Name: Poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne wzrostu korzeni rzodkiewnika z szybką manipulacją środowiskiem korzeniowym za pomocą RootChip (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Poznaj metodę mikroskopowego obrazowania korzeni Arabidopsis thaliana przy użyciu platformy RootChip. To podejście umożliwia precyzyjną kontrolę warunków wzrostu i długoterminową obserwację rozwoju korzeni w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Philippowi Denningerowi za pomoc w przygotowaniu materiałów wideo oraz Bhavnie Chaudhuri za udostępnienie linii roślin wykazujących ekspresję sensorów FRET. Praca ta była wspierana przez granty z National Science Foundation (MCB 1021677), Department of Energy (DE-FG02-04ER15542) przyznane W.B.F., National Institutes of Health oraz Howard Hughes Medical Institute przyznane S.R.Q. G.G. otrzymał wsparcie w ramach stypendium długoterminowego EMBO. M.M. otrzymał wsparcie z Alexander von Humboldt Foundation.

Uwaga: Wszystkie kroki przygotowawcze należy przeprowadzić w warunkach sterylnych.
1. Przygotowanie plastikowych stożków do kiełkowania nasion
<ol>
 <li>Wypełnij szalkę Petriego o średnicy 10 cm pożywką wzrostową zawierającą 1% agaru do grubości 5 mm. Stosujemy zmodyfikowaną pożywkę Hoaglanda o połowicznym stężeniu4, jednak skład pożywki należy dobrać do indywidualnych wymagań eksperymentalnych.</li>
 <li>Gdy pożywka jest jeszcze w stanie ciekłym, użyj pipety wielokanałowej, aby napełnić końcówki do pipety o pojemności 10 μl ilością 5 μl pożywki z szalki Petriego.</li>
 <li>Przechowuj napełnione końcówki w pudełku na końcówki do czasu zastygnięcia pożywki, Następnie odetnij je, tworząc plastikowe stożki o długości 4 mm, i ustaw je pionowo w szalce Petriego zawierającej stałą pożywkę wzrostową.</li>
</ol>
2. Kiełkowanie nasion i wzrost siewek
<ol>
 <li> Zdezynfekuj powierzchnię nasion w 5% NaOCl przez 5 min, przemyj trzykrotnie sterylną wodą, a następnie umieść pojedyncze nasiono na wierzchu każdego z stożków wypełnionych pożywką. </li>
 <li> Uszczelnij szalkę taśmą Micropore (3M) i przechowuj w temperaturze 4 °C w celu synchronizacji kiełkowania. </li>
 <li> Po trzech dniach przenieś płytki do komory wzrostowej, aby rozpocząć kiełkowanie. Warunki wzrostu to 23 °C przy cyklu 16h światła/8h ciemności (natężenie światła: 100 μE m-2 s-1). </li>
 <li> Od 5 do 7 dni po wykiełkowaniu siewki powinny być gotowe do przeniesienia na RootChip. W tym czasie wierzchołki korzeni powinny znajdować się w pobliżu dolnych wylotów plastikowych stożków. Pod mikroskopem stereoskopowym sprawdź kondycję siewek, długość korzeni oraz, jeśli dotyczy, ekspresję markera fluorescencyjnego. </li>
 <li> Zaznacz poszczególne siewki do przeniesienia na chip. Wybierz około dziesięciu siewek na wypadek uszkodzenia którejś z nich podczas przenoszenia. </li>
</ol>

