Prosty protokół zlepiania się erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum za pośrednictwem płytek krwi w warunkach ubogich w zasoby

Ta procedura oferuje pewne znormalizowane wytyczne do wykonywania testów zlepiania się płytek krwi klinicznych lub laboratoryjnych fałszywych izolatów parem plasmodium. Najpierw zbierz krew od zakażonego pacjenta i zbierz spasożytowane erytrocyty przez odwirowanie, a następnie posiew i oczyść dojrzałe stadia bezpłciowe. Następnie należy pobrać krew od zdrowego dawcy w celu przygotowania i standaryzacji osocza bogatopłytkowego poprzez odwirowanie.

Połącz zarówno płytki krwi, jak i spasożytowane erytrocyty do testu zbrylania. Powiedzmy, że wyniki mikroskopii immunofluorescencyjnej mogą wykazać grudki P Fal sperum za pośrednictwem płytek krwi. Technika ta została specjalnie zaprojektowana do pomiaru fenotypu zbrylania się plasmodium.Izoluje

klinicznie w warunkach ubogich w zasoby. Minimalne różnice w procedurach miały podobno zwiększyć wpływ na wynik zbrylania się kwasu w terenie. W związku z tym potrzebny był jasny i łatwy do przestrzegania protokół dostosowany do ustawień o niskich zasobach w celu standaryzacji endemicznych miejsc polowych malarii W przypadku cytrynianu sodu vacutainer zbiera około pięciu mililitrów krwi pełnej od żywiciela, który nie ma wcześniej chorego na malarię, lub 2,5 mililitra krwi od pacjentów z malarią CM lub SM.

Odwirować krew pełną w temperaturze 250 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie przenieś mętny supernatant do czystej 15-mililitrowej probówki. Pamiętaj, że płytki krwi są łatwo aktywowane przez temperaturę, zmiany i wstrząsy fizyczne.

Wyliczyć zawiesinę PRP za pomocą cytometru hemologicznego Annoy Bowera i dostosować do pożądanego stężenia za pomocą PBS, aby uzyskać osad osocza ubogiego w płytki krwi, większość płytek krwi z części frakcji PRP przez wirowanie w 1500 GS przez 10 minut. Frakcje PRP i PPP należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do ośmiu do 10 dni. Najlepiej przy użyciu świeżych płytek krwi do testu zbrylania.

Przemyj granulowane obwodowe krwinki czerwone trzykrotnie pięcioma do 10 mililitrami RPMI 1640 w kolbie hodowlanej Uzupełnij PRBC standardową kulturą malarii, pożywką i świeżymi niezakażonymi krwinkami czerwonymi, aby uzyskać 5% hematokryt. Przesiąknąć kolby hodowlane mieszaniną 92,5% azotu, 2,5% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Następnie foka i hodowla dojrzałych pasożytów od pacjentów pbc.

Inkubować kolbę hodowlaną przez 24 do 36 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza w temperaturze 5% dwutlenku węgla. Umieść około 10 do 15 mikrolitrów krwi na jednym końcu szkiełka z matowego szkła spoczywającego na płaskiej powierzchni. Dotknij kropli krwi krawędzią drugiego szkiełka, aż krew zostanie równomiernie rozprowadzona na krawędzi drugiego szkiełka, trzymając drugi szkiełko pod kątem 45 stopni.

Szybko, ale delikatnie, nie wywierając zbyt dużego nacisku na pierwszy szkiełko, równomiernie rozprowadź krew na pierwszym szkiełku. Następnie wysuszyć na powietrzu cienką warstwę krwi, odwodnić obszar próbki metanolem przez 10 sekund. Następnie wysuszyć na powietrzu, a następnie zanurzyć próbkę w 2% keem.

Przytrzymaj przez co najmniej 10 minut. Dokładnie spłucz, aż woda będzie czysta i sucha na powietrzu. Zbadaj próbki pod soczewką emulsji olejowej 100 x pod mikroskopem świetlnym.

Następnie oczyść i zsynchronizuj dojrzałą parum PFS, PRBC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wszyscy przenoszą kulturę do czystej, sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze pokojowej przy 370 GS przez pięć minut.

Teraz ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadu. Następnie ponownie zawieś komórki w taki sposób, aby połowa całkowitej objętości uległa fuzji galaretki. Jedna trzecia drugiej połowy to pożywka bezbiałkowa, a dwie trzecie drugiej połowy to pbcs.

Przenieść zawiesinę do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów i inkubować przez 15 do 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż utworzy się wyraźne rozgraniczenie między górnym i dolnym poziomem. Ostrożnie przenieś górną warstwę do świeżej sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów i dodaj 10 mililitrów świeżej wirówki RPMI o temperaturze od 370 do 430 GS przez pięć minut. Następnie ostrożnie wyrzuć supernatant.

Teraz oceń parsit i etap rozwoju za pomocą cienkiego rozmazu krwi i zbadaj pod mikroskopem świetlnym, jak opisano wcześniej. Dostosuj zawiesinę P RBC otrzymaną po flotacji żelu plazmowego do jednego razy 10 do ósmego P RBC na mikrolitr w świeżej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Zawieszamy pbcs na poziomie 5% hematokrytu aine pomarańczy lub bromku atherium w stężeniu 20 mikrogramów na mililitr, stężeniu końcowym i PRP w 10% całkowitej objętości.

Podobnie, należy przygotować następujące kontrole niezakażone krwinki czerwone oraz PRP i PRBC z PPP, aby ustalić rolę płytek krwi w zlepianiu się PBC. Teraz przenieść zawiesinę do fiolki z nakrętką o pojemności dwóch mililitrów. Umieścić fiolkę pod delikatnym mieszaniem, tocząc z prędkością 10-12 RRP w temperaturze pokojowej, pobierając próbki w odstępach 15-20 minut, w sumie przez 120 minut, aby sprawdzić, czy nie tworzy się grudki.

Pobrać pipetą 10 mikrolitrów próbki na szkiełko podstawowe i przykryć szkiełkiem szklanym w celu zbadania pod wpływem fluorescencji, Za grudkę uważa się agregat trzech lub więcej zakażonych erytrocytów. W eksperymencie tym oznaczono około 70% dojrzałych stadiów p FALs parem po wzbogaceniu przez flotację żelu plazmowego, grudki są łatwo dostrzegalne pod mikroskopem, jak w normalnym świetle. Pojawiają się jako agregaty komórkowe i pod wpływem fluorescencji jako plamy koloru zielonego lub czerwonego.

Po zabarwieniu acro i pomarańczowym lub atherium bromek umiera odpowiednio. Rozmiar grudki znacznie wzrasta do średnio ponad 15 pbcs na kępę po inkubacji przez 120 minut, przy czym niektóre grudki zawierają wiele pbc na kępę, których nie można było wizualnie policzyć. Częstość fenotypu zlepiania się oblicza się jako liczbę zakażonych komórek obecnych w kępkach na 1000 zakażonych komórek policzonych w zduplikowanych testach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś teraz dobrze zrozumieć, jak wykonać Plasmodium falciparum, test zbrylania za pośrednictwem płytek krwi. Należy uważać, aby nie aktywować płytek krwi gwałtownymi ruchami i zmianami temperatury. Test ten może być również stosowany do pomiaru testu zbrylania się płytek krwi w ciężkiej malarii.