Monitorowanie replikacji plazmidu w żywych komórkach ssaków przez wiele pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja podziału genomów wirusa w dzielących się komórkach. Osiąga się to poprzez najpierw wykonanie plazmidu, który można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym przypadku plazmid jest modyfikowany tak, aby zawierał tandemowe powtórzenia sekwencji operatora laktozy lub LAC O. Drugim krokiem jest wprowadzenie plazmidu do dzielących się komórek, a następnie zakażenie komórek retrowirusem kodującym represor laktozy lub lac eye połączone z białkiem fluorescencyjnym.

Białka fuzyjne represora laktozy będą specyficznie wiązać sekwencje operatora laktozy w sub plazmidu. Komórki są monitorowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu śledzenia poszczególnych plazmidów przez wiele cykli komórkowych. Ostatecznie uzyskane obrazy są przetwarzane w celu określenia, w jaki sposób genomy wirusa są utrzymywane w dzielących się komórkach.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ilościowa PCR, Southern blot lub fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, jest to, że technika ta pozwala na obserwację pojedynczych plazmidów w wielu punktach w czasie. Aby umożliwić wizualizację plazmidu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, stosuje się standardowe techniki klonowania molekularnego w celu wprowadzenia do plazmidu fragmentu DNA zawierającego około 250 kopii sekwencji operatora laktozy lub LAC O. W tym przykładzie plazmid jest tylnym środkiem około 170 par kilozasad, który zawiera cały genom wirusa opryszczki związanego z mięsakiem czapy lub KSHV i koduje oporność na higromycynę.

Wprowadź LAC O zawierające plazmidowe DNA do komórek ssaków hela i SLK przez transfekcję W 60-milimetrowych naczyniach inkubuj komórki z 10 mikrogramami oczyszczonego plazmidu, DNA 25 mikrolitrów, lipektomii, 2000 0,5 mililitra, Optum i 3,5 mililitra. DMEM przez cztery godziny. Zmień pożywkę na DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą i pozwól komórkom odzyskać siły przez 48 godzin.

Następnie pokryj transfekowane komórki o niskiej gęstości w dużych naczyniach i hoduj przez trzy tygodnie w DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą i 300 mikrogramami na mililitr higromycyny, aby wybrać wprowadzony plazmid, użyj kawałków sterylnych wycieczek i namoczonej bibuły filtracyjnej do przeniesienia kolonii odpornych na higromycynę do nowych naczyń hodowlanych. Umieścić szalki w inkubatorze po jednym do dwóch tygodni, gdy transfekowane klony wyrosną do wypełnienia naczynia, wyizolować DNA do restrykcji, trawienia i południowego blottingu, aby upewnić się, że polimer plazmidu LAC O jest jednorodny i ma oczekiwany rozmiar. Ten przykładowy blot pokazuje, że polimer LAC O w sklonowanym polimerze jest jednorodny i identyczny z polimerem kontroli pozytywnej.

Na pasie siódmym, jeśli plazmid nie został zmodyfikowany do ekspresji fuzji represora laktozy, lak eye infekuje odpowiednie klony retrowirusem kodującym lac eye połączone z czerwonym białkiem fluorescencyjnym, takim jak lac eye, pomidor TD, pomidor TD jest wybierany zamiast białek, które fluoryzują bliżej zieleni, aby zminimalizować fototoksyczność, która wystąpiłaby w wyniku wielokrotnych ekspozycji przez długi czas. Po wprowadzeniu białka fuzyjnego oka LAC należy hodować komórki w obecności 200 mikrogramów na mililitr IPTG, aby zablokować białka fuzyjne przed wiązaniem DNA. Jednym z najbardziej krytycznych aspektów tej procedury jest uzyskanie klonów o odpowiedniej intensywności fluorescencji.

Duża liczba klonów powinna zostać poddana badaniom przesiewowym w celu zidentyfikowania tych z optymalną kulturą fluorescencyjną. Komórki przez co najmniej trzy dni, aby umożliwić ekspresję klonów białka pomidora LAC eye TD dla osób z optymalnym poziomem lak eye, pomidora TD, które ujawniają wyraźne sygnały z minimalnymi poziomami tła niezwiązanego białka fuzyjnego, 24 do 48 godzin przed obrazowaniem komórek eksprymujących pomidora LAC I TD umieszcza je w naczyniu o szklanym dnie o grubości 35 milimetrów przy gęstości mniejszej niż 10% konfluencji. Umożliwi to parom komórek podział na kolonie składające się z ośmiu do 16 komórek bez nakładania się na jedną do trzech godzin przed rozpoczęciem obrazowania.

Przepłukać płytkę trzykrotnie pożywką hodowlaną, która nie zawiera zarówno selektywnych leków, jak i IPTG. To zmywa niezdolne do życia komórki i pozwala białkom fuzji lac oka wiązać cyty LAC w plazmidach. Zastąp pożywkę hodowlaną dwoma mililitrami, DMEM 10% płodową surowicą bydlęcą i 25 milimolowymi Hipisi inkubują przez jedną do trzech godzin tuż przed obrazowaniem Zastąp górną część naczynia hodowlanego kultową folią rozciągniętą w pierścieniu montażowym na 35-milimetrową szalkę.

