Name: Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w izoenzymach kinazy białkowej C z nadekspresją komórek nerkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Poznaj metodę oceny funkcji mitochondriów i żywotności komórek w izoenzymach kinazy białkowej C z nadekspresją w komórkach nerkowych. Technika ta wykorzystuje wektory adenowirusowe do badania oddychania mitochondrialnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant z National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 2R01DK59558 (dla G.N.). UAMS Translational Research Institute, wspierany przez grant UL1 RR029884 z National Institutes of Health National Center for Research Resources, zapewnił częściowe finansowanie dla Flow Cytometry Core w UAMS. Dziękujemy dr Peipei Ping (University of California at Los Angeles; Los Angeles, CA) za udostępnienie aliquoty adenowirusa niosącego cDNA kodujące dominujący negatywny (nieaktywny) mutant PKC-ε oraz dr Allenowi Samarelowi (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) za udostępnienie aliquoty wektora adenowirusowego kodującego konstytutywnie aktywny mutant PKC-ε. Dziękujemy również dr Peterowi Parkerowi i dr Peterowi Sugdenowi (Imperial College London, Londyn, UK) za udostępnienie cDNA kodującego konstytutywnie aktywną PKC-ε.

<ol><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li>
<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells%3A+improvements+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li>
<li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits%3A+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li>
<li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C%2C+Ras+plays+multiple+roles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li>
<li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-%CE%B5+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li>
<li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ERK1%2F2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li>
<li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li>
<li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-%CE%B1+and+ERK1%2F2+mediate+mitochondrial+dysfunction%2C+decreases+in+active+Na%2B+transport%2C+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li>
<li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-%281%2C2-dichlorovinyl%29-L-cysteine+injury+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li>
<li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+a+functional+p21WAF1%2FCIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis%3A+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawione tutaj podejście pozwala na nadekspresję poszczególnych izozymów PKC w hodowli pierwotnej komórek cewek bliższych nerek. Metoda ta posiada kilka istotnych zalet: 1. Pozwala na badanie mechanizmów regulacyjnych w homogennej populacji komórek (komórek cewek bliższych nerek), które są głównym celem dla różnych czynników uszkadzających (niedokrwienia, hipoksji, stresu oksydacyjnego), leków oraz substancji nefrotoksycznych w obrębie nerki. 2. Funkcje mitochondriów w tej in vitro model RPTC hodowanych w k...

<table><tbody><tr><td>Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>FORMA 1104</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkanek Dounce 2 ml i 15 ml</td><td>WHEATON</td><td>989-24607, 357544</td><td></td></tr><tr><td>Sito nylonowe 85 i 235 mikronów</td><td>Small Parts</td><td>CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna probówka wirówkowa 50 ml</td><td>BIOLOGIX</td><td>BCT-P 50BS</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne szalki hodowlane 35 x 10 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Jouan</td><td>Jouan</td><td>Jouan CR3 11175704 Rotory: Jouan T40</td><td></td></tr><tr><td>Regulowana mikrowirówka</td><td>SIGMA</td><td>Model 1 - 15</td><td></td></tr><tr><td>Monitor biologicznego zużycia tlenu</td><td>YSI Incorporated</td><td>YSI Model 5300A</td><td></td></tr><tr><td>Jednokomorowy mikro system pomiaru tlenu</td><td>YSI Incorporated</td><td>5356S</td><td></td></tr><tr><td>Sonda tlenowa</td><td>YSI Incorporated</td><td>5331A</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia cyrkulacyjna</td><td>YSI Incorporated</td><td>5310</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw membran standardowych i KCl</td><td>YSI Incorporated</td><td>5775</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>YSI Incorporated</td><td>5222</td><td></td></tr><tr><td>Rejestrator płaski</td><td>Kipp Zonen</td><td>BD 11E</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste płytki 48- i 96-dołkowe</td><td>Costar</td><td>3548, 3679</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>5355 21919</td><td></td></tr><tr><td>Wstrząsarka orbitalna MAXQ 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKA 2000</td><td></td></tr><tr><td>Spectra FLUOR Plus (czytnik absorbancji/fluorescencji/luminescencji)</td><td>Tecan</td><td>F129005</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator automatyczny do CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; z płaszczem wodnym US Autoflow</td><td>NUAIRE</td><td>NU 4850</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe probówki hodowlane 12x75 mm do cytometrii przepływowej</td><td>Fisher Brand</td><td>14-961-20</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop&lt;br/&gt; Obiektyw immersyjny wodny 63x / 0,90W</td><td>Carl Zeiss</td><td>114846&lt;br/&gt; ACHROPLAN 44 00 67</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Cellgro</td><td>99 - 830 - PB</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 Ham</td><td>Sigma</td><td>D 2906 - 1L</td><td></td></tr><tr><td>Mezylan deferoksaminy</td><td>Hospira</td><td>D110</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Worthington</td><td>4196</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Sigma</td><td>T 6522 - 500mg</td><td></td></tr><tr><td>jodek 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylkarbocyjaniny (JC-1)</td><td>Invitrogen</td><td>T3168</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>M22425</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do bioluminescencyjnego oznaczania ATP HS II</td><td>Roche</td><td>11 699 709 001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Aneksyny V - FITC</td><td>BioVision</td><td>1001 - 200</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej c