3. Przeniesienie siewek na RootChip
<ol>
 <li> Aby wysterylizować RootChip do eksperymentów długoterminowych, należy owinąć urządzenie papierem chłonnym, umieścić w szklanej szalce Petriego i poddać autoklawowaniu. </li>
 <li> Po ostygnięciu RootChipu należy zalać go płynną pożywką wzrostową. RootChip powinien być całkowicie zanurzony, jednak poziom cieczy nie powinien przekraczać 3 mm powyżej powierzchni urządzenia. </li>
 <li> Za pomocą pipety 20 μl należy pobrać pożywkę przez wlot korzenia i wylot komory, aby wypełnić komorę obserwacyjną pożywką. </li>
 <li> Do wlotów RootChipu należy włożyć plastikowe stożki wybrane w kroku 2.5. Stożki powinny ściśle przylegać do wlotów. Ponieważ RootChip jest zamontowany na cienkiej warstwie szkła optycznego, nie należy wywierać zbyt dużego nacisku na chip. </li>
 <li> RootChip należy inkubować przez noc w płynnej pożywce. Aby zapobiec wypływaniu, na chip należy położyć dwa szkiełka podstawowe. Należy dodać magnetyczny mieszadło i zamknąć szalkę. </li>
 <li> Cały zestaw należy przenieść na mieszadło magnetyczne i delikatnie mieszać pożywkę. </li>
 <li> Wloty RootChipu przecinają kanały pod kątem 30° względem normalnej urządzenia, aby ułatwić wzrost korzeni do wnętrza kanałów (Rysunek 1A). Aby dodatkowo wspomóc wzrost w pożądanym kierunku, należy lekko przechylić zestaw, kładąc szkiełko podstawowe pod szalką Petriego po stronie chipu przeciwnej do wylotów. </li>
 <li> W celu zachowania cyklu światło/ciemność, należy oświetlać siewki lampą pierścieniową (natężenie światła: 100 μE m-2 s-1) podłączoną do programatora czasowego. </li>
</ol>
4. Podłączenie RootChip do nośnika
<ol>
 <li> Następnego dnia napełnij szczelną fiolkę odporną na ciśnienie płynną pożywką wzrostową (Rysunek 1B). </li>
 <li> Odwróć uchwyt chipa i postaw go na stabilnej powierzchni. Wyjmij RootChip z pożywki płynnej i włóż go stroną PDMS w dół do dolnego otworu uchwytu chipa. Zorientuj chip tak, aby strona zawierająca wloty warstwy sterującej była skierowana w stronę złączy przewodów linii ciśnieniowej w bocznej ściance uchwytu. </li>
 <li> Osusz szkiełko podstawowe na spodzie chipa, delikatnie przykładając chusteczkę higieniczną. Przymocuj RootChip do uchwytu taśmą i ustaw cały zestaw w pozycji pionowej. </li>
 <li> Złącza przewodów wykonuje się poprzez pocięcie elastycznych plastikowych przewodów mikrobore (TYGON, 0.20" ID x 0.060" OD) na odcinki o długości 5 cm i połączenie ich ze stalowymi rurkami mikrobore (New England Small Tube, 0.025" OD x 0.013" ID x 0.75" long). Napełnij złącza przewodów wodą za pomocą strzykawki i podłącz każde złącze do odpowiedniego wlotu warstwy sterującej na chipie. Woda wypełni później kanały warstwy sterującej i będzie służyć do przekazywania ciśnienia do zaworów mikromechanicznych.</li>
 <li> Włóż przeciwległe końce przewodów do fiolki(ek) z pożywką/roztworem. Przyłóż ciśnienie do fiolki z roztworem za pomocą strzykawki z powietrzem. Zwiększone ciśnienie powietrza w fiolce z roztworem wymusi przepływ cieczy do przewodów. </li>
</ol>
5. Montaż RootChipu pod mikroskopem
<ol>
 <li> Umieść nośnik na stoliku mikroskopu. Aby zmniejszyć ryzyko przesunięcia się układu w trakcie eksperymentu na skutek wibracji w pomieszczeniu, nośnik powinien dokładnie pasować do nacięć wkładki stolika. </li>
 <li> Zawory w chipie oraz przepływ medium przez chip są kontrolowane za pomocą ciśnienia powietrza. Od głównej linii ciśnienia odchodzą dwie linie z regulatorami – jedna służy do sterowania przepływem medium przez kanały, a druga jest podłączona do elektrozaworów powietrznych, które uruchamiają zawory wypychające warstwy sterującej. Elektrozawory są obsługiwane z komputera za pomocą kontrolera zaworów USB (opracowanego przez Rafaela Gómeza-Sjöberga z Lawrence Berkeley National Lab). Przed podłączeniem chipa zamknij oba regulatory ciśnienia. </li>
 <li> Do zbiorników nośnika dodaj kilka ml wody, aby utrzymać wysoką wilgotność wewnątrz układu. Krok ten należy powtarzać w trakcie dłuższych eksperymentów, aby zapobiec wysychaniu roślin. Utrzymuj niską objętość, aby zminimalizować ilość cieczy, która mogłaby zostać rozlana na mikroskop. W przypadku eksperymentów długoterminowych odpływ z wylotów chipa można skierować do zbiorników nośnika, łącząc wyloty chipa ze zbiornikami za pomocą rurek o małej średnicy (patrz krok 4.4). Alternatywnie, odpływ gromadzący się na powierzchni chipa można zbierać za pomocą pipety. </li>
 <li> Przygotuj kwadratowe arkusze przezroczystego plastiku z koszulek ochronnych (C-Line). Przymocuj przezroczysty plastik do nośnika za pomocą taśmy dwustronnej, aby utrzymać wysoką wilgotność w układzie.</li>
 <li> Umieść pierścieniowe oświetlenie nad chipem i zachowaj cykl światła/ciemności. Oświetlenie pierścieniowe należy wyłączyć przed rozpoczęciem każdego eksperymentu z użyciem markerów fluorescencyjnych, ponieważ bezpośrednie oświetlenie będzie zakłócać obrazowanie. </li>
</ol>
6. Obsługa RootChip za pomocą interfejsu LabView
Interfejs sterownika RootChip dla platformy programistycznej LabView można pobrać z naszej strony internetowej <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a>.
<ol>
 <li> Zawory na chipie są zamykane poprzez wywieranie nacisku na warstwę sterującą, w tym przypadku poprzez otwarcie elektrozaworów powietrznych. Interfejs sterownika umożliwia aktywację zaworów poprzez kliknięcie przycisku pod numerem zaworu. Jasnozielony kolor wskazuje przyłożenie ciśnienia i zamknięcie zaworu chipa (Rysunek 2B). Przed otwarciem regulatorów ciśnienia należy aktywować wszystkie trzy zawory wlotowe roztworów w interfejsie sterownika.
 Uwaga: Interfejs sterownika posiada pętlę sprzężenia zwrotnego, która umożliwia monitorowanie stanu systemu. Funkcję tę można aktywować, klikając przycisk „Readback” w interfejsie sterownika.</li>
