Name: Monitorowanie replikacji plazmidu w żywych komórkach ssaków przez wiele pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Poznaj metodę obserwacji replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków przez wiele pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia śledzenie zachowania DNA podczas podziałów komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantów NIH oraz ACS, w tym T32CA009135, CA133027, CA070723 oraz CA022443. Bill Sugden jest profesorem badawczym American Cancer Society.

1. Inżynieria komórek z plazmidami widocznymi
<ol>
	<li>Należy zastosować standardowe techniki trawienia restrykcyjnego lub rekombinacji homologicznej, aby wprowadzić do wizualizowanego plazmidu fragment DNA zawierający około 250 kopii sekwencji operatora laktozy (LacO). Nasz plazmid był BACmid o wielkości około 170 kbp, zawierał cały genom wirusa herpes powiązanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV) i kodował oporność na hygromycynę 12.</li>
	<li>DNA plazmidu zawierającego LacO należy wprowadzić do komórek ssaków poprzez transfekcję przy użyciu Lipofectamine 2000. Transfekcję komórek HeLa i SLK w szalkach 60 mm przeprowadzono przez 4 hr, stosując 10 μg oczyszczonego DNA plazmidowego z 25 μl Lipofectamine 2000, 0,5 ml OptiMEM i 3,5 ml DMEM.</li>
	<li>Należy wymienić pożywkę hodowlaną na 5 ml DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą i inkubować komórki przez 48 hr.</li>
	<li>Komórki należy wysiać przy niskiej gęstości w dużych szalkach i hodować w pożywce zawierającej antybiotyk selekcyjny dla wprowadzonego plazmidu; selekcję komórek przeprowadzano w DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą i 300 μg/ml hygromycyny przez 3 tygodnie.</li>
	<li>Do przeniesienia kolonii opornych na hygromycynę do nowych szalek hodowlanych należy użyć kawałków sterylnego papieru filtracyjnego nasączonego trypsyną.</li>
	<li>Gdy transfekowane klony urosną i wypełnią szalkę, należy wyizolować DNA do trawienia restrykcyjnego i Southern blottingu, aby upewnić się, że polimer plazmidu LacO jest homogeniczny i ma oczekiwaną wielkość.</li>
	<li>Jeśli plazmid nie został zaprojektowany do ekspresji białka fuzyjnego LacI, należy zainfekować odpowiednie klony retrowirusem kodującym represor laktozy (LacI) połączony z czerwonym białkiem fluorescencyjnym, takim jak LacI-tdTomato. Użyliśmy tdTomato zamiast białek fluorescujących w kolorze zbliżonym do zielonego, aby zminimalizować fototoksyczność, która wystąpiłaby przy wielokrotnych ekspozycjach przez dłuższy czas13.</li>
	<li>Po wprowadzeniu białka fuzyjnego LacI, komórki należy hodować w obecności 200 μg/ml izopropyl-b-D-tiogalaktosydu (IPTG), aby zablokować wiązanie białek fuzyjnych z DNA.</li>
	<li>Komórki należy hodować przez co najmniej 3 dni, aby umożliwić ekspresję białka LacI-tdTomato.</li>
	<li>Należy przeprowadzić przesiew klonów (poprzez wypłukanie IPTG i obserwację komórek zgodnie z opisem poniżej), aby wyłonić te z optymalnym poziomem LacI-tdTomato, które wykazują wyraźne sygnały przy minimalnym poziomie tła niezwiązanego białka fuzyjnego.</li>
</ol>
2. Opracowanie systemu obrazowania
Nasz system obrazowania składa się z mikroskopu Zeiss Axiovert 200M wyposażonego w zmotoryzowany stolik oraz obiektyw olejowy Plan-Aochromat 63x/1.4. Światło wzbudzenia fluorescencji jest dostarczane przez „neutralną białą” diodę LED systemu Colibri. Emisję wykrywa kamera CascadeII:1024 EMCCD. Jest to chłodzona kamera z utońszoną tylną ścianką i rejestrem wzmocnienia do amplifikacji sygnałów; prąd ciemny wynosi 0,061 elektronów na piksel na sekundę, a wydajność kwantowa jest większa niż 0,90. System jest sterowany za pomocą oprogramowania Axiovision 4.8, w tym modułu SmartExperiments. Do detekcji tdTomato używamy zestawu filtrów Zeiss 75HE, dla którego 85% światła przechodzącego może wzbudzić fluorofor, a 95% światła emitowanego przechodzi przez filtr emisyjny.
