Poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne wzrostu korzeni rzodkiewnika z szybką manipulacją środowiskiem korzeniowym za pomocą RootChip

Ten artykuł zawiera protokół uprawy sadzonek rzodkiewnika w RootChip, platformie obrazowania mikroprzepływowego, która łączy zautomatyzowaną kontrolę warunków wzrostu z mikroskopijnym monitorowaniem korzeni i pomiarem wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów opartym na FRET.

Aby zapewnić maksymalne plony, rośliny muszą mieć zapewniony zestaw składników odżywczych, niedobory składników odżywczych, stresy, takie jak zimno lub ekstremalne upały, susza lub patogeny, które powodują ogromne straty w plonach każdego roku. Źródło wielu z tych problemów często leży w podziemiu. Korzeń jest fizyczną kotwicą rośliny, ale jest również organem odpowiedzialnym za pobieranie wody i pobieranie mineralnych składników odżywczych, takich jak azot, siarczan fosforu i wiele pierwiastków śladowych.

Jeśli chcemy opracować zrównoważone podejście do uzyskiwania wysokich plonów, musimy lepiej zrozumieć, w jaki sposób rozwijają się korzenie, w jaki sposób pobierają one tak szerokie spektrum składników odżywczych i jak wchodzą w interakcje z organizmami symbiotycznymi i chorobotwórczymi. Aby to zrobić, musimy być w stanie badać korzenie na poziomie mikroskopowym Z oczywistych powodów. Studiowanie biologii korzeni zawsze było trudniejsze niż badanie nadziemnych części rośliny.

Ponieważ korzenie są zwykle ukryte pod ziemią, nie są łatwo dostępne do badań mikroskopowych. Usunięcie z gleby powoduje poważne uszkodzenie systemu korzeniowego i dlatego nie jest dobrym sposobem badania ich zachowania. Jednym z rozwiązań, które sprawi, że korzenie będą bardziej dostępne, jest uprawa ich na jeed lub pokazano w tym przykładzie w podłożach hydroponicznych.

Plany uprawy w pożywkach galaretowich lub hydroponicznych były z powodzeniem stosowane w wielu badaniach korzeni, ale przy użyciu tych metod nadal bardzo trudno jest badać korzenie w mikroskopijnych szczegółach i przez długi czas, aby zbliżyć się jak najbardziej do rosnącego korzenia i uniknąć stresu fizycznego związanego z przygotowaniem do obrazowania. Budujemy platformę, która pozwala nam rosnąć i obrazować korzenie, a jednocześnie pozwala nam kontrolować i modyfikować mikrośrodowisko korzeni z bardzo dużą precyzją i szybkością. Tę platformę nazwaliśmy chipem głównym. Chip korzeniowy to urządzenie mikroprzepływowe wykonane z PDMS, organicznego polimeru na bazie silikonu.

Na chipie znajdują się komory obserwacyjne do wzrostu i obrazowania korzeni siewek królika. Nasiona najpierw kiełkują w plastikowych stożkach wykonanych z plastikowych końcówek pipet, które wypełniamy stałym podłożem. Wierzchołek korzenia następnie przerasta pożywkę i dociera do komory, gdzie doświadcza ciągłego przepływu płynnego podłoża, utrzymując warunki w komorze.

Stałe zawory mikromechaniczne opracowane przez laboratorium Steve'a Quake'a na Uniwersytecie Stanforda są pokazane na czerwono w sterowaniu. Przepływ, ponieważ chip jest zamontowany na przezroczystym szkle nakrywkowym, jak zwykle stosuje się w mikroskopii, wszystkie procesy w komorze obserwacyjnej można monitorować za pomocą odwróconego mikroskopu. Rozwidlona struktura kanału, która kieruje przepływem płynu, jest widoczna pod mikroskopem.

