Name: Badanie funkcji rodziny BCL-2 z dużymi pęcherzykami jednowarstwowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę tworzenia dużych pęcherzyków jednowarstwowych do badania interakcji białek rodziny BCL-2. Model ten naśladuje zewnętrzną błonę mitochondrialną, umożliwiając analizę regulacji apoptozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować wszystkim członkom Laboratorium Chipuka za współpracę i wsparcie. Ponadto chcielibyśmy wyrazić wdzięczność Tomomi Kuwanie i Donaldowi Newmeyerowi za opracowanie podstaw eksperymentalnych dla niniejszej pracy. Praca ta była finansowana przez: NIH CA157740 (dla J.E.C.) oraz projekt pilotażowy z NIH P20AA017067 (dla J.E.C.). Praca ta była również częściowo wspierana przez grant badawczy 5-FY11-74 z Fundacji March of Dimes (dla J.E.C.).

1. Połącz lipidy i wytwórz film lipidowy
<ol>
	<li>Pracując w dygestorium przy minimalnym oświetleniu, lipidy rozpuszczone w chloroformie przenosi się do 1,5 ml bursztynowej fiolki szklanej, używając do tego szczelnej szklanej strzykawki Hamiltona przepłukanej chloroformem. Taka kombinacja pozwoli uzyskać około 4 mg lipidów (Rysunek 1A).
	<ul>
		<li>Kardiolipina 10 mg/ml (CL) - 63 μl</li>
		<li>Fosfatydylocholina 10 mg/ml (PC) - 84 μl</li>
		<li>Fosfatydyloetanoloamina 10 mg/ml (PE) - 125 μl</li>
		<li>Fosfatydyloinozytol 10 mg/ml (PI) - 59,5 μl</li>
		<li>Fosfatydyloseryna 10 mg/ml (PS) - 65 μl</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Aby usunąć chloroform, skieruj delikatny strumień gazu obojętnego (np. azot lub argon) do wnętrza fiolki. Po wyschnięciu, co zazwyczaj zajmuje od 2 do 3 godzin, na dnie i ściankach fiolki pojawi się widoczna warstwa lipidowa (Rysunek 1A).</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu liposomów
<ol>
	<li>W probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml przygotować 500 μl 12,5 mM ANTS w buforze LUV (0,2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 ) oraz 500 μl 45 mM DPX w buforze LUV (Rysunek 1B).</li>
	<li>Połączyć roztwory ANTS i DPX, wymieszać w wirówce vortex przez 1 min i poddać sonikacji przez 1 min w temperaturze pokojowej. Sonikację przeprowadza się w ultradźwiękowej kąpieli wodnej (np. Branson 3510MTH, bez konkretnych ustawień, po prostu „włączony”). Zapewnia to całkowite rozpuszczenie i homogeniczność roztworów.</li>
	<li>Dodać roztwór ANTS/DPX do filmu lipidowego i szczelnie zamknąć fiolkę parafilmem (Rysunek 1B).</li>
	<li>Poddać film lipidowy sonikacji w wyżej wspomnianej kąpieli wodnej przez 5 min. Po sonikacji roztwór będzie miał mleczny wygląd. Należy upewnić się, że film lipidowy został całkowicie rozpuszczony, ponieważ małe agregaty lipidowe negatywnie wpłyną na kolejne etapy. Należy również sprawdzić ścianki i dno fiolki, aby upewnić się, że nie pozostały żadne fragmenty filmu lipidowego (Rysunek 1B).</li>
</ol>
3. Ekstruzja i oczyszczanie liposomów
<ol>
	<li>Złożyć ekstruder zgodnie z wytycznymi producenta, używając buforu LUV do nawilżenia podpórek filtra i membrany poliwęglanowej. Dokręcić obudowę urządzenia tak, aby nie doszło do ubytku objętości podczas ekstruzji, ale nie zbyt mocno, aby nie przerwać membrany. Wskazane jest również przetestowanie ekstrudera za pomocą buforu LUV w celu upewnienia się, że nie ma wycieków ani innych problemów.</li>
	<li>Zacząć od umieszczenia roztworu lipidów w prawym strzykawce, przeprowadzić ekstruzję roztworu lipidów 31 razy; LUV zostaną zgromadzone w lewej strzykawce, co zapewni, że wszystkie lipidy przeszły przez membranę przynajmniej raz. Pierwsze kilka przejść może wymagać nieco większego nacisku, aby przejść przez membranę. Jeśli roztwór nagle zacznie szybko przepływać przez membranę, należy sprawdzić, czy membrana nie uległa przerwaniu i w razie potrzeby ją wymienić (Ryc. 1C).</li>
