Name: Analiza ilościowa proteomów chromatyny w chorobie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj metodę izolacji białek chromatyny z serca myszy przy użyciu gradientu sacharozy i spektrometrii masowej. Technika ta umożliwia ilościową analizę proteomu jądrowego w chorobach serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratorium Vondriski jest wspierane przez granty z National Heart, Lung and Blood Institute NIH oraz Laubisch Endowment na UCLA. EM jest laureatem stypendium Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship in Physiology na UCLA; HC jest laureatem stypendium American Heart Association Pre-doctoral Fellowship; MP jest laureatem stypendium NIH Ruth Kirschstein Post-doctoral Fellowship; a SF jest laureatem nagrody NIH K99 Award.

<ol><li>Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transition+of+cardiac+myocytes+from+hyperplasia+to+hypertrophy+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).</li>
<li>Rumyantsev, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelations+of+the+proliferation+and+differentiation+processes+during+cardiact+myogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration.</a> Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).</li>
<li>Olson, E. N., Schneider, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+the+heart%3A+development+redux+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Sizing up the heart: development redux in disease.</a> Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).</li>
<li>Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+signaling+pathways+that+regulate+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy.</a> Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).</li>
<li>Fishman, M. C., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fashioning+the+vertebrate+heart%3A+earliest+embryonic+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions.</a> Development. 124, 2099-2117 (1997).</li>
<li>Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Return+to+the+fetal+gene+program+protects+the+stressed+heart%3A+a+strong+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Fail+Rev%22%5BJournal%5D)">Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis.</a> Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).</li>
<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li>
<li>Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+membrane+proteins+with+potential+disease+links+found+by+subtractive+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics.</a> Science. 301, 1380-1382 (2003).</li>
<li>Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+proteomics+approach+for+the+discovery+of+chromatin-associated+protein+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks.</a> Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).</li>
<li>Malik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+and+lamin-dependent+targeting+of+novel+transmembrane+proteins+in+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).</li>
<li>Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+post-translational+modifications+on+synaptic%2C+nuclear%2C+and+histone+proteins+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain.</a> J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).</li>
<li>Chu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chromatin+proteomics+identifies+evolutionarily+conserved+fertility+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors.</a> Nature. 443, 101-105 (2006).</li>
<li>Uchiyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+human+metaphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of human metaphase chromosomes.</a> J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Kislinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse%3A+combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li>
<li>Moore, D. H., Ruska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+study+of+mammalian+cardiac+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells.</a> J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).</li>
<li>Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cardiac+hypertrophy%3A+a+quantitative+ultrastructural+study+in+the+compensatory+stage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Paulsson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+calsarcin-1+during+pressure+overload-induced+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+chromatin+proteome+in+disease+reveals+remodeling+principles+and+identifies+high+mobility+group+protein+b2+as+a+regulator+of+hypertrophic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth.</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Gramolini, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+profiling+of+a+phospholamban+mutant+mouse+model+of+dilated+cardiomyopathy+reveals+progressive+intracellular+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).</li>
<li>Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+Identify+Proteins+Interacting+with+P2X2+Ligand-Gated+Cation+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels.</a> J. Vis. Exp. (27), e1178(2009).</li>
<li>Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+software+tool+for+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).</li>
<li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).</li>
<li>Kamleh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+using+Orbitrap+Fourier+transform+mass+spectrometry+with+hydrophilic+interaction+chromatography%3A+a+method+with+wide+applicability+to+analysis+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).</li>
<li>Searle, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold%3A+a+bioinformatic+tool+for+validating+MS%2FMS-based+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies.</a> Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).</li>
<li>Murray, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Basic+Proteins+of+Cell+Nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The Basic Proteins of Cell Nuclei.</a> Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).</li>
<li>Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+fractionations+of+arginine-rich+histones+from+calf+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus.</a> Biochem. J. 77, 631-636 (1960).</li>
<li>Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+methods+for+purification+of+histones+from+cultured+mammalian+cells+with+the+preservation+of+their+native+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications.</a> Nucleic Acids Res. 37, e81(2009).</li>
<li>Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentrations+of+high-mobility-group+proteins+in+the+nucleus+and+cytoplasm+of+several+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues.</a> J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).</li>
<li>Gronow, M., Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+separation+of+the+non-histone+proteins+of+rat+liver+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei.</a> FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).</li>
<li>Mischke, B. G., Ward, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+tissue+specificity+of+chromatin-associated+proteins+in+Vicia+faba%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba.</a> Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).</li>
<li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+proteomic+analysis+of+the+human+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed proteomic analysis of the human nucleolus.</a> Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).</li>
<li>Zhao, Y., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification-specific+proteomics%3A+strategies+for+characterization+of+post-translational+modifications+using+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques.</a> Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).</li>
<li>Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+identification+of+modified+proteins+using+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS.</a> Proteomics. 10, 671-686 (2010).</li>
<li>Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-wide+proteomic+characterization+of+combinatorial+post-translational+modification+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns.</a> Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).</li>
<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protease+for+%27middle-down%27+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A protease for 'middle-down' proteomics.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480, 254-258 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Wcześniej opisano dwie główne metody izolacji jąder komórkowych:27 pierwszą jest technika Behrensa, polegająca na homogenizacji liofilizowanej tkanki w rozpuszczalniku nie wodnym, a drugą, której modyfikację stosujemy w niniejszej pracy, jest homogenizacja tkanki w wodnym roztworze sacharozy/soli, a następnie centryfugacja różnicowa lub w gradiencie gęstości.
Subfrakcjonowanie jąder komórkowych poprzez ekstrakcję kwasową z próbek tkanek jest istotnym narzędziem badania chromatyny, s...