Chip korzeniowy składa się z dwóch warstw, warstwy kontrolnej zawierającej zawory w warstwie przepływowej zawierającej kanały, przez które roztwory testowe pożywki wzrostowej przepływają do komór obserwacyjnych. Objętość tych komór wynosi około 400 nanolitrów. Oznacza to, że potrzebne są tylko bardzo małe ilości roztworu, a warunki mogą ulec bardzo szybkiej zmianie.

Protokół ten opisuje, w jaki sposób żywe korzenie ośmiu siewek rzodkiewnika są przygotowywane do równoległego obrazowania mikroskopowego na chipie korzeniowym i obserwowane przez okres do trzech dni, zaczynając od wypełnienia 10-milimetrowej szalki Petriego pożywką wzrostową zawierającą 1% agar, gdy podłoże jest jeszcze płynne. Napełnij 10 mikrolitrów końcówek pipet pięcioma mikrolitrami pożywki z szalki Petriego za pomocą pipety wielokanałowej. Napełnione końcówki są przechowywane w pudełku z końcówkami do pipet, dopóki podłoże nie stanie się stałe.

Następnie pokrój plastikowe stożki o długości czterech milimetrów i umieść pionowo na szalce Petriego zawierającej stałe podłoże wzrostowe. Po sterylizacji powierzchniowej pojedyncze nasiona umieszcza się na stożkach wypełnionych pożywką. Naczynie jest następnie uszczelniane taśmą z mikroporami, a płytka jest przechowywana w czterech stopniach w celu zsynchronizowania kiełkowania.

Po trzech dniach płytki przenosi się do szafki wzrostowej, aby rozpocząć kiełkowanie. Nasze warunki wzrostu w tym eksperymencie wynoszą 23 stopnie. Przy 16-godzinnym podświetleniu, ośmiogodzinnym cyklu ciemności między pięcioma a siedmioma dniami po wykiełkowaniu, sadzonka powinna być gotowa do przeniesienia na sadzonkę chipa korzeniowego zdrowotną długość korzenia, a jeśli ma to zastosowanie, Ekspresję markera fluorescencyjnego należy sprawdzić pod mikroskopem preparacyjnym.

Gdy tylko końcówki korzeni sadzonek dotrą do dolnego wylotu plastikowego stożka, poszczególne sadzonki są oznaczane do przeniesienia na chip. Należy wybrać około 10 sadzonek roślin na wypadek, gdyby jedna z nich uległa uszkodzeniu podczas przenoszenia, aby wysterylizować wiór korzeniowy. W przypadku długotrwałych eksperymentów urządzenie owija się w tkankę, umieszcza na szklanej szalce Petriego i autoklawie.

Ten chip był już wcześniej autoklawowany. Eksperyment po schłodzeniu chipa jest pokryty płynnym podłożem wzrostowym. Chip powinien być całkowicie zakryty, ale poziom płynu nie powinien być wyższy niż trzy milimetry nad powierzchnią chipa.

Pipeta o pojemności 20 mikrolitrów służy do przeciągania pożywki przez wlot i wylot komory korzeniowej. To wypełnia komorę obserwacyjną. W przypadku nośnika wybrane plastikowe stożki są teraz podłączane do głównego chipa.

Stożek powinien ściśle przylegać do wlotów. Ponieważ chip główny jest zamontowany na cienkiej warstwie szkła optycznego, należy uważać, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku na chip. Na tym etapie chip jest teraz przygotowany do całonocnej inkubacji w płynnym podłożu, aby zapobiec unoszeniu się chipa na wodzie.

Na chipie umieszcza się dwa szkiełka podstawowe, jedno przecięte na pół. Dodaje się mieszadło magnetyczne i naczynie zamyka się. Zespół jest teraz przenoszony do mieszadła magnetycznego, które delikatnie poruszy podłoże, aby ułatwić wzrost korzeni w kierunku wylotów.

Chip główny. Wloty są dziurkowane pod kątem, aby jeszcze bardziej wspomóc wzrost w pożądanym kierunku. Lekko przechyl zespół, podnosząc stronę chipa, która znajduje się naprzeciwko wylotów.

