Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo
4 listopada 2012
Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.
W niniejszym filmie opisano zastosowanie obrazowania bioluminescencyjnego całego ciała do badania transportu bakterii w żywych myszach, ze szczególnym uwzględnieniem detekcji wzrostu bakterii w ksenoprzeszczepach nowotworowych. Bakterie stanowią atrakcyjną klasę wektorów w terapii nowotworów, posiadając naturalną zdolność do preferencyjnego wzrostu w obrębie guzów po podaniu dożylnym, rozwijając się albo na zewnątrz, albo wewnątrz komórek nowotworowych. Szczepy bakteryjne zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji kasety genów lux ułatwiają detekcję bakterii, a jednocześnie samych guzów. Wartość nieinwazyjnego, podłużnego monitorowania szczepów bakteryjnych in vivo jest powszechnie uznana, gdyż pozwala na ograniczenie liczby wykorzystywanych zwierząt i generuje dane bardziej istotne statystycznie niż analizy końcowe.
Niniejsza procedura obejmuje indukcję guzów podskórnych u myszy. Guzy są monitorowane w czasie, pozwalając im na rozwój. W opisanych tutaj eksperymentach bakterie są podawane myszom, które następnie poddawane są obrazowaniu bioluminescencyjnemu w określonych punktach czasowych.
Guzy podskórne indukuje się u myszy o kompetentnym układzie odpornościowym lub z ubytkiem grasicy. W zależności od wybranego ksenoprzeszczepu, bakterie typu Lux pożądanego gatunku, np. e coli, hoduje się w kulturach nocnych. Komórki bakteryjne przemywa się i resuspenduje do pożądanego stężenia w celu podania dożylnego.
10⁶ komórek bakteryjnych w objętości wtrysku 100 µL jest stosowane rutynowo. Myszy z guzami podskórnymi o objętości rutynowo 100 mm³ są przygotowywane do leczenia.
Przy użyciu igły strzykawki o rozmiarze 29 G zawiesinę bakteryjną wstrzykuje się do bocznej żyły ogonowej. Bakterie preferencyjnie replikują się w masie guza w czasie. Bakterie wewnątrzguźne kontynuują replikację przez kilka tygodni i są wykrywalne za pomocą obrazowania IVUS między trzecim a szóstym dniem.
Po podaniu preparatu, w celu obrazowania bioluminescencyjnego, żywe i znieczulone myszy umieszcza się w komorze IVIS w temperaturze 37°C. W razie potrzeby można obrazować kilka myszy jednocześnie. Zdjęcia fotograficzne oraz obrazy luminescencyjne są rejestrowane za pomocą chłodzonej kamery CCD przy wybranych ustawieniach oprogramowania.
W zależności od urządzenia obrazującego można przeprowadzić analizę dwu- lub trójwymiarową. Uzyskano silną i liniową zależność między liczbą bakterii wewnątrzguza a poziomem emitowanego światła, co umożliwia wiarygodną oszacowanie liczby bakterii in vivo. Bakterie wykazujące ekspresję LX mogą być również wykrywane z głębokich obszarów ciała.
Bakterie komensalne kolonizujące jelita, wykazujące ekspresję genu lux, są wizualizowane przez kilka tygodni. Podanie preparatu drogą kaważu dodatkowo demonstruje użyteczność obrazowania bioluminescencyjnego w analizie bakterii wykazujących ekspresję lux w zwierzętach badawczych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie obrazowania bioluminescencyjnego całego ciała do badania przemieszczania się bakterii w żywych myszach. Głównym celem jest wykrywanie wzrostu bakterii w ksenoprzeszczepach nowotworowych, co podkreśla potencjał bakterii jako wektorów w terapii nowotworów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia
- Terapia nowotworów
Wstęp
- Bakterie mogą namnażać się preferencyjnie w obrębie guzów, co czyni je atrakcyjnym narzędziem w leczeniu nowotworów.
- Zmodyfikowane szczepy bakteryjne wykazujące ekspresję genu lux umożliwiają nieinwazyjny monitoring.
- Obrazowanie podłużne ogranicza liczbę wykorzystywanych zwierząt i dostarcza statystycznie istotnych danych.
- Na potrzeby badania u myszy indukowane są guzy podskórne.
Cel badania
- Analiza przemieszczania się bakterii w żywych myszach z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego.
- Monitorowanie wzrostu bakterii w ksenoprzeszczepach nowotworowych w czasie.
- Wykazanie użyteczności bakterii jako wektorów terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Indukcja guzów podskórnych u myszy.