<table><tbody><tr><td>Pożywka Dulbecco Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Pelet proteazy</td><td>Roche</td><td>04 693 159 001</td><td></td></tr><tr><td>Sito 100 &amp;mu;m</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom Ultracut</td><td>Reichert</td><td></td><td></td></tr><tr><td> transmisyjny mikroskop elektronowy 100CX &lt;br/&gt;</td><td>JEOL USA, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oriole</td><td>BioRad</td><td>161-0496</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko histonie H2A</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8648</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko nukleoporynie p62</td><td>BD Biosciences</td><td>610498</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko transporterowi nukleotydów adeninowych</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9299</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko BiP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1050</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko tubulinie</td><td>Sigma</td><td>T1568</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko histonie H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko fibrylarynie</td><td>Cell Signaling</td><td>C12C3</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko SNRP70</td><td>Abcam</td><td>ab51266</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko E2F-1</td><td>Thermo Fisher</td><td>MS-879</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko białku retinoblastoma</td><td>BD Biosciences</td><td>554136</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko czynnikowi indukowanemu hipoksją 1 (HIF-1)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-469</td><td></td></tr><tr><td>Test białka BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna do chromatografii w fazie odwróconej</td><td>New Objective</td><td>PFC7515-B14-10</td><td></td></tr><tr><td>Przeglądarka BioWorks</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