 <li> Otwórz regulator ciśnienia dla warstwy sterującej i ustaw go początkowo na 15 psi, następnie otwórz regulator dla warstwy przepływowej i ustaw go początkowo na 5 psi. W zależności od pożądanego natężenia przepływu, ciśnienia można później skorygować. </li>
 <li> Otwórz zawór wlotowy dla wybranego medium wzrostowego, aby przepłukać komory medium. </li>
 <li> Sprawdź ścieżki przepływu pod mikroskopem. Zazwyczaj w kanałach przepływowych uwięzione jest powietrze, które należy usunąć. Dodatkowo w kanałach warstwy sterującej wciąż znajduje się powietrze, które musi zostać wypchnięte i zastąpione wodą z złączy rurek (napełnianie ślepe). Oba zadania realizuje się poprzez kilkukrotne przepłukanie każdej z ośmiu komór (5 psi), aż całe powietrze zostanie wypchnięte z kanałów do PDMS („odgazowanie”). 
 Uwaga: Interfejs sterownika można zaprogramować w celu automatyzacji eksperymentów. Takie rutyny mogą być również wykorzystane do odgazowania chipa. </li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Głównym celem urządzenia RootChip jest połączenie platformy obrazowania i systemu perfuzji w jednym, wysoko zintegrowanym urządzeniu. Aby zademonstrować możliwość manipulacji mikrośrodowiskiem korzeni, przepłukaliśmy komory ciemnym barwnikiem spożywczym (rozcieńczenie 1:4 w pożywce hydroponicznej) i zmierzyliśmy wymianę płynu wewnątrz komór. Przy zalecanym ciśnieniu 5 psi odnotowaliśmy pełną wymianę w ciągu 10 sekund przy obliczonym natężeniu przepływu wynoszącym około 1,5 μl/min (Rysunek 3).
Obserwowaliśmy również wzrost korzeni siewek, które w tym przypadku były hodowane w ciemności z dodatkiem 10 mM glukozy jako zewnętrznego źródła energii (Rycina 4). W zależności od warunków wzrostu, takich jak światło i skład pożywki, rośliny mogą być obserwowane w urządzeniu RootChip przez okres do trzech dni.
Układ RootChip został wykorzystany do monitorowania wewnątrzkomórkowych poziomów glukozy i galaktozy w korzeniach wykazujących ekspresję genetycznie zakodowanych nanoczujników opartych na transferze energii rezonansowej Förestera (FRET)5-7. Korzenie w chipie były perfundowane impulsami roztworu glukozy lub galaktozy (Rysunek 5). Monitorowano wewnątrzkomórkowe poziomy cukrów, które przedstawiono tutaj jako stosunek intensywności fluorescencji akceptora Citrine do intensywności donora ECFP. Wzrost tego stosunku wskazuje na akumulację cukru.
<img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="Schemat zestawu RootChip do mikroskopii korzeni roślin pokazujący kierunek przepływu i komorę obserwacyjną." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Zasada działania RootChip.
<ol class="ualpha">
 <li> RootChip posiada osiem komór obserwacyjnych przeznaczonych do wzrostu i obrazowania korzeni. Nasiona najpierw kiełkują w plastikowych stożkach – wykonanych z końcówek pipet – które są wypełnione podłożem stałym. Wierzchołek korzenia rośnie przez podłoże i dociera do komory, w której ciągły przepływ podłoża ciekłego utrzymuje stałe warunki. Zawory mikromechaniczne (czerwone) kontrolują przepływ. Chip jest zamocowany na szklanej lamielce optycznej. 
 Rysunek nie w skali. (Adaptowano za zgodą Grossmann et al., 2011 Plant Cell.)</li>
 <li> Schemat fiolki z roztworem z możliwością nadciśnienia z membraną (czerwoną).</li>
 </ol>
<img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="Urządzenie mikroprzepływowe; schemat sieci kanałów; system PCR do analizy i separacji DNA." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Podłączanie i montaż RootChip.
<ol class="ualpha">
 <li>Widok z góry w pełni połączonego układu RootChip wraz z nośnikiem zamontowanym na mikroskopie odwróconym.</li>
 <li>Schemat ilustrujący system zaworowy oraz interfejs sterownika. Przedstawiono przykład ustawienia zaworów w celu skierowania przepływu cieczy do pojedynczej komory. Podczas gdy zawory od 4 do 8 działają jako zawory pojedyncze, zawory od 0 do 3 działają w grupach. Dzięki temu systemowi do pojedynczej komory można uzyskać dostęp poprzez aktywację odpowiedniej kombinacji zaworów.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="Wizualizacja przepływu w kanale; sekwencja z kamery wysokiej rozdzielczości; dynamika płynów; wykres procesu dynamicznego." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Wymiana roztworów w komorach obserwacyjnych. Wizualizacja wymiany płynu w komorze obserwacyjnej przy użyciu roztworu barwnika. Obraz stanowi nałożenie obrazu w jasnym polu na fałszywie kolorowaną intensywność sygnału barwnika.
<img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="Wzrost korzenia w trybie time-lapse, rozwój siewki, wyniki eksperymentu, badanie biologii roślin, sekwencyjne obrazy." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Wzrost korzenia na chipie. Obserwacja pojedynczego rosnącego korzenia wykazującego ekspresję fluorescencyjnego nanoczujnika FRET dla glukozy/galaktozy w ciągu 20 h. Format czasu: hh:mm; pasek skali: 100 μm.
<img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna i wykres przedstawiający wpływ glukozy i galaktozy na odpowiedź metaboliczną." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
 Rycina 5. Pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów cukrów przy użyciu nanoczujników FRET.
<ol class="ualpha">
 <li>Ilość sensora jest przedstawiona jako intensywność cytrynowa w obrębie wierzchołka korzenia (po lewej). Odpowiedź wewnątrzkomórkowego nanosensora FRET na aplikację roztworu glukozy lub galaktozy przedstawiono w formie obrazów ratiometrycznych. (Zaadaptowano za zgodą Grossmann et al., 2011 Plant Cell). Pasek skali: 100 μm.</li>
 <li>Zapis zmian stosunku FRET w odpowiedzi na trzy powtórzone impulsy prostokątne glukozy (zielony) i galaktozy (czerwony).</li>
</ol>

