Name: Bioluminescencyjne obrazowanie bakterii in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Poznaj bioluminescencyjne obrazowanie bakterii in vivo w myszach do monitorowania wzrostu bakterii w ksenotransplantatach nowotworowych. Ta metoda umożliwia nieinwazyjne śledzenie bakterii jako wektorów terapii przeciwnowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie związane z niniejszym manuskryptem otrzymane z programu Seventh Framework Programme Komisji Europejskiej (PIOF-GA-2009-255466) oraz irlandzkiej Health Research Board (HRA_POR/2010/138). Szczepy E. coli znakowane Lux zostały uprzejmie przekazane przez dr. Cormaca Gahana z University College Cork.

1. Indukcja guza
<ol>
 <li>W celu rutynowej indukcji nowotworu, minimalną dawkę tumorigenną komórek zawieszonych w 200 μl bezserwatkowego medium hodowlanego wstrzykiwano podskórnie (s.c.) w bok wolnych od infekcji samic myszy Balb/C lub atymicznych MF1-nu/nu w wieku 6-8 tygodni, n=6 (Harlan, Oxfordshire, UK) (1 x 106 komórek 4T1), używając igły strzykawki o rozmiarze 21G. Żywotność komórek użytych do inokulacji wynosiła ponad 95 %, co określono poprzez przeliczenie wizualne przy użyciu hemocytometru i testu wykluczania błękitu trypanu (Trypan Blue Dye Exclusion) (Gibco).</li>
 <li>Po utworzeniu się guza pozwalano mu rosnąć i rozwijać się, monitorując go dwa razy w tygodniu. Objętość guza obliczano zgodnie ze wzorem V=(ab2) Π/6, gdzie a to najdłuższa średnica guza, a b to najdłuższa średnica prostopadła do średnicy a.</li>
</ol>
2. Przygotowanie bakterii
<ol>
 <li>Szczep bakteryjny wykorzystany w niniejszym protokole to E. coli K-12 MG1655, szczep niewytwarzający toksyn białkowych, zawierający plazmid kodujący luxABCDE, który umożliwia detekcję bakterii za pomocą BLI. E. coli MG1655 z zintegrowanym luxABCDE hodowano tlenowo w temperaturze 37 °C w pożywce LB (Sigma-Aldrich, Irlandia) uzupełnionej o 300 μg/ml erytromycyny (Em). Bioluminescencyjny szczep pochodny MG1655 stworzono z wykorzystaniem plazmidu p16Slux, który zawiera konstytutywny operon PHELPluxABCDE 1.</li>
 <li>W celu przygotowania do podania myszom, kultury inkubowano w pożywce LB w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 200 rpm do fazy średnio-logarytmicznej (gęstość optyczna przy 600 nm). Bakterie zebrano poprzez wirowanie (6,000 × g przez 5 min), przemyto PBS (Sigma) i rozcieńczono w PBS do stężenia 1 × 107 jednostek tworzących kolonie (cfu)/ml do podania dożylnego (IV) lub 1 x 1010 do podania przez zgłębnik (gavage).</li>
</ol>
3. Podawanie bakterii
<ol>
 <li>Myszy zostały losowo podzielone na grupy doświadczalne, gdy objętość guzów osiągnęła około 100 mm3. W przypadku podaży dożylnej, unieruchomione myszy otrzymały każda 106 komórek w 100 μl, wstrzykniętych bezpośrednio do bocznej żyły ogonowej za pomocą igły strzykawki 28G. Liczbę żywych komórek każdego inokulum określono metodą siewu retrospektywnego. </li>
 <li>W badaniach nad kolonizacją przewodu pokarmowego (GIT), 109 komórek bakteryjnych podawano doustnie w 100 μl na mysz za pomocą zgłębnika, przez trzy kolejne dni. Poziom istniejących bakterii komensalnych obniżono przed podawaniem poprzez dodanie 5 mg/ml streptomycyny do wody pitnej myszy przez 7 dni przed rozpoczęciem podaży doustnej za pomocą zgłębnika 1. </li>
</ol>
4. Obrazowanie bioluminescencyjne
<ol>
 <li>Obrazowanie BLI 2D in vivo wykonano za pomocą systemu IVIS100 (Caliper). W określonych punktach czasowych po podaniu bakterii myszy znieczulono przy użyciu systemu znieczulania gazowego XGI-8 firmy Caliper z zastosowaniem 3% izofluranu, a następnie przeprowadzono analizę obrazu całego ciała w systemie IVIS 100 przez 2-5 min przy wysokiej czułości. </li>
