Name: Liczenie głównych populacji leukocytów krwi obwodowej do wieloośrodkowych badań klinicznych z wykorzystaniem testu fenotypowania krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Poznaj metodę fenotypowania leukocytów w pełnej krwi obwodowej z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i rurek TruCount. Standaryzowana procedura umożliwia dokładne liczenie populacji komórek w wieloośrodkowych badaniach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jessice Jones, Ericie Clark, Constance Ducar, Donnie Smith, Royowi Lewisowi, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devinowi Adamsowi, Coreyowi McBainowi oraz Stephenowi Voghtowi za pomoc w opracowaniu tej metody, manuskryptu i filmu.
Niniejsza praca była wspierana przez grant CAVD 38645 Fundacji Billa i Melindy Gates (M.J.M.) oraz granty Narodowych Instytutów Zdrowia UM1 AI068618 i U01 AI069481 (M.J.M.). E.A-N. jest wspierany przez grant NIH T32 AI007140. Dziękujemy James B. Pendleton Charitable Trust za hojną darowiznę sprzętu.

Uwaga: Aby chronić przeciwciała sprzężone z fluoroforem przed światłem, należy przeprowadzić wszystkie etapy w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy wyłączonym oświetleniu.
1. Przygotowanie panelu barwienia przeciwciałami
<ol>
 <li> Panel barwienia przeciwciałami znajduje się w Tabeli 1. Stężenie przeciwciał należy określić poprzez miareczkowanie z użyciem krwi pełnej, korzystając z tej samej aparatury do cytometrii przepływowej oraz procedur, które będą stosowane podczas analizy barwionych próbek fenotypowych. </li>
 <li> Po ustaleniu odpowiednich mian barwienia, należy połączyć wszystkie przeciwciała w jednej probówce z zakrętką. Dodać bufor do płukania w cytometrii przepływowej (PBS Dulbecco z 2% inaktywowanym termicznie płodową surowicą bydlęcą), aby doprowadzić całkowitą objętość do 100 μl. Skalować objętość mieszaniny zgodnie z liczbą barwionych próbek. Mieszaninę tę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie osiem tygodni. </li>
</ol>
2. Barwienie
<ol>
 <li> Jeśli pobrana krew ma zostać wykorzystana do innych celów poza niniejszym badaniem, należy odstawić alikwot, podczas gdy pozostałą krew poddaje się bardziej wrażliwym czasowo procedurom. Alikwot można przechowywać w temperaturze pokojowej do 4 hr po wenipunkcji bez znaczącej utraty komórek. </li>
 <li> Należy sprawdzić, czy na dnie probówki Trucount znajduje się nienaruszony osad kulek, a następnie opisać probówkę, aby zidentyfikować barwioną próbkę. W badaniach klinicznych HVTN do opisywania i śledzenia barwionych próbek wykorzystuje się Laboratory Data Management System (Frontier Science and Technology Research Foundation; Amherst, NY). </li>
 <li> Należy zapisać numery partii i daty ważności wszystkich odczynników. Należy zapisać liczbę kulek w probówce Trucount podaną przez producenta na opakowaniu probówek; należy upewnić się, że numer partii na opakowaniu jest zgodny z numerem partii na probówce. </li>
 <li> Stosując pipetowanie odwrotne, należy precyzyjnie nanieść 100 μl krwi pełnej do probówki Trucount, tuż nad metalowy ogranicznik. Należy unikać rozmazywania krwi po ściankach probówki. </li>
 <li> Stosując standardową technikę pipetowania (dodnie), należy nanieść 100 μl zmieszanego panelu przeciwciał barwiących (patrz Tabela 1) do probówki Trucount. Należy zakręcić probówkę i mieszać na wirówce typu vortex z niską prędkością przez około 15 sec. Należy wizualnie sprawdzić probówkę, aby upewnić się, że osad kulek został całkowicie rozpuszczony. </li>
 <li> Probówkę Trucount należy inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (15-30 °C) w ciemności. </li>
 <li> W razie potrzeby należy rozcieńczyć alikwot 10× roztworu FACS Lysing do stężenia 1X za pomocą diH2O. Do probówki należy dodać 900 μl 1× roztworu FACS Lysing. </li>
 <li> Należy zakręcić probówkę i dokładnie mieszać na wirówce typu vortex z niską prędkością przez około 15 sec. Należy mocno docisnąć zakrętkę do pozycji blokady na probówce i uszczelnić ją folią laboratoryjną. </li>
 <li> Probówkę należy przechowywać w temperaturze od -65 °C do -95 °C do czasu przygotowania próbki do wysyłki do centralnego laboratorium analitycznego lub do analizy wewnętrznej. Próbki są stabilne na tym etapie przez co najmniej cztery tygodnie. W przypadku natychmiastowej wysyłki lub analizy ten krok można pominąć. </li>
</ol>
3. Wysyłka
Uwaga: Poniższe instrukcje wykorzystują izolowany system transportowy firmy Saf-T-Pak, Inc., zaprojektowany specjalnie do transportu zwolnionych z przepisów substancji biologicznych kategorii B zgodnie z regulacjami Międzynarodowego Zrzeszenia Transportu Powietrznego (IATA). Jeśli analiza próbek odbywa się w tym samym miejscu, w którym przeprowadzono barwienie, należy przejść do sekcji 4.
<ol>
 <li> Próbki można wysłać natychmiast po barwieniu lub po zamrożeniu w temperaturze od -65 °C do -95 °C. Każdą probówkę należy całkowicie owinąć folią i umieścić w pudełku na zabarwione preparaty. Pudełko z zabarwionymi preparatami należy umieścić w szczelnym worku polietylenowym z materiałem absorbującym. </li>
 <li> Szczelny worek polietylenowy wraz z zawartością należy umieścić w worku Tyvek i zamknąć, usuwając z niego jak najwięcej powietrza.</li>
 <li> Pakiet z preparatem (preparat w opakowaniu wtórnym) należy umieścić w wewnętrznym brązowym pudełku. </li>
 <li> Wewnętrzne brązowe pudełko należy umieścić w styropianowej skrzyni, mocując je w zagłębieniu, aby zapobiec przemieszczaniu. </li>
 <li> Styropianową skrzynię należy wypełnić suchym lodem (około 8 kg) i szczelnie zamknąć pokrywą. </li>
 <li> Pudełko transportowe należy starannie zakleić taśmą i wysłać jako Substancję Biologiczną, Kategoria B (UN3373) z odpowiednimi oznaczeniami Suchego Lodu (UN1845), zgodnie z instrukcjami IATA PI-650. </li>