<ol><li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors%3A+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li>
<li>Loqué, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wirén, N., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytosolic+trans-activation+domain+essential+for+ammonium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake.</a> Nature. 446, 195-198 (2007).</li>
<li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li>
<li>Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+maltose+uptake+in+living+yeast+cells+by+fluorescent+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).</li>
<li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li>
<li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li>
<li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-in-chip%3A+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li>
<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li>
<li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+Compatibility+of+Poly%28dimethylsiloxane%29-Based+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Głównymi zaletami RootChip w porównaniu z konwencjonalnymi metodami hodowli są małoinwazyjne przygotowanie do mikroskopii, możliwość odwracalnej i wielokrotnej zmiany środowiska korzenia oraz zdolność do ciągłej obserwacji tkanki kompetentnej rozwojowo i fizjologicznie zdrowej przez okres kilku dni. Wcześniej siewki hodowano pionowo na pożywkach żelowych i przenoszono do systemu perfuzyjnego bezpośrednio przed eksperymentem, co pozwalało na pomiar tylko pojedynczych korzeni w jednym czasie8. Narzędzia mikrofluidyczne były stosowane dla Arabidopsis, lecz na niskim poziomie integracji9 lub bez kontroli perfuzji10. RootChip łączy wysoki poziom integracji z możliwością automatyzacji eksperymentów dzięki precyzyjnemu sterowaniu przepływem. Kolejną zaletą tej platformy, charakterystyczną dla wszystkich urządzeń mikrofluidycznych11, jest fakt, że do dostarczenia korzeniowi niezbędnych składników odżywczych wymagane są jedynie minimalne ilości cieczy, nawet w przypadku eksperymentów trwających kilka dni. RootChip jest obecnie zaprojektowany jako urządzenie jednorazowe, jednak ze względu na niskie koszty produkcji chipów, niewielkie ilości zużywanych odczynników sprawiają, że urządzenie to pozostaje bardzo ekonomiczne.
Istnieje kilka krytycznych kroków, które należy podjąć, aby zagwarantować zdrowie siewek:
Objętość w plastikowych stożkach wynosi zaledwie 3-4 μl, co sprawia, że ciecz zacznie wysychać po wystawieniu na działanie powietrza. Dlatego kluczowe jest, aby szybko przenieść stożki na chip i utrzymywać wysoką wilgotność aż do momentu, gdy korzenie dotrą do komór obserwacyjnych, które zapewnią im odpowiednią ilość wody. Kroki od 4.2 do 4.5 należy wykonać szybko i bez przerwy, aby zapobiec wysychaniu siewek.
Kroki 3.5 - 3.8 opisują inkubację chipa w mediach płynnych, podczas której korzenie wrastają do komór obserwacyjnych. Krok ten można pominąć, montując chipa w nośniku natychmiast i rozpoczynając stałą perfuzję pożywką wzrostową. Zalecamy jednak namaczanie w pożywce wzrostowej przez noc, ponieważ niesie to ze sobą pewne korzyści: 1) tworzy to wilgotne środowisko, dzięki czemu siewki rzadziej ulegają wysuszeniu podczas wrastania do komory obserwacyjnej; 2) chip jest nasączony cieczą, dzięki czemu odpowietrzanie (krok 6.4) przebiegnie szybciej.
Ważne jest stosowanie mediów o niskim stężeniu substancji rozpuszczonych. Bardziej skoncentrowane roztwory mogą ulec wytrąceniu i zapchać kanały, szczególnie jeśli chip jest używany przez kilka dni.
Po podłączeniu urządzenia do linii ciśnienia powietrza przepływ medium jest kontrolowany poprzez zmianę ciśnienia hydraulicznego w zaworach. Aby zagwarantować prawidłowe zamknięcie zaworów mikromechanicznych, należy wybrać ciśnienie sterujące około trzy razy wyższe niż ciśnienie przepływu. Ciśnienie przepływu nie powinno przekraczać 15 psi, ponieważ ciecz zostanie wypchnięta z wlotów korzeniowych. Wyższe ciśnienia mogą również spowodować delaminację chipa, co uczyni go niezdatnym do użytku.
Ograniczeniem RootChip jest fakt, że PDMS jest porowaty i hydrofobowy. Chociaż materiał ten jest praktycznie obojętny w stosunku do roztworów wodnych, może absorbować związki organiczne12. Może to utrudniać szybką wymianę roztworów, ponieważ związki organiczne mogą wyciekać z materiału nawet po zatrzymaniu ich podawania przez wlot. Ze względu na porowatość, stosowanie rozpuszczalników organicznych może powodować pęcznienie PDMS12.
Kontynuujemy optymalizację RootChip i rozszerzamy zakres jego zastosowań, na przykład w odniesieniu do korzeni roślin uprawnych. Wierzymy, że dzięki usprawnieniu dostępu do korzenia w celu przeprowadzania zabiegów i obserwacji, narzędzia mikrofluidyczne, takie jak RootChip, otworzą nowe perspektywy w badaniach nad systemami korzeniowymi.