<ol>
	<li>Zmontuj system obrazowania składający się z mikroskopu odwróconego i kamery EMCCD do czułego wykrywania sygnałów, źródła światła LED do specyficznego wzbudzania i szybkiego przysłaniania, zmotoryzowanego stolika i ramienia ostrzenia oraz oprogramowania sterującego do zautomatyzowanego pozyskiwania obrazów w długich odstępach czasu z wieloma stosami z (z-stacks). System powinien spoczywać na stole pneumatycznym w celu izolacji od wibracji.</li>
	<li>Zmontuj inkubator nakładany na stolik, aby utrzymać komórki w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5-10% CO2 w nawilżonej komorze. Odczekaj wystarczający czas, aż system osiągnie stabilną temperaturę, aby zminimalizować artefakty ruchowe podczas eksperymentu.</li>
	<li>Zastosuj podgrzewaną obręcz dla obiektywu, aby zapobiec odprowadzaniu ciepła z próbki przez obiektyw.</li>
</ol>
3. Wizualizacja znakowanego DNA
<ol>
	<li>Wysiej komórki w szalku z szklanym dnem o średnicy 35 mm przy gęstości poniżej 10% konfluencji, co pozwoli parom komórek na podział w kolonie od 8 do 16 komórek bez ich nakładania się. Należy to zrobić co najmniej 24-48 hr przed obrazowaniem, aby żywe komórki miały czas na podział.</li>
	<li>Od jednej do trzech hr przed rozpoczęciem obrazowania przepłucz szalkę 3 razy pożywką hodowlaną pozbawioną zarówno leków selekcyjnych, jak i IPTG. Procedura ta usuwa nieżywe komórki i umożliwia białkom fuzyjnym LacI wiązanie się z miejscami LacO w plazmidach.</li>
	<li>Zastąp pożywkę hodowlaną 2 ml DMEM z 10% płodowej surowicy bydlęcej i 25 mM HEPES.</li>
	<li>Zastąp górną część szalki hodowlanej folią CultFoil rozpiętą w pierścieniu montażowym do szalek 35 mm. Przykrycie to zapobiegnie odparowywaniu pożywki hodowlanej, co z czasem zwiększyłoby stężenie soli i doprowadziło do śmierci komórek.</li>
	<li>Użyj obrazowania z kontrastem interferencyjnym (DIC), aby obejrzeć komórki i wyznaczyć płaszczyznę ogniskowania górnej i dolnej części komórek w wielu polach widzenia. W każdym polu przejdź do płaszczyzny ogniskowania znajdującej się mniej więcej 1/3 drogi od góry komórki. Zapisz współrzędne x, y, z na liście zapisanych pozycji stolika. 