 <li> Po otrzymaniu próbki są przechowywane w temperaturze od -65 °C do -95 °C do momentu analizy. </li>
</ol>
4. Rozmrażanie i analiza cytometryczna
<ol>
 <li> Wyjmij zabarwioną próbkę z zamrażarki i rozmroź ją w temperaturze pokojowej w ciemności przed pomiarem na cytometrze przepływowym. W przypadku pomiaru więcej niż jednej próbki, ustandaryzuj proces dla wszystkich probówek, wprowadzając rozstęp w rozmrażaniu, tak aby żadna z probówek nie pozostawała w temperaturze pokojowej dłużej niż 1 hr. </li>
 <li> Próbki należy analizować przy użyciu cytometru przepływowego z czterema laserami wyposażonego w odpowiednie filtry, takiego jak BD LSR II. Do gromadzenia danych należy zastosować standardowe metody kalibracji cytometru oraz kompensacji fluorescencji 4.</li>
</ol>
 Uwaga: Podczas zbierania danych nie należy ustawiać progów dla rozproszenia światła przedniego (forward scatter) ani bocznego (side scatter) 5. Kuleczki Trucount mogą znajdować się poniżej najniższego możliwego ustawienia progu dla tych parametrów, co spowodowałoby pominięcie części kuleczek podczas analizy. Jeśli instrument wymaga ustawienia progu, należy ustawić najniższy możliwy próg dla kanału Am Cyan. Ponieważ leukocyty CD45+ barwione tym panelem będą dodatnie w kanale Am Cyan, a kuleczki Trucount również fluorescują w tym kanale, powinno to zapewnić właściwe zebranie wszystkich istotnych danych. 
 <ol start="3">
 <li> Przed nałożeniem na cytometr przepływowy wymieszaj próbkę w probówce na wirówce typu vortex przez 5 sec. Kuleczki Trucount wykazują silną fluorescencję w wielu kanałach. Podczas pomiaru wyznacz bramkę dla kuleczek, identyfikując populację silnie dwudodatnią dla PE Cy5 i APC (dwa kolory, które najłatwiej odróżniają kuleczki od komórek, mogą się różnić w zależności od aparatury). Wybierz bramkę kuleczek jako bramkę stopu i rejestruj dane do momentu pozyskania co najmniej 20 000 kuleczek. </li>
 <li> Przeanalizuj dane przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, np. FlowJo (Treestar; Ashland, OR). Rysunek 1 przedstawia schemat bramkowania wykorzystany do analizy różnych populacji leukocytów z reprezentatywnego pobrania krwi kontrolnej. </li>
</ol>
5. Obliczenia Trucount
<ol>
 <li>Każda probówka Trucount zawiera liofilizowany osad kulek fluorescencyjnych. Po dodaniu cieczy do probówki i wymieszaniu na wortexie, kulki powinny zostać równomiernie rozłożone w całej próbce. Liczba kulek w osadzie nieznacznie różni się w zależności od numeru partii i jest podana na worku do przechowywania probówek. </li>
 <li>Należy wyznaczyć bramki dla kulek Trucount oraz populacji komórek, jak pokazano na Rysunku 1, aby określić liczbę zdarzeń dla każdej populacji. Porównanie liczby zdarzeń w bramce kulek z całkowitą liczbą kulek pierwotnie znajdujących się w probówce pozwoli określić stosunek pobranej próbki, co następnie można wykorzystać do obliczenia bezwzględnego stężenia (t.j. komórek/μl) dla każdej populacji. W tym celu można zastosować następujące równanie: Stężenie komórek (# komórek/μl krwi pełnej)= [# zdarzeń populacji/(# zdarzeń kulek/# całkowitych kulek w osadzie)]/100 μl. </li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1.jpg" alt="Wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające strategię bramkowania podzbiorów komórek odpornościowych. Panele A-D, wizualizacja markerów CD." fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat bramkowania wykorzystany do analizy głównych populacji leukocytów, przedstawiający reprezentatywne dane od zdrowego ochotnika. A) Kuleczki Trucount (i) są bramkowane i wykluczane z populacji komórek. Wyodrębniono granulocyty (ii), a limfocyty i monocyty podzielono na 3 populacje: limfocyty CD14 negatywne (iii), wszystkie komórki CD14 negatywne (iv) oraz nie-limfocyty (v). B) Limfocyty CD14 negatywne są bramkowane w celu rozróżnienia limfocytów T CD4+ (vi), limfocytów T CD8+ (vii), limfocytów B (viii), komórek NK CD56 bright (ix), komórek NK CD56 dim (x) oraz komórek NK CD56 negatywnych (xi). C) Wszystkie komórki CD14 negatywne są bramkowane w celu rozróżnienia mieloidalnych (xii) i plazmacytoidalnych (xiii) komórek dendrytycznych. D) Nie-limfocyty są bramkowane w celu rozróżnienia monocytów nieklasycznych (xiv), pośrednich (xv) i klasycznych (xvi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4302/4302fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
Bardziej specyficzne subpopulacje komórek, które nie zostały przedstawione na Rysunku 1 (np. komórki NKT lub neutrofile), mogą być również rozróżnione przy użyciu prezentowanego przez nas panelu, a schemat bramkowania można rozszerzyć lub zmodyfikować w zależności od konkretnych potrzeb badania. Niektóre przedstawione kroki bramkowania są specyficzne dla tej metody. Warto zauważyć, że wokół kulek Trucount wyznacza się bramkę włączenia i bramkę wykluczenia, które są nałożone na siebie – jedna służy do bramkowania kulek w celu ich przeliczenia, a druga do wykluczenia kulek z analizy komórkowej (Rysunek 1A). Ponadto, ponieważ limfocyty, monocyty i granulocyty nie są tak łatwo rozróżnialne w krwi pełnej, jak w mononuklearnych komórkach krwi obwodowej za pomocą rozpraszania przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter), często konieczne jest bramkowanie tych komórek z wykorzystaniem ekspresji CD45 i rozpraszania bocznego (Rysunek 1A). Zanieczyszczające granulocyty (zakreślone okręgiem), których nie udało się oddzielić od limfocytów i monocytów za pomocą CD45 i rozpraszania bocznego, są na niektórych wykresach rozróżnialne dzięki wysokiej ekspresji CD16 (Rysunek 1C i Rysunek 1D). Liczba zanieczyszczających granulocytów jest zazwyczaj niewielka i nie zakłócają one bramkowania monocytów i komórek NK.