<table><tbody><tr><td>Uchwyt chipa, oprogramowanie i inne informacje.</td><td>Carnegie Institution - DPB</td><td>Pliki CAD i CNC do produkcji uchwytów, oprogramowanie sterownika oraz dalsze informacje są dostępne do pobrania ze strony internetowej &lt;a href=&quot;http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip&quot; target=&quot;_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip&lt;/a&gt; Uchwyty można również zamówić za pośrednictwem tej strony.</td><td></td></tr><tr><td>RootChip</td><td>Stanford Foundry</td><td>Projekty masek i protokoły wykonania są dostępne na zapytanie. Gotowe do użycia układy RootChip można zamówić ze strony &lt;a href=&quot;http://www.stanford.edu/group/foundry/&quot; target=&quot;_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik chipa</td><td>Własnej konstrukcji</td><td>Zautomatyzowany system sterowania zaworami został pierwotnie opracowany przez Rafaela G&amp;#243;mez-Sj&amp;#246;berga z Lawrence Berkeley National Lab. Szczegółową instrukcję budowy własnego sterownika zaworów siłownikowych można znaleźć pod adresem &lt;a href=&quot;https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers&quot; target=&quot;_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers &lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia rootchip

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Korzeń pełni funkcję fizycznej kotwicy rośliny i jest organem odpowiedzialnym za pobieranie wody oraz składników mineralnych, takich jak azot, fosfor, siarczany i mikroelementy, które rośliny pozyskują z gleby. Aby opracować zrównoważone podejścia do osiągania wysokich plonów upraw, musimy lepiej zrozumieć, w jaki sposób korzeń się rozwija, pobiera szerokie spektrum składników odżywczych i wchodzi w interakcje z organizmami symbiotycznymi i patogennymi. Aby zrealizować te cele, musimy mieć możliwość badania korzeni w szczegółach mikroskopowych w przedziałach czasowych od kilku minut do wielu dni.
Opracowaliśmy RootChip, mikrofluidyczne urządzenie oparte na polidimetylosiloksanie (PDMS), które pozwala na hodowlę i obrazowanie korzeni siewek Arabidopsis przy jednoczesnym uniknięciu jakiegokolwiek stresu fizycznego korzeni podczas przygotowania do obrazowania1 (Rysunek 1). Urządzenie zawiera rozwidloną strukturę kanałów z zaworami mikromechanicznymi, które kierują przepływem cieczy z wlotów roztworów do każdej z ośmiu komór obserwacyjnych2. Ten system perfuzji pozwala na precyzyjną i szybką kontrolę oraz modyfikację mikrośrodowiska korzeni. Objętość komór wynosi około 400 nl, co sprawia, że wymagane są jedynie minimalne ilości roztworów testowych.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy protokół badania biologii korzeni z wykorzystaniem RootChip oraz metod obrazowania z rozdzielczością czasową w czasie rzeczywistym. Korzenie można analizować przez kilka dni, stosując mikroskopię poklatkową. Istnieje możliwość perfuzji korzeni roztworami odżywczymi lub inhibitorami, a w sposób równoległy można analizować do ośmiu siewek. System ten stwarza potencjał dla szerokiego zakresu zastosowań, w tym analizy wzrostu korzeni w obecności lub przy braku substancji chemicznych, analizy ekspresji genów opartej na fluorescencji oraz analizy biosensorów, np. nanosensorów FRET3.

Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli siewek Arabidopsis w RootChip, mikrofluidycznej platformie obrazowania, która łączy zautomatyzowaną kontrolę warunków wzrostu z mikroskopijnym monitorowaniem korzeni oraz pomiarem wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w oparciu o technikę FRET.

Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia RootChip

Korzeń pełni funkcję fizycznej kotwicy rośliny i jest organem odpowiedzialnym za pobieranie wody oraz składników mineralnych, takich jak azot, ...

