Badanie funkcji rodziny BCL-2 z wykorzystaniem dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych

Ten biochemicznie zdefiniowany modelowy system dużych pęcherzyków Ella naśladuje zewnętrzną błonę mitochondrialną w celu obserwacji funkcji białek BCL2 in vitro. Najpierw połącz lipidy i stwórz film lipidowy w szczelnej fiolce. Następnie przygotuj świeży roztwór LUV i rozpuść film lipidowy.

Następnie należy wycisnąć roztwór lipidowy i oczyścić duże LUV za pomocą filtracji żelowej. Ostatnim krokiem jest analiza LUV pod kątem zwiększenia fluorescencji indukowanego przez detergent. W końcowej fazie model LUV jest wykorzystywany do oceny funkcji i regulacji białek przepuszczalnych przez błonę, takich jak rekombinowane białka BCL2.

Podejście to, wykorzystujące duże pęcherzyki jednowarstwowe, posiada kilka zalet w stosunku do istniejących systemów, takich jak mitochondria. Ponieważ są one generowane z oczyszczonych lipidów w obecności białek, są one biochemicznie zdefiniowane zarówno pod względem składu, jak i rozmiaru.

Pozwala to na jednoznaczną interpretację wyników, ponieważ jedynymi białkami poddanymi badaniu są te, które zostaną dodane. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat mechanizmów zdolności rodziny BCL-2 do regulacji integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej. Można ją również zastosować w innych układach badających przebudowę błon oraz aktywność przepuszczania.

Obejmowałoby to mechanizmy dynamiki mitochondrialnej lub toksyny wytwarzane przez bakterie. Pracę należy prowadzić w dygestorium przy minimalnym oświetleniu. Przepłukać szklaną strzykawkę typu Hamilton Gast chloroformem.

Następnie w szklanej fiolce 1,5 ml połączyć 4 mg lipidów rozpuszczonych w chloroformie. Aby usunąć chloroform, zastosować łagodny strumień gazu obojętnego, takiego jak azot lub argon. Po dwóch do trzech godzinach sprawdzić, czy na dnie i ściankach fiolki w buforze LUV utworzył się suchy film lipidowy.

Przygotować 500 µL roztworów barwnika polianionowego oraz jonowego wygaszacza CAS, mieszając je za pomocą wortexa. Następnie połączyć roztwory A NTS i DPX, wymieszać je w vortexie przez jedną minutę i poddać sonikacji w ultradźwiękowej kąpieli wodnej, aby upewnić się, że roztwory są całkowicie rozpuszczone i homogeniczne.

Teraz dodaj roztwór A-N-T-S-D-P-X do filmu lipidowego i szczelnie zamknij fiolkę za pomocą parafilmu, a następnie poddaj film lipidowy sonikacji przez pięć minut. Po sonikacji roztwór stanie się mętny. Upewnij się, że roztwór został całkowicie rozpuszczony, ponieważ małe agregaty lipidowe negatywnie wpłyną na kolejne etapy. Sprawdź również dno i ścianki fiolki, aby upewnić się, że nie pozostały na nich żadne fragmenty filmu lipidowego.

Zmontuj ekstruder zgodnie z wytycznymi producenta, używając buforu LUV do nawilżenia podpór filtra i membrany poliwęglanowej; dokręć obudowę urządzenia tak, aby nie dopuścić do utraty objętości podczas ekstruzji, lecz nie rób tego zbyt mocno, aby nie przerwać membrany. Przetestuj ekstruder za pomocą buforu LUV, aby upewnić się, że nie występują żadne wycieki ani problemy. Następnie napełnij prawą strzykawkę roztworem lipidów i przeprowadź ekstruzję 31 razy, aby duże pęcherzyki ELLA przeszły przez membranę co najmniej raz i zostały zebrane w lewej strzykawce. Pierwsze kilka ekstruzji może wymagać nieco większego nacisku, jeśli roztwór nagle i szybko przejdzie przez membranę.

Sprawdzić membranę pod kątem pęknięć i w razie potrzeby ją wymienić. Dodać do kolumny w jednym kroku. Unikać naruszenia warstwy kulek.