<ol><li>Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryobiology+of+rat+and+human+dendritic+cells%3A+preservation+and+destruction+of+membrane+integrity+by+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing.</a> Cryobiology. 27, 269-278 (1990).</li>
<li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors%3A+implications+for+multicenter+clinical+trials.+The+ACTG+Immunology+Advanced+Technology+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).</li>
<li>Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+granulocytes%3A+study+of+granulocyte+function+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure.</a> Blood. 56, 237-245 (1980).</li>
<li>Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assurance+for+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quality assurance for polychromatic flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).</li>
<li>Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+methods+for+assessing+absolute+numbers+of+cell+subsets+in+blood.+European+Working+Group+on+Clinical+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis.</a> Cytometry. 42, 327-346 (2000).</li>
<li>Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+blood+processing+parameters+for+optimal+detection+of+cryopreserved+antigen-specific+responses+for+HIV+vaccine+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials.</a> J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).</li>
<li>Kantor, A. B., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKantor%2C+AB+%22The+handbook+of+Experimental+Immunology%22">The handbook of Experimental Immunology</a>. Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. 43, 1-49 (1996).</li>
<li>Hulspas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+the+stability+of+phycoerythrin-tandem+dye+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates.</a> Cytometry A. 75, 966-972 (2009).</li>
<li>Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+APC-tandem+dyes+are+degraded+through+a+cell-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism.</a> Cytometry A. 75, 882-890 (2009).</li>
<li>Mandy, F., Brando, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+absolute+cell+counts+using+immunophenotypic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6(2001).</li>
<li>Vuckovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dendritic+cells+in+clinical+practice+using+a+new+whole+blood+single-platform+TruCOUNT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay.</a> J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).</li>
<li>Lichtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+dendritic+cells+and+interferon-alpha+production+in+patients+with+tuberculosis%3A+correlation+with+clinical+outcome+and+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response.</a> Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).</li>
<li>Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+analysis+of+dendritic+cell+subsets%3A+the+dendritogram%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram.</a> Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym raporcie przedstawiamy metodę opartą na kuleczkach do wyliczania populacji leukocytów w świeżej krwi pełnej za pomocą cytometrii przepływowej oraz omawiamy parametry niezbędne do jej zastosowania w wieloośrodkowym badaniu klinicznym z centralną analizą próbek. Metoda ta opiera się na protokole BD Trucount i go optymalizuje, umożliwiając jego niezawodne zastosowanie w warunkach wieloośrodkowego badania klinicznego. Test barwienia jest prosty i trwa około 45 minut, co sprawia, że może być on wykonywany przez t...