	<li>Przygotować kolumnę do przepływu grawitacyjnego Sepharose S-500 o pojemności 10 ml (1,0 cm x 20 cm, objętość złoża 10 ml). Przemyć kolumnę 3 objętościami buforu LUV, poczekać do zatrzymania przepływu i założyć zatyczkę. Ponieważ ten krok zajmuje trochę czasu, zaleca się rozpocząć płukanie w momencie, gdy lipidy są łączone w celu wysuszenia. Kolumnę należy trzymać z zamkniętą zatyczką do momentu użycia.</li>
	<li>Dodać wyekstrudowane LUV do kolumny w jednym kroku, unikając zaburzenia powierzchni złoża. Pozostawić bufor do wypłynięcia z kolumny, aż przepływ się zatrzyma, a następnie założyć zatyczkę. Ostrożnie napełnić kolumnę buforem LUV. Ponownie, należy zachować ostrożność podczas dodawania buforu, aby nie naruszyć złoża (Ryc. 1C).</li>
	<li>Zdjąć zatyczkę i zebrać 6 frakcji po 1 ml. LUV zazwyczaj eluiują w frakcjach 3 i 4 i można je rozpoznać po mętnej postaci. Po zebraniu frakcji przemyć kolumnę 5 objętościami wody oraz 2 objętościami 20% etanolu. Przechowywać kolumnę w temperaturze 4 °C (Ryc. 1C).</li>
	<li>Przechowywać frakcje w temperaturze 4 °C w ciemności do momentu analizy.</li>
</ol>
4. Testowanie frakcji kolumnowych
<ol>
	<li>Następnie frakcje kolumnowe testuje się pod kątem fluorescencji, porównując bufor LUV oraz bufor LUV uzupełniony o 0,5% CHAPS. Frakcje, w których fluorescencja wzrasta pod wpływem obecności CHAPS, zawierają LUV. Do sześciu dołków pipetuje się po 100 μl buforu LUV lub buforu LUV + 0,5% CHAPS, a następnie dodaje 5 μl odpowiedniej frakcji i miesza. We wszystkich badaniach LUV należy stosować nieprzezroczyste, czarne, niepowlekane płytki 96-dołkowe (Ryc. 1D).</li>
	<li>Płytkę odczytuje się w temperaturze 37 °C przy następujących parametrach: długość fali wzbudzenia: 355 nm; długość fali emisji: 520 nm; wzmocnienie (napięcie): 125; pozycja optyki: góra (Top); wysokość odczytu: 5,5 mm. Taka konfiguracja dotyczy urządzenia BioTek H1 Synergy z oprogramowaniem Gen 5 2.0 (Ryc. 1D).</li>
	<li>Frakcje 3 i 4 zazwyczaj wykazują 5–10-krotny wzrost fluorescencji. Po analizie frakcje zawierające LUV należy połączyć i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności; zostanie oczyszczone około 2 ml lipidów o stężeniu ~ 2 mM (Ryc. 1D).</li>
</ol>
5. Badania nad rodziną białek BCL-2 z wykorzystaniem LUV
<ol>
	<li>Białka BCL-2 są testowane pod kątem ich zdolności do bezpośredniego indukowania permeabilizacji LUV oraz regulacji aktywności permeabilizującej. Testy LUV są zazwyczaj przeprowadzane w objętościach 100 μl, w temperaturze 37 °C i mogą być analizowane albo w jednym punkcie czasowym po 30 - 60 min (Rysunki 2A-C, 3A-B), albo poprzez badania kinetyczne co 1 - 2 min przez maksymalnie 1 h (Rysunek 2D). Przedstawiono reprezentatywny schemat testu opisujący składniki, stężenia początkowe/końcowe oraz kolejność dodawania (Tabela 1). Zaleca się również, aby czytnik mikropłytek delikatnie wstrząsał płytką przed każdym odczytem. Pierwsze kilka minut często daje sporadyczne odczyty (prawdopodobnie z powodu zmian temperatury, mieszania itp.), dlatego w badaniach kinetycznych zazwyczaj analizujemy punkty danych po 2 - 3 odczytach. Często zdarza się również uzyskanie dużych słupków błędów dla niektórych warunków ze względu na zmienność partii LUV oraz wydajność oddziaływań białkowych przy granicznych stężeniach aktywacji lub inhibicji.</li>
	<li>Zapasy białek z rodziny BCL-2 należy rozcieńczyć w buforze LUV do stężenia 100x; konieczne miareczkowania BAX, BID oraz wszystkich pozostałych białek przeprowadza się w celu znalezienia najniższych stężeń niezbędnych do wykrycia minimalnej, zależnej od BAX permeabilizacji LUV wobec braku BID, a także znaczącej synergii między BAX a BID. Ponadto wszystkie pozostałe białka wymagają miareczkowania w celu ograniczenia strat białka i zminimalizowania stężeń kolejno dodawanych białek.