Prosty protokół badania agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum indukowanej przez płytki krwi w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów

Niniejsza procedura oferuje zestandaryzowane wytyczne dotyczące przeprowadzania testów agregacji zapośredniczonej przez płytki krwi dla klinicznych lub laboratoryjnych izolatów Plasmodium falciparum. Najpierw należy pobrać krew od zakażonego pacjenta i wyizolować erytrocyty z pasożytami poprzez wirowanie, a następnie hodować i oczyszczać dojrzałe stadia aseksualne. Następnie należy pobrać krew od zdrowego dawcy w celu przygotowania i standaryzacji osocza bogatopłytkowego poprzez wirowanie.

Połącz płytki krwi oraz erytrocyty zainfekowane pasożytem w celu przeprowadzenia testu zlepiania. Wyniki mikroskopii immunofluorescencyjnej mogą wykazać skupiska P. falciparum pośredniczone przez płytki krwi. Technika ta została zaprojektowana specjalnie do pomiaru fenotypu zlepiania plasmodium sra.

Izolaty kliniczne w warunkach ograniczonych zasobów. Według doniesień minimalne różnice w procedurach zwiększały wpływ na wynik testu kłaczkowania kwasowego w terenie. Konieczne było zatem opracowanie jasnego i łatwego do naśladowania protokołu, dostosowanego do warunków ograniczonych zasobów, w celu standaryzacji badań w miejscach endemicznych dla malarii. Do probówki typu vacutainer z cytrynianem sodu należy pobrać około 5 ml krwi pełnej od gospodarza, który nie miał kontaktu z malarią, lub 2,5 ml krwi od pacjentów z CM lub SM malarią.

Wirować krew pełną z prędkością 250 Gs przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie przenieść mętny nadsącz do czystej probówki o pojemności 15 mililitrów. Należy pamiętać, że płytki krwi są łatwo aktywowane przez zmiany temperatury oraz wstrząsy mechaniczne.

Policz zawiesinę PRP za pomocą komory countingowej Neubauera i dostosuj ją do pożądanego stężenia za pomocą PBS. Aby otrzymać osocze ubogie w płytki krwi (PPP), oddziel większość płytek krwi z części frakcji PRP poprzez wirowanie przy 1500 ×g przez 10 minut. Przechowuj frakcje PRP i PPP w temperaturze 4 °C do 8–10 dni. Do testu agregacji najlepiej używać świeżych płytek krwi.

Osadzone obwodowe erytrocyty przemyć trzykrotnie pięcioma do 10 ml RPMI 1640 w kolbie hodowlanej. Uzupełnić PRBC standardową pożywką do hodowli malarii oraz świeżymi, niezakażonymi erytrocytami, aby uzyskać 5% hematokrytu. Przepuścić przez kolby hodowlane mieszaninę 92,5% azotu, 2,5% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Następnie szczelnie zamknąć i inkubować do czasu dojrzewania pasożytów z pbcs pacjenta.

Inkubować kolbę z hodowlą przez 24 do 36 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide. Nanieść około 10 do 15 µL krwi na jeden koniec matowego szkiełka przedmiotowego leżącego na płaskiej powierzchni. Dotknąć kropli krwi krawędzią drugiego szkiełka, trzymając je pod kątem 45 stopni, aż krew równomiernie rozprzestrzeni się wzdłuż krawędzi drugiego szkiełka.

Szybko, lecz delikatnie, nie wywierając zbyt dużego nacisku na pierwszy szkiełko, równomiernie rozprowadź krew po jego powierzchni. Następnie wysusz cienką warstwę krwi na powietrzu i odwodnij obszar z preparatem za pomocą metanolu przez 10 sekund. Po ponownym wysuszeniu na powietrzu, zanurz preparat w 2% keem.

Pozostawić na co najmniej 10 minut. Płukać obficie, aż woda będzie czysta, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Próbki badać pod mikroskopem świetlnym przy użyciu obiektywu imersyjnego 100 x.

Następnie należy oczyścić i zsynchronizować dojrzałe PFS parum, PRBC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Całą hodowlę przenieść do czystej, sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Komórki sfragmentować poprzez wirowanie w temperaturze pokojowej przy 370 GS przez pięć minut.

Teraz ostrożnie odessaj nadsącz, aby nie naruszyć osadu. Następnie resuspenduj komórki w taki sposób, aby jedna połowa całkowitej objętości stanowiła jello fusing. Jedna trzecia drugiej połowy to medium wolne od białek, a dwie trzecie drugiej połowy to pbcs.

Przenieś zawiesinę do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i inkubuj przez 15 do 20 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aż utworzy się wyraźna granica między górną a dolną warstwą. Ostrożnie przenieś górną warstwę do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml, dodaj 10 ml świeżego medium RPMI i wiruj przy 370 do 430 ×g przez pięć minut. Następnie ostrożnie odlej nadsącz.

Następnie należy ocenić obecność pasożyta oraz stadium jego rozwoju za pomocą cienkiego rozmazu krwi i zbadać go pod mikroskopem świetlnym zgodnie z wcześniejszym opisem. Dostosuj stężenie zawiesiny P RBC uzyskanej po flotacji w żelu osoczki do 1×10⁸ P RBC na µL w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Zawiesimy P RBC przy hematokrycie 5% w roztworze akrydyny pomarańczowej lub bromku etydyny o stężeniu końcowym 20 µg/ml oraz PRP w ilości 10% całkowitej objętości.

Podobnie przygotuj następujące kontrole: niezinfekowane erytrocyty oraz PRP i PRBC z dodatkiem PPP, aby ustalić rolę płytek krwi w agregacji PBC. Następnie przenieś zawiesinę do fiolki z nakrętką o pojemności 2 ml. Poddaj fiolkę łagodnemu mieszaniu poprzez obracanie z prędkością 10 do 12 RRP w temperaturze pokojowej, pobierając próbki w odstępach 15 do 20 minut przez łącznie 120 minut w celu sprawdzenia tworzenia się agregatów.

Nanieś pipetą 10 µL próbki na szkiełko przedmiotowe i przykryj szkiełkiem nakrywnym, aby zbadać ją pod mikroskopem fluorescencyjnym. Za aglutynat uznaje się skupisko trzech lub więcej zainfekowanych erytrocytów. W tym doświadczeniu przeanalizowano około 70% dojrzałych stadiów p FALs po wzbogaceniu metodą flotacji w żelu plazmowym; skupiska są łatwo dostrzegalne pod mikroskopem, również w świetle przechodzącym. Przejawiają się one jako agregaty komórkowe, a w fluorescencji jako zielone lub czerwone punkty.

Po barwieniu odpowiednio barwnikami akrydyną i pomarańczą lub bromkiem etydium, wielkość skupisk znacząco wzrosła do średnio ponad 15 pbcs na skupisko po 120 minutach inkubacji, przy czym niektóre skupiska zawierały liczne pbcs, których nie można było policzyć wizualnie. Częstość fenotypu skupiania oblicza się jako liczbę zakażonych komórek występujących w skupiskach na 1000 zakażonych komórek policzonych w testach powtórzonych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne zrozumienie sposobu przeprowadzenia testu aglutynacji płytek krwi indukowanej przez Plasmodium falciparum. Należy uważać, aby nie aktywować płytek krwi gwałtownymi ruchami oraz wahaniami temperatury. Test ten można również zastosować do pomiaru aglutynacji płytek krwi w przebiegu ciężkiej malarii.