<table><tbody><tr><td>Probówki do zliczania bezwzględnego Trucount</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>10X roztwór lizujący do FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Kategoria B &amp;System transportu zwolnionego z przepisów ADR, izolowany</td><td>Saf-T-Pak</td><td>STP-320</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-CD45 AmCyan </td><td>BD Biosciences</td><td>339192</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-CD3 znakowane FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>349201</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne CD8 PerCp-Cy 5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>341051</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne CD4 znakowane Alexa Fluor 700 </td><td>BD Biosciences</td><td>557922</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne przeciwko ECD HLA-DR </td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3636</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-CD14 v450 </td><td>BD Biosciences</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-CD19 znakowane PE </td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne CD16 APC-H7 </td><td>BD Biosciences</td><td>560195</td><td></td></tr><tr><td> przeciwciało monoklonalne CD56 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>335791</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-CD11c znakowane APC </td><td>BD Biosciences</td><td>559877</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne CD123 PE-Cy5 </td><td>BD Biosciences</td><td>551065</td><td></td></tr></tbody></table>

wyliczanie głównych populacji leukocytów krwi obwodowej w wieloośrodkowych badaniach klinicznych z wykorzystaniem analizy fenotypowej krwi pełnej

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Kriokonserwacja leukocytów krwi obwodowej jest szeroko stosowana w celu zachowania komórek do oceny odpowiedzi immunologicznej w badaniach klinicznych i oferuje wiele zalet w zakresie łatwości oraz standaryzacji ocen immunologicznych, jednak w przypadku niektórych subpopulacji komórek, takich jak granulocyty, limfocyty B i komórki dendrytyczne, zaobserwowano szkodliwe skutki tego procesu 1-3. Analiza świeżych leukocytów daje dokładniejszy obraz stanu komórek in vivo, ale często jest trudna do przeprowadzenia w kontekście dużych badań klinicznych. Testy na świeżych komórkach zależą od zaangażowania i ram czasowych ochotników, a jeśli są czasochłonne, ich zastosowanie może być niepraktyczne ze względu na godziny pracy wymagane od personelu laboratoryjnego. Dodatkowo, gdy badania są prowadzone w wielu ośrodkach, laboratoria dysponujące zasobami i szkoleniem niezbędnym do przeprowadzenia analiz mogą nie znajdować się w wystarczającej bliskości od ośrodków klinicznych. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy 11-kolorowy panel barwienia przeciwciałami, który może być stosowany z probówkami Trucount (Becton Dickinson; San Jose, CA) do fenotypowania i zliczania głównych populacji leukocytów we krwi obwodowej, dostarczając bardziej rzetelnych informacji specyficznych dla typów komórek niż badania takie jak morfologia krwi (CBC) lub analizy z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych paneli przeznaczonych do probówek Trucount, które barwią tylko kilka typów komórek. Procedura barwienia jest prosta, wymaga jedynie 100 μl świeżej krwi pełnej i trwa około 45 minut, co czyni ją wykonalną dla standardowych laboratoriów przetwarzających krew. Została ona zaadaptowana z karty danych technicznych probówek BD Trucount (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">wersja 8/2010</a>). Koktajl przeciwciał barwiących można przygotować wcześniej w dużych ilościach w centralnym laboratorium analitycznym i wysłać do laboratoriów przetwarzających w poszczególnych ośrodkach. Zabarwione probówki można utrwalić i zamrozić w celu wysyłki do centralnego laboratorium analitycznego w celu przeprowadzenia wielokolorowej cytometrii przepływowej. Dane uzyskane z tego panelu barwiącego mogą być wykorzystane do śledzenia zmian w stężeniach leukocytów w czasie w odniesieniu do interwencji i mogą być łatwo rozwinięte w celu oceny stanów aktywacji specyficznych, interesujących typów komórek. W niniejszym raporcie prezentujemy procedurę stosowaną przez techników laboratoriów przetwarzających krew do barwienia świeżej krwi pełnej oraz kroki niezbędne do analizy tych zabarwionych próbek w centralnym laboratorium analitycznym wspierającym wieloośrodkowe badanie kliniczne. Film szczegółowo przedstawia procedurę wykonywaną w kontekście pobrania krwi do badania klinicznego w ramach HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

W niniejszym raporcie przedstawiamy etapy barwienia i analizy w badaniu fenotypowania przeprowadzonym na świeżej krwi pełnej w celu zliczenia głównych populacji leukocytów wrodzonych i adaptacyjnych. Kładziemy szczególny nacisk na kwestie związane z wykonywaniem tych procedur w kontekście wieloośrodkowego badania klinicznego.

Wyliczanie głównych populacji leukocytów krwi obwodowej w wieloośrodkowych badaniach klinicznych z wykorzystaniem analizy fenotypowej krwi pełnej

Kriokonserwacja leukocytów krwi obwodowej jest powszechnie stosowana w celu zachowania komórek do oceny odpowiedzi immunologicznej w badaniach klinicznych i oferuje wiele...