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Istnieje wiele możliwości obserwacji i badania regulacji permeabilizacji LUV zależnej od rodziny BCL-2. W celu przygotowania pozytywnej kontroli permeabilizacji LUV stosujemy BAX12 aktywowany detergentem. Detergent, n-octyl-β-D-glukozyd (OG), sztucznie wywołuje aktywację BAX (dla 100 μl OG-BAX o stężeniu 2,3 μM: 5 μg BAX + 0,7% OG w buforze LUV, inkubować przez 60 min w 4 °C, podzielić na alykwoaty i przechowywać w -80 °C), w związku z czym OG-BAX (10 - 100 nM) może być użyty jako wiarygodna kontrola pozytywna. Należy zauważyć, że stężenia OG poniżej 0,025% nie wpływają bezpośrednio na permeabilizację LUV. Obróbka 0,5% CHAPS jest stosowana do wyznaczenia maksymalnej fluorescencji LUV na jeden test, a wartość ta przyjmuje poziom 100%. Wszystkie próby należy przygotować w trzech powtórzeniach. Przykład organizacji testu kontrolnego LUV przedstawiono w Table 1, a odpowiadające mu dane zaprezentowano na Figure 2A.
Koniecznym punktem wyjścia w badaniu permeabilizacji LUV przez białka z rodziny BCL-2 jest ustalenie stężeń BAX i BID, które zapewnią optymalne uwalnianie. Ponieważ poszczególne preparaty białek wykazują różną aktywność permeabilizacji w tle, zaleca się przeprowadzenie miareczkowania przed rozpoczęciem bardziej zaawansowanych analiz. Należy miareczkować BAX (50 - 200 nM) oraz BID (0 - 10 nM) w celu uzyskania minimalnego uwalniania w tle oraz optymalnej synergii, odpowiednio zgodnie z rysunkami 2B-C. Różne formy białka BID można nabyć od R&amp;D Systems; alternatywnie, peptyd domeny BH3 białka BID jest dostępny w firmie Anaspec. Nie istnieje komercyjna forma BAX odpowiednia do testów z LUV, w związku z czym musi on zostać wyekspresowany i oczyszczony zgodnie z opublikowanymi metodami3,13.
Po ustaleniu stężeń BAX i BID oraz ich synergii, powszechnie stosowanym testem jest określenie wpływu białek antyapoptotycznych na zależną od BAX i BID permeabilizację LUV. BCL-xL jest komercyjnie dostępnym członkiem rodziny BCL-2 o działaniu antyapoptotycznym, który w sposób zależny od dawki hamuje aktywność BAX i BID, zazwyczaj w zakresie 5-10-krotnego nadmiaru molowego względem BAX lub BID (Rycina 3A). Efekt hamujący ten można odwrócić poprzez dodanie kolejnych białek typu BH3-only (2-5-krotny nadmiar molowy względem BCL-xL) lub peptydów domeny BH3 (5-10-krotny nadmiar molowy względem BCL-xL), które wiążą się z BCL-xL, umożliwiając tym samym BAX i BID wykazanie synergii i permeabilizację LUV (Rycina 3B). Na Rycynie 3B przedstawiamy efekt pełnowymiarowego rekombinowanego ludzkiego białka PUMAβ; peptyd domeny BH3 białka PUMA wykazuje podobne działanie funkcjonalne (dane nie pokazano)8. Eksperyment ten jest powszechnie nazywany „testem zniesienia represji” (de-repression assay), ponieważ białko PUMA znosi hamujący wpływ BCL-xL na BAX i BID. W warunkach idealnych dodanie znoszącego represję białka/peptydu BH3-only powinno mieć minimalny wpływ na aktywację BAX14.
<img alt="Schemat procesu syntezy i oczyszczania lipidów; szczegółowe etapy chromatografii i analizy frakcji." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. (A) Lipidy rozpuszczone w chloroformie są łączone, suszone w celu utworzenia filmu lipidowego i zamykane. (B) Przygotowuje się roztwory ANTS i DPX, łączy je i poddaje sonikacji, aby zapewnić pełne rozpuszczenie i homogenizację. Roztwór dodaje się do filmu lipidowego, fiolkę uszczelnia parafilmem i sonikuje przez 5 min w łaźni wodnej. Roztwór przybierze teraz mleczny wygląd. (C) Sonikowany roztwór lipidowy jest wprowadzany do mini-ekstrudera, przetwarzany 31 razy i nanoszony na przygotowaną kolumnę Sepharose S-500 w celu późniejszego oczyszczania. (D) Frakcje uzyskane po chromatografii wykluczania cząsteczkowego są analizowane poprzez porównanie względnych jednostek fluorescencji (RFUs) w buforze LUV oraz w buforze LUV + 0.5% CHAPS. Odczyt dla „buforu LUV” wskazuje fluorescencję tła z nienaruszonymi LUV; warunek „bufor LUV + 0.5% CHAPS” wykaże wzrost fluorescencji wywołany lizą, co świadczy o obecności LUV. Frakcje 3 i 4 zazwyczaj zawierają LUV i są łączone po analizie. Frakcje 5 i 6 zawierają nieinkorporowany ANTS (tzn. znajdujący się poza LUV po ekstruzji), który wykazuje wysoką fluorescencję niezależną od obecności CHAPS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4291/4291fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię</a>.
