Name: Prosty protokół zlepiania się erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum za pośrednictwem płytek krwi w warunkach ubogich w zasoby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj metodę zlepiania się erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum za pośrednictwem płytek krwi w warunkach ubogich w zasoby. Protokół umożliwia standaryzację badań nad patologią malarii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została zrealizowana dzięki finansowaniu z The Wellcome Trust. JM (080964) oraz SCW (080948) otrzymali wsparcie w ramach stypendiów Wellcome Trust, a DT w ramach stypendium studenckiego Malawi-Liverpool-Wellcome Trust.

1. Pobieranie próbek
Płytki krwi mogą zostać łatwo aktywowane pod wpływem temperatury, wstrząsania lub przechowywania, dlatego należy z nimi obchodzić się ostrożnie. Stosowanie probówek typu vacutainer do pobierania krwi w celu przygotowania płytek jest w większości sytuacji klinicznych nieuniknione, jednak powinno być starannie rozważone, ponieważ ssanie może potencjalnie powodować aktywację płytek. Ze względu na protokół kliniczny stosowany w naszym szpitalu badawczym, nasze próbki są ostrożnie pobierane do probówek z cytratem sodu. Zarówno w niniejszym, jak i w naszym poprzednim badaniu 12 nie odnotowaliśmy problemów z przedwczesną aktywacją płytek. Krew do przygotowania płytek pobieramy od osób z grupą krwi O+, aby zminimalizować nieswoistą agregację antygenów grup krwi. Dawcy nie przyjmowali również leków w ciągu ostatnich 7-10 dni, ponieważ niektóre preparaty farmakologiczne mogą wpływać na funkcję płytek.
1.1 Przygotowanie osocza bogatopłytkowego (PRP)
<ol>
	<li>Pobrać około 5 ml krwi pełnej od gospodarza naiwnego na malarię lub 2,5 ml krwi od pacjentów z CM lub ciężką malarią (SM) do probówki typu vacutainer z cytrynianem sodu (numer produktu BD 36276).</li>
	<li>Wirować krew pełną z prędkością 250 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Nie wirować w 4 °C, ponieważ niskie temperatury mogą powodować agregację płytek krwi.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść mętny nadsącz do czystej probówki o pojemności 15 ml. Płytki krwi są łatwo aktywowane przez zmiany temperatury i wstrząsy fizyczne, dlatego należy z nimi obchodzić się ostrożnie. Unikać potrząsania lub gwałtownych ruchów probówką.</li>
	<li>Użyć hematocytometru Neubauera, aby policzyć i dostosować zawiesinę płytek krwi do stężenia &gt;300 x 103 płytek/μl dla zdrowych dawców i &lt;150 x 103 płytek/μl dla pacjentów z CM i SM, wykorzystując 1X bufor fosforanowy (pH 7,2-7,4; PBS). Należy wybrać wysoki stopień rozcieńczenia, aby ułatwić liczenie płytek i zapewnić dokładność pomiaru.</li>
</ol>
Uwaga: Pacjenci z malarią mają obniżoną liczbę płytek krwi w porównaniu do osób zdrowych 16,17,18. Dlatego stężenia płytek krwi dla CM i UM są dostosowane do średniej liczby płytek krwi u pacjentów w każdej z grup diagnostycznych malarii. Fenotyp agregacji P. falciparum jest powszechny w izolatach CM i wykazuje silne powinowactwo wiązania, zatem obniżone stężenia płytek krwi nie wpływają na wielkość ani częstotliwość agregacji, ponieważ stężenie płytek krwi jest standaryzowane dla wszystkich przypadków CM.
1.2 Przygotowanie osocza ubogopłytkowego (PPP)
<ol>
	<li>Aby uzyskać PPP, odwiruj część otrzymanego wcześniej PRP z prędkością 1,500 x g przez 10 min. Większość płytek krwi zostanie osadzona w formie osadu na dnie probówki.</li>
	<li>Zarówno PRP, jak i PPP można przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni. W celu przeprowadzenia testu agregacji najlepiej użyć świeżych płytek krwi. Po 8–10 dniach większość płytek prawdopodobnie będzie nieaktywna i prawdopodobnie zagregowana.</li>
</ol>
2. Hodowla pasożyta
<ol>
	<li>Osad pRBC przemyć trzykrotnie 5-10 ml RPMI 1640 poprzez wirowanie przy 370 x g przez 5 min. 
	Uwaga: w niniejszym protokole wszystkie hodowle rozpoczynano od około 1 ml objętości skondensowanych krwinek (PCV) i utrzymywano przy hematokrycie 5%. Hodowle można rozpoczynać z dowolną wartością PCV pRBC i odpowiednio dostosowywać ją za pomocą niezakażonych RBC oraz pożywki, aby osiągnąć pożądany hematokryt.</li>
	<li>Przenieść pRBC do kolby hodowlanej i uzupełnić standardową pożywką do hodowli malarii RPMI 1640 z dodatkiem 25 mM HEPES, 5% Albumax II lub 10% surowicy oraz 40 μg/ml gentamycyny, aby uzyskać hematokryt 5%.</li>
	<li>Przed zamknięciem i inkubacją przepuścić przez kolby hodowlane mieszaninę 92,5% azotu, 2,5% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Alternatywnie można zastosować metodę szczelnego słoja z knotem (candle jar) według Trager-Jensen.</li>
	<li>W przypadku pRBC otrzymanych bezpośrednio od pacjentów, inkubować kolbę hodowlaną przez 24-36 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C w 5% CO2, aby uzyskać dojrzałe pasożyty. 
	UWAGA: Większość linii laboratoryjnych i adaptowanych do hodowli jest bardzo łatwa w utrzymaniu w kulturze w standardowych warunkach. Poniżej opisano proste techniki, które można wykorzystać do synchronizacji różnych stadiów pasożytów w celu zachowania tempa wzrostu.</li>
	<li>Przygotować cienki rozmaz krwi zgodnie z poniższym opisem i zbadać dojrzewanie pasożytów pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
3. Przygotowanie cienkiego rozmazu krwi
<ol>
	<li>Nanieść około 10-15 μl krwi na jeden koniec matowego szkiełka przedmiotowego leżącego na płaskiej powierzchni.</li>
	<li>Dotknąć kropli krwi krawędzią drugiego szkiełka, aż krew równomiernie rozprzestrzeni się wzdłuż krawędzi drugiego szkiełka.</li>