 <li>W przypadku obrazowania 3D znieczulone myszy umieszczono w uchwycie do obrazowania myszy wewnątrz systemu obrazowania optycznego w celu wykonania obrazowania grzbietowego (IVIS Spectrum, Caliper). Aby uzyskać obrazy sygnału lucyferazy bakteryjnej do rekonstrukcji optycznej 3D, zastosowano filtry emisyjne o długościach fal od 500-580 nm z czasem akwizycji bin 16 wynoszącym 3-4 min na filtr, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu. W ramach tej sekwencji akwizycji obrazów uzyskano obraz światła strukturalnego w celu zdefiniowania mapy wysokości. Mapę tę wprowadzono do algorytmów rekonstrukcji tomografii obrazowania światła rozproszonego (DLIT), które posłużyły do utworzenia optycznego obrazu 3D przy użyciu optymalizacji najmniejszych kwadratów nieujemnych 2.</li>
 <li>Analiza obrazu: Obszary zainteresowania zidentyfikowano i ilościowo oceniono przy użyciu oprogramowania Living Image (Caliper). </li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
W niniejszym badaniu niepatogenne bakterie komensalne E.coli K-12 MG1655 wykazujące ekspresję operonu luxABCDE podano dożylnie myszom z podskórnymi ksenoprzeszczepami guzów 4T1. Sygnał bakteryjny lux wykryto specyficznie w guzach myszy po podaniu dożylnym (Rysunek 2). Odzyskanie hodowli bakterii z próbek pobranych od myszy potwierdza istnienie liniowej zależności między liczbą żywych bakterii a ilością wykrytego światła (Rysunek 3). Dzięki zastosowaniu 3D BLI uzyskano również obrazowanie in vivo bakterii komensalnych podanych doustnie do przewodu pokarmowego.
<img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig1.jpg" alt="Wykres wzrostu guza; objętość w funkcji dni; leczenie bakteriami; punkty obrazowania bioluminescencyjnego (BLI)." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4318/4318fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Harmonogram protokołu. U myszy indukuje się guzy podskórne, a bakterie podaje się po rozwoju guza (100 mm3). U żywych myszy wykonuje się obrazowanie BLI w różnych punktach czasowych po podaniu bakterii (strzałki wskazują typowe terminy). 
<img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig2.jpg" alt="Obrazowanie luminescencyjne, wykres wzrostu bakterii; eksperyment na myszach z nowotworem, analiza log CFU/guz." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Podanie E. coli MG1655 luxABCDE myszom z nowotworem. Podskórne guzy 4T1 indukowano u myszy MF1 nu/nu, a E. coli MG1655 luxABCDE podano po rozwoju nowotworu. Każde zwierzę otrzymało 106 komórek wstrzykniętych bezpośrednio do bocznej żyły ogonowej. Obrazowanie myszy przeprowadzono w czterech punktach czasowych podczas badania (czarne kropki na osi z i obrazy), z późniejszym odzyskaniem żywych bakterii (cfu) z guzów pobranych od uśpić myszy (wykres słupkowy). W czasie badania zaobserwowano wzrost liczby bakterii i ekspresji genów plazmidowych specyficznie w guzach (na każdy punkt czasowy przedstawiono reprezentatywną mysz). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4318/4318fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>. 
<img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig3.jpg" alt="Wykres wzrostu E. coli w stosunku do luminescencji in vivo; analiza korelacji, punkty danych, linia trendu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Zależność między liczbą bakterii wewnątrzguza a bioluminescencją. Żywe bakterie w guzach wyliczono za pomocą hodowli bakteryjnej ex vivo z guzów po wykonaniu BLI w różnych punktach czasowych po podaniu dożylnym (IV). Na wykresie przedstawiono wartości logarytmiczne liczby bakterii (cfu) w stosunku do jednostek bioluminescencji in vivo. Zaobserwowano silną korelację między liczbą bakterii a sygnałami bioluminescencji bakteryjnej R2=0,97171.
<img src="/files/ftp_upload/4318/4318fig4.jpg" alt="Obrazowanie tomograficzne, model mysi, mapa intensywności fluorescencji; analiza fotoniczna in vivo." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Trójwymiarowy obraz IVIS przewodu pokarmowego myszy skolonizowanego przez E. coli MG1655. Przewód pokarmowy myszy został skolonizowany poprzez doustną administrację 109 cfu E. coli przez trzy kolejne dni. Przedstawiono przykładowy obraz wyizolowany z tomografii 3D skolonizowanej myszy. Obrazy 3D zawierają cyfrowy atlas szkieletu myszy w celu zapewnienia rejestracji anatomicznej. Bioluminescencja E. coli MG1655 jest widoczna w kolorze zielonym dla niższych i fioletowym dla wyższych poziomów intensywności.