<img alt="Wykresy słupkowe permeabilizacji LUV przedstawiające efekty miareczkowania BAX i BID; wykres intensywności fluorescencji w czasie." fo:content-width="5.45in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Eksperymenty kontrolne z rodziną BCL-2 oraz miareczkowania BAX/BID z użyciem LUV. (A) Eksperymenty kontrolne. LUV traktowano samym buforem do LUV, 0,025% oktyloglukozydem „OG”, 50 nM BAX lub 50 nM OG-BAX. LUV inkubowano przez 60 min w 37 °C. Procent (%) permeabilizacji wyznaczono poprzez odjęcie fluorescencji w próbce traktowanej buforem od wszystkich pozostałych próbek; 100% permeabilizacji wyznaczono na podstawie próbki solubilizowanej w 0,5% CHAPS; wartości eksperymentalne podzielono przez wartość dla CHAPS, aby uzyskać % permeabilizacji LUV. OG-BAX to BAX aktywowany detergentem, który stanowi wiarygodną kontrolę pozytywną permeabilizacji LUV. (B) Wyznaczenie optymalnego stężenia BAX. LUV traktowano rosnącymi stężeniami BAX (50 – 200 nM) w obecności 10 nM C8-BID „BID” lub samym buforem. (C) Wyznaczenie optymalnego stężenia BID. LUV traktowano rosnącymi stężeniami BID (0 – 10 nM) w obecności 100 nM BAX. (D) Przykład zbioru danych kinetycznych permeabilizacji LUV. LUV traktowano BAX (100 nM) ± BID (10 nM). Odczyty wykonywano co dwie minuty przez 30 min, poprzedzając każdy odczyt dwusekundowym łagodnym wstrząsaniem płytki. Pierwsze trzy odczyty (0, 2 i 4 min) nie zostały uwzględnione na wykresie. Minimalne i maksymalne względne jednostki fluorescencji (RFU) wyznaczono zgodnie z opisem w sekcji 4.3. Słupki błędów na Rysunkach 2A-C reprezentują odchylenie standardowe z danych z trzech powtórzeń. Dane na rysunku 2D reprezentują test wykonany w dwóch powtórzeniach.
<img alt="Wykresy słupkowe permeabilizacji LUV; wpływ BID/BAX/BCL-xL i PUMA; analiza eksperymentalna." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przykłady typowych oddziaływań białek rodziny BCL-2 badanych z użyciem LUV. (A) Permeabilizacja LUV indukowana przez BAX i BID jest hamowana przez BCL-xL. LUV inkubowano z 100 nM BAX, 10 nM BID oraz rosnącymi stężeniami BCL-xL (0 - 500 nM). Inkubację LUV prowadzono przez 60 min w 37 °C. (B) PUMA znosi represyjny wpływ BCL-xL, promując funkcję BAX i BID. LUV inkubowano przez 60 min w 37 °C z kombinacjami 100 nM BAX, 10 nM BID, 500 nM BCL-xL oraz (0 - 2,5 μM) PUMA. PUMA w stężeniu 2,5 μM zastosowano w przypadku BAX samego. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kolejność dodawania:</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WARUNKI</td>
			<td>LUV 
			Bufor</td>
			<td>OG 
			(0.7%)</td>
			<td>BAX 
			(2.3 μM)</td>
			<td>OG-BAX 
			(2.3 μM)</td>
			<td>CHAPS 
			(10%)</td>
			<td>LUV (duże jednowarstwowe pęcherzyki) 
			(2 mM)</td>
			<td>ŁĄCZNIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor</td>
			<td>95 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG (0,015%)</td>
			<td>92.83 μl</td>
			<td>2.17 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAX (50 nM)</td>
			<td>92.83 μl</td>
			<td>-</td>
			<td>2.17 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG-BAX (50 nM)</td>
			<td>92.83 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>2.17 μl</td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS (0,5%)</td>
			<td>90 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Przykład testu kontrolnego w celu określenia wpływu OG-BAX na permeabilizację LUV.