W jądrze komórkowym znajdują się proteomy, których funkcje są najściślej powiązane z regulacją genów. Jądra kardiomiocytów dorosłych ssaków są wyjątkowe ze względu na wysoki odsetek komórek dwuukładowych,1 przeważająco heterochromatyczny stan DNA oraz niedzielący się charakter kardiomiocytów, co sprawia, że dojrzałe jądra znajdują się w permanentnym stanie interfazy.2 Regulacja transkrypcyjna podczas rozwoju i w przebiegu chorób była w tym organie dobrze zbadana,3-5 jednak pozostaje stosunkowo nieodkryta rola białek jądrowych odpowiedzialnych za pakowanie i ekspresję DNA oraz sposób, w jaki białka te kontrolują zmiany w programach transkrypcyjnych występujące podczas choroby.6 W krajach rozwiniętych choroby serca są główną przyczyną śmiertelności zarówno u mężczyzn, jak i u kobiet.7 Zrozumienie, w jaki sposób białka jądrowe współpracują w celu regulowania progresji tych schorzeń, jest kluczowe dla rozwoju obecnych opcji terapeutycznych.
Spektrometria mas jest idealnym narzędziem do odpowiedzi na te pytania, ponieważ umożliwia bezstronną adnotację proteomu jądrowego oraz kwantyfikację względną zmian w obfitości tych białek w przebiegu choroby. Choć przeprowadzono kilka badań proteomicznych kompleksów białek jądrowych ssaków,8-13 do niedawna14 istniało tylko jedno badanie analizujące proteom jądra komórek serca, które obejmowało ono całe jądro, zamiast badać proteom na poziomie podprzedziałów jądrowych.15 W dużej mierze ten brak prac wynika z trudności w izolacji jąder komórek serca. Jądra te znajdują się w obrębie sztywnego i gęstego aparatu aktynowo-miozynowego, z którym są połączone za pomocą licznych wypustek siateczki śródplazmatycznej, do tego stopnia, że skurcz miocytów zmienia ich ogólny kształt.16 Dodatkowo kardiomiocyty składają się w 40% objętościowo z mitochondriów,17 co wymaga wzbogacenia frakcji jąder w celu oddzielenia ich od pozostałych organelli. W niniejszej pracy opisujemy protokół wzbogacania jąder komórek serca i ich dalszego frakcjonowania na biologicznie istotne przedziały. Ponadto szczegółowo omawiamy metody bezetykietowej ilościowej analizy spektrometrycznej tych frakcji – techniki te nadają się do eksperymentów in vivo w różnych modelach zwierzęcych i układach organów, w których znakowanie metaboliczne nie jest możliwe.

Rysunek 4 podkreśla użyteczność tej formy kwantyfikacji względnej. Na lewym panelu przedstawiono poszczególne monizotopowe piki peptydowe (nałożone z różnych myszy), które zostały przypisane do białka HMGB1 (zidentyfikowanego poprzez przeszukiwanie bazy danych). Każdy pik, będący w istocie chromatogramem jonów wyekstrahowanych dla danego peptydu, pochodzi z innej myszy. Grupy reprezentują trzy różne stany fizjologiczne: podstawowy, przerost serca oraz niewydolność serca, przy trzech powtórzeniach biologi...

Postępy w spektrometrii mas umożliwiły wysokoprzepustową analizę ekspresji i modyfikacji białek w wielu tkankach. W połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i modelami chorób, ilościowa spektrometria mas oraz bioinformatyka mogą ujawnić nowe właściwości systemów biologicznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu analizuje białka związane z chromatyną w kontekście chorób serca i jest łatwo stosowalna w innych modelach in vivo chorób ludzkich.

