Name: Zastosowanie mikroskopii poklatkowej do wizualizacji zawieszonej animacji wywołanej niedotlenieniem w zarodkach C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii poklatkowej do wizualizacji zawieszonej animacji wywołanej niedotlenieniem w zarodkach C. elegans. Technika ta umożliwia obserwację dynamiki subkomórkowej w warunkach anoksji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy wyrazić wdzięczność za wkład i uwagi członków laboratorium Padilla. Szczepy nicieni wykorzystane w tej pracy zostały udostępnione przez Caenorhabditis Genetics Center, finansowane przez NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dziękujemy dr. Lonowi Turnbullowi za pomoc techniczną w zakresie mikroskopii konfokalnej. Praca ta była wspierana przez grant z National Science Foundation (NSF-IOS, CAREER) przyznany P.A.P.

1. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przygotować lub pozyskać odpowiedni transgeniczny szczep C. elegans przy użyciu metod transgenicznych, z centrum zasobów genetycznych Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) lub od współpracownika. W tym przypadku wykorzystujemy szczep TH32 (pie-1::tbg-1::GFP; pie-1::GFP::H2B)5 do wizualizacji chromosomów i centrosomów jako markerów podziału komórkowego.</li>
	<li>Uzyskać zsynchronizowaną populację, stosując jedną z trzech metod: 1) rozbić dorosłe osobniki z jajami w roztworze podchlorynu i wykorzystać pozostałe embriony6, 2) przenieść dorosłe osobniki z jajami na płytkę z pożywką i pozwolić im składać jaja przez 1-2 hr lub 3) wybrać larwy L4 z mieszanej populacji i przenieść je na nową płytkę z pożywką.</li>
	<li>Hodować nicienie w temperaturze 20 °C do stadium młodej dorosłości z jajami, co zajmie około 96 hr od wyklucia, 72 hr od stadium larwy L1 lub 24 hr po linieniu L4. Embriony (stadium 2-20 komórek) in utero zawierają duże blastomery i jądra, które są optymalne odpowiednio do obrazowania zmian podkomórkowych i podjądrowych. Metoda ta pozwala na uzyskanie populacji młodych dorosłych osobników zawierających liczne wczesne embriony.</li>
</ol>
2. Przygotowanie preparatów i konfiguracja komory anoksycznej
<ol>
	<li>Przygotować komorę wilgotną do przechowywania przygotowanych szkiełek, umieszczając wilgotny ręcznik papierowy w dużej szalce Petriego lub pojemniku przykrytym odpowiedniej wielkości pokrywką.</li>
	<li>Przygotować roztopioną 2% agarozę wykonaną w odsolonej wodzie H2O, podgrzewając mieszaninę w naczyniu szklanym w kuchence mikrofalowej lub kąpieli wodnej.</li>
	<li>Nanieść 1-3 krople ciepłej agarozy na czyste szkiełko przedmiotowe. Natychmiast położyć drugie szkiełko odwrócone prostopadle na kroplach agarozy, lekko dociskając, aby powstała cienka warstwa pozbawiona pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Odczekać do ostygnięcia i powoli rozdzielić dwa szkiełka, pozostawiając warstwę agarozy w całości na jednym z nich. Ważne jest, aby warstwa agarozy była wystarczająco cienka, by nie utrudniać późniejszego ustawienia ostrości w mikroskopie. Możliwość wizualizacji próbki zależy również od konkretnej odległości optycznej używanego obiektywu, która może się różnić w zależności od mikroskopu.</li>
	<li>Używając czystej żyletki, przyciąć warstwę agarozy do kształtu małego kwadratu. Przechowywać w przygotowanej komorze wilgotnej do momentu użycia.</li>
	<li>Ostrożnie, za pomocą tej samej czystej żyletki, uchwycić krawędź warstwy agarozy i przenieść ją ze szkiełka na okrągłe szkiełko nakrywowe o średnicy 25 mm, unikając gromadzenia się pęcherzyków powietrza pod warstwą agarozy. Wybrane okrągłe szkiełko nakrywowe jest odpowiednio dopasowane do mikroinkubatora.</li>
	<li>Nanieść kroplę środka znieczulającego (0,5% tricaine, 0,05% tetramisole w buforze M9) na warstwę agarozy. Wybrać 5-10 nicieni i umieścić je w kropli środka znieczulającego. Odczekać 1-3 min, aż nicienie przestaną się poruszać.</li>
	<li>Uzasadnieniem dla obserwacji embrionów wewnątrz macicy dorosłego osobnika, zamiast embrionów wypreparowanych, jest zminimalizowanie ryzyka wysuszenia embrionów oraz ich przemieszczania się pod wpływem przepływu azotu przez komorę.</li>
