Zastosowanie mikroskopii poklatkowej do wizualizacji zawieszonej animacji wywołanej niedotlenieniem w zarodkach C. elegans

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie techniki in vivo do obrazowania dynamiki subkomórkowej w zarodkach elegancji morskiej narażonych na anoksję przy użyciu przepływu gazu przez konfigurację na mikroskopie o dużej mocy. Osiąga się to poprzez przygotowanie próbki młodych dorosłych zwierząt transgenicznych w celu wygenerowania odpowiedniej populacji młodych zarodków do obrazowania. Następnie przygotuj cienkie szkiełka agros pad do użycia w komorze mikroinkubacji.

Następnie morska elegancja jest odpowiednio znieczulana i pokrywana olejem węglowym halo, aby uniknąć wysuszenia pod wpływem przepływu gazu. Na koniec okrągłe szkło nakrywkowe ze znieczulonymi zwierzętami umieszcza się w komorze mikroinkubacyjnej. Komora jest następnie umieszczana na stoliku mikroskopu i napełniana azotem gazowym w celu wytworzenia środowiska beztlenowego, jednocześnie obrazując ostatecznie wykorzystanie przepływu gazu przez mikrokomorę inkubacyjną.

W połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną in vivo umożliwia tworzenie szczegółowych filmów i obrazów o wysokiej rozdzielczości przedstawiających zatrzymanie cyklu komórkowego w odpowiedzi na niedotlenienie. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak immunofluorescencja pośrednia, jest to, że zmiany subkomórkowe można udokumentować in vivo, podczas gdy zwierzęta są narażone na określone warunki. Chociaż ta metoda może dostarczyć wglądu w zawieszoną animację wywołaną anoksją w zarodkach elegans.

Może być również stosowany do innych systemów, takich jak drożdże, hodowle komórkowe lub inne zarodki małych bezkręgowców lub kręgowców. Można również zastosować dodatkowe warunki, takie jak hiperoksja, temperatura, stres lub leczenie małymi cząsteczkami. Tę procedurę demonstrują Anastacia Garcia i Mary Latt, dwie doktorantki z mojego laboratorium Zacznij od odpowiedniego transgenicznego szczepu C Elgan, który jest przedmiotem zainteresowania w tym badaniu, transgeniczny szczep TH 32 zostanie wykorzystany do wizualizacji chromosomów i centrosomów jako markerów podziału komórek.

Wygeneruj zsynchronizowaną populację poprzez dezintegrację grawitacyjnych dorosłych osobników w roztworze podchlorynu i wykorzystaj pozostałe zarodki, zbierając grawitacyjnie dorosłe osobniki na wysiewaną płytkę i jajo, składając od jednej do dwóch godzin lub zbierając larwy L cztery z mieszanej populacji na nową płytkę z nasionami. Hoduj nicienie w temperaturze od 20 stopni Celsjusza do młodej dorosłości GR, która zajmie około 96 godzin od wyklucia, 72 godziny od L jednej larwy lub 24 godziny po L 4 linieniu. Metodologia ta zapewnia środki do wygenerowania populacji młodych dorosłych, która zawiera dużą liczbę młodych zarodków, które zawierają duże bluźnierstwa i jądra, które są optymalne do obrazowania zmian subkomórkowych i subjądrowych.

Aby ustawić wilgotną komorę do przechowywania przygotowanych szkiełek, umieść wilgotny ręcznik papierowy w dużej szalce Petriego lub pojemniku przykrytym pokrywką o odpowiedniej wielkości. Przygotuj stopiony 2% aros w wodzie dejonizowanej, podgrzewając mieszaninę w szklanych naczyniach za pomocą kuchenki mikrofalowej lub łaźni wodnej. Następnie miejsce, jedna do trzech kropli ciepłego aros na czystym szklanym mikroskopie Szkiełko natychmiast umieść drugie szkiełko odwrócone prostopadle na kroplach aros i lekko dociśnij, aby powstała podkładka była cienka i wolna od pęcherzyków powietrza.

Po ostygnięciu aros powoli rozłóż dwa szkiełka mikroskopowe, pozostawiając nienaruszoną podkładkę aros na jednym ze szkiełek. Ważne jest, aby upewnić się, że podkładka aros jest wystarczająco cienka, aby nie zakłócać możliwości ustawiania ostrości mikroskopu. Później. Użyj czystej żyletki, aby uformować podkładkę Aros w mały kwadratowy sklep.

