Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

W niniejszym doświadczeniu wykorzystano selektywną modulację izoform kinazy białkowej C w celu określenia ich funkcji mitochondrialnych i komórkowych w komórkach cewek bliższych nerek w różnych warunkach fizjologicznych i patologlogicznych. W pierwszej kolejności należy wyizolować pierwotne komórki cewkowe bliższe z kory nerek lub RPC, które charakteryzują się metabolizmem oksydacyjnym zbliżonym do metabolizmu w cewkach bliższych nerek.

Zainfekowano RPC wektorami adenowirusowymi wykazującymi ekspresję aktywnych i nieaktywnych form białka kinazy C. Następnie przeprowadzono analizę różnych funkcji mitochondrialnych oraz żywotności komórek, aby określić wpływ izoenzymu na zdolność mitochondriów do syntezy ATP i zapobiegania śmierci komórkowej. Wykonano również analizę immuno-blottingu dla fosforylowanej kinazy C epsilon w pobranych lizatach komórkowych.

Wyniki wskazują, że aktywacja kinazy białkowej epsilon negatywnie reguluje zdolność mitochondriów do generowania ATP, obniżając wewnątrzkomórkowy poziom ATP oraz żywotność komórek cewek bliższych nerek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do stosowanych przez nas metod, takich jak linie komórkowe, jest to, że pierwotne hodowle komórek cewek bliższych nerek zachowują funkcje zróżnicowane i mechanizmy utleniania typowe dla cewki bliższej nerek. Ponieważ kinazy białkowe mogą służyć jako cele i potencjalne czynniki terapeutyczne, zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię, zapobieganie uszkodzeniom nerek lub przyspieszanie regeneracji nerek po urazie.

Metoda ta pozwala na poznanie mechanizmu uszkodzenia i regeneracji. Może być ona zastosowana np. do świeżo wyizolowanych nerek królika, które kolejno przemywa się 50 mililitrami sterylnego medium D-M-E-M-F 12, sterylnego roztworu soli fosforanowej PBS o pH 7.4 oraz roztworu tlenku żelaza w PBS w celu pobrania kory każdej nerki.

Najpierw należy zhomogenizować tkankę, używając homogenizatora o pojemności 15 mililitrów. Następnie homogenizat należy przelać przez dwa sterylne sita z siatką do jednego litrowego sterylnego zlewki. Komórki pozostałe na sitach należy wypłukać buforem zawierającym deferoksaminę.

Przenieś wszelką tkankę pozostałą na dnie sita o oczkach 85 µm do 40 ml buforu zawierającego deferoksaminę, umieszczonego w stożkowej probówce do wirowania. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą silnego magnesu.

Należy wychwycić kłębuszki wypełnione żelazem i odessać żelazo przytwierdzone do magnesu. Objętość zawiesiny komórkowej należy dostosować do 40 milliliters, a następnie dodać jeden milliliter medium do trawienia zawierającego kolagenazę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 17 minutes.

Delikatnie wymieszać zawiesinę. Zebrać komórki poprzez wirowanie z prędkością 50 ×g przez dwie minuty w temperaturze 4 °C po kilku przemyciach. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 46 ml medium bez dodatku glukozy.

Pierwotne komórki nabłonka naczyniówki (RPC) hodowano przy gęstości jednego miligrama białka na naczynie w 2 mL pożywki D-M-E-M-F 12 bez glukozy na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po wymianie pożywki przystąpiono do infekcji konfluentnych komórek RPC adenowirusem niosącym cDNA dla konstytutywnie aktywnej kinazy białkowej C epsilon lub dominująco negatywnej kinazy białkowej C epsilon; następnie inkubowano je przez 24 h, wymieniono pożywkę i hodowano transfekowane pierwotne RPC przez kolejne 24 h. Aby zwizualizować morfologię mitochondriów w monowarstwie pierwotnych komórek, wymieniono pożywkę, dodano MitoTracker Red CMXRos i pozostawiono naczynia w inkubatorze na 30 min.

Następnie należy zbadać żywe monowarstwy pod mikroskopem fluorescencyjnym z użyciem obiektywu immersyjnego wodnego. Cel drugi. Aby ocenić funkcję mitochondriów, należy przeanalizować oddychanie w stanie 3 zawiesiny RPTC w komorze do pomiaru zużycia tlenu wyposażonej w elektrodę typu Clarka.

Najpierw należy zmierzyć oddychanie stanu dwa w obecności DP. Następnie dodaje się DP do stężenia końcowego 0,4 mM. Aby zainicjować oddychanie stanu trzy dla oddychania stanu cztery, dodaje się oligomycynę do stężenia końcowego 0,5 µg/mL.

Należy również przeprowadzić pomiar oddychania rozsprzężonego poprzez dodanie 0,5 µM FCCP do komórek oddychających w stanie trzy. Powoli dodaj 20 µL 0,5 mM roztworu JC-1 do każdej szalki z hodowlą RPTC i zamieszaj ruchem wirowym, aby dokładnie wymieszać barwnik. Przenieś szalki z powrotem do inkubatora na 30 minut.

Następnie umieść hodowle w lodzie i przeprowadź dwa przemycia lodowatym PBS. Następnie zbierz komórki. Przenieś komórki RPT do probówki typu Eppendorf i rozbij monowarstwy do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez pipetowanie.

Analizę fluorescencji przeprowadź metodą cytometrii przepływowej, wykorzystując wzbudzenie laserem jonowym argonowym o długości fali 488 nanometrów. Następnie oblicz potencjał błony mitochondrialnej w wyizolowanych mitochondriach. Ułatwi to ocenę integralności łańcucha oddechowego.

Po dwukrotnym przemyciu monowarstw RPTC lodowatym buforem PBS, zbierz komórki i osadź je poprzez wirowanie. Przemyj osad raz w 1 mL buforu A, a następnie homogenizuj komórki w homogenizatorze Dounce, aż do momentu, gdy podczas kontroli pod mikroskopem większość komórek w homogenacie zostanie rozbita. Następnie usuń szczątki komórkowe poprzez wirowanie z niską prędkością.

Odwirować surowe mitochondria z naddatku przy 15 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie trzykrotnie przemyć osad z mitochondriów buforem c. Zawiesić osad mitochondrialny w 50–100 µL buforu do testu i zamrozić w ciekłym azocie w celu oznaczenia aktywności NADH-ubichinon oksydoreduktazy. Dodać 500 µL buforu do testu wraz z dodatkami oraz mitochondria; należy również przygotować próbę ślepą zawierającą wszystkie dodatki, ale bez mitochondriów. Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez pięć minut przy jednoczesnym mieszaniu w celu wyrównania temperatury.

Następnie umieść płytkę w spektrofotometrze i dodaj 10 µL 3,25 mM ubichinonu do każdego dołka, aby rozpocząć reakcję. Zapisuj absorbancję przy 340 nm przez trzy minuty w odstępach 22 s. W podobnym teście zmierz aktywność oksydazy cytochromu C, wykorzystując zredukowany cytochrom C jako substrat dla reakcji syntazy ATP.

Przygotować mieszaniny do oznaczania całkowitej aktywności APAs oraz aktywności APAs niewrażliwej na oligomycynę dla każdej z grup badawczych. Próbki inkubować w mieszaninie reakcyjnej w temperaturze 31 °C przez 10 minut. Rozpocząć reakcję poprzez dodanie substratu TP i inkubować w temperaturze 31 °C przez pięć minut.

Przenieś 200 µL mieszaniny inkubacyjnej do probówki zawierającej 50 µL 3 M TCA i wytrącaj białka na lodzie przez 10 minut. Następnie odwiruj osad w wirówce. Kolejnym krokiem jest napełnienie płytki 96-dołkowej, aplikując 50 µL każdego standardu fosforanowego oraz 50 µL nadsączu z każdej próbki w dwóch powtórzeniach.