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

W jądrze komórkowym znajdują się proteomy, których funkcje są najściślej powiązane z regulacją genów. Jądra kardiomiocytów dorosłych ssaków są wyjątkowe ze względu na...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie białek związanych z chromatyną z serca myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie homogenizowanie serca, a następnie izolację jąder komórek serca za pomocą gradientu gęstości sacharozy. Następnie plazma jądrowa jest oddzielana od frakcji chromatyny.Następnie z osadu chromatyny ekstrahuje się białka, aby wzbogacić frakcję białek słabo związanych z DNA. Na koniec białka są ekstrahowane z innego osadu chromatyny w celu wzbogacenia frakcji białek silnie związanych z DNA. Ostatecznie, dzięki ilościowej analizie spektrometrią mas bez użycia znaczników, można uzyskać wyniki obrazujące charakterystykę proteomu jądrowego w różnych warunkach fizjologicznych.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny kardiologii, takie jak wpływ przebudowy chromatyny na przerost i niewydolność serca. Po uśmierceniu dorosłej myszy i wycięciu serca, należy przepłukać je w lodowatym PBS. Następnie umieścić je w probówce z 2 mL buforu do lizy zawierającego mieszaninę inhibitorów proteaz i fosfataz, a następnie poddać homogenizacji.Przefiltruj lizaty przez sito o oczkach 100 micron i zbierz filtrat do probówki 1,5 ml; od tego momentu, chyba że wskazano inaczej, przechowuj próbkę w lodzie. Wirowarkuj próbkę przy 4 000 RPM przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Zbierz nadsącz zawierający cytozol i przechowuj go w temperaturze -80 °C.Resuspender osad w 200 µL buforu do lizy. Do nowej probówki dodać 1 ml buforu sacharozowego, a następnie ostrożnie nanieść zresuspendowany osad na warstwę sacharozy za pomocą pipety transferowej i wirować przy 5 000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć cienką warstwę znad wierzchu oraz poduszkę sacharozową zawierającą błonę.Przepłucz pozostały pellet zawierający jądra komórkowe 200 µL lodowatego PBS-EDTA, zawieś pellet z jądrami w 200 µL buforu do ekstrakcji detergentowej i wymieszaj próbkę na vortexie dwa razy po 10 sekund. Umieść próbkę na lodzie na 10 minut, a następnie odwiruj przy 13 000 RPM przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Usuń nadosad zawierający białka nukleoplazmy i przechowuj go w temperaturze -80 °C.Przemyj osad lodowatym PBSE-DTing i resuspenduj go w 300 µL buforu Tris-SDS-EDTA. Poddaj próbkę sonikacji od trzech do sześciu razy po 10 sekund każdorazowo. Aby rozbić DNA, utrzymując próbkę w lodzie pomiędzy sonikacjami, odwiruj w wirówce przy 13 000 RPM przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Przechowywać supernatant zawierający wyizolowane białko w temperaturze -80°C, aby wzbogacić próbkę o białka takie jak histony, ściśle związane z DNA. Przeprowadzić oddzielne frakcjonowanie w celu izolacji chromosomów, zaczynając od wyizolowanego serca dorosłego szczura lub kardiomiocytów z rat PARPs. Chromatynowy osad utrzeć w 400 µL 0,4 N kwasu siarkowego i wymieszać w wstrząsarce wirówkowej. Aby usunąć grudki, inkubować próbkę w temperaturze 4°C przez 30 minut lub przez noc; po inkubacji usunąć zanieczyszczenia jądrowe poprzez wirowanie przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4°C.Przenieś nadsącz do nowej probówki i dodaj do próbki 132 µL kwasu trichlorooctowego, dodając go kroplami. Kilkukrotnie odwróć probówkę i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Po wirowaniu odrzuć nadsącz, a następnie użyj lodowatego acetonu, aby delikatnie wypłukać osad zawierający histony i ponownie odwiruj.Ponownie powtórz przemywanie acetonem, wypłucz i wysusz osad na powietrzu przed jego ponownym zawieszeniem w 100 µL buforu Tris-SDS-EDTA. Użyj 1 M Tris do doprowadzenia pH do wartości 8.Sonicuj próbkę w kąpieli wodnej przez 15 minut. Próbkę przechowywać w temperaturze -80 °C. Do przeprowadzenia analiz w celu określenia czystości oraz identyfikacji przedstawionych tutaj białek należy wykorzystać spektrometrię mas.Nałożone na siebie ekstrakcyjne chromatogramy jonowe dla jednego peptydu zmapowanego do białka HMGB1. Każdy chromatogram pochodzi z innej próbki chromatyny i został oznaczony kolorystycznie, aby reprezentować stan fizjologiczny myszy, od której pobrano próbkę. Dla każdego z warunków fizjologicznych – hipertrofii podstawowej serca oraz niewydolności serca – przeanalizowano trzy powtórzenia biologiczne, przy czym każda próbka była analizowana dwukrotnie, co dało łącznie 18 chromatogramów.Poprzez całkowanie pola pod krzywą można określić względną obfitość dla każdej powtórki. W tym panelu wyciągnięto średnią z sześciu powtórek dla każdego z trzech stanów fizjologicznych, aby uzyskać ogólne wartości obfitości. Z tej analizy jasno wynika, że obfitość HGB one zmienia się w przebiegu choroby, co tutaj przedstawiono.Widmo fragmentacji tego peptydu potwierdza jego sekwencję aminokwasową i umożliwia jego przypisanie do białka HMGB1. W przeciwieństwie do tego, analiza ilościowa innego peptydu z białka histony H4 wykazuje, że jego zawartość nie zmienia się w przebiegu choroby. Za pomocą analizy statystycznej możemy ocenić powtarzalność obserwowanych zmian w zawartości peptydów pomiędzy różnymi stanami fizjologicznymi.W pierwszej kolejności obfitość wszystkich peptydów zidentyfikowanych w każdej powtórce poddawana jest analizie wariancji (ANOVA), a następnie analizie głównych składowych (PCA). Grupowanie powtórzeń technicznych i biologicznych na tym wykresie potwierdza, że zmiany obfitości wykryte za pomocą spektrometrii mas są spójne i powtarzalne pomiędzy różnymi stanami chorobowymi. Stan podstawowy zaznaczono kolorem niebieskim, przerost kolorem czerwonym, a niewydolność kolorem zielonym; równie istotne co ilościowe oznaczenie i powtarzalność wyników jest zwiększone pokrycie proteomu jądrowego, które umożliwiło podfrakcjonowanie jąder komórkowych.Rysunek ten obrazuje, że analiza samego całego jądra nie pozwala na wykrycie nawet większości białek jądrowych zidentyfikowanych podczas łączenia wyników analiz poszczególnych przedziałów. Co więcej, umiarkowana część wspólna między różnymi frakcjami wykazuje biologiczną istotność rozpatrywania tych przedziałów indywidualnie w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat funkcji jądra i regulacji genów. Wreszcie, możliwość specyficznego frakcjonowania chromosomów po ekstrakcji kwasowej lub detergentowej wzbogaca próbkę o kluczowe strukturalne białka chromatyny, takie jak histony, co umożliwia bardziej ukierunkowaną analizę spektrometryczną grupy białek bez konieczności stosowania specyficznych przeciwciał dla każdego wariantu i izoformy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby wszystkie próbki przeznaczone do analizy spektrometrem mas były wolne od kontaminacji keratyną.Jest to szczególnie istotne w kolejnych etapach następujących po izolacji białka.