Wsuwa się do przygotowanej wilgotnej komory, aż będzie gotowy do użycia. Używając tej samej czystej żyletki, ostrożnie chwyć krawędź podkładki aros i przenieś ją z szkiełka na okrągłe 25-milimetrowe mikro szkło nakrywkowe. Aby uniknąć gromadzenia się pęcherzyków powietrza pod okrągłą pokrywą, szkło powinno odpowiednio pasować do mikroinkubatora.

Dodaj kroplę środka znieczulającego na podkładkę aros. Wybierz od pięciu do 10 robaków i umieść je w kropli środka znieczulającego. Odczekaj od jednej do trzech minut, aż robaki przestaną się poruszać.

Za pomocą końcówki pipety dodaj kroplę olejku z węgla świętego na robaki, aby zapobiec odwodnieniu robaków podczas przepływu gazu przez komorę. Następnie podłącz jeden koniec elastycznej plastikowej rurki do komory. Oddziel dwie połówki zamkniętego mikroinkubatora perfuzyjnego i ostrożnie umieść szklankę nakrywkową pionowo na dolnym pierścieniu.

Zamknij szczelnie obie strony komory. Następnie podłącz komorę za pomocą elastycznej plastikowej rurki do zbiornika azotu i umieść ją na stoliku mikroskopu. Sprawdź, czy nie ma wycieków, upewniając się, że rurka i zaślepki portu są bezpiecznie przymocowane wzdłuż boku komory, aby zobrazować zarodki.

Najpierw zlokalizuj zwierzęta w mniejszym powiększeniu. Następnie przejdź do odpowiedniego większego powiększenia. Aby zobrazować embrionalnych bluźnierców u dorosłych, użyj lasera o długości 488 nanometrów, aby zlokalizować białko fuzyjne GFP w interesujących komórkach.

Aby zobrazować określony etap zatrzymania cyklu komórkowego, na przykład późną profazę, zidentyfikuj bluźniercę na wcześniejszym etapie podziału komórki, takim jak późna interfaza lub wczesna profaza. Przepłucz komorę gazowym azotem i kontynuuj monitorowanie bluźnierców, gdy azot wypełnia komorę, dostosowując w razie potrzeby płaszczyznę ogniskowej. Przeprowadź obrazowanie poklatkowe, aby uchwycić pożądane zjawisko będące przedmiotem zainteresowania w tym przypadku.

Zatrzymanie profazy i dokowanie chromosomów do wewnętrznej błony jądrowej. Rób zdjęcia raz na 10 sekund przez maksymalnie 30 minut. Zazwyczaj zatrzymanie profazy wywołane anoksją następuje w ciągu 20 do 30 minut od rozpoczęcia przepływu azotu gazowego.

Aby udokumentować powrót do zdrowia ze stanu zatrzymania wywołanego anoksją, wyłącz gaz i pozwól, aby komora powróciła do normoksji podczas nagrywania serii poklatkowej. Wznowienie cyklu komórkowego i cofnięcie chromosomów następuje zwykle w ciągu pięciu do 20 minut. Użyj obrazu erris J lub Photoshopa, aby przetworzyć obrazy i filmy, a następnie zaimportować je do programu QuickTime w celu wyświetlenia.

W zarodku narażonym na anoksję chromosomy profazy. Bluźniercy skondensują się i zestroją z wewnętrznymi peryferiami nuklearnymi. Zjawisko określane jako dokowanie chromosomów po reoksygenacji, progresja cyklu komórkowego zostanie wznowiona, a chromosomy profazy.

Bluźnierstwo przesunie się z peryferii jądra na płytę równikową, wskazując na postęp do metafazy. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu trzech do czterech godzin przy użyciu odpowiednio zainscenizowanych zwierząt. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby używać tylko zdrowych, młodych dorosłych zwierząt, aby przeznaczyć wystarczająco dużo czasu na ukończenie eksperymentu i uzbroić się w cierpliwość, gdy uczymy się wybierać odpowiednio zainscenizowanych bluźnierców.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uchwycić zdarzenia subkomórkowe wywołane anoksją in vivo przy użyciu zarodków GaN i przepływu gazu przez komorę pod mikroskopem o dużej mocy.