<ol><li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940(2012).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007(2007).</li>
<li>Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Postgrad+Med%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for prostate cancer.</a> Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).</li>
<li>Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+targeting+with+systemically+administered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tumour targeting with systemically administered bacteria.</a> Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).</li>
<li>Collins, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+in+cancer+immunotherapy%3A+which+vector+for+which+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy.</a> Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).</li>
<li>Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+conditions+required+for+tumor+colonization+by+intravenously+delivered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria.</a> Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).</li>
<li>Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+as+vectors+for+gene+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+Bugs%22%5BJournal%5D)">Bacteria as vectors for gene therapy of cancer.</a> Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).</li>
<li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orally+administered+bifidobacteria+as+vehicles+for+delivery+of+agents+to+systemic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors.</a> Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).</li>
<li>van Pijkeren, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Listeria+monocytogenes-based+DNA+delivery+system+for+cancer+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+effective+antitumor+response+after+mucosal+bacterial+vector+mediated+DNA+vaccination+with+endogenous+prostate+cancer+specific+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen.</a> J. Urol. 186, 687-693 (2011).</li>
<li>Riedel, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+luciferase+tagging+system+for+Listeria+monocytogenes+allows+real-time+monitoring+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro.</a> Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).</li>
<li>Cheng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeting+prodrug-activating+bacteria+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy.</a> Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).</li>
<li>Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+the+study+of+intestinal+colonization+by+Escherichia+coli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).</li>
<li>Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+Imaging+For+Gene+%26+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">PET Imaging For Gene & Cell Therapy.</a> Curr. Gene Ther. , (2012).</li>
<li>Tangney, M., Francis, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Optical+Imaging+in+Gene+%26+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy.</a> Curr. Gene Ther. , (2012).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W kontekście terapii genowej wykorzystanie czynników biologicznych do dostarczania genów terapeutycznych pacjentom wykazuje duże perspektywy 3-5. Podobnie jak wirusy, wrodzone właściwości biologiczne bakterii umożliwiają efektywne dostarczanie DNA do komórek lub tkanek, szczególnie w przypadku nowotworów. Wykazano, że bakterie podawane systemowo mają naturalną zdolność do kierowania się w stronę guzów, co skutkuje wysokim poziomem replikacji miejscowej, albo na zewnątrz komórek nowotworowych (gatunki nieinwazy...

<table><tbody><tr><td>linia komórkowa 4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td>Syngeneiczny model raka piersi pochodzący z samoistnie powstałego guza gruczołu mlekowego myszy BALB/c</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>&lt;em&gt;&lt;em&gt;Podłoże Eagle'a modyfikowane przez Dulbecco&lt;/em&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Fosforanowy bufor solny</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>IVIS 100 do obrazowania 2D; IVIS Spectrum do obrazowania 3D.</td></tr><tr><td>pożywka Luria Broth Miller (LB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2542</td><td>Pożywka wzrostowa dla &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Erytromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5389</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td>Antybiotyk </td></tr><tr><td>myszy MF1nu/nu</td><td>Harlan (UK)</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td>Hsd:Myszy nago-athymiczne&lt;em&gt;Foxn1nu&lt;/em&gt; </td></tr><tr><td>myszy Balb/c</td><td>Harlan (UK)</td><td>066</td><td>Haplotyp:&lt;em&gt;H-2&lt;sup&gt;d&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Kaniula do gavage'u </td><td>Vet-tech Solutions (UK)</td><td>DE009</td><td>prosta igła do zgłębnika 22G x 38 mm </td></tr><tr><td>Strzykawka do iniekcji dożylnej </td><td>BD BioSciences</td><td>309309 - 1 ml</td><td>Strzykawka insulinowa z igłą 28 G x &amp;#189; mikrocienka igła do infuzji dożylnej (IV) o długości 1 cala.</td></tr><tr><td>Strzykawka do inokulacji guza</td><td>Braun</td><td>9161376V</td><td>Omnifix 26 G x &amp;#189; igła calowa</td></tr></tbody></table>

obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych in vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Niniejszy film opisuje zastosowanie obrazowania bioluminescencyjnego całego ciała (BLI) do badania przemieszczania się bakterii w żywych myszach, ze szczególnym uwzględnieniem wykorzystania bakterii w terapii genowej i komórkowej nowotworów. Bakterie stanowią atrakcyjną klasę wektorów w terapii nowotworowej, ponieważ posiadają naturalną zdolność do preferencyjnego namnażania się w guzach po podaniu systemowym. Bakterie zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji kasety genów lux umożliwiają detekcję BLI bakterii, a jednocześnie miejsc występowania guzów. Lokalizację oraz poziom bakterii w guzach w czasie można w łatwy sposób zbadać i zwizualizować w dwóch lub trzech wymiarach. Metoda ta ma zastosowanie do szerokiego zakresu gatunków bakterii i typów ksenoprzeszczepów nowotworowych. Niniejszy artykuł opisuje protokół analizy bakterii bioluminescencyjnych u myszy z podskórnymi guzami. Opisano również wizualizację bakterii komensalnych w przewodzie pokarmowym (GIT) za pomocą BLI. Ta potężna i tania strategia obrazowania w czasie rzeczywistym stanowi idealną metodę badania bakterii in vivo w kontekście badań nad nowotworami, w szczególności terapii genowej, oraz chorobami zakaźnymi. Film ten przedstawia procedurę badania E. coli znakowanych genami lux u żywych myszy, demonstrując przestrzenną i czasową analizę możliwą do uzyskania przy użyciu systemu BLI IVIS.

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Niniejszy film opisuje zastosowanie obrazowania bioluminescencyjnego całego ciała (BLI) do badania przemieszczania się bakterii w żywych myszach, ze szczególnym uwzględnieniem zastosowania ...

W niniejszym filmie opisano zastosowanie obrazowania bioluminescencyjnego całego ciała do badania transportu bakterii w żywych myszach, ze szczególnym uwzględnieniem detekcji wzrostu bakterii w ksenoprzeszczepach nowotworowych. Bakterie stanowią atrakcyjną klasę wektorów w terapii nowotworów, posiadając naturalną zdolność do preferencyjnego wzrostu w obrębie guzów po podaniu dożylnym, rozwijając się albo na zewnątrz, albo wewnątrz komórek nowotworowych. Szczepy bakteryjne zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji kasety genów lux ułatwiają detekcję bakterii, a jednocześnie samych guzów. Wartość nieinwazyjnego, podłużnego monitorowania szczepów bakteryjnych in vivo jest powszechnie uznana, gdyż pozwala na ograniczenie liczby wykorzystywanych zwierząt i generuje dane bardziej istotne statystycznie niż analizy końcowe.Niniejsza procedura obejmuje indukcję guzów podskórnych u myszy. Guzy są monitorowane w czasie, pozwalając im na rozwój. W opisanych tutaj eksperymentach bakterie są podawane myszom, które następnie poddawane są obrazowaniu bioluminescencyjnemu w określonych punktach czasowych.Guzy podskórne indukuje się u myszy o kompetentnym układzie odpornościowym lub z ubytkiem grasicy. W zależności od wybranego ksenoprzeszczepu, bakterie typu Lux pożądanego gatunku, np. e coli, hoduje się w kulturach nocnych. Komórki bakteryjne przemywa się i resuspenduje do pożądanego stężenia w celu podania dożylnego.10⁶ komórek bakteryjnych w objętości wtrysku 100 µL jest stosowane rutynowo. Myszy z guzami podskórnymi o objętości rutynowo 100 mm³ są przygotowywane do leczenia.Przy użyciu igły strzykawki o rozmiarze 29 G zawiesinę bakteryjną wstrzykuje się do bocznej żyły ogonowej. Bakterie preferencyjnie replikują się w masie guza w czasie. Bakterie wewnątrzguźne kontynuują replikację przez kilka tygodni i są wykrywalne za pomocą obrazowania IVUS między trzecim a szóstym dniem.Po podaniu preparatu, w celu obrazowania bioluminescencyjnego, żywe i znieczulone myszy umieszcza się w komorze IVIS w temperaturze 37°C. W razie potrzeby można obrazować kilka myszy jednocześnie. Zdjęcia fotograficzne oraz obrazy luminescencyjne są rejestrowane za pomocą chłodzonej kamery CCD przy wybranych ustawieniach oprogramowania.W zależności od urządzenia obrazującego można przeprowadzić analizę dwu- lub trójwymiarową. Uzyskano silną i liniową zależność między liczbą bakterii wewnątrzguza a poziomem emitowanego światła, co umożliwia wiarygodną oszacowanie liczby bakterii in vivo. Bakterie wykazujące ekspresję LX mogą być również wykrywane z głębokich obszarów ciała.Bakterie komensalne kolonizujące jelita, wykazujące ekspresję genu lux, są wizualizowane przez kilka tygodni. Podanie preparatu drogą kaważu dodatkowo demonstruje użyteczność obrazowania bioluminescencyjnego w analizie bakterii wykazujących ekspresję lux w zwierzętach badawczych.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie bakteryjne bioluminescencyjne in vivo