	Uwaga: Sygnały plazmidowe mogą nie być widoczne przez okulary, gdy komórki są oświetlane diodami LED o długości fali odpowiedniej dla białka fuzyjnego LacI. Słabe sygnały mogą być widoczne jedynie przy użyciu kamery EMCCD, która umożliwia całkowanie sygnału w czasie, a tym samym skutecznie wzmacnia słabe sygnały.</li>
	<li>W oprogramowaniu sterującym mikroskopem zdefiniuj stos obrazów z (z-stack), który ma zostać wykonany w każdej zapisanej pozycji stolika. Wybierz wielkość kroku z wynoszącą 0.35-0.50 μm, co pozwoli na przybliżenie próbkowania Nyquista w wymiarze z14. Uwzględnij „dodatkowe” przekroje powyżej i poniżej płaszczyzn, w których znajdują się komórki; przekroje te umożliwiają detekcję po ruchach komórek podczas cyklu komórkowego i są również wykorzystywane w przetwarzaniu post-akwizycyjnym (dekonwolucji) stosów obrazów. Takie podejście zaowocuje stosem 40-60 obrazów, w zależności od grubości komórek.</li>
	<li>W oprogramowaniu sterującym mikroskopem zdefiniuj eksperyment z szeregiem czasowym, aby zbierać obrazy w jasnym polu dla stosów z w odstępach 30 min (do śledzenia podziałów i migracji komórek w długim czasie) oraz obrazy fluorescencyjne w odstępach 10-60 min (do wizualizacji plazmidów wewnątrz komórek). Nie używaj obrazowania DIC podczas eksperymentu, ponieważ wymaga ono więcej światła niż standardowe obrazowanie w jasnym polu, co może niepotrzebnie narażać komórki na fototoksyczność w trakcie długich eksperymentów.</li>
	<li>Uruchom sterowany programowo eksperyment. Upewnij się, że system nie jest zakłócany (np. przez wstrząsy, ekspozycję na nadmierne światło w pomieszczeniu) podczas trwania eksperymentu.</li>
	<li>W razie potrzeby uzupełnij wodę w systemie nawilżania w trakcie eksperymentu.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie obrazów po akwizycji
<ol>
	<li>Przejrzyj obrazy dla każdego stosu z (z-stack) oraz punktu czasowego. Wytnij zbędne obszary obrazów, aby skrócić czas przetwarzania komputerowego w następnym kroku.</li>
	<li>Użyj algorytmu dekonwolucji, aby przypisać intensywność sygnału z powrotem do piksela pochodzenia w każdym stosie z15. Choć dekonwolucja może opierać się na teoretycznej funkcji rozproszenia punktu (PSF) dla danego systemu obrazowania, zaleca się pomiar funkcji rozproszenia punktu dla konkretnego systemu poprzez obrazowanie fluorescencyjnych mikrosfer i wykorzystanie tego pomiaru w algorytmie dekonwolucji. Zmierzyliśmy funkcję rozproszenia punktu naszego systemu obrazowania i zastosowaliśmy ograniczony iteracyjny algorytm maksymalnej wiarygodności w oprogramowaniu AxioVision (opis oprogramowania AxioVision, Zeiss).</li>
	<li>Przeanalizuj obrazy, aby śledzić zmiany intensywności i ruchy plazmidów podczas cyklu komórkowego oraz podział plazmidów do komórek potomnych.</li>
</ol>

<ol><li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Chang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
<li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+Virology+2+volume+set%22">Fields Virology 2 volume set</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).</li>
<li>Adams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+latent+Epstein-Barr+virus+genomes+in+Raji+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells.</a> J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).</li>
<li>Humme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EBV+nuclear+antigen+1+%28EBNA1%29+enhances+B+cell+immortalization+several+thousandfold%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).</li>
<li>Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimal+replicator+element+of+the+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+terminal+repeat+supports+replication+in+a+semiconservative+and+cell-cycle-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner.</a> J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).</li>
<li>Yates, J. L., Guan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-derived+plasmids+replicate+only+once+per+cell+cycle+and+are+not+amplified+after+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells.</a> J. Virol. 65, 483-488 (1991).</li>
<li>Ye, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+latent+nuclear+antigen+leads+to+abortive+episome+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence.</a> J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).</li>
<li>Robinett, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).</li>
<li>Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coupling+of+synthesis+and+partitioning+of+EBV%27s+plasmid+replicon+is+revealed+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells.</a> Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).</li>
<li>Herndier, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+Kaposi%27s+sarcoma+cell+line+that+induces+angiogenic+tumors+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals.</a> Aids. 8, 575-581 (1994).</li>
<li>Zhou, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+infection+by+a+recombinant+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+cloned+in+a+bacterial+artificial+chromosome%3A+application+for+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis.</a> J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).</li>
<li>Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCannell%2C+MB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda może być wykorzystana do śledzenia plazmidów w żywych komórkach ssaków w czasie obejmującym wiele pokoleń. Poprzez ograniczenie ekspozycji na światło wzbudzenia, wykorzystaliśmy te techniki do śledzenia komórek od nowo podzielonych par aż po kolonie liczące 16-32 komórki, co reprezentuje co najmniej 72 hr i 3 podziały komórkowe. Eksperymenty te dostarczają informacji, których nie można uzyskać za pomocą analiz statycznych, takich jak ilościowy PCR, Southern blotting oraz FISH.