W niniejszym filmie opisano procedurę opracowaną przez HIV Vaccine Trials Network w Fred Hutchinson Cancer Research Center dotyczącą barwienia świeżej krwi pełnej w wieloośrodkowych badaniach klinicznych w celu analizy w laboratorium centralnym. Procedura wykorzystuje probówki tru count firmy Becton Dickinson biosciences, z których każda zawiera liofilizowany granulat, który rozpuszcza się podczas przygotowywania próbki, uwalniając znaną liczbę fluorescencyjnych kuleczek. Do barwienia markerów powierzchniowych specyficznych dla różnych populacji komórek zastosowano przeciwciała fluorescencyjne.Liczbę komórek w tych różnych populacjach można porównać z liczbą kulek fluorescencyjnych podczas analizy cytometrycznej, co pozwala na monitorowanie w czasie bezwzględnych stężeń różnych populacji leukocytów w krwi pełnej w odniesieniu do interwencji. Dzień dobry, nazywam się Erica Anderson Nissan i jestem naukowcem w HIV Vaccine Trials Network. Procedura, którą zaraz Państwo obejrzycie, została opracowana przez nas do zastosowania w wieloośrodkowych badaniach klinicznych.W tych badaniach technicy laboratorium przetwarzania krwi otrzymują próbki świeżej krwi pełnej, barwią je przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie, a następnie przesyłają próbki do scentralizowanego laboratorium zdolnego do ich analizy za pomocą cytometru przepływowego. Świeża krew pełna często nie jest analizowana w ramach badań klinicznych ze względu na koszty i kwestie wykonalności, jednak opracowaliśmy panel barwienia pojedynczym przeciwciałem, który pozwala zidentyfikować główne populacje leukocytów we krwi obwodowej, a barwienie tych populacji trwa mniej niż 45 minut, co czyni tę metodę wykonalną do zastosowania w badaniach klinicznych. W HVTN używamy tego panelu do zrozumienia wczesnych zdarzeń występujących po szczepieniu kandydackimi szczepionkami przeciwko HIV, jednak panel PI może zostać dalej zmodyfikowany, aby skupić się na typach komórek interesujących poszczególnych badaczy. Bardzo dziękujemy za oglądanie i mamy nadzieję, że będzie to dla Państwa użyteczne w przyszłości.Tabela 1 przedstawia 11-kolorowy panel barwień przeciwciałami opracowany w celu fenotypowania i zliczania głównych populacji leukocytów we krwi obwodowej. Koktajl przeciwciał jest przygotowywany przez centralne laboratorium analityczne i przesyłany do laboratoriów przetwarzających, aby zapewnić spójność między ośrodkami oraz umożliwić przetestowanie koktajli na kontrolnej próbce krwi przed ich użyciem do barwienia próbek z badania. Każde przeciwciało sprzężone z fluoresceincją jest miareczkowane osobno, a następnie przeciwciała są łączone przy użyciu odpowiednich mian w jedną mieszaninę z buforem do płukania w cytometrii przepływowej, zawierającym PBS z dodatkiem 2% podgrzanego i aktywowanego płodowej surowicy bydlęcej.Koktajl przeciwciał jest oznaczony numerem serii oraz datą ważności i przesyłany z centralnego laboratorium analitycznego do laboratoriów procesowych w systemie opakowań utrzymującym temperaturę 4 °C podczas transportu. Po otrzymaniu panel barwiący przeciwciałami może być przechowywany w temperaturze 4 °C w ciemności do ośmiu tygodni. Roztwór do lizy BD fax slicing jest stosowany po barwieniu w celu lizy erytrocytów i utrwalenia barwienia przeciwciałami przy jednoczesnym zachowaniu leukocytów.Roztwór otrzymuje się od producenta w stężeniu 10 x, a centralne laboratorium analityczne rozcieńcza go w stosunku 1:10 wodą dejonizowaną. Rozcieńczony roztwór zostaje następnie oznakowany numerem partii oraz datą ważności i po otrzymaniu wysłany do laboratoriów przetwórczych w temperaturze otoczenia. Roztwór do wypełniania (lacing solution) do badania Fax przechowuje się w temperaturze pokojowej od 15 do 30 stopni Celsjusza przed pobraniem krwi do barwienia w celu dokładnego zliczenia.Laboratorium przetwarzające musi upewnić się, że wszystkie odpowiednie odczynniki zostały pobrane z centralnego laboratorium analitycznego. Należą do nich probówki BD TRU count, łączony panel barwienia przeciwciałami oraz jeden zestaw roztworu licencyjnego fax. HVTN wykorzystuje system zarządzania danymi laboratoryjnymi do rejestrowania wszystkich istotnych informacji dla każdej próbki.Unikalny kod identyfikacyjny jest drukowany na etykiecie, która zostaje umieszczona na probówce do zliczania rzeczywistego. Aby śledzić próbkę w trakcie całego procesu, należy opisać probówkę kriogeniczną w celu identyfikacji barwionej próbki. Zazwyczaj obejmuje to identyfikator pacjenta lub ochotnika, identyfikator wizyty oraz datę pobrania krwi; należy odmierzyć wymaganą ilość krwi do opisanej probówki kriogenicznej, stosując technikę aseptyczną.Ilość krwi wykorzystywanej do barwienia zależy od stosowanego panelu barwień, ale zazwyczaj wynosi 50 lub 100 µL na panel. Probówka kriogeniczna może być następnie odstawiona na maksymalnie cztery godziny w temperaturze pokojowej przed barwieniem. W pozostałej części krwi przeprowadza się procedury bardziej wrażliwe na czas.Należy sprawdzić, czy na dnie probówki znajduje się nienaruszony osad kulek, a następnie oznakować probówkę tru count. Wraz z odpowiednimi informacjami o próbce należy zapisać numery partii i daty ważności wszystkich odczynników. Arkusze robocze