<ol><li>Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BCL-2+family+reunion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The BCL-2 family reunion.</a> Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways%3A+ten+minutes+to+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways: ten minutes to dead.</a> Cell. 121, 671-674 (2005).</li>
<li>Gavathiotis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAX+activation+is+initiated+at+a+novel+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BAX activation is initiated at a novel interaction site.</a> Nature. 455, 1076-1081 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+trigger+apoptosis%2C+Bak+exposes+its+BH3+domain+and+homodimerizes+via+BH3%3Agroove+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions.</a> Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bak+activation+for+apoptosis+involves+oligomerization+of+dimers+via+their+alpha6+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices.</a> Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).</li>
<li>Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-triggered+structural+reorganization+drives+the+activation+of+proapoptotic+BAX%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX.</a> Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+of+BH3-only+proteins+differentially+regulate+Bax-mediated+mitochondrial+membrane+permeabilization+both+directly+and+indirectly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly.</a> Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).</li>
<li>Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+apoptosis+induction+by+inhibition+of+the+anti-apoptotic+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of apoptosis induction by inhibition of the anti-apoptotic BCL-2 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20327-20332 (2008).</li>
<li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+BH3+domains+either+sensitize+or+activate+mitochondrial+apoptosis%2C+serving+as+prototype+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 183-192 (2002).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lipids+cooperate+to+form+supramolecular+openings+in+the+outer+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane.</a> Cell. 111, 331-342 (2002).</li>
<li>Lovell, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+by+tBid+initiates+an+ordered+series+of+events+culminating+in+membrane+permeabilization+by+Bax%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax.</a> Cell. 135, 1074-1084 (2008).</li>
<li>Hsu, Y. T., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonionic+detergents+induce+dimerization+among+members+of+the+Bcl-2+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family.</a> J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Bax%3A+coregulation+of+dimer+formation+and+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization.</a> Cell. 103, 645-654 (2000).</li>
<li>Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+other+than+Bim+and+Bid+can+directly+activate+Bax%2FBak%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak.</a> J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisana metoda generowania LUV umożliwia szybki i wydajny sposób testowania funkcji różnych białek rodziny BCL-2, peptydów oraz powiązanych odczynników w biochemicznie zdefiniowanym środowisku błonowym, podobnym do OMM. W przypadku stosowania wartości końcowych do określenia permeabilizacji LUV, można przygotować wiele płytek, aby przeanalizować setki warunków w ciągu jednego dnia. Ustaliliśmy, że odczynnikami ograniczającymi w tych testach są zazwyczaj jakość i ilość białek rekombinowanych, dlatego poświęcenie odpowiedn...