<p class="jove_cont...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>GIBCO</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>Sigma</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Sigma</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna</td><td>Calbiochem</td><td>400050</td><td>400 &amp;mu;g/ml dla SLK; 300 &amp;mu;g/ml dla HeLa</td></tr><tr><td>Izopropyl-b-D-tiogalaktozyd (IPTG)</td><td>Roche</td><td>10 724 815 001</td><td>Stężenie końcowe 200 &amp;mu;g/ml </td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Szalki z dnem szklanym</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>CultFoil</td><td>Pecon</td><td>000000-1116-08</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colibri</td><td>Zeiss</td><td>423052-9500-000</td><td></td></tr><tr><td>Neutralna biała dioda LED</td><td>Zeiss</td><td>423052-9120-000</td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtrująca 75 HE</td><td>Zeiss</td><td>489075-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw Plan-Apochromat 63x/1.4</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Kamera EMCCD CascadeII:1024</td><td>Photometrics</td><td>B10C892007</td><td></td></tr><tr><td>Tempcontrol mini</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>000000-1116-070</td><td></td></tr><tr><td>Tempcontrol 37-2 digital</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>000000-1052-320</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik CTI Controller 3700 digital</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>411856-9903</td><td></td></tr><tr><td>Grzałka obiektywu</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>440760-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka grzewcza stolika P</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>411861-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator nadstolikowy S</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>411860-9902-000</td><td></td></tr><tr><td>System nawilżający</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>000000-1116-065</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków na przestrzeni wielu pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Niewiele naturalnie występujących plazmidów jest utrzymywanych w komórkach ssaków. Wśród nich znajdują się genomy gamma-herpeswirusów, w tym wirus Epsteina-Barr (EBV) oraz herpeswirus związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV), które wywołują liczne nowotwory u ludzi 1-3. Te dwa genomy replikują się w sposób licencjonowany, przy czym każdy z nich wykorzystuje pojedyncze białko wirusowe oraz komórkowy aparat replikacyjny, i są przekazywane komórkom potomnym podczas podziału komórki, pomimo braku tradycyjnych centromerów 4-8.
Przeprowadzono wiele badań w celu scharakteryzowania replikacji tych genomów plazmidowych przy użyciu takich metod jak Southern blotting oraz fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH). Metody te mają jednak swoje ograniczenia. Ilościowy PCR i Southern blotting dostarczają informacji o średniej liczbie plazmidów na komórkę w populacji komórek. FISH jest testem jednokomórkowym, który ujawnia zarówno średnią liczbę, jak i rozkład plazmidów na komórkę w populacji, lecz jest on statyczny, co uniemożliwia uzyskanie informacji o komórce macierzystej lub potomstwie badanej komórki.
W niniejszej pracy opisujemy metodę wizualizacji plazmidów w żywych komórkach. Metoda ta opiera się na wiązaniu białka represora laktozy z etykietą fluorescencyjną do wielu miejsc w badanym plazmidzie 9. DNA poddane analizie jest modyfikowane tak, aby zawierało około 250 tandemowych powtórzeń sekwencji operatora laktozy (LacO). LacO jest specyficznie wiązany przez białko represora laktozy (LacI), które może być połączone z białkiem fluorescencyjnym. Białko fuzyjne może być ekspresowane z zmodyfikowanego plazmidu lub wprowadzone za pomocą wektora retrowirusowego. W ten sposób cząsteczki DNA zostają oznakowane fluorescencyjnie, dzięki czemu stają się widoczne w mikroskopii fluorescencyjnej. Wiązanie białka fuzyjnego z DNA plazmidowym jest blokowane poprzez hodowlę komórek w obecności IPTG do momentu, aż plazmidy będą gotowe do obserwacji.
