniem szalki. Następnie przenieś szalkę na stolik mikroskopu odwróconego wyposażonego w optykę kontrastu fazowego. Obserwuj komórki przy 40-krotnym powiększeniu.Zwróć uwagę na różnorodność morfologii komórek. Niektóre komórki mają kształt awokado, podczas gdy inne są długie i cienkie. Obecność wierzchołkowych wiązek rzęsek wskazuje na komórki rzęsate, a jasność w obrazowaniu fazowym potwierdza ich prawidłowy stan.W przypadku rejestracji metodą perforowanej membrany (perforated patch), przygotuj roztwór zawierający amfoterycynę, umieszczając najpierw 5 mg amfoterycyny B w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Następnie dodaj 100 µL DMSO i natychmiast wymieszaj probówkę na wortexie przez 10 do 20 sekund, aż cała amfoterycyna zostanie rozpuszczona. Następnie pipetuj 625 µL wewnętrznego roztworu jonów potasu do drugiej probówki mikrowirówkowej.Następnie dodaj 10 µL roztworu amfoterycyny do wewnętrznego roztworu jonów potasu i wymieszaj go w wstrząsارce przez kolejne 10 do 20 sekund. Wykonaj pipety do patch-clampu z włókien zawierających kapilary z borokrzemianowego szkła. Przy użyciu wielostopniowego wyciągacza, końcówki pipety powinny mieć średnicę około dwóch mikronów, a oporność od jednego do trzech megaomów.Zaleca się stosowanie pipet o tępym, kulistym zakończeniu, ponieważ oferują one najmniejszy opór dostępu podczas rejestracji elektrofizjologicznej. Następnie należy użyć igły mikrostrzykawki o rozmiarze 28 G, aby wypełnić pipetę do połowy wewnętrznym roztworem jonów potasu zawierającym amfoterycynę. Pipetę tę mocuje się do głowicy wzmacniacza patch-clamp, aby umożliwić prowadzenie rejestracji metodą patch-clamp.Najpierw przyłóż dodatnie ciśnienie do elektrody podczas jej opuszczania przez granicę faz powietrze-roztwór i przesuwania w dół do dna naczynia pomiarowego, w pobliże komórek. Następnie ustaw elektrodę prostopadle do komórki o zdrowym wyglądzie. Gdy elektroda znajdzie się wystarczająco blisko, by komórka zaczęła oddalać się od wypływającego roztworu, szybko odwróć ciśnienie, tworząc w elektrodzie lekką próżnię, aż komórka „przeskoczy” na nią.Natychmiast przerwij ssanie na elektrodzie, aby umożliwić utworzenie uszczelnienia gigaomowego z komórką. Przykładaj do elektrody powtarzalne skoki napięcia hiperpolaryzującego o wartości 10 millivolts i obserwuj przejściowy prąd pojemnościowy. Kontynuuj monitorowanie perforacji błony indukowanych przez amfoterycynę, aż amplituda stanu przejściowego wzrośnie do swojej maksymalnej wartości.Aby potwierdzić utworzenie konfiguracji patcha perforowanego w zdrowej komórce, należy wywołać prądy bramkowane napięciem poprzez zastosowanie kroków potencjału hiperpolaryzującego i depolaryzującego. Większość komórek rzęsek wykazuje wyraźne prądy wychodzące, które szybko ulegają inaktywacji podczas utrzymywanej depolaryzacji. Rycina ta przedstawia brzuszną część skrzyni mózgowej po usunięciu mózgu.Otolity związane z tulo, genus i sculli, a także te związane z dwoma utricle, są widoczne przez cienką kość znajdującą się nad nimi po usunięciu miseczkowej części kości. Obecność otolitów pomaga zidentyfikować położenie labiryntów. Linia przerywana na schemacie wskazuje przybliżony obrys lewego labiryntu.Po wyizolowaniu błędnika można zidentyfikować narządy słuchu i równowagi, takie jak ślimak, woreczek, łagiewka i kanały półkoliste. Schemat ilustruje położenie tych struktur: A, B i C to kanały półkoliste, D to woreczek, E to ślimak, a F to łagiewka.Różnorodność morfologii komórek rzęsatych jest widoczna na tej figurze przedstawiającej komórki wyizolowane z lega. Komórki można podzielić w przybliżeniu na dwie klasy: o kształcie cienkim lub przypominającym awokado. Zdrowe komórki są w kontraście do nich jasne w fazie, z wyraźnymi konturami i widocznymi pęczkami rzęsek.Martwe komórki przedstawione tutaj na wstawce B mają ziarnisty, czarny wygląd. Rysunek ten przedstawia uśrednione odpowiedzi komórki na trzy serie skoków napięcia przyłożonych w przyrostach 10 mV od -140 mV do +70 mV przy potencjale spoczynkowym -70 mV. Należy zauważyć, że prąd inaktywacyjny pojawia się przy bardziej zdepolaryzowanych potencjałach.Po opanowaniu techniki, rejestracje elektrofizjologiczne mogą być wykonywane już 90 minut od rozpoczęcia procedury. Ponadto, jeśli etap tri zostanie odłożony w czasie, a narządy końcowe będą przechowywane w odpowiednim roztworze BS, zdrowe komórki można uzyskać do czterech godzin po rozpoczęciu sekcji. Przy zastosowaniu szeroko dostępnych mutacji genetycznych u rybek zebrafish, preparat ten stanowi unikalny system modelowy do badania czynników molekularnych leżących u podstaw mechanizmów nierównowagi słuchowej.