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoil-sn-glycero-3-fosfo&amp;#8211;etanolamina &quot;PE&quot;</td><td>Avanti</td><td>850725C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-fosfatydylocholina (jajo, kura) &quot;PC&quot;</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-fosfatydyloinozytol (wątroba, bydlęca) &quot;PI&quot;</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-fosfatydyloseryna (mózg, świńska) &quot;PS&quot;</td><td>Avanti</td><td>8400320</td><td></td></tr><tr><td>Kardiolipina (serce, bydlęca - sól sodowa) &quot;CL&quot;</td><td>Avanti</td><td>840012C</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mini-ekstruzji</td><td>Avanti</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PC 0,2 µm</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Czarna płytka 96-dołkowa Costar</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-590</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie BID cięte przez kaspazę-8</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>882-B8-050</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie BCL-xL (bez końca C)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>894-BX-050</td><td></td></tr><tr><td>Peptydy domeny BH3 BID/PUMA</td><td>Anaspec</td><td>61711/62404</td><td></td></tr><tr><td>Hybrydowy wielomodułowy czytnik mikropłytek Synergy H1</td><td>BioTek</td><td>None</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie funkcji rodziny bcl-2 z wykorzystaniem dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

Rodzina BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) składa się z około dwudziestu białek, które współpracują w celu utrzymania przeżywalności komórek lub inicjacji apoptozy1. W następstwie stresu komórkowego (np. uszkodzeń DNA), proapoptotyczne efektory z rodziny BCL-2, BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) i/lub BAX (BCL-2 associated X protein), ulegają aktywacji i naruszają integralność zewnętrznej błony mitochondrialnej (OMM) poprzez proces nazywany permeabilizacją zewnętrznej błony mitochondrialnej (MOMP)1. Po zajściu MOMP, białka proapoptotyczne (np. cytochrom c) przedostają się do cytoplazmy, promując aktywację kaspaz, co prowadzi do szybkiego wystąpienia apoptozy2.
Aby BAK/BAX mogły wywołać MOMP, wymagają one przejściowych oddziaływań z członkami innej proapoptotycznej podgrupy rodziny BCL-2, białkami zawierającymi wyłącznie domenę homologii BCL-2 nr 3 (BH3-only), takimi jak BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Antyapoptotyczne białka rodziny BCL-2 (np. BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulują przeżywalność komórkową poprzez ścisłą kontrolę oddziaływań między BAK/BAX a białkami BH3-only zdolnymi do bezpośredniego indukowania aktywacji BAK/BAX7,8. Ponadto dostępność antyapoptotycznych białek BCL-2 jest regulowana przez białka BH3-only pełniące rolę sensytyzatorów/derepresorów, takie jak BAD (BCL-2 antagonist of cell death) lub PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), które wiążą i hamują członków antyapoptotycznych7,9. Ponieważ większość repertuaru antyapoptotycznego BCL-2 jest zlokalizowana w OMM, decyzja komórki o utrzymaniu przeżywalności lub wywołaniu MOMP jest determinowana przez liczne oddziaływania rodziny BCL-2 w tej membranie.
Duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUVs) stanowią model biochemiczny służący do badania zależności pomiędzy interakcjami rodziny BCL-2 a permeabilizacją błony10. LUVs składają się z określonych lipidów, które są dobierane w proporcjach wyznaczonych w badaniach składu lipidowego mitochondriów Xenopus ekstrahowanych rozpuszczalnikiem (46,5% fosfatydylocholiny, 28,5% fosfatydyloetanoloaminy, 9% fosfatydyloinozytolu, 9% fosfatydyloseryny oraz 7% kardiolipiny)10. Jest to wygodny system modelowy do bezpośredniego badania funkcji rodziny BCL-2, ponieważ komponenty białkowe i lipidowe są całkowicie określone i możliwe do kontrolowania, co nie zawsze ma miejsce w przypadku mitochondriów pierwotnych. Choć zawartość kardiolipiny nie jest zazwyczaj tak wysoka w całej zewnętrznej błonie mitochondrialnej (OMM), model ten wiernie naśladuje OMM, aby promować funkcje rodziny BCL-2. Ponadto nowsza modyfikacja powyższego protokołu umożliwia analizy kinetyczne interakcji białek oraz pomiary permeabilizacji błony w czasie rzeczywistym, co opiera się na LUVs zawierających barwnik polianionowy (ANTS: kwas 8-aminonaftalenu-1,3,6-trisulfonowy) i kationowy wygaszacz (DPX: bromek p-ksylenu-bis-pirydyniowy)11. W miarę permeabilizacji LUVs, ANTS i DPX dyfundują od siebie, co skutkuje wykryciem wzrostu fluorescencji. W niniejszej pracy opisano powszechnie stosowane kombinacje rekombinowanych białek rodziny BCL-2 oraz kontrole z wykorzystaniem LUVs zawierających ANTS/DPX.