Chip jest podświetlany lampą pierścieniową Podłączoną do wyłącznika czasowego, aby utrzymać rytm światła, ciemności. Po całonocnej inkubacji płynną pożywkę wzrostową przygotowuje się w szczelnej fiolce pod ciśnieniem. Poniższe kroki należy wykonać szybko i bez przerwy, aby zapobiec wysuszeniu sadzonek.

Chip jest teraz wyjmowany z płynnego medium i umieszczany do góry nogami w dolnym otworze nośnika wiórów, który jest również odwrócony. Chip musi być zorientowany w taki sposób, aby strona zawierająca wloty warstwy kontrolnej była skierowana w stronę boku przewodu ciśnieniowego. Dwa duże łączniki w ścianie bocznej nośnika.

Szkło nakrywkowe na spodzie chipa jest suszone przez delikatne osuszanie bibułką i umieszczane na nośniku. Za pomocą taśmy cały zespół jest następnie odwracany. Złącza przewodów są napełniane wodą za pomocą strzykawki, a każde złącze rurki jest podłączane do odpowiedniego wlotu.

Na chipie. Rurki są podłączone do medium i roztworu. Fiolki i powietrze są następnie usuwane z przewodów poprzez wywieranie nacisku na roztwór żółci za pomocą strzykawki z powietrzem, nośnik jest pokryty przezroczystym tworzywem sztucznym.

Aby utrzymać wysoką wilgotność w zespole, nośnik umieszcza się na stoliku mikroskopu. Powinien dokładnie pasować do wycięć sceny. Zawory wiórowe, jak również przepływ medium przez wiór, są kontrolowane przez ciśnienie powietrza.

Dwa przewody z regulatorami są rozgałęzione od głównego przewodu ciśnieniowego. Jeden służy do sterowania przepływem płynu, a drugi jest podłączony do elektromagnetycznych zaworów powietrza. Zawory te są obsługiwane z komputera za pośrednictwem sterownika zaworów USB i są odpowiedzialne za uruchamianie zaworów na chipie.

Oba regulatory ciśnienia powinny być zamknięte przed podłączeniem chipa. Przewody, złączki i fiolki z roztworem są teraz podłączone do odpowiednich przewodów ciśnieniowych. Do zbiorników nośnika dodaje się kilka mililitrów wody.

Ten krok może wymagać powtórzenia w trakcie dłuższych eksperymentów. Aby utrzymać wysoką wilgotność, utrzymuj objętość, aby zminimalizować potencjalną ilość płynu, który mógłby zostać rozlany na mikroskop. Światło pierścieniowe jest przesuwane na miejsce nad chipem, aby utrzymać cykl światła i ciemności do momentu rozpoczęcia eksperymentu.

Zawory na chipie są zamykane przez przyłożenie ciśnienia, w tym przypadku poprzez otwarcie elektromagnetycznych zaworów powietrznych. Interfejs widoku laboratorium umożliwia sterowanie zaworami poprzez kliknięcie przycisku poniżej numeru zaworu. Jasnozielony wskazuje zastosowanie ciśnienia i zamknięcie zaworu wiórowego.

Schemat ten ilustruje organizację układu zaworów, podczas gdy zawory od czwartego do ósmego działają jako pojedyncze zawory, zawory od zera do trzech działają. W grupach z tym systemem można zająć się pojedynczą komorą, aktywując kombinację zaworów, na przykład w celu kierowania przepływu płynu wyłącznie do trzeciej komory od góry zawory zero, trzy i cztery muszą być zamknięte. Ponadto zawory szósty, siódmy i ósmy kontrolują, który roztwór jest używany do płukania wlotów A, B i C, aktywują teraz wszystkie trzy zawory wlotowe roztworu, aby je zamknąć.

Interfejs sterownika posiada pętlę sprzężenia zwrotnego, która umożliwia monitorowanie stanu systemu. Tę funkcję można aktywować, klikając przycisk odczytu wstecz. Regulator ciśnienia dla warstwy kontrolnej jest najpierw otwarty i ustawiony na 15 PSI.