	<li>Trzymając drugie szkiełko pod kątem 45°, szybko, lecz delikatnie i bez wywierania zbyt dużego nacisku na pierwsze szkiełko, przesunąć krew po jego powierzchni, aby utworzyć cienką, równomiernie rozprowadzoną warstwę krwi. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Zanurzyć szkiełko w metanolu na 10 sec. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Zanurzyć szkiełko w 2% barwniku Giemsy na co najmniej 10 min. Płukać obficie, aż woda stanie się czysta. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Obejrzeć preparat pod mikroskopem świetlnym, używając olejowego obiektywu o powiększeniu 90-100x.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie i synchronizacja stadiów bezpłciowych
Oczyszczanie dojrzałych pRBC P. falciparum jest niezbędnym etapem testu aglutynacji (clumping assay). W rzeczywistości tylko dojrzałe pasożyty są zdolne do wiązania się z receptorami płytek krwi, ponieważ to na tym etapie cyklu życiowego ekspresowane są odpowiednie ligandy, które wystają z powierzchni zakażonych erytrocytów. Istnieje kilka metod oczyszczania i synchronizacji stadiów bezpłciowych P. falciparum: późne stadia bezpłciowe można wzbogacić za pomocą gradientu Percoll 19, magnetycznego sortowania komórek 20 lub stosując protokół sedymentacji w żelatynie 21 opisany w niniejszej pracy. Synchronizacja sorbitolem pozwala na wyselekcjonowanie stadiów pierścieniowych 22, które następnie hoduje się przez 24-26 hr w celu uzyskania stadiów dojrzałych (bez konieczności przeprowadzania flotacji w żelatynie).
4.1 Flotacja w Plasmagelu
Flotacja w żelu plazmowym (plasmagel) wykorzystuje roztwór przypominający żelatynę do selekcji lżejszych, guzowatych erytrocytów, które pozostają w roztworze, podczas gdy formy pierścieniowe o większej gęstości oraz rozetki opadają na dno. Technika ta pozwala uzyskać do 90% czystości erytrocytów zainfekowanych w stadium dojrzałym i może być stosowana zarówno w przypadku izolatów polowych, jak i laboratoryjnych. Jednakże, jak wspomniano wcześniej, flotacja w żelu plazmowym usuwa pRBC tworzące rozety, a także stadia niedojrzałe, co może prowadzić do zmniejszenia częstotliwości agregacji (clumping) w próbkach o wysokiej częstotliwości tworzenia rozet. Niemniej jednak, brak pRBC tworzących rozety po flotacji w żelu plazmowym nie wpływa na test agregacji, ponieważ tworzenie rozet jest interakcją pRBC z niezinfekowanymi erytrocytami, natomiast agregacja polega na wiązaniu pRBC za pośrednictwem płytek krwi. Ligandy zaangażowane w te dwie cechy są różne; za tworzenie rozet odpowiada głównie receptor dopełniacza CR-1 na niezinfekowanych erytrocytach.
<ol>
	<li>Podgrzej roztwór Gelofusine oraz pożywkę bez surowicy/Albumax II do 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Przenieś kulturę do czystej, sterylnej probówki 15 ml i odwirowuj komórki w temperaturze pokojowej przy 370 x g przez 5 min.</li>
	<li>Ostrożnie odessaj nadsącz, aby nie naruszyć osadu, a następnie resuspenduj komórki w równym objętościowo roztworze Gelofusine i pożywki bezbiałkowej.</li>
	<li>Przenieś mieszaninę do sterylnej probówki 15 ml i pozostaw na 15-20 min w inkubatorze w 37 °C lub do momentu uzyskania wyraźnego rozwarstwienia na poziom górny i dolny.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś górną warstwę do nowej sterylnej probówki 15 ml i dodaj 10 ml świeżego RPMI.</li>
	<li>Wirowuj przy 370 x g przez 5 min, a następnie ostrożnie odlej nadsącz.</li>
	<li>Oceń poziom pasożytemii oraz stadium rozwojowe za pomocą cienkiego rozmazu krwi i zbadaj go pod mikroskopem świetlnym, zgodnie z opisem w sekcji 4.</li>
</ol>
UWAGA: Odsetek dojrzałych pRBC mieści się w zakresie 60-90% zainfekowanych erytrocytów, w zależności od początkowej parasitemii hodowli. Aby uzyskać wysoki odsetek dojrzałych pasożytów, należy stosować hodowle o początkowej parasitemii ≥10%.
5. Test aglutynacji
<ol>
	<li>Użyj komory Neubauera, aby policzyć i dostosować stężenie zawiesiny pRBC uzyskanej po flotacji w żelu plazmowym do 1 x 108 pRBC/μl.</li>
	<li>W nowej probówce 1,5 ml resuspenduj pRBC przy hematokrycie 5%, pomarańczowej akrydynie w końcowym stężeniu 20 μg/ml oraz PRP w ilości stanowiącej 10% całkowitej objętości. 
	Zamiast pomarańczowej akrydyny, kultury pasożytów można barwić bromkiem etydyny w stężeniu 25 μg/ml przez 5 min przed użyciem. 
	Np. Dla 200 μl mieszaniny reakcyjnej dodaj 10 μl dojrzałych pRBC, 20 μl płytek krwi w stężeniu 300 x 103 platelets/μl dla PRP od zdrowych dawców lub 150 x 103 platelets/μl od pacjentów z SM oraz 170 μl medium bezbiałkowego. 
	UWAGA: Stosunek płytek krwi do pRBC w końcowych reakcjach wynosi 20:1. Jest to istotne, ponieważ pozwala na określenie maksymalnej częstotliwości agregacji w próbce. Jeśli w kontrolach dodano mniej płytek, nie wszystkie pRBC zdolne do agregacji mogą mieć możliwość utworzenia skupisk.</li>
	<li>W ten sam sposób przygotuj następujące kontrole: niezakażone erytrocyty i PRP oraz pRBC z PPP, aby określić rolę płytek krwi w agregacji pRBC.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę do stożkowej probówki z zakrętką o pojemności 1,5-2,0 ml.</li>