Aby zapewnić maksymalne plony, rośliny muszą otrzymywać zestaw składników odżywczych; niedobory substancji odżywczych, stresy takie jak zimno lub ekstremalny upał, susza bądź patogeny powodują każdego roku ogromne straty w plonach upraw. Przyczyna wielu z tych problemów często kryje się pod ziemią. Korzeń jest fizyczną kotwicą rośliny, ale jest również organem odpowiedzialnym za pobieranie wody oraz przyswajanie składników mineralnych, takich jak azot, siarczan fosforu i wiele pierwiastków śladowych.Aby opracować zrównoważone podejścia do uzyskiwania wysokich plonów roślin uprawnych, musimy lepiej zrozumieć, w jaki sposób rozwijają się korzenie, jak pobierają szerokie spektrum składników odżywczych oraz jak wchodzą w interakcje z organizmami symbiotycznymi i patogennymi. Aby to osiągnąć, z oczywistych względów musimy mieć możliwość badania korzeni na poziomie mikroskopowym. Badanie biologii korzeni zawsze było bardziej wymagające niż badanie nadziemnych części rośliny.Ponieważ korzenie zazwyczaj znajdują się pod ziemią, nie są one łatwo dostępne do badań mikroskopowych. Usunięcie ich z gleby powoduje poważne uszkodzenia systemu korzeniowego, przez co nie jest to dobra metoda badania ich zachowania. Jednym z rozwiązań zwiększających dostępność korzeni jest ich hodowla na podłożu, co w niniejszym przykładzie pokazano w środowisku hydroponicznym.Uprawa roślin w pożywkach żelowych lub w systemach hydroponicznych z sukcesem stosowana jest w wielu badaniach nad korzeniami, jednak metody te wciąż utrudniają szczegółową analizę mikroskopową korzeni w długich odstępach czasu. Aby uzyskać jak najbliższy możliwy dostęp do rosnącego korzenia i uniknąć stresu fizycznego związanego z przygotowaniem do obrazowania, zbudowaliśmy platformę umożliwiającą jednoczesną uprawę i obrazowanie korzeni, a także precyzyjne i szybkie kontrolowanie oraz modyfikowanie ich mikrośrodowiska. Platformę tę nazwaliśmy „root chip”. Root chip to urządzenie mikroprzepływowe wykonane z PDMS, organicznego polimeru na bazie silikonu.Chip posiada komory obserwacyjne do wzrostu i obrazowania korzeni siewek *Arabidopsis*. Nasiona kiełkują początkowo w plastikowych stożkach wykonanych z końcówek pipet plastikowych, które wypełniamy pożywką stałą. Następnie wierzchołek korzenia przerasta przez pożywkę i dociera do komory, w której znajduje się w ciągłym przepływie pożywki płynnej, co pozwala na utrzymanie stałych warunków w komorze.Stałe mikromechaniczne zawory opracowane w laboratorium Steve'a Quake'a na Uniwersytecie Stanforda są tutaj pokazane w czerwonym sterowaniu. Ponieważ chip jest zamontowany na przezrozystym szkiełku nakrywkowym, typowo stosowanym w mikroskopii, wszystkie procesy w komorze obserwacyjnej mogą być monitorowane przy użyciu mikroskopu odwróconego. Pod mikroskopem widoczna jest rozgałęziona struktura kanałów prowadząca przepływ cieczy.Chip korzeniowy składa się z dwóch warstw: warstwy sterującej zawierającej zawory oraz warstwy przepływowej zawierającej kanały, przez które pożywki wzrostowe i roztwory testowe dopływają do komór obserwacyjnych. Objętość tych komór wynosi około 400 nanolitrów. Oznacza to, że wymagane są jedynie bardzo małe ilości roztworu, a warunki mogą być zmieniane bardzo szybko.Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania żywych korzeni ośmiu siewek Arabidopsis do równoległego obrazowania mikroskopowego na chipie korzeniowym oraz ich obserwację przez okres do trzech dni. Należy rozpocząć od napełnienia 10 milimetrowej płytki Petri pożywką zawierającą 1% agar, gdy pożywka jest jeszcze w stanie ciekłym. Przy użyciu pipety wielokanałowej należy napełnić końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów ilością 5 mikrolitrów pożywki z płytki Petri. Napełnione końcówki przechowuje się w pudełku na końcówki pipet aż do momentu zestalenia się pożywki.Następnie wycina się plastikowe stożki o długości czterech milimetrów i ustawia się je pionowo w szalce Petriego zawierającej stałą pożywkę wzrostową. Po sterylizacji powierzchniowej pojedyncze nasiona umieszcza się na wierzchu stożków wypełnionych pożywką. Szalkę uszczelnia się taśmą mikroporową, a następnie przechowuje w temperaturze czterech stopni, aby zsynchronizować kiełkowanie.Po trzech dniach płytki przenosi się do komory wzrostu w celu rozpoczęcia kiełkowania. Warunki wzrostu w tym eksperymencie wynoszą 23°C. Przy cyklu 16 godzin światła i 8 godzin ciemności, od pięciu do siedmiu dni po wykiełkowaniu siewka powinna być gotowa do przeniesienia na chip korzeniowy; należy sprawdzić zdrowie siewki, długość korzenia oraz, jeśli dotyczy, ekspresję markera fluorescencyjnego pod mikroskopem stereotypowym.Gdy tylko wierzchołki korzeni siewek dotrą do dolnego wylotu plastikowego stożka, poszczególne siewki są znakowane w celu przeniesienia ich na chip. Należy wybrać około 10 siewek roślin na wypadek, gdyby któraś z nich uległa uszkodzeniu podczas przenoszenia na sterylny chip korzeniowy. W przypadku eksperymentów długoterminowych urządzenie owija się chusteczką, umieszcza w szklanej szalce Petriego i sterylizuje w autoklawie.Chip został wcześniej poddany autoklawowaniu. Po schłodzeniu chipu, w ramach eksperymentu, należy pokryć go płynną pożywką wzrostową. Chip powinien być całkowicie zakryty, jednak poziom cieczy nie może przekraczać 3 mm ponad powierzchnię chipu.Do przeciągnięcia pożywki przez wlot korzeniowy i wylot komory używa się pipety 20 µL. W ten sposób wypełniana jest komora obserwacyjna. Następnie do chipa korzeniowego wprowadza się plastikowe końcówki, aby zatkać otwory z pożywką.Stożek powinien ściśle pasować do wlotów. Ponieważ chip korzenia jest zamontowany na cienkiej warstwie szkła optycznego, należy uważać, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku na chip. Na tym etapie chip jest przygotowany do całonocnej inkubacji w pożywce ciekłej, aby zapobiec jego wypływaniu.Na chipie umieszcza się dwa szkiełka przedmiotowe, z czego jedno jest przecięte na pół. Następnie dodaje się magnetyczny mieszadło i zamyka naczynie. Cały układ przenosi się na mieszadło magnetyczne, które będzie delikatnie agytować medium, aby ułatwić wzrost korzeni w kierunku wylotów.Wloty w chipie korzeniowym są wykonane pod kątem, aby dodatkowo wspomagać wzrost w pożądanym kierunku. Delikatnie przechyl zestaw, podnosząc stronę chipa przeciwległą do wylotów.Chip jest oświetlony lampą pierścieniową podłączoną do przełącznika czasowego w celu utrzymania rytmu światła i ciemności. Po inkubacji nocnej przygotowuje się płynną pożywkę wzrostową w szczelnej fiolce odpornej na ciśnienie. Kolejne kroki należy wykonać szybko i bez przerw, aby zapobiec wysuszeniu siewek.Chip zostaje teraz wyjęty z medium ciekłego i umieszczony odwrócony w dolnym otworze uchwytu do chipów, który również jest odwrócony. Chip musi być zorientowany tak, aby strona zawierająca wloty warstwy sterującej była skierowana w stronę linii ciśnieniowej z dwoma dużymi złączami w ściance bocznej uchwytu.Kryształy szkiełka nakrywkowego na spodzie chipa osuszono, delikatnie odciskając je papierową chusteczką, a następnie przymocowano do nośnika. Cały zestaw odwrócono za pomocą taśmy. Złącza rurek napełniono wodą przy użyciu strzykawki, a następnie każde złącze rurki wpięto do odpowiedniego wlotu.Na chipie. Przewody są podłączone do medium i roztworu. Następnie z linii usuwa się pęcherzyki powietrza, wywierając nacisk na fiolkę z roztworem za pomocą strzykawki z powietrzem, a nośnik zostaje przykryty przezroczystym plastikiem.Aby utrzymać wysoką wilgotność w układzie, nośnik umieszcza się na stoliku mikroskopu. Powinien on dokładnie pasować do wycięć w stoliku. Zawory w chipie, jak również przepływ medium przez chip, są kontrolowane za pomocą ciśnienia powietrza.Od głównej linii ciśnienia odchodzą dwie linie z regulatorami. Jedna z nich służy do kontrolowania przepływu cieczy, a druga jest podłączona do elektromagnetycznych zaworów powietrznych. Zawory te są sterowane z komputera za pomocą kontrolera zaworów USB i odpowiadają za uruchamianie zaworów na chipie.Oba regulatory ciśnienia powinny być zamknięte przed podłączeniem chipa. Przewody, złączki i fiolki z roztworem zostają teraz podłączone do odpowiednich linii ciśnienia. Do zbiorników nośnika dodaje się kilka mililitrów wody.Krok ten może wymagać powtórzenia w przypadku dłuższych eksperymentów. Aby utrzymać wysoką wilgotność, należy ograniczyć objętość załadunku, by zminimalizować potencjalną ilość cieczy, która mogłaby zostać rozlana na mikroskop. Lampę pierścieniową ustawia się nad chipem, aby utrzymać cykl światła i ciemności aż do rozpoczęcia eksperymentu.Zawory na chipie są zamykane poprzez przyłożenie ciśnienia, w tym przypadku poprzez otwarcie elektrozaworów powietrznych. Interfejs LabVIEW umożliwia sterowanie zaworami poprzez kliknięcie przycisku znajdującego się pod numerem zaworu. Kolor jasnozielony wskazuje przyłożenie ciśnienia i zamknięcie zaworu na chipie.Ten schemat ilustruje organizację systemu zaworowego, w którym zawory od czwartego do ósmego działają jako zawory pojedyncze, natomiast zawory od zera do trzeciego działają w grupach. W tym systemie do poszczególnych komór można się odwołać poprzez aktywację kombinacji zaworów; na przykład, aby skierować przepływ cieczy wyłącznie do trzeciej komory od góry, zawory zero, trzy i cztery muszą być zamknięte. Ponadto zawory sześć, siedem i osiem kontrolują, który roztwór jest używany do płukania wlotów A, B i C; teraz aktywuj wszystkie trzy zawory wlotowe roztworów, aby je zamknąć.Interfejs sterownika posiada pętlę sprzężenia zwrotnego, która umożliwia monitorowanie stanu systemu. Funkcję tę można aktywować, klikając przycisk odczytu (read back). W pierwszej kolejności otwiera się regulator ciśnienia dla warstwy sterującej i ustawia go na 15 PSI.Następnie otwiera się regulator warstwy przepływu i ustawia go na wartość 5 PSI. Otwiera się zawór wlotowy dla wybranego medium hodowlanego i płucze komory medium, po czym należy sprawdzić ścieżki przepływu pod mikroskopem. W większości przypadków w kanałach uwięzione jest powietrze, które musi zostać usunięte.Dodatkowo, w kanałach powietrza sterującego wciąż znajduje się powietrze, które musi zostać wypchnięte i zastąpione wodą z złączy rurek. Proces ten nazywa się napełnianiem ślepym (dead end filling). Oba zadania realizuje się poprzez kilkukrotne przepłukanie każdej z ośmiu komór, aż całe powietrze zostanie wypchnięte z kanałów do PDMS.System można zaprogramować w celu automatyzacji eksperymentów. Takie procedury mogą być również wykorzystywane do odgazowania chipa. Głównym celem chipa głównego jest połączenie platformy obrazowania i systemu perfuzji w jednym urządzeniu.Aby zademonstrować manipulację mikrośrodowiskiem korzeni, przepłukaliśmy komory barwnikiem i zmierzyliśmy wymianę płynu wewnątrz komór. Przy zalecanym ciśnieniu 5 PSI zmierzyliśmy pełną wymianę w ciągu 10 sekund przy obliczonym szybkości przepływu wynoszącej około 1,5 µL/min. Obserwowaliśmy również wzrost korzeni siewek, które w tym przypadku były hodowane w ciemności i dostarczano im 10 mM glukozy jako zewnętrzne źródło energii.W zależności od warunków wzrostu, takich jak oświetlenie i skład pożywki, rośliny można obserwować na chipie korzeniowym przez okres do trzech dni. System ten był wykorzystywany do monitorowania wewnątrzkomórkowych poziomów glukozy i galaktozy w korzeniach wykazujących ekspresję genetycznie kodowanych nanoczujników. Czujniki te, oparte na transferze energii między fluorescencją a fluorescencją (FRET), zostały opracowane w laboratorium Fromera.W tym eksperymencie korzenie znajdujące się w chipie poddawano perfuzji prostokątnymi impulsami roztworu glukozy lub galaktozy. Monitorowano wewnątrzkomórkowe poziomy cukrów, które przedstawiono tutaj jako stosunek intensywności fluorescencji akceptora four citrine do intensywności donora ECFP po lewej stronie. W środkowej części widzimy obraz ratiometryczny sensorów citrine w koniuszku korzenia, a po prawej stronie przedstawiono przebieg zmian ilości cukru w odpowiedzi na trzy powtórzone prostokątne impulsy glukozy (kolor zielony) i galaktozy (kolor czerwony).Wzrost stosunku wskazuje na akumulację cukru. Głównymi zaletami chipa korzeniowego w porównaniu z konwencjonalnymi metodami uprawy są minimalnie inwazyjny sposób przygotowania do mikroskopii, możliwość odwracalnej i wielokrotnej zmiany środowiska korzeniowego oraz możliwość ciągłej obserwacji tkanek kompetentnych rozwojowo i fizjologicznie zdrowych przez okres wielu dni. Innym istotnym atutem jest fakt, że do dostarczenia korzeniom wszystkich niezbędnych składników odżywczych w czasie wymagane są jedynie minimalne ilości cieczy.Dzięki temu chip korzeniowy jest bardzo opłacalny, zwłaszcza przy zastosowaniu drogich odczynników. Kontynuujemy optymalizację chipa korzeniowego i rozszerzanie zakresu jego użyteczności, ponieważ wierzymy, że poprzez lepsze udostępnienie tego ważnego organu do zabiegów i obserwacji, narzędzia mikroprzepływowe, takie jak chip korzeniowy, potencjalnie otworzą nowe wymiary badań nad roślinami. Więcej informacji na temat budowy systemu chipa korzeniowego można znaleźć na naszej stronie internetowej.Układy scalone można zamówić w Stanford Foundry.