Następnie regulator warstwy przepływu jest otwarty i ustawiony na pięć PSI. Zawór wlotowy dla wybranej pożywki wzrostowej jest otwierany, a komory są przepłukiwane ścieżkami przepływu pożywki, które należy sprawdzić pod mikroskopem. W większości przypadków powietrze jest uwięzione w kanałach i musi zostać usunięte.

Ponadto w kanałach powietrza sterującego nadal znajduje się powietrze, które musi zostać wypchnięte i zastąpione wodą z króćców przewodów. Ten proces nazywa się wypełnianiem ślepego zaułka. Oba zadania osiąga się poprzez kilkukrotne przepłukanie każdej z ośmiu komór, aż całe powietrze zostanie wtłoczone z kanałów do PDMS.

System można zaprogramować tak, aby automatyzował eksperymenty. Takie procedury mogą być również używane do odgazowywania chipa. Głównym celem chipa głównego jest połączenie platformy obrazowania i systemu profusion w jednym urządzeniu.

Aby zademonstrować manipulację mikrośrodowiskiem korzeni, przepłukaliśmy komory barwnikiem i zmierzyliśmy wymianę płynu w komorach. Przy zalecanym ciśnieniu pięciu PSI zmierzyliśmy pełną wymianę w ciągu 10 sekund przy obliczonym natężeniu przepływu około 1,5 mikrolitra na minutę. Zaobserwowaliśmy również wzrost korzeni siewek, w tym przypadku uprawianych w ciemności i zaopatrywanych w 10 milimolową glukozę jako zewnętrzne źródło energii.

W zależności od warunków wzrostu, takich jak światło i skład podłoża, rośliny można obserwować w wiórach korzeniowych do trzech dni. System ten został wykorzystany do monitorowania wewnątrzkomórkowych poziomów glukozy i galaktozy w korzeniach wykazujących ekspresję genetycznie kodowanych nanoczujników. Czujniki te oparte na pierwszym lub rezonansowym transferze energii lub progu zostały opracowane w laboratorium Fromer.

W tym eksperymencie korzenie w chipie były perfuzjowane kwadratowymi impulsami roztworu glukozy lub galaktozy. Wewnątrzkomórkowe poziomy cukrów były monitorowane i pokazane tutaj, wyrażone jako stosunek intensywności akceptora cytryny fluoro-czwartej do intensywności ECFP dawcy po lewej stronie. Obserwujemy ilość czujników cytrynu w środku lub w proporcji obrazu metrycznego wierzchołka korzenia, a po prawej śledzimy ilość cukru w odpowiedzi na trzy powtarzające się kwadratowe impulsy glukozy w kolorze zielonym i galaktozie pokazane na czerwono.

Wzrost stosunku wskazuje na akumulację cukru. Głównymi zaletami chipa korzeniowego w porównaniu z konwencjonalnymi metodami wzrostu są minimalnie inwazyjne przygotowanie do mikroskopii, zdolność do odwracalnych i wielokrotnych zmian środowiska korzeniowego oraz zdolność do ciągłej obserwacji kompetentnej rozwojowo i fizjologicznie zdrowej tkanki przez okres kilku dni. Kolejną bardzo ważną zaletą jest to, że potrzebne są tylko minimalne ilości płynu, aby z czasem dostarczyć korzeniom wszystkich niezbędnych składników odżywczych.

To sprawia, że chipp korzeniowy jest bardzo opłacalny, zwłaszcza gdy stosowane są drogie odczynniki. Kontynuujemy optymalizację chippa korzeniowego i rozszerzamy jego użyteczność, ponieważ wierzymy, że dzięki lepszemu dostępowi do tego ważnego narządu do leczenia i obserwacji, narzędzia mikroprzepływowe, takie jak chip korzeniowy, potencjalnie otworzą nowy wymiar badań nad roślinami. Więcej informacji o tym, jak zbudować główny system chipowy, można znaleźć na naszej stronie internetowej.

Frytki można zamówić w odlewni Stanforda.