są przydatne do śledzenia tych informacji w trakcie badania klinicznego.Liczba kulek oraz numer partii probówek tru count znajdują się na przodzie opakowania probówek tru count. Przed rozpoczęciem procesu barwienia tru Count należy upewnić się, że wszystkie materiały i odczynniki są przygotowane do użycia w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Należą do nich: probówka z aliquotą krwi oznaczona jako probówka z panelem barwienia przeciwciał łączonych tru count, roztwór 1x fax lacing, mikropipety 200 µL i 1000 µL wraz z końcówkami do pipet, folia do wybielania, folia laboratoryjna oraz minutnik do użycia po barwieniu.Będzie również potrzebne pudełko na zabarwione preparaty, jednak nie musi ono znajdować się w dygestorium. Ilość krwi i przeciwciał zależy od tego, które komórki są rozróżniane przez panel oraz ile komórek jest wymaganych do przeprowadzenia prawidłowej analizy. Każdy panel jest testowany na próbkach kontrolnych w celu ustalenia optymalnej ilości krwi do zabarwienia; ilość użytych przeciwciał jest równa ilości krwi wykorzystanej dla panelu przedstawionego w tym filmie.Przed pipetowaniem należy odmierzyć 100 µL krwi i 100 µL przeciwciała. Wymieszać krew, delikatnie odwracając probówkę kilkakrotnie, a następnie kilkakrotnie ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby dodatkowo zapewnić dokładne wymieszanie krwi.Następnie, używając techniki odwrotnego pipetowania, precyzyjnie przenieś krew pełną z alikwotu do probówki tru count, dozując ją tuż nad metalnym uchwytem. Unikaj rozmazywania krwi na ściankach probówki. Wymień końcówkę pipety pomiędzy każdą probówką tru count.Nadszedł czas na zabarwienie krwi za pomocą panelu przeciwciał przed pipetowaniem. Wymieszaj panel barwiący, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół kilka razy. Dodaj 100 µl mieszaniny przeciwciał do krwi w probówce true count.W tym kroku nie należy stosować pipetowania zwrotnego, aby nie zmarnować cennego odczynnika. Zamknąć probówkę i wymieszać na wirówce typu vortex z niską prędkością przez około 15 sekund. Należy upewnić się, że osad z kulek został całkowicie rozpuszczony.Przykryj probówkę folią i ustaw czasomierz na 15 minut barwienia krwi. Ilość potrzebnego 1x roztworu do lizy FAX jest dziewięciokrotnością ilości krwi użytej w analizie, zatem w tym przykładzie stosuje się 900 µL 1x roztworu do lizy FAX. Po 15 minutowej inkubacji dodaj 900 µL 1x roztworu do lizy FAX do zbarwionej krwi, aby utrwalić barwienie i zlizować erytrocyty.Na tym etapie nie ma potrzeby stosowania pipetowania odwrotnego. Należy zakręcić probówkę i mieszać ją na wirówce typu vortex z niską prędkością przez około 15 sekund. Mocno dociśnij zakrętkę do pozycji blokady i uszczelnij.Z folią laboratoryjną. Próbówki należy przechowywać w ciemnym pudełku lub całkowicie owinięte w folię w temperaturze od -65 do -95 °C do momentu ich wysłania do centralnego laboratorium analitycznego. Dotychczasowe badania wykazały, że próbki są stabilne do czterech tygodni w tej temperaturze; próbki barwione muszą być wysyłane jako substancje biologiczne kategorii B zgodnie z wytycznymi Międzynarodowego Zrzeszenia Przewoźników Powietrznych (IATA).Zgodnie z przepisami HVTN próbki są wysyłane co tydzień z laboratoriów przetwórczych do centralnego laboratorium analitycznego przy użyciu izolowanego systemu transportowego firmy Safety Pack Inc., który został zaprojektowany specjalnie w celu spełnienia tych wymogów. Korzystając z tego systemu, należy umieścić wewnętrzne brązowe pudełko w styropianowej skrzyni, mocując je w zagłębieniu, aby zapobiec przesuwaniu. Skrzynię należy całkowicie wypełnić suchym lodem i odczekać od 5 do 10 minut, aby pudełko ostygło.Aby przygotować preparaty do wysyłki, należy całkowicie owinąć każdą probówkę folią i umieścić je w pudełku na barwione preparaty. W szczelnym worku polietylenowym należy umieścić materiał chłonny oraz pudełko z barwionymi preparatami. Należy usunąć nadmiar powietrza z worka i szczelnie go zamknąć.Umieść szczelną torbę polietylenową wewnątrz torby Tyvek. Ponownie usuń całe powietrze z torby przed jej zamknięciem. Umieść opakowanie z próbką w wewnętrznym brązowym pudełku i szczelnie zamknij pokrywę styropianowej skrzyni.Mocno zaklej taśmą pudełko transportowe i wyślij jako substancję biologiczną kategorii B, stosując odpowiednie oznakowania dotyczące suchego lodu. Postępuj zgodnie z instrukcjami I ATA PI six 50 w wieloośrodkowych badaniach klinicznych. Ważne jest monitorowanie próbek na etapach krótkoterminowego przechowywania, transportu oraz długoterminowego przechowywania.System zarządzania danymi wykorzystywany przez HVTN umożliwia utworzenie manifestu wysyłkowego, który może zostać zaimportowany do bazy danych próbek w centralnym laboratorium analitycznym, gdzie próbki będą przechowywane i analizowane. Tworzy to zapis tego, kiedy próbki zostały wysłane i odebrane, gdzie zostały ostatecznie zmagazynowane oraz kiedy zostały pobrane. W celu przeprowadzenia analizy należy wyjąć próbkę do barwienia z zamrażarki i rozmrozić ją w temperaturze pokojowej w ciemnym pudełku.Przygotowanie należy przeprowadzić nie wcześniej niż godzinę przed pomiarem na cytometrze przepływowym. W przypadku zbierania danych z wielu próbek należy