	<li>Natychmiast dodać kroplę oleju halokarbonowego na nicienie, aby zapobiec ich odwodnieniu podczas przepływu gazu przez komorę. Ponieważ olej halokarbonowy jest lepki, do pobrania go i naniosia na nicienie można użyć końcówki pipety lub igły do nicieni.</li>
	<li>Po przygotowaniu okrągłego szkiełka nakrywkowego z nicieniami, rozdzielić dwie połowy zamkniętego mikroinkubatora perfuzyjnego Leiden, a następnie ostrożnie umieścić szkiełko nakrywkowe pionowo na dolnym pierścieniu. Następnie szczelnie zamknąć obie części komory.</li>
	<li>Komorę podłączyć do butli z azotem za pomocą elastycznej plastikowej rurki i umieścić w odpowiednim miejscu na stoliku mikroskopu (Rysunek 1C). W tym momencie należy dokładnie sprawdzić rurkę i mikroinkubator pod kątem nieszczelności, upewniając się, że rurka oraz korki portów po bokach komory są bezpiecznie zamocowane. Można również lekko rozprowadzić niewielką ilość wody z mydłem na rurce, aby sprawdzić, czy nie tworzą się pęcherzyki, co wskazywałoby na nieszczelność.</li>
</ol>
3. Mikroskopia w warunkach anoksji
<ol>
	<li>Zlokalizuj zwierzęta przy mniejszym powiększeniu, a następnie przełącz na odpowiednie większe powiększenie (64x dla tej aplikacji), aby obrazować wybrane tkanki lub komórki, takie jak blastomery embrionalne lub oocyty u osobników dorosłych. Włącz laser 488 nm, aby zobrazować sygnał GFP i zlokalizować białko fuzyjne GFP w wybranych komórkach.</li>
	<li>Aby zwizualizować zatrzymanie w konkretnym stadium cyklu komórkowego (np. późna profaza), zidentyfikuj blastomer znajdujący się w wcześniejszym stadium podziału komórki (np. późna interfaza lub wczesna profaza). Markery komórkowe, takie jak położenie centrioli, początek kondensacji chromosomów, lokalizacja chromosomów oraz obecność lub brak otoczki jądrowej, pomogą zidentyfikować stadium cyklu komórkowego (Rycina 2A).</li>
	<li>Następnie komorę przepłukuje się azotem (99,999% N2; &lt;2 ppm O2). W tym przypadku zastosowano ciśnienie 6 psi, jednak ciśnienie może wymagać dostosowania i optymalizacji w zależności od wielkości każdego mikroinkubatora i średnicy stosowanych rurek. Kontynuuj monitorowanie blastomerów podczas napełniania komory azotem, dostosowując płaszczyznę ogniskowania w razie potrzeby.</li>
	<li>W tym momencie rozpoczyna się obrazowanie time-lapse. Obrazowanie jest prowadzone tak długo, jak jest to konieczne do uchwycenia interesującego zjawiska, w tym przypadku zatrzymania w profazie i dokowania chromosomów do wewnętrznej błony jądrowej. Obrazy są pobierane co 10 sec przez nie więcej niż 30 min. Częstotliwość przechwytywania obrazów oraz ustawienia, takie jak wzmocnienie (gain) i moc lasera, powinny być dostosowane w razie potrzeby.</li>
	<li>Czas, w którym embriony reagują na środowisko anoksyczne, może się różnić w zależności od stadium cyklu komórkowego w momencie ekspozycji na anoksję. Zazwyczaj anoksja indukuje zatrzymanie w profazie w ciągu 20-30 min od rozpoczęcia przepływu azotu. Zaobserwowaliśmy anoksyjne zatrzymanie cyklu komórkowego w czasie &lt;20 min. Obrazy można uzyskać w tym przedziale czasowym lub wyizolować konkretne obrazy później z serii time-lapse. Dodatkową opcją jest zastosowanie mikroskopii wideo w celu wizualizacji struktur subkomórkowych w embrionach.</li>
	<li>Aby udokumentować powrót ze stanu zatrzymania wywołanego anoksją, wyłącza się dopływ gazu i pozwala komorze powrócić do normoksji poprzez dyfuzję, rejestrując serię time-lapse. Wznowienie progresji cyklu komórkowego i oddokowanie chromosomów następuje zazwyczaj w ciągu 5-20 min od wyłączenia przepływu azotu.</li>
	<li>Należy zauważyć, że w oddzielnych eksperymentach do przepływowej mikrokomory wprowadzono wskaźnik anoksji, rezazurynę; ustalono, że w komorze zapada stan anoksji średnio około 19 min po rozpoczęciu przepływu azotu.</li>
	<li>Obrazy i filmy są przetwarzane przy użyciu programów Imaris, Image J lub Photoshop, a następnie importowane do programu QuickTime w celu prezentacji.</li>
</ol>