System ten pozwala na monitorowanie plazmidów w żywych komórkach przez kilka pokoleń, co ujawnia właściwości ich syntezy i rozdziału do komórek potomnych. Idealne komórki są przylegające, łatwo ulegają transfekcji i posiadają duże jądra. Technika ta została wykorzystana do ustalenia, że w komórkach HeLa 84% plazmidów pochodzących z EBV jest syntetyzowanych w każdym pokoleniu, a 88% nowo syntetyzowanych plazmidów jest wiernie rozdzielanych do komórek potomnych. Zaobserwowano, że pary tych plazmidów EBV są przywiązane do chromatyd siostrzanych lub z nimi związane po syntezie w fazie S, aż do momentu ich rozdzielenia podczas separacji chromatyd siostrzanych w anafazie10. Metoda ta jest obecnie wykorzystywana do badania replikacji genomów KSHV w komórkach HeLa i SLK. Komórki HeLa są unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami nabłonkowymi, a komórki SLK są unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami śródbłonka. Chociaż komórki SLK pochodziły pierwotnie z zmiany wywołanej przez KSHV, ani linia HeLa, ani SLK nie posiadają naturalnie genomów KSHV11. Oprócz badania replikacji wirusowej, ta technika wizualizacji może być stosowana do badania wpływu dodania, usunięcia lub mutacji różnych elementów sekwencji DNA na syntezę, lokalizację i rozdział innych rekombinowanych plazmidowych DNA.

Maksymalne projekcje intensywności stosów z (z-stacks) uzyskane w reprezentatywnym eksperymencie przedstawiono na Rysunku 3. Typowe sygnały plazmidów występują w 3-8 warstwach stosu z, w zależności od tego, czy reprezentują one pojedyncze plazmidy, czy ich skupiska. W przypadku plazmidów pochodzących z EBV i KSHV sygnały przemieszczają się powoli w obrębie komórki, aż do momentu wejścia komórki w fazę mitozy. Same komórki migrują w trakcie trwania eksperymentu. Podczas mitozy stają się one również sferyc...

Opisano metodę obserwacji pojedynczych cząsteczek DNA w żywych komórkach. Technika ta opiera się na wiązaniu białka represora lac znakowanego fluorescencyjnie do miejsc wiążących wprowadzonych do badanego DNA. Metodę tę można dostosować do śledzenia wielu rekombinowanych cząsteczek DNA w żywych komórkach w czasie.

Monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków na przestrzeni wielu pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Niewiele naturalnie występujących plazmidów jest utrzymywanych w komórkach ssaków. Wśród nich znajdują się genomy gammaherpeswirusów, w tym wirusa Epsteina-Barr (EBV)...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja rozdziału genomów wirusowych w dzielących się komórkach. Zostaje to osiągnięte poprzez uprzednie stworzenie plazmidu, który można zwizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym przypadku zaprojektowano plazmid zawierający tandemowe powtórzenia sekwencji operatora laktozy lub LAC O. Drugim krokiem jest wprowadzenie plazmidu do dzielących się komórek, a następnie zakażenie komórek retrowirusem kodującym represor laktozy lub lac eye połączony z białkiem fluorescencyjnym.Białka fuzyjne represora laktozy będą specyficznie wiązać sekwencje operatora laktozy w plazmidzie sub. Komórki są monitorowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu śledzenia pojedynczych plazmidów przez wiele cykli komórkowych. Ostatecznie pozyskane obrazy są przetwarzane, aby określić, w jaki sposób genomy wirusowe są utrzymywane w dzielących się komórkach.