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Źródło: de Vries, C. R. i in., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje bioluminescencyjną technikę obrazowania monitorującego postęp infekcji bakteryjnej na żywym modelu myszy. Bakterie patogenne opracowane z systemem raportu luxABCDE emitują światło w miejscu zakażenia, umożliwiając wizualizację bakterii aktywnych przemianownie. Obrazując mysz w czasie, naukowcy mogą nieinwazyjnie śledzić dynamikę infekcji i...

Bioluminescencja zakażeń bakteryjnych u myszy

Źródło: Valentine, M. E. i in., Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa oraz testowanie tłumienia zjadliwości w prostym modelu infekcji myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje zastosowanie podejścia obrazowania opartego na bioluminescencji do monitorowania zakażenia bakteryjnego w modelu żywej myszy. Sekwencyjne obrazowanie bioluminescencyjne i rentgenowskie umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym oraz anatomiczną lokalizację infekcji rozprzestrzeniającej...

Obrazowanie w czasie rzeczywistym infekcji bakteryjnej w modelu myszy z użyciem bioluminescencji

Źródło: Wang, Y. i in. In Vivo Badanie terapii przeciwdrobnoustrojowym niebieskim światłem w leczeniu wieloopornych infekcji oparzeń Acinetobacter baumannii z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencji. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje procedurę obrazowania zakażeń ran oparzeniowych u myszy zaszczepionych Acinetobacter baumannii z bioluminescencyjnym operonem. Pokazuje, jak utlenianie podłoża katalizowane lucyferazą wytwarza światło proporcjonalne do obciążenia bakterii, umożliwiając...

Bioluminescencja ran oparzonych Acinetobacter baumanniii u myszy

Połączone obrazowanie optyczne i μCT w mysim modelu infekcji implantu ortopedycznego, wykorzystujące bioluminescencyjny zmodyfikowany szczep Staphylococcus aureus, zapewniło możliwość nieinwazyjnego i podłużnego monitorowania dynamiki infekcji bakteryjnej, jak również odpowiadającej jej reakcji zapalnej i zmian anatomicznych w kości.

Połączone obrazowanie optyczne in vivo i μCT w celu monitorowania infekcji, stanu zapalnego i anatomii kości w zakażeniu implantu ortopedycznego u myszy

Infekcje wywołane przez wielolekooporne (MDR) szczepy bakteryjne stały się poważnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego, co spowodowało konieczność opracowania alternatywnych metod leczenia. Przedstawiamy protokół oceny skuteczności terapii przeciwdrobnoustrojowym światłem niebieskim (aBL) w zakażeniach MDR Acinetobacter baumannii w oparzeniach myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

In vivo (in vivo) Badanie przeciwdrobnoustrojowej terapii światłem niebieskim w wielolekoopornych zakażeniach oparzeniami Acinetobacter baumannii przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Bakterie bioluminescencyjne regulują produkcję światła za pomocą różnych mechanizmów, takich jak quorum sensing. Ta nowatorska metoda pozwala na badanie in situ bioluminescencji i korelacji emisji światła z gęstością komórek. Sztuczny bioluminescencyjny system Escherichia coli pozwala na scharakteryzowanie operonów luksów, białek Lux i ich wzajemnych oddziaływań.

In Situ Pomiar i korelacja gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych

Ten protokół opisuje stworzenie mysiego modelu z guzem do monitorowania progresji guza i angiogenezy w czasie rzeczywistym za pomocą podwójnego obrazowania bioluminescencyjnego.

Podwójne obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza i angiogenezy

Protokół tutaj opisuje szczegółowe kroki do przeprowadzenia badań skuteczności leków w bioluminescencyjnym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi, z naciskiem na pozyskiwanie, analizę i interpretację danych. Dostępne są również procedury rozwiązywania problemów i kontroli jakości w celu zminimalizowania problemów technicznych.

Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków

Poznaj bioluminescencyjne obrazowanie bakterii in vivo w myszach do monitorowania wzrostu bakterii w ksenotransplantatach nowotworowych. Ta metoda umożliwia nieinwazyjne śledzenie bakterii jako wektorów terapii przeciwnowotworowej.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Przeglądaj więcej filmów