Biochemicznie zdefiniowane duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUVs) stanowią wygodny system modelowy do analizy oddziaływań białek z rodziny BCL-2, co ma bezpośrednie znaczenie dla lepszego zrozumienia mitochondrialnej ścieżki apoptozy. Przedstawiono metodę otrzymywania LUVs, wraz ze standardowymi kombinacjami białek z rodziny BCL-2 oraz kontrolami służącymi do badania permeabilizacji LUVs.

Badanie funkcji rodziny BCL-2 z wykorzystaniem dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych

Rodzina BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) składa się z około dwudziestu białek, które współpracują w celu utrzymania przeżywalności komórek lub zainicjowania ...

Ten biochemicznie zdefiniowany modelowy system dużych pęcherzyków Ella naśladuje zewnętrzną błonę mitochondrialną w celu obserwacji funkcji białek BCL2 in vitro. Najpierw połącz lipidy i stwórz film lipidowy w szczelnej fiolce. Następnie przygotuj świeży roztwór LUV i rozpuść film lipidowy.Następnie należy wycisnąć roztwór lipidowy i oczyścić duże LUV za pomocą filtracji żelowej. Ostatnim krokiem jest analiza LUV pod kątem zwiększenia fluorescencji indukowanego przez detergent. W końcowej fazie model LUV jest wykorzystywany do oceny funkcji i regulacji białek przepuszczalnych przez błonę, takich jak rekombinowane białka BCL2.Podejście to, wykorzystujące duże pęcherzyki jednowarstwowe, posiada kilka zalet w stosunku do istniejących systemów, takich jak mitochondria. Ponieważ są one generowane z oczyszczonych lipidów w obecności białek, są one biochemicznie zdefiniowane zarówno pod względem składu, jak i rozmiaru.Pozwala to na jednoznaczną interpretację wyników, ponieważ jedynymi białkami poddanymi badaniu są te, które zostaną dodane. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat mechanizmów zdolności rodziny BCL-2 do regulacji integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej. Można ją również zastosować w innych układach badających przebudowę błon oraz aktywność przepuszczania.Obejmowałoby to mechanizmy dynamiki mitochondrialnej lub toksyny wytwarzane przez bakterie. Pracę należy prowadzić w dygestorium przy minimalnym oświetleniu. Przepłukać szklaną strzykawkę typu Hamilton Gast chloroformem.Następnie w szklanej fiolce 1,5 ml połączyć 4 mg lipidów rozpuszczonych w chloroformie. Aby usunąć chloroform, zastosować łagodny strumień gazu obojętnego, takiego jak azot lub argon. Po dwóch do trzech godzinach sprawdzić, czy na dnie i ściankach fiolki w buforze LUV utworzył się suchy film lipidowy.Przygotować 500 µL roztworów barwnika polianionowego oraz jonowego wygaszacza CAS, mieszając je za pomocą wortexa. Następnie połączyć roztwory A NTS i DPX, wymieszać je w vortexie przez jedną minutę i poddać sonikacji w ultradźwiękowej kąpieli wodnej, aby upewnić się, że roztwory są całkowicie rozpuszczone i homogeniczne.Teraz dodaj roztwór A-N-T-S-D-P-X do filmu lipidowego i szczelnie zamknij fiolkę za pomocą parafilmu, a następnie poddaj film lipidowy sonikacji przez pięć minut. Po sonikacji roztwór stanie się mętny. Upewnij się, że roztwór został całkowicie rozpuszczony, ponieważ małe agregaty lipidowe negatywnie wpłyną na kolejne etapy. Sprawdź również dno i ścianki fiolki, aby upewnić się, że nie pozostały na nich żadne fragmenty filmu lipidowego.Zmontuj ekstruder zgodnie z wytycznymi producenta, używając buforu LUV do nawilżenia podpór filtra i membrany poliwęglanowej; dokręć obudowę urządzenia tak, aby nie dopuścić do utraty objętości podczas ekstruzji, lecz nie rób tego zbyt mocno, aby nie przerwać membrany. Przetestuj ekstruder za pomocą buforu LUV, aby upewnić się, że nie występują żadne wycieki ani problemy. Następnie napełnij prawą strzykawkę roztworem lipidów i przeprowadź ekstruzję 31 razy, aby duże pęcherzyki ELLA przeszły przez membranę co najmniej raz i zostały zebrane w lewej strzykawce. Pierwsze kilka ekstruzji może wymagać nieco większego nacisku, jeśli roztwór nagle i szybko przejdzie przez membranę.Sprawdzić membranę pod kątem pęknięć i w razie potrzeby ją wymienić. Dodać do kolumny w jednym kroku. Unikać naruszenia warstwy kulek.Pozostaw bufor do całkowitego wypłukania z kolumny. Gdy przepływ ustanie, zatkaj kolumnę i ostrożnie napełnij ją buforem LUV, dbając o to, aby nie zaburzyć osadu kulek. Następnie usuń zatyczkę i zbierz sześć frakcji o objętości 1 ml każda.AUV zazwyczaj eluują w trzeciej i czwartej frakcji i można je zidentyfikować po mętnym wyglądzie; należy przeprowadzić płukanie kolumny w celu jej regeneracji i przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsius. UUV w frakcji kolumny wykrywa się poprzez wzrost fluorescencji wynikający z obecności chaps. Należy pamiętać o stosowaniu czarnych, nieprzezroczystych płytek 96-dołkowych we wszystkich badaniach LUV.Do sześciu dołków pipetujemy 100 µL buforu LUV lub LUV plus 0,5% chaps. Do każdego z nich dodajemy 5 µL odpowiedniej frakcji i mieszamy dla biotech H one synergy. Otwieramy oprogramowanie gen five 2.0, ustawiając długość fali wzbudzenia na 355 nm oraz długość fali emisji na 520 nm.Ustaw wzmocnienie napięcia na pozycji optyki 125 u góry i zwiększ wysokość odczytu o 5,5 millimeters. Następnie odczytaj płytkę w temperaturze 37 degrees Celsius i zidentyfikuj frakcje zawierające LUV. Pobierz frakcje oczyszczonych LUV.Testy te zostały zaprojektowane w celu pomiaru zdolności białek BCL2 do bezpośredniego indukowania permeabilizacji LUV, a także w celu badania regulacji aktywności permeabilizacji. Należy łączyć komponenty testu w kolejności ich dodawania. Szczegółowe informacje na temat miareczkowania białek BS i bid są dostępne w towarzyszącym manuskrypcie.Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez wyznaczone punkty czasowe analizy. Włożyć płytkę do czytnika mikropłytek, który wstrząśnie płytką i zmierzy fluorescencję zgodnie z wcześniejszym opisem. W tym eksperymencie zastosowano detergent OG do aktywacji pęcherzyków w celu wygenerowania dodatniej kontroli przenikania LUV.Warto zauważyć, że stężenia OG poniżej 0.025% nie wpływają w tym przypadku bezpośrednio na przenikanie przez LUV. Zabieg z użyciem 0.5% chaps jest również stosowany w celu określenia maksymalnej fluorescencji LUV w jednym teście. Niezbędnym punktem wyjścia w badaniu przenikania przez LUV z białkami z rodziny BCL-2 jest ustalenie stężeń białek Bax i Bid w celu zapewnienia optymalnego uwalniania.Niniejsze krzywe miareczkowania dla backs i bid wykazują minimalne uwalnianie tła oraz optymalną synergię. Alternatywnie, przenikanie LUV można mierzyć kinetycznie. Pomiary te przeprowadzono co dwie minuty przez 30 minut, poprzedzając każdy odczyt dwusekundowym delikatnym wstrząsaniem płytki.Niniejszy eksperyment określa wpływ białka antyapoptotycznego na permeację LUV zależną od białek Bax i Bid. BCL-XL hamuje aktywność białek Bax i Bid w sposób zależny od dawki. W teście supresji D efekt hamujący można odwrócić poprzez dodanie białek zawierających wyłącznie domenę BH3.Na przykład puma beta wiąże się z BCL xl, co pozwala na synergię i permeabilizację białek backs i bid. Tworzenie dużych pęcherzyków ELLA – po opanowaniu tej techniki generowania dużych pęcherzyków – umożliwia efektywną i szybką analizę białek z rodziny BCL two, peptydów oraz małych cząsteczek w biochemicznie zdefiniowanym środowisku, podobnym do zewnętrznej błony mitochondrialnej. Co ważne, test ten pozwala na szybką analizę setek warunków z wykorzystaniem zarówno punktów końcowych, jak i parametrów kinetycznych.Należy pamiętać, że oba białka, UUV i BCL two, są bardzo podatne na artefakty wywołane przez detergenty. Aby zapewnić powtarzalne wyniki, należy używać czystego sprzętu wolnego od detergentów.