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ilościowy PCR, Southern blotting czy fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, jest możliwość obserwacji poszczególnych plazmidów w wielu punktach czasowych. Aby umożliwić wizualizację plazmidu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, wykorzystuje się standardowe techniki klonowania molekularnego w celu wprowadzenia do plazmidu fragmentu DNA zawierającego około 250 kopii sekwencji operatora laktozy lub LAC O. W tym przykładzie plazmid jest BAC o wielkości około 170 kilobaz par, który zawiera cały genom wirusa herpes związany z sarkomą Kaposiego lub KSHV i koduje oporność na hygromycynę.Wprowadź LAC O zawierający plazmidowe DNA do komórek ssaczych HeLa i SLK poprzez transfekcję. W szalkach 60 milimetrowych inkubuj komórki z 10 µg oczyszczonego plazmidowego DNA, 25 µL lipofektamid 2000, 0,5 ml Opti-MEM oraz 3,5 ml DMEM przez cztery godziny. Wymień podłoże na DMEM z 10% płodowej surowicy bydlęcej i pozostaw komórki do regeneracji na 48 godzin.Następnie wysiej transmitowane komórki o niskiej gęstości na duże szalki i hoduj przez trzy tygodnie w medium DMEM z 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 300 µg/mL hygromycyny w celu selekcji wprowadzonego plazmidu; użyj sterylnych końcówek do pipet i nasączonego papieru filtracyjnego, aby przenieść kolonie oporne na hygromycynę do nowych naczyń hodowlanych. Umieść szalki w inkubatorze; po jednym do dwóch tygodniach, gdy transmitowane klony urosną i wypełnią szalkę, wyizoluj DNA do trawienia restrykcyjnego i southern blottingu, aby upewnić się, że polimer plazmidu LAC O jest homogeniczny i ma oczekiwaną wielkość. Niniejszy przykładowy obraz z blottingu pokazuje, że polimer LAC O w klonie pierwszym jest homogeniczny i identyczny z polimerem w kontroli pozytywnej.W ścieżce siódmej, jeśli plazmid nie został zaprojektowany tak, aby wyrażać białko fuzyjne represora laktozy lacI, należy zainfekować odpowiednie klony retrowirusem kodującym lacI połączony z czerwonym białkiem fluorescencyjnym, takim jak tdTomato. Wybrano tdTomato zamiast białek fluorescujących w kolorach bliższych zielonemu, aby zminimalizować fototoksyczność, która wystąpiłaby przy wielokrotnych ekspozycjach przez dłuższy czas. Po wprowadzeniu białka fuzyjnego lacI należy hodować komórki w obecności 200 µg/mL IPTG, aby zapobiec wiązaniu DNA przez białka fuzyjne. Jednym z najkrytyczniejszych aspektów tej procedury jest uzyskanie klonów o odpowiedniej intensywności fluorescencji.Należy przesiewać dużą liczbę klonów, aby zidentyfikować te o optymalnej fluorescencji. Hodować komórki przez co najmniej trzy dni, aby umożliwić ekspresję białka LAC eye TD tomato; przesiewać klony w celu znalezienia tych z optymalnym poziomem lac eye TD tomato, które wykazują wyraźne sygnały przy minimalnym poziomie tła nieprzypisanego białka fuzyjnego. Od 24 do 48 godzin przed obrazowaniem wysiać komórki wykazujące ekspresję LAC I TD tomato do szklanego naczynia o średnicy 35 mm z dnem z płytki szklanej, przy gęstości poniżej 10% konfluencji. Pozwoli to parom komórek na podział w kolonie od 8 do 16 komórek bez nakładania się na siebie, jedną do trzech godzin przed rozpoczęciem obrazowania.Przepłucz płytkę trzykrotnie pożywką hodowlaną pozbawioną zarówno leków selekcyjnych, jak i IPTG. Pozwala to na usunięcie nieżywotnych komórek i umożliwia wiązanie białek fuzyjnych lac eye z cytami LAC w plazmidach. Zastąp pożywkę hodowlaną dwiema mililitrami DMEM z 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 25 milimolarnym roztworem Hippies; inkubuj przez jedną do trzech godzin. Bezpośrednio przed obrazowaniem zastąp górną część naczynia hodowlanego folią kulturową rozciągniętą w pierścieniu montażowym do płytki 35 milimetrowej.Przykrycie to zapobiegnie odparowywaniu pożywki hodowlanej, co w przeciwnym razie doprowadziłoby do wzrostu stężenia soli w czasie i zginęłyby komórki. System obrazowania wykorzystany w tym eksperymencie składa się z odwróconego mikroskopu Zeiss Axio 200 