	<li>Poddaj probówkę łagodnemu mieszaniu poprzez toczenie z prędkością 10-12 rpm w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Sprawdź tworzenie się skupisk za pomocą preparatu świeżego, nanosząc pipetą 10 μl mieszaniny pRBC ± płytek krwi na szkiełko przedmiotowe, przykrywając je szkiełkiem nakrywnym i badając pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Pobieranie próbek można przeprowadzać w odstępach 15-20 min przez łącznie 120 min. Za skupisko uznaje się agregat trzech lub więcej zakażonych erytrocytów.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Saul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+variant+surface+antigens+on+malaria-infected+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Today%22%5BJournal%5D)">The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells.</a> Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).</li>
<li>Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Malaria pathogenesis.</a> Science. 264, 1878-1883 (1994).</li>
<li>Newbold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-specific+adhesion+and+clinical+disease+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).</li>
<li>Turner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+study+of+the+pathology+of+fatal+malaria.+Evidence+for+widespread+endothelial+activation+and+a+potential+role+for+intercellular+adhesion+molecule-1+in+cerebral+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration.</a> Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).</li>
<li>Fried, M., Duffy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherence+of+Plasmodium+falciparum+to+chondroitin+sulfate+A+in+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta.</a> Science. 272, 1502-1504 (1996).</li>
<li>Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P.+falciparum+rosetting+mediated+by+a+parasite-variant+erythrocyte+membrane+protein+and+complement-receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1.</a> Nature. 388, 292-295 (1997).</li>
<li>Udomsangpetch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+-infected+erythrocytes+form+spontaneous+erythrocyte+rosettes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes.</a> J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).</li>
<li>Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+conserved+Plasmodium+falciparum+var+gene+implicated+in+malaria+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy.</a> J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).</li>
<li>Biswas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+uses+gC1qR%2FHABP1%2Fp32+as+a+receptor+to+bind+to+vascular+endothelium+and+for+platelet-mediated+clumping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping.</a> PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).</li>
<li>Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+accumulation+in+brain+microvessels+in+fatal+pediatric+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria.</a> J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).</li>
<li>Wassmer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-induced+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+from+Malawian+patients+with+cerebral+malaria-possible+modulation+in+vivo+by+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia.</a> J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).</li>
<li>Mayor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+severe+malaria+outcomes+with+platelet-mediated+clumping+and+adhesion+to+a+novel+host+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor.</a> PLoS One. 6, e19422(2011).</li>
<li>Arman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-Mediated+Clumping+of+Plasmodium+falciparum+Infected+Erythrocytes+Is+Associated+with+High+Parasitemia+but+Not+Severe+Clinical+Manifestations+of+Malaria+in+African+Children%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).</li>
<li>Arman, M., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+conditions+affect+the+outcome+of+Plasmodium+falciparum+platelet-mediated+clumping+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays.</a> Malar. J. 7, 243(2008).</li>
<li>Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombocytopenia+in+malaria+with+immunoglobulin+%28IgM%29+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes.</a> Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).</li>
<li>Jy, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregates+as+markers+of+platelet+activation%3A+characterization+of+flow+cytometric+method+suitable+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications.</a> Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).</li>
<li>Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection-induced+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">Infection-induced thrombocytopenia.</a> Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).</li>
<li>Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+humoral+immune+response+in+Plasmodium+falciparum+malaria.+II.+IgG+subclass+levels+of+anti-P.+falciparum+antibodies+in+different+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera.</a> Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).</li>
<li>Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MACS%22%5BJournal%5D)">Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> MACS. 4, 7-8 (2000).</li>
<li>Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mature-stage+Plasmodium+falciparum+by+gelatine+flotation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Trop.+Med.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
<li>Chotivanich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-induced+autoagglutination+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells+and+disease+severity+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand.</a> J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).</li>