examining-bcl-2-family-function-with-large-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie funkcji rodziny BCL-2 za pomocą dużych jednowarstwowych pęcherzyków

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

Celem protokołu jest wiarygodny pomiar właściwości mechanicznych membrany gigantycznych pęcherzyków za pomocą aspiracji mikropipet.

Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Tutaj prezentujemy metodologię zwięzłej oceny poziomów markera autofagosomu LC3-II w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EVs) za pomocą immunoblottingu. Analiza poziomów LC3-II w EV, tworzeniu autolizosomów i tworzeniu omegasomów sugeruje nową rolę STX6 w uwalnianiu LC3-II-dodatnich EV, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana.

Ocena uwalniania LC3-II przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w odniesieniu do akumulacji wewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-dodatnich

Ten artykuł przedstawia metodę przygotowywania złożonych wielowarstwowo-jednowarstwowych pęcherzyków (cGUVs) o strukturze pęcherzyka w pęcherzyku, z dostosowaną przewodnością elektryczną w regionach wewnętrznym, pierścieniowym i zewnętrznym. Elektroformacja syntetyzuje proste GUV, które są przekształcane w stomatocyty i cGUV za pomocą wstrząsu osmotycznego, zapewniając wartościowy model do badania biofizyki komórek z jądrami.

Synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: Biomimetyczny model komórek z jądrem

Pojawienie się systemów MEG dostosowanych rozmiarem do małych dzieci otwiera istotne nowe możliwości badania rozwoju mózgu. Nowy system, wraz z protokołem dopasowującym wymagania eksperymentalne do możliwości dzieci, może być wykorzystany do badania procesów poznawczych i językowych u zdrowych, czuwających dzieci w wieku od trzech do sześciu lat.

Pomiar neuromagnetycznych funkcji mózgu u dzieci w wieku przedszkolnym z użyciem MEG o dostosowanym rozmiarze

Poznaj metodę tworzenia dużych pęcherzyków jednowarstwowych do badania interakcji białek rodziny BCL-2. Model ten naśladuje zewnętrzną błonę mitochondrialną, umożliwiając analizę regulacji apoptozy.

Badanie funkcji rodziny BCL-2 z wykorzystaniem dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych

Przeglądaj więcej filmów