- Podawanie bakterii znakowanych lucyferazą.
- Obrazowanie bioluminescencyjne w określonych punktach czasowych.
- Podłużne monitorowanie szczepów bakteryjnych in vivo.
Główne wyniki
- Skuteczne wykrycie wzrostu bakterii w obrębie guzów.
- Zdemonstrowana nieinwazyjna technika obrazowania do śledzenia bakterii.
- Przedstawienie informacji na temat zachowania bakterii w środowisku guza.
- Potwierdzenie przydatności zmodyfikowanych genetycznie bakterii w terapii nowotworów.
Wnioski
- Bakterie mogą służyć jako skuteczne wektory w leczeniu nowotworów.
- Obrazowanie bioluminescencyjne jest cennym narzędziem w badaniach in vivo.
- Badanie to potwierdza potencjał bakterii w zastosowaniach terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie bioluminescencyjne bakterii umożliwia nieinwazyjne śledzenie w czasie rzeczywistym przemieszczania się bakterii in vivo, co wspiera przedkliniczną ocenę wektorów bakteryjnych stosowanych w terapii nowotworów. Podejście to ogranicza liczbę wykorzystywanych zwierząt, dostarczając jednocześnie podłużnych, ilościowych danych na temat celowania w guz oraz przeżywalności bakterii. Metoda ta zwiększa wiarygodność prognostyczną we wczesnej fazie opracowywania wektorów terapeutycznych poprzez wizualizację dynamiki przestrzennej i czasowej lokalizacji bakterii w obrębie guzów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie tropizmu bakteryjnego do guzów oraz preferencyjnego wzrostu bakterii w modelach ksenoprzeszczepowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację zmodyfikowanych szczepów bakteryjnych jako wektorów terapeutycznych poprzez monitorowanie podłużne.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez korelację intensywności sygnału bakteryjnego z obciążeniem wewnątrzguzowym w czasie.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia standaryzowany, ilościowy odczyt służący do oceny dostarczania i replikacji bakterii w tkankach nowotworowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wysokoprzepustowe, nieterminalne procesy obrazowania kompatybilne z platformami opartymi na systemie IVIS.
- Gotowość testu: Generuje liniowe zależności między sygnałem a liczbą bakterii, co pozwala na niezawodną kwantyfikację in vivo.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje użyteczność w różnych gatunkach bakterii i typach ksenoprzeszczepów guzów, co potwierdza szerokie zastosowanie w onkologii.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wizualizację bakterii komensalnych w przewodzie pokarmowym po podaniu, rozszerzając zastosowanie na badania mikrobiomu.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera decyzje o rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez śledzenie trwałości bakterii i lokalizacji guza przez kilka tygodni.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków – od wczesnego przesiewu wektorów po walidację przedkliniczną, umożliwiając iteracyjne cykle projektowania, budowy i testowania terapeutyków bakteryjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów celowania bakterii w nowotwory za pomocą przestrzennych i czasowych odczytów obrazowania.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki bioluminescencyjne do porównywania szczepów bakteryjnych lub schematów dawkowania.
- Analityka: Generuje liniowe korelacje między luminescencją a liczbą bakterii, umożliwiając statystyczne porównanie warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesną charakterystykę wektorów z walidacją przedkliniczną poprzez podłużne monitorowanie nowotworu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do oceny różnorodnych wektorów bakteryjnych w programach onkologicznych i chorób zakaźnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w zachowaniu wektora bakteryjnego dzięki śledzeniu in vivo w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje monitorowanie podłużne, redukując zmienność oraz liczebność kohort zwierzęcych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając wczesnych, prognostycznych danych na temat lokalizacji i trwałości wektora w guzie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na terapeutyki bakteryjne z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe dane dotyczące transportu.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli bakterii, znakowaniu genem lux oraz podawaniu dożylnym w modelach mysich.
- Zależne od systemu IVIS lub porównywalnych systemów obrazowania bioluminescencyjnego z chłodzonymi kamerami CCD i komorami środowiskowymi.
- Wymaga standaryzacji przygotowania bakterii, objętości wstrzyknięcia oraz punktów czasowych obrazowania w obrębie poszczególnych badań.
- Kwestie adaptacyjne obejmują wybór gatunków bakteryjnych, kompatybilność z modelem guza oraz metody dostarczania substratu (lucyferyny).
- Ograniczenia praktyczne obejmują tłumienie sygnału w głębokich tkankach oraz potencjalne zakłócenia wynikające z endogennej luminescencji lub flory jelitowej.