<li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+is+a+common+adhesive+phenotype+and+is+associated+with+severe+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).</li>
<li>Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-adrenergic+stimulation+of+phosphatidylinositol+synthesis+in+human+platelets+as+an+alpha-2+effect+secondary+to+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation.</a> J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).</li>
<li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma%3A+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisaliśmy test aglutynacji pośredniej z udziałem płytek krwi, wykorzystywany do badania pRBC w izolatach klinicznych bezpośrednio w terenie. Aglutynacja pośrednia z udziałem płytek krwi, będąca charakterystycznym zachowaniem w P. falciparum izolaty kliniczne, został zidentyfikowany jako odrębny fenotyp adhezyjny, często występujący w izolatach wiążących CD36 12,23-24Wykorzystaliśmy ten test do zidentyfikowania trzech głównych kwestii: 1) silnej in vitro fenotyp agregacji P. falciparum 1) wyizolowany od dzieci z Malawi, który jest powiązany z ciężkością przebiegu choroby i diagnozą, 2) nowy receptor P-selektyna pośredniczy w agregacji płytek krwi wraz z CD36, 3) stopień małopłytkowości występujący u pacjentów z CM jest wystarczający, aby ograniczyć dalsze tworzenie się agregatów pRBC in vitro 12Udział płytek krwi w tworzeniu skupisk wykazano poprzez badanie preparatu na świeżo, zgodnie z opisem w sekcji 6. Płytki krwi można wyizolować z PRP poprzez wirowanie z wysoką prędkością w celu zminimalizowania reakcji antygenowych grup krwi; jednak w niniejszej pracy zastosowano pełne PRP, aby ograniczyć przedwczesną aktywację płytek wynikającą z nadmiernej manipulacji oraz wirowania z wysoką prędkością. Aktywność płytek krwi można zmierzyć za pomocą testu agregacji płytek z użyciem słabych agonistów płytek, takich jak adrenalina lub difosforan adenozyny (ADP). 25 zgodnie z opisem w 26.
Istnieje kilka aspektów testu, które wcześniej były słabo scharakteryzowane; jednym z nich jest znaczenie wyboru źródeł PRP oraz wpływ grup antygenowych krwi na wynik testu. Przygotowaliśmy PRP od osób z grupą krwi O+, które nie przyjmowały żadnych leków w ciągu ostatnich 7-10 dni przed pobraniem krwi, ponieważ niektóre preparaty farmaceutyczne mogą wpływać na zachowanie płytek krwi.
Inne czynniki, które mogą wpływać na powodzenie procesu agregacji, obejmują hematokryt pRBC, poziom parasitemii oraz czas trwania testu agregacji. Przy wysokim hematokrycie i liczbie płytek krwi trudno byłoby rozstrzygnąć, czy skupisko jest faktycznie agregatem, czy też zbyt wiele komórek znajduje się blisko siebie jedynie z powodu gęstego upakowania 15. Agregacja zazwyczaj wzrasta również wraz z wydłużeniem czasu inkubacji. Są to przydatne wytyczne, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania badań nad agregacją.
Stwierdzamy, że próbki z różnych grup klinicznych mogą być analizowane równolegle przy użyciu PRP od tego samego dawcy, jeśli jest to możliwe, jednak w warunkach ograniczonych zasobów, takich jak stanowiska terenowe, pula transfuzji jest zazwyczaj ograniczona. Trudno jest zatem pozyskać jednego dawcę grupy O+, aby zestandaryzować testy. W związku z tym zidentyfikowano kilku dawców grupy O+, aby w miarę możliwości zapewnić zgodność grup krwi. Wykorzystanie wielu dawców jest pomocne również w przypadku dużych liczebności próbek, tak aby obciążenie związane z oddawaniem krwi nie spoczywało tylko na jednej osobie.
Punkty pobierania próbek w 15-20 min są znacznie bardziej praktyczne, jeśli testy przeprowadza jedna osoba, co pozwala na przygotowanie preparatów na świeżo i badanie kinetyki testu bez nakładania się czasów pobierania próbek. Większość danych mikroskopowych ma charakter wizualny i w pewnym stopniu obiektywny; dlatego ważne jest, aby liczenie komórek zostało zweryfikowane przez więcej niż jedną osobę. W takim przypadku analiza jednej próbki naraz pozwala na pełną analizę od trzech do czterech próbek dziennie, w zależności od wydajności osobistej.
Agregację zapośredniczoną przez płytki krwi można przeprowadzać z użyciem zarówno izolatów klinicznych, jak i laboratoryjnych. W przypadku linii laboratoryjnych zaleca się stosowanie pasożytów wiążących CD36, aby zmaksymalizować częstość agregacji. Test ten można łączyć z innymi testami aglutynacji, takimi jak tworzenie rozet, lub wykorzystać w testach inhibicji agregacji, co umożliwiłoby badanie receptorów na płytkach krwi, które mogą zapośredniczać wiązanie pRBC – aspektu tego fenotypu słabo rozpoznanego i zbadanego.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870-092</td><td> </td></tr><tr><td>Pomarańcz akrydynowy</td><td>Invitrogen</td><td>A3568</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelofusine</td><td>B Braun</td><td>Gelofusine</td><td> </td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td> </td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15750045</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Albumax</td><td>GIBCO</td><td>1102-037</td><td> </td></tr><tr><td>Probówka vacutainer z cytrynianem sodu</td><td>BD</td><td>362760</td><td>pojemność 4 ml</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Leica</td><td>MD16000 B</td><td> </td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>Zawiera filtry fluorescencyjne światła niebieskiego i zielonego dla pomarańczu akrydynowego i bromku etydyny</td></tr></tbody></table>