time-lapse-fluorescence-imaging-arabidopsis-root-growth-with-rapid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przetwarzanie obrazów fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybkim sterowaniem środowiskiem korzeni za pomocą RootChip

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Ten protokół opisuje proces szybkiego zbierania obrazów sadzonek rzodkiewnika reagujących na bodziec grawitacyjny za pomocą dostępnych na rynku skanerów płaskich.  Metoda ta pozwala na niedrogie, wysokonakładowe przechwytywanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, które można poddać dalszym algorytmom analizy.

Używanie skanerów płaskich do zbierania poklatkowych obrazów o wysokiej rozdzielczości odpowiedzi grawitropowej korzenia rzodkiewnika

Ten protokół pokazuje metodę przygotowania próbek roślinnych do mikroskopii świetlnej. Konfiguracja charakteryzuje się zamontowaniem rośliny pionowo na powierzchni żelu i pozwoleniem jej rosnąć w kontrolowanych jasnych warunkach. Pozwala to na długotrwałą obserwację rozwoju organów roślinnych w znormalizowanych warunkach.

Mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego korzeni roślin rosnących na powierzchni żelu

Przedstawiona tutaj jest prosta technika konfokalnego obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości rozwoju korzeni i hipokotylu przez okres do 3 dni przy użyciu obiektywów o dużej aperturze numerycznej i perfluorodekaliny jako medium immersyjnego.

Prosta komora do długoterminowego obrazowania konfokalnego rozwoju korzeni i hipokotylu

Ten artykuł pokazuje, jak hodować siewki Arabidopsis thaliana w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej, która ogranicza główny korzeń i włośniki do jednej płaszczyzny optycznej. Platforma ta może być wykorzystywana do obrazowania optycznego w czasie rzeczywistym drobnej morfologii korzeni, a także do obrazowania w wysokiej rozdzielczości za pomocą innych środków.

Obrazowanie morfologii włośnika siewek rzodkiewnika w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni

Niniejszym przedstawiamy przewodnik krok po kroku, prezentujący przeznaczenie, zasadę działania oraz reprezentatywne wyniki uzyskiwane za pomocą nowatorskiego spektrometru siły grawitacyjnej.

Demonstracja zastosowań nowatorskiego spektrometru sił grawitacyjnych do rozciągania i pomiaru białek włóknistych

Opracowano unikalną metodę inżynierii tkankowej w celu wydłużenia licznych włókien nerwowych w hodowli poprzez odtworzenie wzrostu aksonów indukowanego rozciąganiem; jest to forma wzrostu układu nerwowego, w której nerwy wydłużają się równocześnie ze wzrostem powiększającego się organizmu.

Wzrost aksonów indukowany rozciąganiem: mechanotransdukcja wzrostu neuronalnego

Poznaj metodę mikroskopowego obrazowania korzeni Arabidopsis thaliana przy użyciu platformy RootChip. To podejście umożliwia precyzyjną kontrolę warunków wzrostu i długoterminową obserwację rozwoju korzeni w czasie rzeczywistym.

Poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne wzrostu korzeni rzodkiewnika z szybką manipulacją środowiskiem korzeniowym za pomocą RootChip (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia RootChip

Przeglądaj więcej filmów