Monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków na przestrzeni wielu pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja rozdziału genomów wirusowych w dzielących się komórkach. Zostaje to osiągnięte poprzez uprzednie stworzenie plazmidu, który można zwizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym przypadku zaprojektowano plazmid zawierający tandemowe powtórzenia sekwencji operatora laktozy lub LAC O. Drugim krokiem jest wprowadzenie plazmidu do dzielących się komórek, a następnie zakażenie komórek retrowirusem kodującym represor laktozy lub lac eye połączony z białkiem fluorescencyjnym.

Białka fuzyjne represora laktozy będą specyficznie wiązać sekwencje operatora laktozy w plazmidzie sub. Komórki są monitorowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu śledzenia pojedynczych plazmidów przez wiele cykli komórkowych. Ostatecznie pozyskane obrazy są przetwarzane, aby określić, w jaki sposób genomy wirusowe są utrzymywane w dzielących się komórkach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ilościowy PCR, Southern blotting czy fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, jest możliwość obserwacji poszczególnych plazmidów w wielu punktach czasowych. Aby umożliwić wizualizację plazmidu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, wykorzystuje się standardowe techniki klonowania molekularnego w celu wprowadzenia do plazmidu fragmentu DNA zawierającego około 250 kopii sekwencji operatora laktozy lub LAC O. W tym przykładzie plazmid jest BAC o wielkości około 170 kilobaz par, który zawiera cały genom wirusa herpes związany z sarkomą Kaposiego lub KSHV i koduje oporność na hygromycynę.

Wprowadź LAC O zawierający plazmidowe DNA do komórek ssaczych HeLa i SLK poprzez transfekcję. W szalkach 60 milimetrowych inkubuj komórki z 10 µg oczyszczonego plazmidowego DNA, 25 µL lipofektamid 2000, 0,5 ml Opti-MEM oraz 3,5 ml DMEM przez cztery godziny. Wymień podłoże na DMEM z 10% płodowej surowicy bydlęcej i pozostaw komórki do regeneracji na 48 godzin.

Następnie wysiej transmitowane komórki o niskiej gęstości na duże szalki i hoduj przez trzy tygodnie w medium DMEM z 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 300 µg/mL hygromycyny w celu selekcji wprowadzonego plazmidu; użyj sterylnych końcówek do pipet i nasączonego papieru filtracyjnego, aby przenieść kolonie oporne na hygromycynę do nowych naczyń hodowlanych. Umieść szalki w inkubatorze; po jednym do dwóch tygodniach, gdy transmitowane klony urosną i wypełnią szalkę, wyizoluj DNA do trawienia restrykcyjnego i southern blottingu, aby upewnić się, że polimer plazmidu LAC O jest homogeniczny i ma oczekiwaną wielkość. Niniejszy przykładowy obraz z blottingu pokazuje, że polimer LAC O w klonie pierwszym jest homogeniczny i identyczny z polimerem w kontroli pozytywnej.

W ścieżce siódmej, jeśli plazmid nie został zaprojektowany tak, aby wyrażać białko fuzyjne represora laktozy lacI, należy zainfekować odpowiednie klony retrowirusem kodującym lacI połączony z czerwonym białkiem fluorescencyjnym, takim jak tdTomato. Wybrano tdTomato zamiast białek fluorescujących w kolorach bliższych zielonemu, aby zminimalizować fototoksyczność, która wystąpiłaby przy wielokrotnych ekspozycjach przez dłuższy czas. Po wprowadzeniu białka fuzyjnego lacI należy hodować komórki w obecności 200 µg/mL IPTG, aby zapobiec wiązaniu DNA przez białka fuzyjne. Jednym z najkrytyczniejszych aspektów tej procedury jest uzyskanie klonów o odpowiedniej intensywności fluorescencji.

Należy przesiewać dużą liczbę klonów, aby zidentyfikować te o optymalnej fluorescencji. Hodować komórki przez co najmniej trzy dni, aby umożliwić ekspresję białka LAC eye TD tomato; przesiewać klony w celu znalezienia tych z optymalnym poziomem lac eye TD tomato, które wykazują wyraźne sygnały przy minimalnym poziomie tła nieprzypisanego białka fuzyjnego. Od 24 do 48 godzin przed obrazowaniem wysiać komórki wykazujące ekspresję LAC I TD tomato do szklanego naczynia o średnicy 35 mm z dnem z płytki szklanej, przy gęstości poniżej 10% konfluencji. Pozwoli to parom komórek na podział w kolonie od 8 do 16 komórek bez nakładania się na siebie, jedną do trzech godzin przed rozpoczęciem obrazowania.

Przepłucz płytkę trzykrotnie pożywką hodowlaną pozbawioną zarówno leków selekcyjnych, jak i IPTG. Pozwala to na usunięcie nieżywotnych komórek i umożliwia wiązanie białek fuzyjnych lac eye z cytami LAC w plazmidach. Zastąp pożywkę hodowlaną dwiema mililitrami DMEM z 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 25 milimolarnym roztworem Hippies; inkubuj przez jedną do trzech godzin. Bezpośrednio przed obrazowaniem zastąp górną część naczynia hodowlanego folią kulturową rozciągniętą w pierścieniu montażowym do płytki 35 milimetrowej.