prosty protokół badania agregacji erytrocytów zakażonych plasmodium falciparum indukowanej przez płytki krwi w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum wywołuje większość ciężkich zakażeń malarią. Mechanizmy patofizjologiczne leżące u podstaw malarii mózgowej (CM) nie są w pełni zrozumiałe i wysunięto kilka hipotez, w tym mechaniczną niedrożność mikronaczyń spowodowaną przez zainfekowane przez P. falciparum erytrocyty (pRBC). Rzeczywiście, podczas wewnątrzerytrocytowego etapu swojego cyklu życiowego, P. falciparum posiada unikalną zdolność modyfikowania powierzchni zakażonego erytrocyta poprzez eksport antygenów powierzchniowych o różnych właściwościach adhezyjnych na błonę RBC. Umożliwia to sekwestrację pRBC w wielu tkankach i organach poprzez adhezję do komórek śródbłonka wyściełających mikronaczynia żylułek pocapilarnych 1. W ten sposób dojrzałe formy pasożyta unikają usuwania zdeformowanych zakażonych erytrocytów przez śledzionę 2 i ograniczają swoje środowisko do korzystniejszego niskiego ciśnienia tlenu 3. W konsekwencji tej sekwestracji w krwi obwodowej można wykryć jedynie niedojrzałe pasożyty bezpłciowe oraz gametocyty.
Cytoadhezja i sekwestracja dojrzałych pRBC do licznych receptorów gospodarza występujących w łożyskach mikronaczyniowych zachodzi zarówno w ciężkiej, jak i niepowikłanej postaci choroby. Jednakże szereg dowodów sugeruje, że tylko specyficzne fenotypy adhezyjne są prawdopodobnie powiązane z ciężkimi skutkami patologicznymi malarii. Przykład takich specyficznych interakcji gospodarz-pasożyt wykazano in vitro, gdzie zdolność cząsteczki adhezji międzykomórkowej-1 do wspierania wiązania pRBC o szczególnych właściwościach adhezyjnych powiązano z rozwojem malarii mózgowej 4,5. Łożysko zostało również uznane za miejsce preferencyjnej akumulacji pRBC u kobiet w ciąży zakażonych malarią, przy czym głównym receptorem jest siarczan chondroityny A występujący na syncytiotrofoblastach wyściełających przestrzeń międzywłośniczkową łożyska 6. Tworzenie rozet pRBC z niezinfekowanymi erytrocytami za pośrednictwem receptora dopełniacza 1 (CD35)7,8 również było wiązane z ciężkim przebiegiem choroby 9.
Jednym z ostatnio opisanych fenotypów cytoadhezji P. falciparum jest zdolność pRBC do tworzenia agregatów z udziałem płytek krwi in vitro. Tworzenie takich agregatów pRBC wymaga obecności CD36, glikoproteiny ekspresjonowanej na powierzchni płytek krwi. Wykazano również, że inny ludzki receptor, gC1qR/HABP1/p32, ekspresjonowany w różnych typach komórek, w tym w komórkach śródbłonka i płytkach krwi, ułatwia adhezję pRBC do płytek krwi w celu tworzenia agregatów 10. Pozostaje niejasne, czy agregacja ta zachodzi in vivo, ale może ona wyjaśniać znaczną akumulację płytek krwi opisaną w mikrokrążeniu mózgowym dzieci z Malawi, które zmarły z powodu CM 11. Ponadto zdolność kultur izolatów klinicznych do agregacji in vitro była bezpośrednio powiązana z ciężkością choroby u pacjentów z Malawi 12 i Mozambiku 13 (choć nie u pacjentów z Mali 14).
Z uwagi na fakt, że kilka aspektów fenotypu agregacji pRBC nie zostało dobrze scharakteryzowanych, obecne badania w tym zakresie nie opierają się na zestandaryzowanej procedurze. Jest to istotny problem ze względu na znaną wysoką zmienność właściwą dla tego testu 15. Przedstawiamy tutaj metodę agregacji P. falciparum pośredniczonej przez płytki krwi in vitro z nadzieją, że stanie się ona podstawą dla spójnej metody stosowanej przez inne grupy badawcze i zwiększy świadomość ograniczeń związanych z badaniem tego fenotypu w przyszłych studiach. Działając w Malawi, opracowaliśmy protokół zaprojektowany specjalnie dla warunków ograniczonych zasobów, co daje tę zaletę, że świeżo pobrane izolaty kliniczne mogą być badane pod kątem fenotypu bez konieczności kriokonserwacji.