Ta osłona zahamuje parowanie pożywki hodowlanej, co z czasem zwiększy stężenie soli i zabije komórki. System obrazowania wykorzystany w tym eksperymencie składa się z odwróconego mikroskopu Zeiss Axio 200 M, wyposażonego w zmotoryzowany stolik i kamerę EM CCD do czułej detekcji sygnałów. Fluorescencyjne światło wzbudzenia jest zapewniane przez neutralną białą diodę LED systemu Collibra.

System obrazowania jest sterowany przez oprogramowanie do automatycznego pozyskiwania obrazów w długich odstępach czasu z wieloma stosami Z. Inkubator stage top służy do utrzymywania komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza, od pięciu do 10% dwutlenku węgla w wilgotnej komorze. Użyj podgrzewanego kołnierza do obiektywu olejowego, aby zapobiec zasysaniu obiektywu.

Ciepło z próbki daje wystarczająco dużo czasu, aby system osiągnął stabilną temperaturę. Aby zminimalizować artefakty ruchu podczas eksperymentu, system obrazowania powinien znajdować się na stole powietrznym, aby był odizolowany od wibracji. Aby rozpocząć procedurę wizualizacji znakowanego DNA, użyj obrazowania DIC, aby wyświetlić komórki i określić płaszczyznę ogniskową górnej i dolnej części komórek w wielu polach widzenia w każdym polu, przejdź do płaszczyzny ogniskowej około jednej trzeciej wysokości w dół od góry komórki, zachowaj x, współrzędne y, Z na liście zapisanych pozycji etapu.

Każda z tych zapisanych pozycji będzie środkiem Zacka obrazów, aby uchwycić komórkę w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, zdefiniować Zack obrazów do wykonania w każdej zapisanej pozycji sceny, zdefiniować wystarczającą liczbę plasterków, aby cała komórka została przechwycona wraz z dodatkowymi plasterkami powyżej i poniżej płaszczyzn, w których znajdują się komórki. Wybierz rozmiar kroku Z od 0,35 do 0,50 mikrona, aby umożliwić przybliżone próbkowanie nyquist w wymiarze Z. Warstwy te umożliwiają wykrywanie ruchów komórek podczas cyklu komórkowego i są również wykorzystywane w przetwarzaniu stosów obrazów po akwizycji.

Spowoduje to powstanie stosu od 40 do 60 obrazów w zależności od grubości komórek. Zdefiniuj eksperyment szeregów czasowych, aby zebrać obraz jasnego pola Zacksa w odstępach 30-minutowych i obrazy fluorescencji w odstępach od 10 do 60 minut. Nie należy używać obrazowania DIC podczas eksperymentu, ponieważ wymaga ono więcej światła niż standardowe obrazowanie w jasnym polu, co może niepotrzebnie narażać komórki na fototoksyczność w trakcie długich eksperymentów.

Rozpocznij eksperyment sterowany przez oprogramowanie. Upewnij się, że system nie jest w żaden sposób zakłócony podczas eksperymentu. Po uzyskaniu wszystkich obrazów do eksperymentu przejrzyj obrazy dla każdego Zacka i punktu czasowego, wytnij wszelkie niepotrzebne obszary obrazów, aby skrócić czas przetwarzania komputera.

W następnym kroku, aby ponownie przypisać intensywność sygnału do piksela początkowego w każdym stosie Z. Użyj algorytmu dekonwolucji w oprogramowaniu wizyjnym Axio opartego na funkcji zmierzonego rozrzutu punktów systemu obrazowania. Wynik dekonwolucji jest pokazany tutaj.

Zbadaj obrazy, aby śledzić intensywność, zmiany i ruchy plazmidów podczas cyklu komórkowego oraz partycjonowanie plazmidów do komórek potomnych. Te obrazy, które są wykonane obliczeniowo tak, aby obejmowały wiele płaszczyzn Z, w których znajdują się różne sygnały, pokazują, że jądra komórek HELOC eksprymujących pomidora LAC eye TD są fluorescencyjne ze względu na sygnał lokalizacji jądrowej na białku fuzyjnym, lokalizując go w jądrze. W przypadku braku genomów I-P-T-G-K-S-H-V kodujących sekwencje LAC O rekrutują wiele kopii białka fluorescencyjnego i wyróżniają się jako jasne sygnały na tle intensywności jądra.

W przeciwieństwie do tego, w obecności IPTG, białka fluorescencyjne oka LAC nie mogą wiązać się z jego rozpoznawaniem Brak sekwencji O, maksymalne projekcje intensywności Zacka nabyte w cyklu komórkowym w pięciokrotnym czasie. Punkty w reprezentatywnym eksperymencie pokazano na tym rysunku. Fluorescencyjnie znakowane genomy wirusowe w komórce widocznej w panelu A są syntetyzowane w panelu pokazanym w panelu B. Genomy wirusa są następnie dzielone na komórki potomne podczas podziału komórki, jak zaobserwowano w panelu C, D i E. Cykl komórkowy dla zdrowych komórek HELOC trwa około 24 godzin, a komórki potomne zazwyczaj przyczepiają się blisko siebie i dzielą się w tym samym czasie w następnym cyklu komórkowym.

Korzystając z tego protokołu, genomy wirusa w komórce mogą być śledzone przez wiele pokoleń Podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o obserwowaniu morfologii komórek w czasie generacji, aby upewnić się, że komórki są zdrowe przez cały czas trwania eksperymentu.