rozłożyć proces rozmrażania w czasie, aby probówki nie pozostawały w temperaturze pokojowej dłużej niż godzinę. Próbki należy analizować przy użyciu cytometru przepływowego z czterema laserami, wyposażonego w odpowiednie filtry, np. BD LSR II. Jeśli instrument tego wymaga, należy zastosować standardowe metody kalibracji cytometru i kompensacji fluorescencji podczas zbierania danych. Aby ustawić próg (threshold), należy wybrać najniższą możliwą wartość progu dla kanału AmCyan. Przed załadowaniem na cytometr probówkę z próbką należy wstrząsnąć w wirówce (vortex) przez 5 s.Kulek do zliczania absolutnego (tru count beads) wykazują silną fluorescencję w wielu kanałach. Podczas zbierania danych wyznacz bramkę dla kulek, identyfikując populację silnie podwójnie dodatnią. W przypadku PE SCI five oraz PC należy zauważyć, że dwa kolory, które najłatwiej pozwalają odróżnić kulki od komórek, mogą się różnić w zależności od aparatury.Wybierz bramkę kulek TruCount jako bramkę stopu i rejestruj dane do momentu zebrania co najmniej 20 000 kulek. Przeanalizuj dane przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, takiego jak FlowJo. Teraz omówimy schemat bramkowania wykorzystany do analizy głównych populacji leukocytów na podstawie danych z reprezentatywnej próbki krwi kontrolnej.Za pomocą tego panelu można wyróżnić również bardziej specyficzne podgrupy komórek, takie jak komórki NKT lub neutrofile, jednak nie zostaną one przedstawione w tym przykładzie. Najpierw wokół kuleczek tru count rysuje się bramkę włączającą (inclusion gate) oraz bramkę wykluczającą (exclusion gate), nakładając je na siebie – jedną w celu wyodrębnienia kuleczek do zliczenia, a drugą w celu wykluczenia kuleczek z analizy komórkowej. Następnie dane komórkowe z wykluczonymi kuleczkami są poddawane bramkowaniu, aby uwzględnić tylko pojedyncze komórki, wykorzystując parametr wysokości rozproszenia przedniego (forward scatter height) w stosunku do powierzchni rozproszenia przedniego (forward scatter area).Bramka ta wyklucza również niewielkie zanieczyszczenia. Następnie wyznacza się bramkę dla komórek CD 45 dodatnich, oddzielając granulocyty od limfocytów i monocytów za pomocą rozproszenia bocznego. Limfocyty i monocyty są następnie podzielone na trzy oddzielne grupy przy użyciu CD 14 oraz rozproszenia bocznego.Obejmują one limfocyty CD 14 negatywne, wszystkie komórki CD 14 negatywne oraz nie-limfocyty z bramki komórek limfocytów CD 14 negatywnych; są one najpierw podzielone na trzy grupy: CD 3 pozytywne CD 19 negatywne, CD 3 negatywne CD 19 pozytywne oraz CD 3 negatywne CD 19 negatywne. Limfocyty T są bramkowane z bramki CD 3 pozytywnych CD 19 negatywnych. Po wykluczeniu komórek CD 56 pozytywnych i CD 16 pozytywnych można wyróżnić limfocyty T CD 4 pozytywne i CD 8 pozytywne. Limfocyty B są bramkowane z bramki CD 3 negatywnych CD 19 pozytywnych po wykluczeniu komórek CD 56 pozytywnych i CD 16 pozytywnych, natomiast komórki NK są bramkowane z bramki CD 3 negatywnych CD 19 negatywnych.Po wykluczeniu potencjalnie zanieczyszczających monocytów za pomocą markerów CD 11 C i CD 4, komórki NK są dzielone na populacje CD 56 bright, CD 56 dim oraz CD 56 negative. W celu wyodrębnienia populacji komórek dendrytycznych, wszystkie komórki CD 14 negative są bramkowane, aby wykluczyć komórki CD 3 positive, CD 19 positive, CD 56 positive oraz CD 16 positive. Następnie bramkowane są komórki HLA-DR positive, a mieloidalne komórki dendrytyczne i plazmacytoidalne komórki dendrytyczne można rozróżnić na podstawie ekspresji CD 11 C i CD 1 23.Na koniec, z bramki nie-limfocytów wyodrębnia się podgrupy monocytów po wykluczeniu potencjalnie zanieczyszczających komórek CD 56 pozytywnych, CD 3 pozytywnych oraz CD 19 pozytywnych. Monocyty nieklasyczne, pośrednie i klasyczne są rozróżniane na podstawie ekspresji CD 16 i CD 14. Po wyznaczeniu interesujących populacji można obliczyć ich stężenia.Porównanie liczby zdarzeń w bramce kulek do całkowitej liczby kulek pierwotnie znajdujących się w probówce pozwoli na określenie stosunku zebranego materiału, co może następnie posłużyć do wyznaczenia stężenia bezwzględnego komórek na mikrolitr dla każdej populacji. W tym celu można zastosować przedstawione tutaj równanie.W niniejszym filmie zaprezentowaliśmy procedurę stosowaną przez techników laboratorium przetwarzania krwi w celu wykonania barwienia świeżej krwi pełnej oraz etapy analizy tych zabarwionych próbek w centralnym laboratorium analitycznym. W kontekście wieloośrodkowego badania klinicznego wykazaliśmy, że badanie jest proste i ma stosunkowo krótki czas trwania, co umożliwia technikom laboratorium przetwarzania krwi jego przeprowadzenie, a następnie zamrożenie i przesłanie próbek do głównego laboratorium analitycznego w celu analizy. Kluczem do uzyskania dokładnych i spójnych wyników jest staranna standaryzacja krytycznych etapów protokołu oraz wykorzystanie systemu dokumentacji, który monitoruje wszystkie kroki, tak aby wszelkie wykryte anomalie można było wywieść do ich źródła.Dane uzyskane z tego panelu barwień mogą być wykorzystane do śledzenia zmian w stężeniach leukocytów w czasie i mogą zostać łatwo rozwinięte w celu oceny stanów aktywacji konkretnych, interesujących badacza typów komórek.