Przykład testu zlepiania zapśredniczonego przez płytki krwi z wykorzystaniem około 70% dojrzałych stadiów P. falciparum po wzbogaceniu metodą flotacji w plasmagelu przedstawiono na Ryc. 2. Zlep (clump) to agregat trzech lub więcej zainfekowanych erytrocytów. Barwienie pomarańczem akrydynowym lub bromkiem etydyny można wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pomarańcz akrydynowy jest podobny spektralnie do fluoresceiny, z maksimum wzbudzenia przy 502 nm i maksimum emisji przy 525 nm (zielony), natomiast bromek etydyny ma maksimum wzbudzenia przy 493 nm i maksimum emisji przy 620 nm (podobnie jak barwniki rhodaminowe, czerwony). Zlepy są łatwo dostrzegalne pod mikroskopem, ponieważ w świetle przechodzącym wyglądają jak agregaty komórek, a w fluorescencji jako zielone lub czerwone plamy przy barwieniu odpowiednio pomarańczem akrydynowym lub bromkiem etydyny, co pokazano na Ryc. 2 (punkt czasowy 30 min z użyciem pomarańczu akrydynowego). Im większe są zlepy, tym większy agregat komórek jest widoczny w świetle przechodzącym i tym większe są zielone lub czerwone plamy w fluorescencji dla odpowiednich barwników. Ponieważ barwniki wiążą się z DNA i w związku z tym barwią jądra, płytki krwi i niezainfekowane RBC nie są wykrywane w mikroskopii fluorescencyjnej ze względu na brak jąder komórkowych.
Po 30 min dochodzi do przypadkowej formacji małych skupisk pRBC, zawierających 4,7±1,6 pRBC/skupisko. Wielkość skupisk znacząco wzrasta do średnio &gt;15 pRBC/skupisko po 120 min inkubacji, przy czym niektóre skupiska zawierają liczne pRBC/skupisko, których nie można było policzyć wizualnie. Częstotliwość fenotypu agregacji oblicza się jako liczbę zainfekowanych komórek obecnych w skupiskach/1 000 zainfekowanych komórek, policzonych w dwóch powtórzeniach pomiarowych.
<img alt="Schemat przetwarzania krwi: regulacja liczby płytek krwi, wirowanie, dojrzewanie i analiza tworzenia agregatów." fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat doświadczenia dotyczącego agregacji. Plazmę bogatą i ubogą w płytki krwi (A) oraz kulturę erytrocytów zainfekowanych P. falciparum (B) przygotowuje się, a następnie łączy w celu przeprowadzenia testu agregacji (C).
<img alt="Time-lapse z mikroskopii fluorescencyjnej pokazujący żywotność komórek w ciągu 120 minut, z podkreśleniem zmian komórkowych." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Agregacja erytrocytów zainfekowanych izolatem laboratoryjnym P. falciparum. Agregaty utworzone przez szczep HB3 w czasie 0, 30 i 120 min w osoczu bogatym w płytki krwi (A) oraz słaba agregacja w osoczu ubogim w płytki krwi (B).
Ograniczenia analizy
Istnieją ograniczenia, które wpływają konkretnie na funkcję płytek krwi lub rzutują na wynik badania, a większość z nich została już wskazana przez Armana i Rowe 15. Poniżej wymieniamy niektóre z potencjalnych problemów, które mogą wystąpić na różnych etapach testu:
<ol>
	<li>Adaptacja izolatów klinicznych do hodowli in vitro może być wyzwaniem, ponieważ czasami wymagane są dłuższe okresy hodowli, aby osiągnąć wystarczająco wysoką parasytemię umożliwiającą tworzenie się agregatów. Ze względu na wysoką stopę zmienności antygenowej u P. falciparum, fenotyp adhezyjny pasożyta zaadaptowanego do hodowli może nie odzwierciedlać pierwotnej populacji pasożytów zakaźnych po długotrwałym okresie hodowli.</li>
	<li>Aby uniknąć nieswoistej aglutynacji spowodowanej antygenami grup krwi, dawcy płytek krwi powinni być dopasowani pod względem antygenów grupy krwi do izolatów klinicznych stosowanych w tym samym teście lub należy użyć krwi z grupy O- (uniwersalny dawca). Jednak osoby z grupą krwi O- są rzadko spotykane w regionach Afryki, takich jak Malawi, dlatego powszechnie stosowane płytki krwi pochodzą od dawców z grupą krwi O+ i muszą być dopasowane pod względem grupy krwi.</li>
	<li>Liczenie agregatów w preparacie świeżym (wet mount) jest uciążliwe i utrudnia rejestrację obrazu, ponieważ komórki znajdują się w ciągłym ruchu. Zazwyczaj pRBC gromadzą się na krawędziach szkiełka nakrywkowego lub mają tendencję do zlepiania się, tworząc „fałszywe” agregaty, które można łatwo pomylić z rzeczywistymi. Aby ograniczyć ruch komórek, należy pozwolić im osiadać przez 15 min w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do analizy.</li>
	<li>Test agregacji jest wrażliwy na czas, dlatego w celu uzyskania optymalnej dokładności jedna osoba może analizować tylko jedną próbkę naraz. Punkty czasowe pobierania próbek dla dwóch różnych próbek mogą łatwo na siebie nachodzić, co prowadzi do niezgodności punktów czasowych pomiędzy próbkami w przypadku jednoczesnej obsługi więcej niż jednej z nich. W takich okolicznościach zaawansowane oprogramowanie ilościowe mogłoby obliczyć wielkość agregatów lub alternatywnie można by zastosować przeciwciała specyficzne dla komórek, aby przeanalizować skład agregatów. Choć techniki te mogłyby znacznie zwiększyć istotność danych, w warunkach ograniczonej dostępności zasobów, gdzie prawdopodobne jest stosowanie tego testu, takie techniki i sprzęt nie są łatwo dostępne.</li>
</ol>