M, wyposażonego w zmotoryzowany stolik oraz kamerę EM CCD do czułej detekcji sygnałów. Światło wzbudzenia fluorescencji zapewnia neutralna biała dioda LED systemu Collibra.System obrazowania jest sterowany za pomocą oprogramowania do zautomatyzowanego pozyskiwania obrazów w długich odstępach czasu z wielokrotnymi stosami Z. Do utrzymania komórek w temperaturze 37 °C i stężeniu dwutlenku węgla od 5 do 10% w nawilżonej komorze wykorzystuje się inkubator montowany na stole mikroskopu. Należy zastosować podgrzewany pierścień dla obiektywu olejowego, aby zapobiec efektowi siphoningu obiektywu.Podgrzewaj próbkę przez czas wystarczający do ustabilizowania temperatury układu. Aby zminimalizować artefakty ruchowe podczas eksperymentu, system obrazowania powinien znajdować się na stole pneumatycznym w celu odizolowania go od wibracji. Aby rozpocząć procedurę wizualizacji znakowanego DNA, należy zastosować obrazowanie DIC w celu obejrzenia komórek i wyznaczenia płaszczyzny ogniskowania dla górnej i dolnej części komórek w wielu polach widzenia; w każdym polu należy przejść do płaszczyzny ogniskowania znajdującej się w około jednej trzeciej wysokości od górnej części komórki, a następnie zapisać współrzędne x, y, Z na liście zapisanych pozycji stolika.Każda z tych zapisanych pozycji będzie centrum serii obrazów (tzw. zestawy Z), które zostaną zarejestrowane w oprogramowaniu sterującym mikroskopem; zdefiniuj zestaw obrazów do wykonania dla każdej zapisanej pozycji etapu, określając liczbę warstw tak, aby uchwycić całą komórkę wraz z dodatkowymi warstwami powyżej i poniżej płaszczyzn, w których znajdują się komórki. Wybierz wielkość kroku Z od 0,35 do 0,50 microns, aby zapewnić przybliżone próbkowanie Nyquista w wymiarze Z. Warstwy te umożliwiają śledzenie ruchów komórek w cyklu komórkowym i są również wykorzystywane w procesach post-akwizycyjnych stosów obrazów.W rezultacie powstanie stos od 40 do 60 obrazów, w zależności od grubości komórek. Zdefiniuj eksperyment z szeregiem czasowym, aby gromadzić obrazy w jasnym polu dla Zacks w odstępach 30-minutowych oraz obrazy fluorescencyjne w odstępach od 10 do 60 minut. Podczas eksperymentu nie należy stosować obrazowania DIC, ponieważ wymaga ono więcej światła niż standardowe obrazowanie w jasnym polu, co w trakcie długich eksperymentów może niepotrzebnie narażać komórki na fototoksyczność.Uruchom eksperyment sterowany programowo. Upewnij się, że system nie zostanie zakłócony w żadnym momencie trwania eksperymentu. Po zarejestrowaniu wszystkich obrazów dla danego eksperymentu, przejrzyj obrazy dla każdego Zacka i punktu czasowego, a następnie wytnij niepotrzebne obszary obrazów, aby skrócić czas przetwarzania komputerowego.W kolejnym kroku przypisano intensywność sygnału do piksela pochodzenia w każdym stosie Z. Użyto algorytmu dekonwolucji w oprogramowaniu Axio vision, opartego na zmierzonej funkcji rozmycia punktowego (PSF) systemu obrazowania. Wynik dekonwolucji pokazano tutaj.Przeanalizuj obrazy, aby śledzić zmiany intensywności i ruchy plazmidów podczas cyklu komórkowego oraz podział plazmidów pomiędzy komórki potomne. Obrazy te, stworzone komputerowo poprzez połączenie wielu płaszczyzn Z, w których znajdują się różne sygnały, pokazują, że jądra komórek HELOC wykazujące ekspresję LAC eye TD tomato są fluorescencyjne ze względu na sygnał lokalizacji jądrowej w białku fuzyjnym, który kieruje je do jądra. W obecności I-P-T-G-K-S-H-V genomy kodujące sekwencje LAC O rekrutują wiele kopii białka fluorescencyjnego i wyróżniają się jako jasne sygnały na tle intensywności fluorescencji jądra.W przeciwieństwie do tego, w obecności IPTG białka fluorescencyjne LAC eye nie wiążą się z rozpoznawaną sekwencją lack