<ol><li>Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+signaling+and+resistance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypoxia signaling and resistance in C. elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).</li>
<li>Padilla, P. A., Ladage, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+animation%2C+diapause+and+quiescence%3A+Arresting+the+cell+cycle+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li>
<li>Hu, P. J. Dauer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+PJ+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-19 (2007).</li>
<li>Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+and+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Longevity and stress in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).</li>
<li>Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+cytoplasmic+dynein+heavy+chain+in+Caenorhabditis+elegans+with+fast-acting+temperature-sensitive+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).</li>
<li>Sulston, J., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+J+%22The+Nematode+Caenorhabditis+elegans%22">The Nematode Caenorhabditis elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+Cell+Cycle-regulated+Proteins+Correlates+with+Anoxia-induced+Suspended+Animation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).</li>
<li>Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+sub-nuclear+changes+in+Caenorhabditis+elegans+embryos+exposed+to+brief%2C+intermediate+and+long-term+anoxia+to+analyze+anoxia-induced+cell+cycle+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest.</a> BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).</li>
<li>Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPadilla%2C+PA+%22Anoxia%22">Anoxia</a>. Padilla, P. A. , InTech. (2012).</li>
<li>Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPP-16%2FNup50+function+and+CDK-1+inactivation+are+associated+with+anoxia-induced+prophase+arrest+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).</li>
<li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+animation+in+C.+elegans+requires+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li>
<li>Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+and+making+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Breaking and making of the nuclear envelope.</a> J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).</li>
<li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li>
<li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+are+protected+from+lethal+hypoxia+by+an+embryonic+diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause.</a> Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Deprywacja tlenu i animacja zawieszona
Chociaż narażenie na silny niedobór tlenu może być śmiertelne dla niektórych organizmów, niektóre z nich są w stanie przeżyć ekspozycję na anoksję. W przypadku C. elegans przeżycie anoksji zależy od stadium rozwojowego, a odpowiedzią na ten stan jest przejście w odwracalny stan animacji zawieszonej, w którym szereg obserwowalnych procesów biologicznych zostaje zatrzymanych. Podziały komórkowe, rozwój, ruch, odżywianie i procesy reprodukcyjne ustają...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Odczynniki/Sprzęt&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Skład&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Roztwór podchlorynu</td><td></td><td></td><td>0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, dopełnić do 50 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>Bufor M9</td><td></td><td></td><td>3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 11 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; na 1 L ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Szklane preparaty mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td>3&quot;x1&quot;x1.0 mm</td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka przykrywowe</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72223-01</td><td>średnica 25 mm</td></tr><tr><td>Olej Halocarbon 700</td><td>Sigma</td><td>H8898-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Środek znieczulający</td><td></td><td></td><td>0,5% trikainy, 0,05% tetramizolu</td></tr><tr><td>Zamknięty mikroinkubator perfuzyjny Leiden</td><td>Harvard Apparatus</td><td>650041</td><td></td></tr><tr><td>Azot UHP</td><td>Calgaz (Air Liquide)</td><td></td><td>&amp;gt;99,9990% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;lt;2 ppm O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Rurki plastikowe</td><td>VWR</td><td>89068-468</td><td>0,062&quot; ID x 0,125&quot; OD</td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop z dyskiem wirującym</td><td>McBain Systems</td><td></td><td>invertedowany mikroskop optyczny Zeiss, system oświetlenia epifluorescencyjnego, konfokalny skaner Yokogawa CSU-10, kamera CCD z mnożnikiem elektronów Hamamatsu.</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie mikroskopii poklatkowej do wizualizacji anoksji-indukowanego stanu zawieszenia animacji w embrionach c. elegans