Metoda ta bada fenotyp agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum (pRBC) pośredniczonej przez płytki krwi w izolatach klinicznych. Jest to realizowane poprzez izolację oraz wspólną inkubację osocza bogatopłytkowego i zawiesiny pRBC.

Prosty protokół badania agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum indukowanej przez płytki krwi w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów

P. falciparum wywołuje większość ciężkich zakażeń malarią. Mechanizmy patofizjologiczne leżące u podstaw malarii mózgowej (CM) nie są w pełni...

Niniejsza procedura przedstawia ustandaryzowane wytyczne dotyczące przeprowadzania testów agregacji zapśredniczonej przez płytki krwi dla klinicznych lub laboratoryjnych izolatów Plasmodium falciparum. W pierwszej kolejności należy pobrać krew od zakażonego pacjenta i wyizolować erytrocyty z pasożytami poprzez wirowanie, a następnie hodować i oczyszczać dojrzałe stadia aseksualne. Następnie należy pobrać krew od zdrowego dawcy w celu przygotowania i standaryzacji osocza bogatego w płytki krwi za pomocą wirowania.Połącz płytki krwi i erytrocyty z pasożytami w celu przeprowadzenia testu aglutynacji. Wyniki mikroskopii immunofluorescencyjnej mogą wykazać skupiska P. falciparum pośredniczące w procesie aglutynacji płytki krwi. Technika ta została opracowana specjalnie do pomiaru fenotypu aglutynacyjnego plasmodium sra.Izolaty kliniczne w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów. Doniesiono, że minimalne różnice w procedurach mogą zwiększać wpływ na wynik testu klastrowania kwasowego w terenie. W związku z tym konieczne było opracowanie przejrzystego i łatwego do naśladowania protokołu, dostosowanego do warunków niskozasobowych, w celu standaryzacji działań w endemicznych obszarach występowania malarii. Do probówki typu vacutainer z cytrynianem sodu należy pobrać około pięciu mililitrów krwi pełnej od gospodarza, u którego nie wystąpiła malaria, lub 2,5 mililitrów krwi od pacjentów z malarią w postaci mózgowej (CM) lub ciężkiej nie mózgowej (SM).Odwirować krew pełną przy 250 Gs przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie przenieść mętny nadsącz do czystej probówki o pojemności 15 mililitrów. Należy pamiętać, że płytki krwi są łatwo aktywowane przez zmiany temperatury oraz wstrząsy fizyczne.Wyznacz liczbę płytek w zawiesinie PRP za pomocą komory countingowej Neubauera i dostosuj do pożądanej stężenia za pomocą PBS, aby uzyskać osocze ubogie w płytki krwi (PPP), usuwając większość płytek z części frakcji PRP poprzez wirowanie przy 1500 g przez 10 minut. Przechowuj frakcje PRP i PPP w temperaturze 4°C przez okres do 8–10 dni. Do testu agregacji najlepiej używać świeżych płytek krwi.Przemyj osad z obwodowych erytrocytów trzykrotnie, używając od 5 do 10 mililitrów RPMI 1640 w kolbie hodowlanej. Uzupełnij PRBC standardową pożywką do hodowli malarii oraz świeżymi, niezakażonymi erytrocytami, aby uzyskać hematokryt na poziomie 5%. Przepłucz kolby hodowlane mieszanką 92,5% azotu, 2,5% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Następnie zamknij szczelnie i inkubuj w celu uzyskania dojrzałych pasożytów z erytrocytów obwodowych pacjenta.Inkubuj kolbę z hodowlą przez 24 do 36 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide. Nanieś około 10 do 15 µL krwi na jeden koniec matowego szkiełka przedmiotowego spoczywającego na płaskiej powierzchni. Dotknij kropli krwi krawędzią drugiego szkiełka i, trzymając je pod kątem 45 stopni, przesuń tak, aby krew równomiernie rozprzestrzeniła się wzdłuż krawędzi drugiego szkiełka.Szybko, ale delikatnie, nie wywierając zbyt dużego nacisku na pierwszy szkiełko, równomiernie rozprowadź krew na całym szkiełku. Następnie wysusz cienką warstwę krwi powietrzem, a obszar z preparatem odwodnij metanolem przez 10 sekund. Po ponownym wysuszeniu powietrzem zanurz preparat w 2% keem.Pozostawić na co najmniej 10 minut. Płukać obficie, aż woda będzie czysta, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Próbki należy zbadać pod mikroskopem świetlnym, używając obiektywu imersyjnego 100 x.Następnie oczyścić i zsynchronizować dojrzałe PFS parum, PRBC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieść całą kulturę do czystej, sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przy 370 GS przez pięć minut.Teraz ostrożnie odessij supernatant, nie naruszając osadu. Następnie resuspenduj komórki w taki sposób, aby jedna połowa całkowitej objętości stanowiła jello fusing. Jedna trzecia drugiej połowy to medium wolne od białek, a dwie trzecie drugiej połowy to pbcs.Przenieś zawiesinę do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i inkubuj przez 15 do 20 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aż do momentu powstania wyraźnej granicy między górną a dolną warstwą. Ostrożnie przenieś górną warstwę do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml, dodaj 10 ml świeżego medium RPMI i wiruj przy 370 do 430 ×g przez pięć minut. Następnie ostrożnie odlej supernatant.Następnie należy ocenić obecność pasożytów oraz stadium ich rozwoju za pomocą cienkiego rozmazu krwi i zbadać go pod mikroskopem świetlnym zgodnie z wcześniejszym opisem. Suspensję P RBC otrzymaną po flotacji w żelu osocza należy dostosować do stężenia 1 × 10⁸ P RBC na µL w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. P RBC zawieszamy przy hematokrycie 5% w roztworze acrydine orange lub ethidium bromide o stężeniu końcowym 20 µg/ml oraz PRP w ilości stanowiącej 10% całkowitej objętości.Analogicznie przygotuj następujące kontrole: niezakażone czerwone krwinki oraz PRP i PRBC z dodatkiem PPP, aby ustalić rolę płytek krwi w aglutynacji PBC. Następnie przenieś zawiesinę do dwumililitrowej fiolki z nakrętką. Umieść fiolkę w delikatnym mieszaniu przez toczenie przy 10 do 12 RRP w temperaturze pokojowej, pobierając próbki w odstępach 15 do 20 minut przez łącznie 120 minut, aby sprawdzić obecność skupisk.Nanieś 10 µL próbki na szkiełko przedmiotowe i przykryj szkiełkiem nakrywką w celu badania pod mikroskopem fluorescencyjnym. Za skupisko uznaje się agregat trzech lub więcej zainfekowanych erytrocytów. W tym eksperymencie analizowano około 70% dojrzałych stadiów p FALs po wzbogaceniu metodą flotacji w żelu plazmowym; skupiska są łatwo widoczne pod mikroskopem w świetle przechodzącym. Pojawiają się one jako agregaty komórek, a w świetle fluorescencyjnym jako zielone lub czerwone punkty.Po barwieniu odpowiednio barwnikami akrydyną i pomarańczą lub bromkiem eterydyny, wielkość skupisk znacznie wzrasta do średnio ponad 15 pbcs na skupisko po 120 minutach inkubacji, przy czym niektóre skupiska zawierają liczne pbcs, których nie można było policzyć wizualnie. Częstotliwość fenotypu skupiania oblicza się jako liczbę zainfekowanych komórek występujących w skupiskach na 1000 zainfekowanych komórek policzonych w pomiarach powtórzonych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o sposobie przeprowadzania testu agregacji wywołanej przez płytki krwi w obecności Plasmodium falciparum. Należy uważać, aby nie aktywować płytek krwi gwałtownymi ruchami oraz zmianami temperatury. Test ten można również zastosować do pomiaru agregacji wywołanej przez płytki krwi w przebiegu ciężkiej malarii.