quantitative-analysis-of-chromatin-proteomes-in-disease

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza ilościowa proteomów chromatyny w chorobie

Przedstawiamy tutaj procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do analizy lokalizacji w całym genomie izoform białek różniących się domeną wiążącą histony. Zastosowaliśmy ją w analizie ChIP-Seq w celu zidentyfikowania celów demetylazy histonów KDM5A/JARID1A/RBP2.

Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Sekwencyjna ekstrakcja soli białek związanych z chromatyną jest użytecznym narzędziem do określania właściwości wiązania dużych kompleksów białkowych. Metoda ta może być stosowana do oceny roli poszczególnych podjednostek lub domen w ogólnym powinowactwie kompleksu białkowego do chromatyny masowej.

Sekwencyjne ekstrakcje soli do analizy właściwości wiązania chromatyny luzem przez kompleksy modyfikujące chromatynę

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

To jest metoda identyfikacji nowych białek oddziałujących z DNA w określonych docelowych loci, polegająca na specyficznym dla sekwencji wychwytywaniu usieciowanej chromatyny do kolejnych analiz proteomicznych. Nie jest wymagana żadna wcześniejsza wiedza na temat potencjalnych białek wiążących ani modyfikacji komórek. Początkowo opracowana dla drożdży, technologia została obecnie zaadaptowana do komórek ssaków.

Adaptacja wychwytywania hybrydyzacji białek związanych z chromatyną do proteomiki komórek ssaków

Przedstawiamy protokół do identyfikacji funkcjonalnych implikacji wariantów niekodujących zidentyfikowanych przez badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) przy użyciu trójwymiarowych interakcji chromatyny.

Mapowanie wariantów choroby Alzheimera do ich docelowych genów przy użyciu obliczeniowej analizy konfiguracji chromatyny

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Wykorzystując ilościową PCR, demonstrujemy, w jaki sposób uznany model CAM kurczaka może być użyty do ilościowej analizy przerzutowania ludzkich komórek nowotworowych do odległych narządów.

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

Poznaj metodę izolacji białek chromatyny z serca myszy przy użyciu gradientu sacharozy i spektrometrii masowej. Technika ta umożliwia ilościową analizę proteomu jądrowego w chorobach serca.

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

Przeglądaj więcej filmów