Przykrycie to zapobiegnie odparowywaniu pożywki hodowlanej, co w przeciwnym razie doprowadziłoby do wzrostu stężenia soli w czasie i zginęłyby komórki. System obrazowania wykorzystany w tym eksperymencie składa się z odwróconego mikroskopu Zeiss Axio 200 M, wyposażonego w zmotoryzowany stolik oraz kamerę EM CCD do czułej detekcji sygnałów. Światło wzbudzenia fluorescencji zapewnia neutralna biała dioda LED systemu Collibra.

System obrazowania jest sterowany za pomocą oprogramowania do zautomatyzowanego pozyskiwania obrazów w długich odstępach czasu z wielokrotnymi stosami Z. Do utrzymania komórek w temperaturze 37 °C i stężeniu dwutlenku węgla od 5 do 10% w nawilżonej komorze wykorzystuje się inkubator montowany na stole mikroskopu. Należy zastosować podgrzewany pierścień dla obiektywu olejowego, aby zapobiec efektowi siphoningu obiektywu.

Podgrzewaj próbkę przez czas wystarczający do ustabilizowania temperatury układu. Aby zminimalizować artefakty ruchowe podczas eksperymentu, system obrazowania powinien znajdować się na stole pneumatycznym w celu odizolowania go od wibracji. Aby rozpocząć procedurę wizualizacji znakowanego DNA, należy zastosować obrazowanie DIC w celu obejrzenia komórek i wyznaczenia płaszczyzny ogniskowania dla górnej i dolnej części komórek w wielu polach widzenia; w każdym polu należy przejść do płaszczyzny ogniskowania znajdującej się w około jednej trzeciej wysokości od górnej części komórki, a następnie zapisać współrzędne x, y, Z na liście zapisanych pozycji stolika.

Każda z tych zapisanych pozycji będzie centrum serii obrazów (tzw. zestawy Z), które zostaną zarejestrowane w oprogramowaniu sterującym mikroskopem; zdefiniuj zestaw obrazów do wykonania dla każdej zapisanej pozycji etapu, określając liczbę warstw tak, aby uchwycić całą komórkę wraz z dodatkowymi warstwami powyżej i poniżej płaszczyzn, w których znajdują się komórki. Wybierz wielkość kroku Z od 0,35 do 0,50 microns, aby zapewnić przybliżone próbkowanie Nyquista w wymiarze Z. Warstwy te umożliwiają śledzenie ruchów komórek w cyklu komórkowym i są również wykorzystywane w procesach post-akwizycyjnych stosów obrazów.

W rezultacie powstanie stos od 40 do 60 obrazów, w zależności od grubości komórek. Zdefiniuj eksperyment z szeregiem czasowym, aby gromadzić obrazy w jasnym polu dla Zacks w odstępach 30-minutowych oraz obrazy fluorescencyjne w odstępach od 10 do 60 minut. Podczas eksperymentu nie należy stosować obrazowania DIC, ponieważ wymaga ono więcej światła niż standardowe obrazowanie w jasnym polu, co w trakcie długich eksperymentów może niepotrzebnie narażać komórki na fototoksyczność.

Uruchom eksperyment sterowany programowo. Upewnij się, że system nie zostanie zakłócony w żadnym momencie trwania eksperymentu. Po zarejestrowaniu wszystkich obrazów dla danego eksperymentu, przejrzyj obrazy dla każdego Zacka i punktu czasowego, a następnie wytnij niepotrzebne obszary obrazów, aby skrócić czas przetwarzania komputerowego.

W kolejnym kroku przypisano intensywność sygnału do piksela pochodzenia w każdym stosie Z. Użyto algorytmu dekonwolucji w oprogramowaniu Axio vision, opartego na zmierzonej funkcji rozmycia punktowego (PSF) systemu obrazowania. Wynik dekonwolucji pokazano tutaj.

Przeanalizuj obrazy, aby śledzić zmiany intensywności i ruchy plazmidów podczas cyklu komórkowego oraz podział plazmidów pomiędzy komórki potomne. Obrazy te, stworzone komputerowo poprzez połączenie wielu płaszczyzn Z, w których znajdują się różne sygnały, pokazują, że jądra komórek HELOC wykazujące ekspresję LAC eye TD tomato są fluorescencyjne ze względu na sygnał lokalizacji jądrowej w białku fuzyjnym, który kieruje je do jądra. W obecności I-P-T-G-K-S-H-V genomy kodujące sekwencje LAC O rekrutują wiele kopii białka fluorescencyjnego i wyróżniają się jako jasne sygnały na tle intensywności fluorescencji jądra.

W przeciwieństwie do tego, w obecności IPTG białka fluorescencyjne LAC eye nie wiążą się z rozpoznawaną sekwencją lack O; na tej figurze przedstawiono maksymalne projekcje intensywności dla komórki Zack pozyskane w pięciu punktach czasowych cyklu komórkowego w reprezentacyjnym eksperymencie. Fluorescencyjnie oznakowane genomy wirusowe w komórce widocznej na panelu A są syntetyzowane, co pokazano na panelu B. Genomy wirusowe są następnie rozdzielane do komórek potomnych podczas podziału komórki, co zaobserwowano na panelach C, D i E. Cykl komórkowy zdrowych komórek HELOC trwa około 24 godzin, a komórki potomne zazwyczaj przywierają blisko siebie i ponownie dzielą się w tym samym czasie w kolejnym cyklu komórkowym.

Stosując ten protokół, można śledzić genomy wirusowe w komórkach przez wiele generacji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest monitorowanie morfologii komórek w czasie trwania generacji, aby upewnić się, że komórki pozostają zdrowe przez cały okres trwania eksperymentu.