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Rodzina izozymów kinazy białkowej C (PKC) bierze udział w licznych procesach fizjologicznych i patologicznych. Nasze ostatnie dane wykazują, że PKC reguluje funkcje mitochondriów oraz stan energetyczny komórek. Liczne doniesienia dowiodły, że aktywacja PKC-α i PKC-ε poprawia funkcje mitochondriów w niedokrwionym sercu i pośredniczy w kardioprotekcji. Z kolei wykazaliśmy, że PKC-α i PKC-ε uczestniczą w indukowanej nefrotoksynami dysfunkcji mitochondriów i śmierci komórek nerkowych. Celem niniejszego badania było zatem opracowanie modelu in vitro komórek nerek zachowujących aktywne funkcje mitochondriów, w którym izozymy PKC mogłyby być selektywnie aktywowane lub hamowane w celu określenia ich roli w regulacji fosforylacji oksydacyjnej i przeżywalności komórek. Pierwotne hodowle komórek cewnych kanalików proksymalnych nerek (RPTC) hodowano w usprawnionych warunkach, co pozwoliło uzyskać oddychanie mitochondrialne i aktywność enzymów mitochondrialnych zbliżoną do tej obserwowanej w RPTC in vivo. Ponieważ tradycyjne techniki transfekcji (Lipofectamine, elektroporacja) są mało wydajne w hodowlach pierwotnych i wywierają niekorzystny wpływ na funkcje mitochondriów, mutanty cDNA PKC-ε dostarczano do RPTC za pomocą wektorów adenowirusowych. Podejście to pozwala na transfekcję ponad 90% hodowanych komórek RPTC.
W niniejszej pracy przedstawiamy metody oceny roli PKC-ε w: 1. regulacji morfologii i funkcji mitochondriów związanych z syntezą ATP oraz 2. przeżywalności RPTC w hodowli pierwotnej. Aktywację PKC-ε osiąga się poprzez nadekspresję konstytutywnie aktywnego mutanta PKC-ε. Inhibicję PKC-ε uzyskuje się poprzez nadekspresję nieaktywnego mutanta PKC-ε. Funkcję mitochondriów ocenia się poprzez badanie oddychania, integralności łańcucha oddechowego, aktywności kompleksów oddechowych i F0F1-ATPase, szybkości produkcji ATP oraz zawartości ATP. Oddychanie ocenia się w RPTC przepuszczczonych za pomocą digitonininy jako stan 3 (maksymalne oddychanie w obecności nadmiaru substratów i ADP) oraz oddychanie rozprzęgane. Integralność łańcucha oddechowego ocenia się poprzez pomiar aktywności wszystkich czterech kompleksów łańcucha oddechowego w izolowanych mitochondriach. Zdolność do fosforylacji oksydacyjnej ocenia się poprzez pomiar potencjału błony mitochondrialnej, szybkości produkcji ATP oraz aktywności F0F1-ATPase. Stan energetyczny RPTC ocenia się poprzez oznaczenie wewnątrzkomórkowej zawartości ATP. Morfologię mitochondriów w żywych komórkach wizualizuje się przy użyciu MitoTracker Red 580, barwnika fluorescencyjnego specyficznie kumulującego się w mitochondriach, a żywe monowarstwy bada się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Żywotność RPTC ocenia się za pomocą barwienia aneksyną V/jodkiem propidyny z następującą cytometrią przepływową w celu określenia poziomu apoptozy i onkozy.
Metody te umożliwiają selektywną aktywację lub inhibicję poszczególnych izoform PKC w celu oceny ich roli w funkcjach komórkowych w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych, które można odtworzyć in vitro.

Rycina 1 pokazuje, że adenowirusowa dostawa cDNA kodującego mutanty konstytutywnie aktywne (caPKC-ε) i nieaktywne (dnPKC-ε) PKC-ε prowadzi do znaczącego wzrostu poziomu białka PKC-ε w RPTC oraz w mitochondriach. Komórki zainfekowane cDNA zawierającym wektor caPKC-ε wykazywały nadekspresję fosforylowanej (aktywnej) formy PKC-ε, natomiast komórki zainfekowane cDNA kodującym dnPKC-ε wykazywały nadekspresję nieaktywnej (niefosforylowanej) PKC-ε (Rycina 1). Obecność aktywnej PKC-ε zmniejszała...

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Rodzina izoenzymów kinazy białkowej C (PKC) bierze udział w licznych procesach fizjologicznych i patologicznych. Nasze ostatnie dane wykazują, że PKC...

W niniejszym eksperymencie wykorzystano selektywną modulację izoform kinazy białkowej C w celu określenia ich funkcji mitochondrialnych i komórkowych w komórkach cewek proksymalnych nerek w różnych warunkach fizjologicznych i patologpecznych. Najpierw należy wyizolować pierwotne komórki cewek proksymalnych nerek z kory nerkowej lub RPC, które charakteryzują się metabolizmem oksydacyjnym przypominającym metabolizm cewek proksymalnych nerek.Zakaźmy RPC wektorami adenowirusowymi wykazującymi ekspresję aktywnych i nieaktywnych form białka kinazy C. Następnie przeanalizujmy różne funkcje mitochondrialne oraz żywotność komórek, aby określić wpływ izoenzymu na zdolność mitochondriów do syntezy ATP i zapobiegania śmierci komórkowej. Przeprowadźmy również analizę immunoblottingu dla fosforylowanej kinazy C epsilon w połączonych lizatach komórkowych.Wyniki wskazują, że aktywacja kinazy białkowej epsilon negatywnie reguluje zdolność mitochondriów do generowania ATP, obniżając komórkowe poziomy ATP oraz żywotność komórek kanalików bliższych nerek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszymi obecnymi metodami, takimi jak linie komórkowe, jest to, że pierwotne hodowle komórek kanalików bliższych nerek zachowują funkcje różnicowania i mechanizmy utleniania kanalików bliższych. Ponieważ kinazy białkowe mogą służyć jako cele i potencjalne środki terapeutyczne, zastosowania tej techniki obejmują terapię, zapobieganie uszkodzeniom nerek lub przyspieszanie regeneracji nerek po urazie.Metoda ta pozwala na wgląd w mechanizmy uszkodzenia i regeneracji. Może ona zostać zastosowana m.in. w przypadku świeżo wyizolowanych nerek królika, które kolejno przepłukano 50 mililitrami sterylnego medium D-M-E-M-F 12, sterylnego roztworu soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,4 oraz roztworu tlenku żelaza w PBS, aby pobrać korę każdej nerki.Najpierw należy zhomogenizować tkankę, używając homogenizatora o pojemności 15 ml. Następnie homogenizat należy przesiać przez dwa sterylne sita z siatką do jednego litrowego sterylnego zlewka. Komórki pozostałe na sitach należy wypłukać buforem zawierającym deferoksaminę.Przenieś każdą pozostałą na dnie tkankę z sita o rozmiarze 85 micron do 40 mililitrów buforu zawierającego deferoksaminę, umieszczonego w stożkowej probówce wirówkowej. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą silnego magnesu.Wyłap kłębki naczyniowe wypełnione żelazem i odessij żelazo przytwierdzone do magnesu. Doprowadź objętość zawiesiny komórkowej do 40 ml i dodaj 1 ml pożywki do trawienia zawierającej kolagenazę. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 17 minut.Delikatnie wymieszać zawiesinę. Zebrać komórki poprzez wirowanie z prędkością 50 ×g przez dwie minuty w temperaturze 4 °C po kilku etapach płukania. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 46 ml pożywki nie zawierającej glukozy.Pierwotne komórki RPC hodowano w gęstości jednego miligrama białka na płytkę w dwóch mililitrach pożywki D-M-E-M-F 12 pozbawionej glukozy na wytrząsarku orbitalnym w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Po uzupełnieniu pożywki przystąpiono do infekcji konfluencyjnych komórek RPT adenowirusem niosącym CD NA dla albo konstytutywnie aktywnej kinazy proteinowej C epsilon, albo dominująco negatywnej kinazy proteinowej C epsilon; inkubowano przez 24 godziny, uzupełniono pożywkę i hodowano transfekowane pierwotne komórki RPC przez kolejne 24 godziny. Aby zwizualizować morfologię mitochondriów w monowarstwie pierwotnych komórek, uzupełniono pożywkę, dodano MIT tracker red five 80 i zwrócono płytki do inkubatora na 30 minut.Następnie zbadaj żywe monowarstwy pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu obiektywu imersyjnego z wodą. Cel drugi. Aby ocenić funkcję mitochondriów, oceń oddychanie w stanie trzy zawiesiny RPTC w komorze pomiaru zużycia tlenu wyposażonej w elektrodę typu Clarka.Najpierw zmierz oddychanie stanu dwa w obecności DP. Następnie dodaj DP do stężenia końcowego 0,4 mM. Aby zainicjować oddychanie stanu trzy dla oddychania stanu cztery, dodaj oligomycynę do stężenia końcowego 0,5 µg/mL.Należy również przeprowadzić pomiar oddychania niesprzężonego, dodając 0,5 µM FCCP do komórek oddychających w stanie trzy. Powoli dodaj 20 µL 0,5 mM roztworu JC-1 do każdej płytki z hodowlą RPTC i zamieszaj, aby dokładnie wymieszać barwnik. Włóż płytki z powrotem do inkubatora na 30 minut.Następnie umieść hodowle w lodzie i przeprowadź dwa przemycia zimnym PBS. Potem zebrać komórki. Przenieś komórki RPT do probówki typu Eppendorf i rozbij monowarstwy do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez pipetowanie.Analizę fluorescencji przeprowadźcie metodą cytometrii przepływowej, wykorzystując wzbudzenie laserem argonowym o długości fali 488 nanometrów. Następnie obliczcie potencjał błonowy izolowanych mitochondriów. Umożliwi to ocenę integralności łańcucha oddechowego.Po dwukrotnym przemyciu monowarstw RPTC lodowatym buforem PBS, zebrać komórki i sfragmentować je poprzez wirowanie. Osad przemyć raz w jednym mililitrze buforu A, a następnie zhomogenizować komórki w homogenizatorze typu Dounce aż do momentu, gdy podczas oględzin pod mikroskopem większość komórek w homogenacie okaże się rozbita. Następnie usunąć debris komórkowy poprzez wirowanie z niską prędkością.Odwiruj surowe mitochondria z supernatantu przy 15 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przeprowadź trzy przemycia osadu mitochondriów w buforze c. Resuspenduj osad mitochondrialny w 50 do 100 µL buforu do testu i zamroź w ciekłym azocie, aby oznaczyć aktywność reduktazy NADH-ubichinonowej. Dodaj 500 µL buforu do testu wraz z dodatkami oraz mitochondria; uwzględnij również próbkę ślepą, zawierającą wszystkie dodatki bez mitochondriów. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przez pięć minut.Następnie umieść płytkę w spektrofotometrze i dodaj 10 µL 3,25 mM ubichinonu, aby rozpocząć reakcję w każdej z próbek. Zapisz absorbancję przy 340 nm przez trzy minuty w odstępach 22-sekundowych. W analogicznym teście zmierz aktywność cytochromu C oksydazy, wykorzystując zredukowany cytochrom C jako substrat dla reakcji syntazy ATP.Przygotować mieszaniny do oznaczania całkowitej aktywności APAs oraz aktywności APAs niewrażliwej na oligomycynę dla każdej grupy badawczej. Inkubować próbki w mieszaninie reakcyjnej w temperaturze 31°C przez 10 minut. Rozpocząć reakcję poprzez dodanie substratu TP i inkubować w temperaturze 31°C przez pięć minut.Przenieś 200 µL mieszaniny inkubacyjnej do probówki zawierającej 50 µL 3 M TCA, a następnie wytrąć białka na lodzie przez 10 minut. Następnie odwiruj osad za pomocą wirówki. Dalej, do płytki 96-dołkowej nanieś po 50 µL każdego standardu fosforanu oraz 50 µL supernatantu z każdej próbki w dwóch powtórzeniach.Następnie do każdej studni dodaj 250 µL odczynnika Sumnera i inkubuj w temperaturze 30 °C przez 15 minut. Następnie zmierz absorbancję przy 595 nm. Przemyj monowarstwy RPTC dwukrotnie lodowatym buforem PBS.Zabierz komórki w jednym mililitrze PBS i przenieś zawiesinę komórkową do probówki typu einor. Odwiruj próbki RPTC w celu uzyskania osadu i wyznacz zawartość TP, wykorzystując metodę lucyferazową z zestawu do bioluminescencyjnego pomiaru ATP. Do analizy żywotności komórek w szalkach 35 milimetrowych użyj pięciu monowarstw RPTC dla trzech grup kontrolnych: komórek z pozytywnym wynikiem w kierunku nekrozy, komórek z pozytywnym wynikiem w kierunku apoptozy oraz kontroli bez barwienia dla dwóch szalek.Dodaj dwa mikrolitry 50 milimolowego cisplatyny do drugiego zestawu. Dodaj dwa mikrolitry 500 milimolowego nadtlenku tert-butyloperoksydu. Po zabarwieniu komórek jodkiem propidynyum, zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście, przemyj monowarstwy buforem wiążącym.Następnie należy zbarwić komórki przy użyciu ANNEXIN five sprzężonego z ZI, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Potem delikatnie zbierz komórki i zawieś je w 500 µL buforu wiążącego, używając gumowego policemana.Za pomocą pipety rozdziel komórki do postaci zawiesiny jednokomórkowej, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówek do cytometrii przepływowej. Rozdziel komórki do postaci zawiesiny jednokomórkowej. Bezzwłocznie przystąp do ilościowego oznaczenia fluorescencji dla PI i FE za pomocą cytometrii przepływowej; adenowiralna dostawa CD NA powlekającej konstytutywnie aktywne i nieaktywne mutanty kinazy białkowej C epsilon prowadzi do znaczącego wzrostu poziomu białka kinazy białkowej C epsilon w RPTC oraz w mitochondriach.Zgodnie z przewidywaniami, konstytutywnie aktywna forma enzymu ulega fosforylacji w RPTC, natomiast enzym dominująco negatywny nie jest fosforylowany. Obecność aktywnej kinazy białkowej C epsilon obniża oddychanie mitochondrialne w RPTC, niezależnie od substratu wykorzystanego do zasilania mitochondriów. Natomiast nieaktywna kinaza białkowa C epsilon nie wywiera wpływu na oddychanie mitochondrialne.Co ciekawe, aktywacja kinazy białkowej C epsilon w RP TCS zmniejsza aktywność kompleksu I i IV. Ten spadek oddychania RPTC wiąże się ze wzrostem potencjału błony mitochondrialnej. Mutacja dominantno-negatywna nie wykazuje takiego efektu.Zmiany te są również powiązane ze spadkiem aktywności syntazy ATP w mitochondriach wyizolowanych z RPTC z nadekspresją aktywnej kinazy białkowej C epsilon. W rezultacie zawartość ATP w RPTC z nadekspresją aktywnej kinazy białkowej C epsilon jest obniżona. Przeciągła aktywacja kinazy białkowej C epsilon wywiera głęboki wpływ na morfologię mitochondriów, co objawia się fragmentacją mitochondriów.Aktywacja, a nie hamowanie kinazy białkowej C. Prowadzi to również do zmian w morfologii RPTC, powodując kurczenie się komórek i wydłużenie komórek przeżywających. Te mitochondrialne efekty nadekspresji aktywnej kinazy białkowej C epsilon w RPC korelowały również ze śmiercią komórek zarówno w wyniku onkozy, jak i apoptozy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak nadekspresować białka w kulturach pierwotnych przy użyciu techniki adenowirusowej oraz jak ocenić wydolność mitochondriów w syntezie TP. Po opanowaniu tej metody, przy prawidłowym przeprowadzeniu, procedura ta zajmuje cztery godziny. Prosimy pamiętać, że praca z adenowirusami wiąże się z ryzykiem, dlatego należy podjąć odpowiednie środki ostrożności.

assessment-mitochondrial-functions-cell-viability-renal-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena funkcji mitochondrialnych i żywotności komórek nerkowych z nadmierną ekspresją izozymów kinazy białkowej C

Ten film demonstruje ocenę funkcjonowania mitochondriów komórek śródbłonka naczyń mózgowych (CVE) za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Komórki CVE są siane na płytce do hodowli komórek strumienia zewnątrzkomórkowego. Czujniki strumienia zewnątrzkomórkowego są nawilżane przed załadowaniem i kalibracją do bioanalizatora. Płytka zawierająca komórki jest następnie ładowana do analizy.

Ocena funkcji mitochondriów w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Mitochondria komórek śródbłonka są niezbędne do utrzymania integralności bariery krew-mózg. Wprowadzamy protokół pomiaru funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych.

Ocena funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych

Zrozumienie wpływu środowiskowych pestycydów chloroorganicznych (OCP) na funkcję mitochondriów w hepatocytach jest ważne dla zbadania mechanizmu OCP powodującego zaburzenia metaboliczne. W pracy przedstawiono szczegółowe metody wykrywania funkcji mitochondriów wątroby.

Eksperymentalny protokół wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach narażonych na pestycydy chloroorganiczne

Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Ta metoda wykorzystuje udział porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów do wycieku protonów o niskiej przewodności, aby określić próg napięcia dla otwarcia porów u noworodków z zespołem łamliwego chromosomu X o zwiększonej zawartości kardiomiocytów mitochondrialnego koenzymu Q w porównaniu do kontroli typu dzikiego.

Ocena otwartego prawdopodobieństwa porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w warunkach nadmiaru koenzymu q

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

Tutaj opisujemy protokół in vitro modelujący niedotlenienie/uszkodzenia reoxygenacji w wysokometabolicznych komórkach nabłonka rurkowo-rurkowego. Model ten został zaprojektowany tak, aby wywołać uszkodzenia wywołane stresem metabolicznym, które można zmierzyć poprzez ekspresję markerów uszkodzenia kanałów bliższych oraz ocenę funkcji oddechowej mitochondriów.

Modelowanie niedotlenienia/uszkodzeń reoxygenacji w bliższych komórkach nabłonka rurkowego

Artykuł ten opisuje wykorzystanie mikroskopii konfokalnej oraz ImageJ do oceny dynamiki rozszczepienia i fuzji mitochondriów za pomocą fluorescencji przełączającej się foto Dendra2.

Ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych

Poznaj metodę oceny funkcji mitochondriów i żywotności komórek w izoenzymach kinazy białkowej C z nadekspresją w komórkach nerkowych. Technika ta wykorzystuje wektory adenowirusowe do badania oddychania mitochondrialnego.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Przeglądaj więcej filmów