Następnie do każdej studni należy dodać 250 µL odczynnika Sumnera i inkubować w temperaturze 30 °C przez 15 minut. Następnie należy zmierzyć absorbancję przy 595 nm. Monowarstwy RPTC należy przemyć dwukrotnie lodowatym buforem PBS.

Zbierz komórki w 1 mL PBS i przenieś zawiesinę komórkową do probówki typu Eppendorf. Odwiruj próbki RPTC, aby uzyskać osad, a następnie wyznacz zawartość ATP za pomocą metody lucyferazy z zestawu do bioluminescencyjnego oznaczania ATP. Do analizy żywotności komórek w szalkach o średnicy 35 mm wykorzystaj pięć monowarstw RPTC dla trzech grup kontrolnych: komórek wykazujących nekrozę, komórek wykazujących apoptozę oraz kontroli bez barwienia w dwóch szalkach.

Do drugiego zestawu dodaj 2 µL 50 mM cisplatyny. Dodaj 2 µL 500 mM hydropertlenku tert-butylu. Po zabarwieniu komórek jodekiem propidyny, zgodnie z opisem w tekście towarzyszącym, przemyj monowarstwy buforem wiążącym.

Następnie przeprowadź barwienie komórek przy użyciu ANNEXIN 5 sprzężonego z ZI, zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole tekstowym. Potem delikatnie zbierz komórki i zawieś je w 500 µL buforu wiążącego, używając gumowego zgarniacza (tzw. rubber policeman).

Użyj pipety, aby rozproszyć komórki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówek do cytometrii przepływowej. Rozprosz komórki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek. Niezwłocznie przystąp do ilościowego oznaczenia fluorescencji dla PI i FE metodą cytometrii przepływowej; adenowirusowa dostawa CD NA powlekającej konstytutywnie aktywne i nieaktywne mutanty kinazy białkowej C epsilon prowadzi do znaczącego wzrostu poziomu białka kinazy białkowej C epsilon w RPTC oraz w mitochondriach.

Zgodnie z oczekiwaniami, konstytutywnie aktywna forma enzymu ulega fosforylacji w RPTC, natomiast dominujący negatywny enzym nie jest fosforylowany. Obecność aktywnej kinazy białkowej C epsilon zmniejsza oddychanie mitochondrialne w RPTC, niezależnie od substratu wykorzystanego do zasilania mitochondriów. Natomiast nieaktywna kinaza białkowa C epsilon nie wpływa na oddychanie mitochondrialne.

Co ciekawe, aktywacja kinazy białkowej C epsilon w RP TCS zmniejsza aktywność kompleksów I oraz IV. Ten spadek oddychania RPTC wiąże się ze wzrostem potencjału błony mitochondrialnej. Mutant dominującego negatywu nie wywołuje takiego efektu.

Zmianom tym towarzyszy również spadek aktywności syntazy ATP w mitochondriach izolowanych z RPTC nadeksperymujących aktywną kinazę białkową C epsilon. W rezultacie zawartość ATP w RPTC nadeksperymujących aktywną kinazę białkową C epsilon ulega obniżeniu. Utrzymana aktywacja kinazy białkowej C epsilon wywiera głęboki wpływ na morfologię mitochondriów, co objawia się fragmentacją mitochondriów.

Aktywacja, a nie inhibicja kinazy białkowej C. Prowadzi to również do zmian w morfologii RPTC, powodując kurczenie się komórek oraz wydłużenie komórek przeżyjących. Te mitochondrialne efekty nadekspresji aktywnej kinazy białkowej C epsilon w RPC korelowały również ze śmiercią komórek zarówno w wyniku onkozy, jak i apoptozy.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić nadekspresję białek w kulturach pierwotnych z wykorzystaniem techniki adenowirusowej oraz jak ocenić wydolność mitochondriów w syntezie TP. Po opanowaniu tej metody, przy jej prawidłowym wykonaniu, cała procedura może zająć cztery godziny. Prosimy pamiętać, że praca z adenowirusami wiąże się z określonym ryzykiem, dlatego należy zachować odpowiednie środki ostrożności.