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans był szeroko wykorzystywany w badaniach nad odpornością na stres, co jest ułatwione przez przejrzystość stadiów dorosłych i embrionalnych, a także dostępność mutantów genetycznych i szczepów transgenicznych wykazujących ekspresję licznych białek fuzyjnych1-4. Ponadto dynamiczne procesy, takie jak podziały komórkowe, można obserwować z wykorzystaniem fluorescencyjnie znakowanych białek reporterowych. Badanie mitozy można usprawnić poprzez zastosowanie eksperymentów time-lapse w różnych systemach, w tym w nienaruszonych organizmach; w związku z tym wczesny embrion C. elegans dobrze nadaje się do takich badań. Przedstawiona tutaj technika umożliwia obrazowanie in vivo struktur wewnątrzkomórkowych w odpowiedzi na stres anoksyczny (99,999% N2; &lt;2 ppm O2) z wykorzystaniem prostego układu przepływu gazu w wysokiej klasy mikroskopie. Komora mikroinkubacyjna jest stosowana w połączeniu z przepływem azotu i konfokalnym mikroskopem z wirującym dyskiem w celu stworzenia kontrolowanego środowiska, w którym można obrazować zwierzęta in vivo. Wykorzystując gamma-tubulinę oraz histon znakowane GFP, można monitorować dynamikę i zatrzymanie podziału komórkowego przed, w trakcie i po ekspozycji na środowisko pozbawione tlenu. Wynikiem zastosowania tej techniki są wysokorozdzielcze, szczegółowe filmy i obrazy struktur komórkowych w blastomerach embrionów poddanych deprywacji tlenowej.

C. elegans zarodki poddane silnemu niedotlenieniu (anoksji) są w stanie przetrwać poprzez zatrzymanie procesów biologicznych, w tym rozwoju i podziałów komórkowych7. Indukowane anoksją zatrzymanie podziału komórkowego można monitorować na poziomie subkomórkowym, wykorzystując komorę mikroinkubacyjną wraz z przepływem azotu oraz konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem, aby stworzyć kontrolowane środowisko, w którym możliwe jest obrazowanie zwierząt in vivo (Rysunek 1). Strukt...

Opisano tutaj technikę in vivo obrazowania struktur podkomórkowych u zwierząt poddanych anoksji, z wykorzystaniem komory mikroinkubacyjnej z przepływem gazu w połączeniu z konfokalnym mikroskopem z wirującym dyskiem. Metoda ta jest prosta i wystarczająco elastyczna, aby dostosować ją do różnych parametrów eksperymentalnych i systemów modelowych.

Wykorzystanie mikroskopii poklatkowej do wizualizacji anoksji-indukowanego stanu zawieszenia animacji w embrionach C. elegans

*Caenorhabditis elegans* jest szeroko wykorzystywany w badaniach nad odpornością na stres, co jest ułatwione przez przejrzystość osobników dorosłych oraz stadiów embrionalnych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opisanie techniki in vivo obrazowania dynamiki subkomórkowej w embrionach C. elegans poddanych anoksji z wykorzystaniem układu przepływu gazu w wysokorozdzielczym mikroskopie. W tym celu przygotowuje się najpierw próbkę młodych dorosłych zwierząt transgenicznych, aby uzyskać odpowiednią populację młodych embrionów do obrazowania. Następnie przygotowuje się cienkie preparaty z podłożem agarowym do zastosowania w mikrokomorze inkubacyjnej.Następnie zwierzęta z gatunku sea elegance są poddawane odpowiedniej anestezji i pokrywane olejem hal węglowym, aby uniknąć wysychania podczas ekspozycji na przepływ gazu. Na koniec okrągłe szkiełko nakrywowe z znieczulonymi zwierzętami jest umieszczane w mikrokomorze inkubacyjnej. Komora zostaje następnie umieszczona na stoliku mikroskopu i wypełniona azotem w celu stworzenia środowiska anoksycznego podczas obrazowania, z wykorzystaniem przepływu gazu przez mikrokomorę inkubacyjną.W połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną in vivo pozwala to na uzyskanie wysokiej rozdzielczości szczegółowych filmów i obrazów zatrzymania cyklu komórkowego w odpowiedzi na anoksję. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pośrednia immunofluorescencja, jest możliwość dokumentowania zmian podkomórkowych in vivo podczas wystawiania zwierząt na określone warunki. Metoda ta może dostarczyć wglądu w indukowany anoksją stan animacji zawieszonej w embrionach elegans.Metodę tę można również zastosować w innych systemach, takich jak drożdże, hodowle komórkowe lub inne embriony małych bezkręgowców i kręgowców. Można również zastosować dodatkowe warunki, takie jak hiperoksja, temperatura, stres lub traktowanie małymi cząsteczkami. Procedurę tę prezentują Anastacia Garcia i Mary Latt, dwie studentki studiów magisterskich z mojego laboratorium. Rozpocznij od odpowiedniego transgenicznego szczepu C Elgan; w niniejszym badaniu zostanie użyty szczep transgeniczny TH 32 w celu wizualizacji chromosomów i centrosomów jako markerów podziału komórkowego.Wygeneruj zsynchronizowaną populację poprzez rozbicie dorosłych osobników w roztworze podchlorynu i wykorzystanie pozostałych embrionów, przenosząc dorosłe osobniki na posianą płytkę i pozwalając im składać jaja przez jedną do dwóch godzin, lub przenosząc larwy w stadium L4 z populacji mieszanej na nową posianą płytkę. Hoduj nicienie w temperaturze 20 °C do osiągnięcia wczesnej dorosłości, co zajmie około 96 godzin od wyklucia, 72 godzin od stadium larwy L1 lub 24 godzin po przeobrażeniu z stadium L4. Metodologia ta umożliwia uzyskanie populacji młodych dorosłych osobników zawierających liczne młode embriony, które posiadają duże blastomery i jądra komórkowe optymalne do obrazowania zmian subkomórkowych i podjądrowych.Aby przygotować komorę wilgotną do przechowywania przygotowanych preparatów, należy umieścić wilgotny ręcznik papierowy w dużej płytce Petriego lub pojemniku przykrytym odpowiednio dużym wieczkiem. Przygotuj roztopiony 2% aros w wodziey dejonizowanej, podgrzewając mieszaninę w naczyniu szklanym za pomocą mikrofalówki lub kąpieli wodnej. Następnie nanieś od jednej do trzech kropli ciepłego aros na czyste szkiełko przedmiotowe, natychmiast kładąc drugie szkiełko odwróconym perpendicularly na kroplach aros i lekko dociskając, aby powstała cienka warstwa pozbawiona pęcherzyków powietrza.Po powolnym schłodzeniu arosy rozdziel dwa szkiełka przedmiotowe, pozostawiając kostkę arosy na jednym z nich. Ważne jest, aby upewnić się, że kostka arosy jest wystarczająco cienka, by nie utrudniać ustawiania ostrości mikroskopu. Następnie, używając czystego ostrza żyletki, przytnij kostkę arosy do kształtu małego kwadratu.Przesuń preparaty w przygotowanej komorze wilgotnościowej do momentu użycia. Używając tego samego czystego ostrza żyletki, ostrożnie chwyć krawędź podkładki z Aros i przenieś ją z szkiełka na okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 milimetrów. Unikając gromadzenia się pęcherzyków powietrza pod okrągłym szkiełkiem nakrywkowym, całość należy odpowiednio umieścić w mikroinkubatorze.Nanieś kroplę anestetyka na wkładkę aros. Wybierz od pięciu do 10 nicieni i umieść je w kropli anestetyka. Odczekaj od jednej do trzech minut, aż nicienie przestaną się poruszać.Za pomocą końcówki pipety nanieś kroplę oleju węglowego na nicienie, aby zapobiec ich odwodnieniu podczas przepływu gazu przez komorę. Następnie podłącz jeden koniec elastycznej plastikowej rurki do komory. Rozdziel dwie połowy zamkniętego mikroinkubatora perfuzyjnego i ostrożnie umieść szkiełko nakrywkę pionowo na dolnym pierścieniu.Szczelnie zamknij obie strony komory. Następnie połącz komorę za pomocą elastycznego plastikowego wężyka z butlą z azotem i umieść ją na stole mikroskopu. Sprawdź, czy nie ma wycieków, upewniając się, że wężyk i korki portów wzdłuż boku komory są bezpiecznie zamocowane w celu obrazowania embrionów.Najpierw zlokalizuj zwierzęta przy mniejszym powiększeniu. Następnie przejdź na odpowiednio większe powiększenie. Aby obrazować embrionalne blasphemery u osobników dorosłych, użyj lasera o długości fali 488 nanometrów, aby zlokalizować białko fuzyjne GFP w interesujących komórkach.Aby zwizualizować konkretny etap zatrzymania cyklu komórkowego, na przykład późną profazę, należy zidentyfikować obiekt na wcześniejszym etapie podziału komórkowego, takim jak późna interfaza lub wczesna profaza. Przesiąknąć komorę azotem i kontynuować monitorowanie obiektów podczas napełniania komory azotem, dostosowując w razie potrzeby płaszczyznę ogniskowania. Wykonać obrazowanie poklatkowe, aby uchwycić interesujące w tym przypadku zjawisko.Zatrzymanie w profazie i dokowanie chromosomów do wewnętrznej błony jądrowej. Wykonuj zdjęcia co 10 sekund przez maksymalnie 30 minut. Zazwyczaj indukowane anoksją zatrzymanie w profazie następuje w ciągu 20 do 30 minut od rozpoczęcia przepływu gazu azotowego.Aby udokumentować powrót do stanu aktywności po stanie zatrzymania indukowanym anoksją, wyłącz dopływ gazu i pozwól, aby w komorze powróciły warunki normoksji, rejestrując serię obrazów w odstępach czasu (time-lapse). Wznowienie cyklu komórkowego i rozplecenie chromosomów następuje zazwyczaj w ciągu od 5 do 20 minut. Do przetwarzania obrazów i filmów należy użyć programu ImageJ lub Photoshop, a następnie zaimportować je do programu QuickTime w celu prezentacji.W obrębie zarodka poddanego anoksji chromosomy profazy kondensują się i ustawiają wzdłuż wewnętrznej obwiedni jądra. Zjawisko to określa się mianem dokowania chromosomów; po ponownym dotlenieniu następuje wznowienie progresji cyklu komórkowego i powrót do etapu profazy.Białko Blasphemy przemieści się z obwodu jądrowego do płytki równikowej, co będzie wskazywać na przejście w fazę metafazy. Po opanowaniu technika ta może być wykonana w ciągu trzech do czterech godzin z wykorzystaniem zwierząt w odpowiednim stadium rozwoju. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, aby używać wyłącznie zdrowych, młodych osobników dorosłych, zarezerwować wystarczająco dużo czasu na ukończenie eksperymentu oraz zachować cierpliwość podczas nauki wyboru odpowiednio rozwiniętych komórek Blasphemy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak rejestrować zdarzenia podkomórkowe indukowane anoksją in vivo, wykorzystując embriony GaN oraz komorę z przepływem gazu w wysokorozdzielczym mikroskopie.

use-time-lapse-microscopy-to-visualize-anoxia-induced-suspended

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie mikroskopii time-lapse do wizualizacji anoksji indukowanej zawieszonej animacji w embrionach C. elegans

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Opracowano proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez użycia środków znieczulających dla C. elegans, nienaruszonych larw Drosophila oraz larw rybek danio. Urządzenie wykorzystuje odkształcalną membranę z PDMS do unieruchomienia tych organizmów modelowych w celu wykonania obrazowania poklatkowego licznych procesów, takich jak bicie serca, podział komórkowy i podkomórkowy transport neuronalny. Prezentujemy zastosowanie tego urządzenia i pokazujemy przykłady różnych typów danych...

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Opisano protokół, który wykorzystuje anoksję/głód u C. elegans do modelowania niedokrwienia/reperfuzji. Wyniki funkcjonalne obejmują zwiększoną śmiertelność, widoczne nieprawidłowości w procesach neuronalnych znakowanych GFP oraz upośledzone reakcje behawioralne, które wymagają funkcji neuronalnej.

Model niedokrwienia/reperfuzji beztlenowej u C. elegans

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i montażu zarodków Caenorhabditis elegans, rejestrowania rozwoju pod mikroskopem 4D i śledzenia linii komórkowej.

Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Poznaj metodę mikroskopii poklatkowej do wizualizacji zawieszonej animacji wywołanej niedotlenieniem w zarodkach C. elegans. Technika ta umożliwia obserwację dynamiki subkomórkowej w warunkach anoksji.

Wykorzystanie mikroskopii poklatkowej do wizualizacji anoksji-indukowanego stanu zawieszenia animacji w embrionach C. elegans

Przeglądaj więcej filmów