enumeration-major-peripheral-blood-leukocyte-populations-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wyliczenie głównych populacji leukocytów krwi obwodowej dla wieloośrodkowych badań klinicznych z wykorzystaniem testu fenotypowań krwi pełnej

Opracowano zautomatyzowane urządzenie mikroprzepływowe do wzbogacania krążących komórek z jądrem z krwi obwodowej poprzez lizę erytrocytów, co zapewnia izolację wysokiej jakości próbki bez utraty komórek.

Zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi w celu wzbogacenia frakcji krążących komórek jądrzastych

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Ten film demonstruje technikę opartą na cytometrii przepływowej wykorzystującą dwa fluorochromy do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po inkubacji komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko markerom powierzchniowym, podzbiory komórek są identyfikowane przy użyciu optymalnej strategii bramkowania cytometrycznego przepływu.

Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Immunofenotypowanie krwi pełnej jest niezbędne do monitorowania ludzkiego układu odpornościowego. Jednak liczba wymaganych odczynników i niestabilność określonych fluorochromów w wstępnie zmieszanych koktajlach wymaga codziennego przygotowywania odczynników. Tutaj pokazujemy, że półautomatyczne przygotowanie koktajlu przeciwciał barwiących pomaga ustalić wiarygodne immunofenotypowanie poprzez zminimalizowanie zmienności w dozowaniu odczynników.

Półautomatyczne podejście do przygotowywania koktajli przeciwciał do analizy immunofenotypowej ludzkiej krwi obwodowej

Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzowania podzbiorów monocytów za pomocą cytometrii przepływu krwi pełnej. Obejmuje to nakreślenie, w jaki sposób bramkować podzbiory i oceniać ich ekspresję markerów powierzchniowych oraz podanie przykładu oceny ekspresji markerów M1 (zapalnych) i M2 (przeciwzapalnych).

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Ten protokół szczegółowo opisuje klinicznie możliwe do wdrożenia przygotowanie wysokiej jakości PBMC i biopróbek osocza w ośrodku badań klinicznych, które mogą być wykorzystane do translacyjnej analizy biomarkerów.

Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów

Protokół pomiaru leukocytów krwi obwodowej za pomocą analizatora leukocytów opartego na karcie POCT jest przedstawiony tutaj. Te same próbki krwi zostały przebadane przez dwa automatyczne analizatory hematologiczne w celu oceny spójności i dokładności wyników. Wyniki pokazały, że oceniany analizator miał dobrą korelację z układem referencyjnym.

Ocena analizatora przyłóżkowego do pomiaru leukocytów krwi obwodowej

Aby skutecznie badać funkcje populacji komórek odpornościowych, często konieczna jest ich puryfikacja. Usuwanie dopełniacza jest szybką i niedrogą techniką izolacji populacji komórek odpornościowych o wysokiej czystości.

Deplecja specyficznych populacji komórek poprzez deplecję dopełniacza

Poznaj metodę fenotypowania leukocytów w pełnej krwi obwodowej z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i rurek TruCount. Standaryzowana procedura umożliwia dokładne liczenie populacji komórek w wieloośrodkowych badaniach klinicznych.

Liczenie głównych populacji leukocytów krwi obwodowej do wieloośrodkowych badań klinicznych z wykorzystaniem testu fenotypowania krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal

Wyliczanie głównych populacji leukocytów krwi obwodowej w wieloośrodkowych badaniach klinicznych z wykorzystaniem analizy fenotypowej krwi pełnej

Przeglądaj więcej filmów