Pozostaw bufor do całkowitego wypłukania z kolumny. Gdy przepływ ustanie, zatkaj kolumnę i ostrożnie napełnij ją buforem LUV, dbając o to, aby nie zaburzyć osadu kulek. Następnie usuń zatyczkę i zbierz sześć frakcji o objętości 1 ml każda.

AUV zazwyczaj eluują w trzeciej i czwartej frakcji i można je zidentyfikować po mętnym wyglądzie; należy przeprowadzić płukanie kolumny w celu jej regeneracji i przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsius. UUV w frakcji kolumny wykrywa się poprzez wzrost fluorescencji wynikający z obecności chaps. Należy pamiętać o stosowaniu czarnych, nieprzezroczystych płytek 96-dołkowych we wszystkich badaniach LUV.

Do sześciu dołków pipetujemy 100 µL buforu LUV lub LUV plus 0,5% chaps. Do każdego z nich dodajemy 5 µL odpowiedniej frakcji i mieszamy dla biotech H one synergy. Otwieramy oprogramowanie gen five 2.0, ustawiając długość fali wzbudzenia na 355 nm oraz długość fali emisji na 520 nm.

Ustaw wzmocnienie napięcia na pozycji optyki 125 u góry i zwiększ wysokość odczytu o 5,5 millimeters. Następnie odczytaj płytkę w temperaturze 37 degrees Celsius i zidentyfikuj frakcje zawierające LUV. Pobierz frakcje oczyszczonych LUV.

Testy te zostały zaprojektowane w celu pomiaru zdolności białek BCL2 do bezpośredniego indukowania permeabilizacji LUV, a także w celu badania regulacji aktywności permeabilizacji. Należy łączyć komponenty testu w kolejności ich dodawania. Szczegółowe informacje na temat miareczkowania białek BS i bid są dostępne w towarzyszącym manuskrypcie.

Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez wyznaczone punkty czasowe analizy. Włożyć płytkę do czytnika mikropłytek, który wstrząśnie płytką i zmierzy fluorescencję zgodnie z wcześniejszym opisem. W tym eksperymencie zastosowano detergent OG do aktywacji pęcherzyków w celu wygenerowania dodatniej kontroli przenikania LUV.

Warto zauważyć, że stężenia OG poniżej 0.025% nie wpływają w tym przypadku bezpośrednio na przenikanie przez LUV. Zabieg z użyciem 0.5% chaps jest również stosowany w celu określenia maksymalnej fluorescencji LUV w jednym teście. Niezbędnym punktem wyjścia w badaniu przenikania przez LUV z białkami z rodziny BCL-2 jest ustalenie stężeń białek Bax i Bid w celu zapewnienia optymalnego uwalniania.

Niniejsze krzywe miareczkowania dla backs i bid wykazują minimalne uwalnianie tła oraz optymalną synergię. Alternatywnie, przenikanie LUV można mierzyć kinetycznie. Pomiary te przeprowadzono co dwie minuty przez 30 minut, poprzedzając każdy odczyt dwusekundowym delikatnym wstrząsaniem płytki.

Niniejszy eksperyment określa wpływ białka antyapoptotycznego na permeację LUV zależną od białek Bax i Bid. BCL-XL hamuje aktywność białek Bax i Bid w sposób zależny od dawki. W teście supresji D efekt hamujący można odwrócić poprzez dodanie białek zawierających wyłącznie domenę BH3.

Na przykład puma beta wiąże się z BCL xl, co pozwala na synergię i permeabilizację białek backs i bid. Tworzenie dużych pęcherzyków ELLA – po opanowaniu tej techniki generowania dużych pęcherzyków – umożliwia efektywną i szybką analizę białek z rodziny BCL two, peptydów oraz małych cząsteczek w biochemicznie zdefiniowanym środowisku, podobnym do zewnętrznej błony mitochondrialnej. Co ważne, test ten pozwala na szybką analizę setek warunków z wykorzystaniem zarówno punktów końcowych, jak i parametrów kinetycznych.

Należy pamiętać, że oba białka, UUV i BCL two, są bardzo podatne na artefakty wywołane przez detergenty. Aby zapewnić powtarzalne wyniki, należy używać czystego sprzętu wolnego od detergentów.