patch-clamp-recordings-in-inner-ear-hair-cells-isolated-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestrowanie metodą Patch Clamp z komórek włosowych ucha wewnętrznego izolowanych od daniosza pręgowanego (zebrafish)

Larwy danio pręgowanego stanowią pierwszy kręgowcowy system modelowy umożliwiający jednoczesną rejestrację metodą patch-clamp z motoneuronu rdzeniowego i docelowego mięśnia szkieletowego. Niniejszy film prezentuje metody mikroskopowe stosowane do identyfikacji segmentowego motoneuronu CaP oraz docelowych komórek mięśniowych, a także metodologię rejestracji z każdego z tych typów komórek.

Podwójne rejestracje metodą patch-clamp z neuronów ruchowych i docelowych mięśni szkieletowych u danio pręgowanego

Rejestracje metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell z dendrytów włókien nerwu słuchowego w obrębie synaps wstążkowych komórek rzęskowych wewnętrznych w ślimaku ssaków.

Rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z neuronów doprowadzających u sparaliżowanej larwy danio pręgowanego poprzez umieszczenie mikropipety w pobliżu zwoju linii bocznej i utworzenie luźnej uszczelki do przechwytywania sygnału. Roztwór zewnątrzkomórkowy utrzymuje żywotność neuronów podczas tego procesu.

Monitorowanie sygnałów elektrycznych z neuronów aferentnych w unieruchomionej larwie danio pręgowanego

Ten film demonstruje technikę patch-clamp do pomiaru prądów jonowych w ciałach komórek neuronów czuciowych ucha wewnętrznego. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie i użycie polerowanej pipety z zaciskiem krosowym wypełnionej wewnętrznym roztworem zawierającym amfoterycynę B, która perforuje błonę, aby umożliwić ruch jonów przy jednoczesnym zachowaniu warunków wewnątrzkomórkowych. Impulsy napięciowe są stosowane do wyzwalania i rejestrowania aktywności kanałów jonowych, zapewniając wgląd w ich...

Perforowane nagrania patch-clamp ciał komórek neuronów czuciowych ucha wewnętrznego

Źródło: Łukasz, D., et al. Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych linii bocznej u larw danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje obrazowanie na żywo napływu wapnia do komórek rzęsatych linii bocznej sparaliżowanej transgenicznej larwy danio pręgowanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Mechaniczna stymulacja wiązek włosów za pomocą impulsów płynu indukuje wnikanie wapnia przez kanały mechanotransdukcji i kanały bramkowane napięciem, co jest wizualizowane w czasie...

Obrazowanie dynamiki wapnia w komórkach rzęsatych linii bocznej larw danio pręgowanego

Opisana jest prosta metoda rejestrowania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego w przodomózgowiu larwy danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia solidny odczyt in vivo aktywności podobnej do napadowej. Technika ta może być stosowana w przypadku genetycznie zmodyfikowanych larw danio pręgowanego będących nosicielami genów związanych z padaczką lub napadów wywołanych podawaniem leków przeciwdrgawkowych.

Zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Ten protokół opisuje metody rejestrowania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u pourodzonych szczurzych szczeniąt. Aby zbadać rozwój funkcjonalny zewnętrznych komórek rzęsatych, opisano krok po kroku eksperymentalną procedurę rejestracji klamry krosowej całej komórki w izolowanych zewnętrznych komórkach rzęsatych.

Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

Danio pręgowany to modelowy system, który posiada wiele cennych cech, w tym przejrzystość optyczną, szybki rozwój zewnętrzny oraz, co szczególnie ważne dla dziedziny słuchu i równowagi, zewnętrznie zlokalizowane czuciowe komórki rzęsate. W tym artykule opisano, w jaki sposób transgeniczny danio pręgowany może być używany do oznaczania zarówno mechanosensacji komórek rzęsatych, jak i funkcji presynaptycznych in toto.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych w linii bocznej u larw danio pręgowanego

Opisujemy protokół monitorowania zmian w aktywności neuronu doprowadzającego podczas poleceń motorycznych w modelowym systemie komórek rzęsatych kręgowców.

Aktywność neuronów aferentnych tylnej linii bocznej podczas pływania u danio pręgowanego

Poznaj metodę patch clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego danio pręgowanego. Technika umożliwia badanie właściwości biofizycznych kanałów napięciowo-zależnych w układzie słuchowym i równowagi.

Rejestracje metodą patch-clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego wyizolowanych z ryby danio-ostrobramowej

Przeglądaj więcej filmów