a-simple-protocol-for-platelet-mediated-clumping-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prosty protokół do agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum za pośrednictwem płytek krwi w warunkach niedostatku zasobów

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie odpornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy stopnia infekcji komarów przez Plasmodium. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania mian wirusów w jelicie środkowym komara.

Protokół zakażania komarów *Plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia

Opisano model in vitro sekwestracji w malarii mózgowej1. Krwinki czerwone zakażone Plasmodium falciparum są selekcjonowane pod kątem wiązania się z unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami śródbłonka mikrokrążenia mózgowego. Wyselekcjonowane pasożyty wykazują wyraźny fenotyp. Proces selekcji można zastosować w przypadku różnych szczepów P. falciparum oraz linii komórek śródbłonka.

Wybór pasożytów Plasmodium falciparum pod kątem cytoadhezji do ludzkich komórek śródbłonka mózgu

Ten film demonstruje test fagocytozy oparty na cytometrii przepływowej, obejmujący znakowane i opsonizowane erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum przez monocyty. Cytometria przepływowa identyfikuje fluorescencję w monocytach, potwierdzając pomyślną identyfikację opsonizowanych erytrocytów poprzez fagocytozę.

Test do ilościowego określania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami za pośrednictwem przeciwciał

Paramagnetyczne właściwości hemozoiny są wykorzystywane do izolowania późnych stadiów wzrostu czerwonych krwinek zakażonych Plasmodium falciparum w hodowli. Metoda jest prosta i szybka i nie wpływa na późniejsze zdolności inwazyjne pasożytów.

Separacja erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum w późnym stadium za pomocą środków magnetycznych

Pomiar funkcji przeciwciał jest kluczem do zrozumienia odporności na malarię Plasmodium falciparum. Metoda ta opisuje oczyszczanie żywotnych merozoitów i pomiar fagocytozy zależnej od opsonizacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Wysokowydajne oczyszczanie merozoitów Plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących

Ekspresja białek malarycznych w systemach komórkowych pozostaje wyzwaniem. Pokazujemy dwuetapowe i jednoetapowe systemy ekspresji komórkowej IVT (translacja in vitro) do ekspresji rekombinowanych białek rhoptrii malarii z komórek HeLa. Do oczyszczania białek rhoptrii używamy systemu oczyszczania opartego na powinowactwie do żywicy Ni.

Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry

Ludzkie mikroRNA przemieszczają się z erytrocytów gospodarza do pasożytów Plasmodium falciparum. W tym miejscu opisano techniki stosowane do transfekcji syntetycznych mikroRNA do erytrocytów gospodarza i wyizolowania wszystkich RNA z P. falciparum.  Ponadto w artykule szczegółowo opisano metodę izolacji polisomów u P. falciparum w celu określenia zajętości rybosomalnej i potencjału translacyjnego transkryptów pasożytów.

Metody badania regulacyjnej roli małych RNA i rybosomalnego zajmowania Plasmodium falciparum

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i oznaczania ilościowego Plasmodium falciparum w zakażonych czerwonych krwinkach wodnych za pomocą spektrometru podczerwonego o całkowitym odbiciu i wielowymiarowej analizy danych.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Plasmodium falciparum w wodnych krwinkach czerwonych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z osłabionym całkowitym odbiciem i wieloczynnikowej analizy danych

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie instrukcji, jak mierzyć zdolność przeciwciał obecnych w surowicach lub osoczu osób, naturalnie narażonych na zakażenie Plasmodium falciparum, do opsonizacji i indukowania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami (IE).

Pomiar naturalnie nabytych przeciwciał indukujących fagocytozę przeciwko pasożytom Plasmodium falciparum za pomocą testu opartego na cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy nową metodę, która pomaga wyjaśnić mechanizmy odporności komórkowej na Plasmodium podczas fazy infekcji krwi. Jest to test in vitro, który mierzy zabijanie zakażonych krwinek czerwonych przez limfocyty cytotoksyczne.

In vitro Test zabijania krwinek czerwonych zakażonych zarodźcem przez limfocyty cytotoksyczne

Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

Poznaj metodę zlepiania się erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum za pośrednictwem płytek krwi w warunkach ubogich w zasoby. Protokół umożliwia standaryzację badań nad patologią malarii.

Prosty protokół zlepiania się erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum za pośrednictwem płytek krwi w warunkach ubogich w zasoby (Wideo) | JoVE Journal

Prosty protokół badania agregacji erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum indukowanej przez płytki krwi w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów

Przeglądaj więcej filmów