O; na tej figurze przedstawiono maksymalne projekcje intensywności dla komórki Zack pozyskane w pięciu punktach czasowych cyklu komórkowego w reprezentacyjnym eksperymencie. Fluorescencyjnie oznakowane genomy wirusowe w komórce widocznej na panelu A są syntetyzowane, co pokazano na panelu B. Genomy wirusowe są następnie rozdzielane do komórek potomnych podczas podziału komórki, co zaobserwowano na panelach C, D i E. Cykl komórkowy zdrowych komórek HELOC trwa około 24 godzin, a komórki potomne zazwyczaj przywierają blisko siebie i ponownie dzielą się w tym samym czasie w kolejnym cyklu komórkowym.Stosując ten protokół, można śledzić genomy wirusowe w komórkach przez wiele generacji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest monitorowanie morfologii komórek w czasie trwania generacji, aby upewnić się, że komórki pozostają zdrowe przez cały okres trwania eksperymentu.

monitoring-plasmid-replication-live-mammalian-cells-over-multiple

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków przez wiele pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisano metodę monitorowania aktywności ubikwityna-proteasomowej w żywych komórkach. Wygenerowano białka fuzyjne: destabilizowane degronem GFP- (GFP-dgn) oraz stabilne GFP-dgnFS, które następnie wprowadzono do komórek za pomocą lentiwirusem wektora ekspresyjnego. Technika ta pozwala na stworzenie stabilnej linii komórkowej wykazującej ekspresję GFP-dgn/GFP-dgnFS, w której aktywność ubikwityna-proteasomową można łatwo ocenić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej.

Monitorowanie aktywności układu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego opartego na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP) destabilizowanego przez degron (dgn)

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Ta technika dostarcza metody zbierania, normalizacji i ilościowego określania wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenów bakteryjnych, które są wstępnie hodowane w naturalnych komórkach gospodarza pierwotniaków przed infekcjami komórek ssaków. Metodę tę można zmodyfikować w celu uwzględnienia szerokiej gamy komórek gospodarza na etapie zasysania, a także typów komórek docelowych.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Opisana jest metoda oparta na białku fluorescencyjnym żywych komórek do oświetlania wakuoli komórkowych (inkluzji) zawierających Chlamydię. Strategia ta umożliwia szybkie, zautomatyzowane określenie zakaźności Chlamydii w próbkach i może być wykorzystana do ilościowego badania dynamiki wzrostu inkluzji.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Nasze eksperymentalne podejście dostarcza strategię śledzenia obfitości plazmidów i oporności na antybiotyki w czasie w populacjach bakterii.

Kwantyfikacja oporności na antybiotyki za pośrednictwem plazmidu w podejściu ewolucji eksperymentalnej

Dostępny przepływ pracy mikroprzepływów o otwartym kodzie źródłowym jest prezentowany do równoległej analizy retencji plazmidu u bakterii. Dzięki zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego określenia obecności plazmidu w mikrokoloniach jednokomórkowych w mikrokropelkach żelu, metoda ta stanowi precyzyjną, dostępną i skalowalną alternatywę dla tradycyjnego liczenia płytek.

Analiza stabilności plazmidu za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source

Poznaj metodę obserwacji replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków przez wiele pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia śledzenie zachowania DNA podczas podziałów komórkowych.

Monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków na przestrzeni wielu pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów