Wykorzystanie mikroskopii poklatkowej do wizualizacji anoksji-indukowanego stanu zawieszenia animacji w embrionach C. elegans
3 grudnia 2012
Opisano tutaj technikę in vivo obrazowania struktur podkomórkowych u zwierząt poddanych anoksji, z wykorzystaniem komory mikroinkubacyjnej z przepływem gazu w połączeniu z konfokalnym mikroskopem z wirującym dyskiem. Metoda ta jest prosta i wystarczająco elastyczna, aby dostosować ją do różnych parametrów eksperymentalnych i systemów modelowych.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest opisanie techniki in vivo obrazowania dynamiki subkomórkowej w embrionach C. elegans poddanych anoksji z wykorzystaniem układu przepływu gazu w wysokorozdzielczym mikroskopie. W tym celu przygotowuje się najpierw próbkę młodych dorosłych zwierząt transgenicznych, aby uzyskać odpowiednią populację młodych embrionów do obrazowania. Następnie przygotowuje się cienkie preparaty z podłożem agarowym do zastosowania w mikrokomorze inkubacyjnej.
Następnie zwierzęta z gatunku sea elegance są poddawane odpowiedniej anestezji i pokrywane olejem hal węglowym, aby uniknąć wysychania podczas ekspozycji na przepływ gazu. Na koniec okrągłe szkiełko nakrywowe z znieczulonymi zwierzętami jest umieszczane w mikrokomorze inkubacyjnej. Komora zostaje następnie umieszczona na stoliku mikroskopu i wypełniona azotem w celu stworzenia środowiska anoksycznego podczas obrazowania, z wykorzystaniem przepływu gazu przez mikrokomorę inkubacyjną.
W połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną in vivo pozwala to na uzyskanie wysokiej rozdzielczości szczegółowych filmów i obrazów zatrzymania cyklu komórkowego w odpowiedzi na anoksję. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pośrednia immunofluorescencja, jest możliwość dokumentowania zmian podkomórkowych in vivo podczas wystawiania zwierząt na określone warunki. Metoda ta może dostarczyć wglądu w indukowany anoksją stan animacji zawieszonej w embrionach elegans.
Metodę tę można również zastosować w innych systemach, takich jak drożdże, hodowle komórkowe lub inne embriony małych bezkręgowców i kręgowców. Można również zastosować dodatkowe warunki, takie jak hiperoksja, temperatura, stres lub traktowanie małymi cząsteczkami. Procedurę tę prezentują Anastacia Garcia i Mary Latt, dwie studentki studiów magisterskich z mojego laboratorium. Rozpocznij od odpowiedniego transgenicznego szczepu C Elgan; w niniejszym badaniu zostanie użyty szczep transgeniczny TH 32 w celu wizualizacji chromosomów i centrosomów jako markerów podziału komórkowego.
Wygeneruj zsynchronizowaną populację poprzez rozbicie dorosłych osobników w roztworze podchlorynu i wykorzystanie pozostałych embrionów, przenosząc dorosłe osobniki na posianą płytkę i pozwalając im składać jaja przez jedną do dwóch godzin, lub przenosząc larwy w stadium L4 z populacji mieszanej na nową posianą płytkę. Hoduj nicienie w temperaturze 20 °C do osiągnięcia wczesnej dorosłości, co zajmie około 96 godzin od wyklucia, 72 godzin od stadium larwy L1 lub 24 godzin po przeobrażeniu z stadium L4. Metodologia ta umożliwia uzyskanie populacji młodych dorosłych osobników zawierających liczne młode embriony, które posiadają duże blastomery i jądra komórkowe optymalne do obrazowania zmian subkomórkowych i podjądrowych.
Aby przygotować komorę wilgotną do przechowywania przygotowanych preparatów, należy umieścić wilgotny ręcznik papierowy w dużej płytce Petriego lub pojemniku przykrytym odpowiednio dużym wieczkiem. Przygotuj roztopiony 2% aros w wodziey dejonizowanej, podgrzewając mieszaninę w naczyniu szklanym za pomocą mikrofalówki lub kąpieli wodnej. Następnie nanieś od jednej do trzech kropli ciepłego aros na czyste szkiełko przedmiotowe, natychmiast kładąc drugie szkiełko odwróconym perpendicularly na kroplach aros i lekko dociskając, aby powstała cienka warstwa pozbawiona pęcherzyków powietrza.
Po powolnym schłodzeniu arosy rozdziel dwa szkiełka przedmiotowe, pozostawiając kostkę arosy na jednym z nich. Ważne jest, aby upewnić się, że kostka arosy jest wystarczająco cienka, by nie utrudniać ustawiania ostrości mikroskopu. Następnie, używając czystego ostrza żyletki, przytnij kostkę arosy do kształtu małego kwadratu.
Przesuń preparaty w przygotowanej komorze wilgotnościowej do momentu użycia. Używając tego samego czystego ostrza żyletki, ostrożnie chwyć krawędź podkładki z Aros i przenieś ją z szkiełka na okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 milimetrów. Unikając gromadzenia się pęcherzyków powietrza pod okrągłym szkiełkiem nakrywkowym, całość należy odpowiednio umieścić w mikroinkubatorze.
Nanieś kroplę anestetyka na wkładkę aros. Wybierz od pięciu do 10 nicieni i umieść je w kropli anestetyka. Odczekaj od jednej do trzech minut, aż nicienie przestaną się poruszać.
Za pomocą końcówki pipety nanieś kroplę oleju węglowego na nicienie, aby zapobiec ich odwodnieniu podczas przepływu gazu przez komorę. Następnie podłącz jeden koniec elastycznej plastikowej rurki do komory. Rozdziel dwie połowy zamkniętego mikroinkubatora perfuzyjnego i ostrożnie umieść szkiełko nakrywkę pionowo na dolnym pierścieniu.
Szczelnie zamknij obie strony komory. Następnie połącz komorę za pomocą elastycznego plastikowego wężyka z butlą z azotem i umieść ją na stole mikroskopu. Sprawdź, czy nie ma wycieków, upewniając się, że wężyk i korki portów wzdłuż boku komory są bezpiecznie zamocowane w celu obrazowania embrionów.
Najpierw zlokalizuj zwierzęta przy mniejszym powiększeniu. Następnie przejdź na odpowiednio większe powiększenie. Aby obrazować embrionalne blasphemery u osobników dorosłych, użyj lasera o długości fali 488 nanometrów, aby zlokalizować białko fuzyjne GFP w interesujących komórkach.
Aby zwizualizować konkretny etap zatrzymania cyklu komórkowego, na przykład późną profazę, należy zidentyfikować obiekt na wcześniejszym etapie podziału komórkowego, takim jak późna interfaza lub wczesna profaza. Przesiąknąć komorę azotem i kontynuować monitorowanie obiektów podczas napełniania komory azotem, dostosowując w razie potrzeby płaszczyznę ogniskowania. Wykonać obrazowanie poklatkowe, aby uchwycić interesujące w tym przypadku zjawisko.
Zatrzymanie w profazie i dokowanie chromosomów do wewnętrznej błony jądrowej. Wykonuj zdjęcia co 10 sekund przez maksymalnie 30 minut. Zazwyczaj indukowane anoksją zatrzymanie w profazie następuje w ciągu 20 do 30 minut od rozpoczęcia przepływu gazu azotowego.
Aby udokumentować powrót do stanu aktywności po stanie zatrzymania indukowanym anoksją, wyłącz dopływ gazu i pozwól, aby w komorze powróciły warunki normoksji, rejestrując serię obrazów w odstępach czasu (time-lapse). Wznowienie cyklu komórkowego i rozplecenie chromosomów następuje zazwyczaj w ciągu od 5 do 20 minut. Do przetwarzania obrazów i filmów należy użyć programu ImageJ lub Photoshop, a następnie zaimportować je do programu QuickTime w celu prezentacji.
W obrębie zarodka poddanego anoksji chromosomy profazy kondensują się i ustawiają wzdłuż wewnętrznej obwiedni jądra. Zjawisko to określa się mianem dokowania chromosomów; po ponownym dotlenieniu następuje wznowienie progresji cyklu komórkowego i powrót do etapu profazy.
Białko Blasphemy przemieści się z obwodu jądrowego do płytki równikowej, co będzie wskazywać na przejście w fazę metafazy. Po opanowaniu technika ta może być wykonana w ciągu trzech do czterech godzin z wykorzystaniem zwierząt w odpowiednim stadium rozwoju. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, aby używać wyłącznie zdrowych, młodych osobników dorosłych, zarezerwować wystarczająco dużo czasu na ukończenie eksperymentu oraz zachować cierpliwość podczas nauki wyboru odpowiednio rozwiniętych komórek Blasphemy.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak rejestrować zdarzenia podkomórkowe indukowane anoksją in vivo, wykorzystując embriony GaN oraz komorę z przepływem gazu w wysokorozdzielczym mikroskopie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę in vivo obrazowania dynamiki wewnątrzkomórkowej w embrionach C. elegans poddanych anoksji. Metoda ta wykorzystuje przepływ gazu przez mikrokomorę inkubacyjną w połączeniu z wysokowydajnym konfokalnym mikroskopem dyskowym (spinning disc).
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Wprowadzenie
- Obrazowanie subkomórkowe jest kluczowe dla zrozumienia reakcji komórkowych na stres środowiskowy.
- Anoksja może znacząco wpływać na dynamikę i żywotność komórek.
- Sea elegans służy jako organizm modelowy w badaniach nad biologią rozwoju.
- Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości są niezbędne do obserwacji dynamicznych procesów w żywych okazach.
Cel badania
- Opracowanie metody obrazowania struktur subkomórkowych w żywych embrionach w warunkach anoksji.
- Pogłębienie zrozumienia reakcji komórkowych na niedobór tlenu.
- Zapewnienie elastycznej techniki obrazowania, odpowiedniej dla różnych konfiguracji eksperymentalnych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie młodych dorosłych transgenicznych osobników C. elegans w celu pozyskania embrionów.
- Zastosowanie szkiełek z cienką warstwą agaru w mikrokomorze inkubacyjnej.
- Anestezja C. elegans przy użyciu oleju halokarbonowego w celu zapobiegania wysychaniu.
- Obrazowanie za pomocą konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym w przepływie azotu w celu stworzenia środowiska beztlenowego.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia obrazowanie dynamiki subkomórkowej w embrionach w czasie rzeczywistym.
- Skuteczne utrzymanie warunków anoksji podczas obrazowania.
- Wykazana elastyczność w odniesieniu do różnych parametrów eksperymentalnych.
- Dostarczenie informacji na temat wpływu anoksji na procesy komórkowe.
Wnioski
- Metoda ta stanowi cenne narzędzie do badania odpowiedzi komórkowych na anoksję.
- Można ją dostosować do różnych systemów modelowych i warunków eksperymentalnych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia dynamiki subkomórkowej w warunkach stresu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Technika ta umożliwia wizualizację dynamiki subkomórkowej w czasie rzeczywistym w żywych embrionach w kontrolowanych warunkach anoksji, dostarczając wglądu w mechanizmy stresowo indukowanego zatrzymania cyklu komórkowego. Poprzez rejestrację odwracalnego zatrzymania w profazie oraz dokowanie chromosomów u C. elegans, metoda ta wspiera walidację celów w szlakach regulujących animację zawieszoną i uśpienie metaboliczne. Podejście to oferuje istotny w kontekście chorób system do badania mechanizmów wykrywania tlenu z pewnością predykcyjną w ramach przedklinicznej redukcji ryzyka.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez wizualizację indukowanego anoksją zatrzymania cyklu komórkowego in vivo, wyjaśniając dynamikę szlaków w warunkach niedoboru tlenu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią obserwację zmian podkomórkowych bez artefaktów utrwalania.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie ekspozycji na anoksję z mierzalnymi wskaźnikami progresji cyklu komórkowego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie walidowanych układów biologicznych z wykorzystaniem reporterów znakowanych GFP w celu zstandaryzowanego i powtarzalnego obrazowania dynamiki podziałów komórkowych.
- Wyniki ilościowe: Generowanie danych z obrazowania poklatkowego, umożliwiających pomiar momentu rozpoczęcia, czasu trwania oraz kinetyki powrotu z zatrzymania cyklu komórkowego w określonych gradientach tlenu.
- Skalowalność platformy: Możliwość adaptacji do przepływów pracy w badaniach wysokoprzepustowych (high-content screening) w celu analizy małych cząsteczek lub modyfikatorów genetycznych wpływających na szlaki odpowiedzi stresowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla jednostek chorobowych: Modeluje uszkodzenie reperfuzyjne oraz stres hipoksyjny w kontekstach rozwojowych, co jest spójne z translacyjnym poszukiwaniem biomarkerów.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez monitorowanie konserwowanych odpowiedzi komórkowych na anoksję w różnych systemach modelowych.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Dostarcza informacji do kryteriów go/no-go w oparciu o odwracalne zatrzymanie fenotypowe i progi regeneracji.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając danych z obrazowania żywych komórek, które pozwalają ocenić wiązanie z celem oraz modulację szlaków przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków wykrywania tlenu poprzez bezpośrednią wizualizację zatrzymania i przywrócenia cyklu komórkowego w embrionach.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy systemów z ilościowymi odczytami postępu mitozy, umożliwiając przesiewanie związków w poszukiwaniu modulatorów animacji zawieszonej.
- Analityka: Zapewnia pomiary czasu trwania zatrzymania w profazie i dynamiki chromosomów w funkcji czasu, co ułatwia analizę porównawczą w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy się z badaniami przedklinicznymi poprzez modelowanie odpowiedzi na stres hipoksyczny istotnych w przypadku niedokrwienia, udaru i zaburzeń metabolicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania, którą można zastosować do drożdży, embrionów kręgowców i systemów hodowli komórkowych pod wpływem różnych czynników stresogennych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności w powiązaniach mechanistycznych między anoksją a regulacją cyklu komórkowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki kontrolowanemu przepływowi gazów i konstrukcji komory środowiskowej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez umożliwienie wczesnego wykrycia efektów cytotoksycznych lub cytostatycznych w systemach istotnych dla danej choroby.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków ukierunkowanych na szlaki czynnika indukowanego hipoksją (HIF) lub odpowiedzi na stres mitochondrialny z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z liniami transgenicznymi, przygotowywaniu embrionów oraz fluorescencyjną mikroskopią żywych komórek.
- Zależne od zastosowania konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym, systemów kontroli przepływu gazów oraz konserwacji komory środowiskowej.
- Konieczna jest standaryzacja czasu ekspozycji na anoksję, kontroli temperatury oraz protokołów regeneracji pomiędzy zespołami.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji do różnych systemów modelowych, w tym etapowania embrionów i kompatybilności reporterów.
- Ograniczone przez konieczność stosowania znaczników fluorescencyjnych odpornych na tlen oraz potencjalną fototoksyczność podczas długotrwałej akwizycji time-lapse.
